專(zhuān)利名稱(chēng)：：檢測(cè)水產(chǎn)品中重要致病菌的基因芯片和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基因芯片和檢測(cè)用試劑盒，尤其涉及檢測(cè)水產(chǎn)品中重要致病菌的基因芯片和試劑盒。
背景技術(shù)：
：食品質(zhì)量與食品安全關(guān)系人類(lèi)健康，因而受到世界各國(guó)的高度重視。微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要問(wèn)題。細(xì)菌污染造成的食源性疾病(食物中毒)是我國(guó)食品安全中最突出的問(wèn)題。據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，2000年共收到重大食物報(bào)告達(dá)150起，中毒6237人，死亡135人；2001年共發(fā)生重大食物中毒事件185起，15715人中毒，116人死亡。2005年全國(guó)各地上報(bào)的食物中毒事件中，微生物食物中毒人數(shù)最多，占總數(shù)的43.0%。國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)個(gè)案報(bào)告的資料分析表明微生物性病原占46.4%，微生物性食源性疾病暴發(fā)中，副溶血性弧菌導(dǎo)致的疾病暴發(fā)占40.1%，變形桿菌占11.3%，葡萄球菌腸毒素占9.4%，蠟樣芽孢桿菌占8.6%，沙門(mén)氏菌占8.1%，致病性大腸桿菌占4%。我國(guó)食物中毒的高危食品為肉類(lèi)、糧食、水產(chǎn)品、水果蔬菜、雞蛋、豆類(lèi)、奶。這一排序是基于國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)部分資料的分析的動(dòng)態(tài)情況。其中水產(chǎn)品排名第三，是重要的食物中毒高危食品。水產(chǎn)品致病菌導(dǎo)致的食源性疾病影響的國(guó)家范圍廣、危急健康人群多，而且還給國(guó)家之間相關(guān)的食品貿(mào)易帶來(lái)危機(jī)，這使得水產(chǎn)品安全問(wèn)題受到了空前的關(guān)注。這些事實(shí)也可以充分說(shuō)明盡管現(xiàn)代科技已經(jīng)發(fā)展到了相當(dāng)高的水平，但水產(chǎn)品致病菌導(dǎo)致的疾病不論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是在發(fā)展中國(guó)家，都沒(méi)有很好的被控制，仍然危害著人民的健康。水產(chǎn)品中的致病菌主要有以下兩類(lèi)一是其自身原有致病菌，這類(lèi)細(xì)菌廣泛分布于水中，如冷源性細(xì)菌單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，噬熱性細(xì)菌如副溶血弧菌和霍亂弧菌等；二是非自身原有致病菌，即生產(chǎn)過(guò)程中被污染的致病菌，主要存在與人和動(dòng)物腸道內(nèi)及被人或動(dòng)物糞便污染的水環(huán)境中，常見(jiàn)的包括沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌等(楊文鵒，孫翠玲，潘云娣，等.水產(chǎn)品中致病微生物的快速檢測(cè)方法.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2006，6(1):402406)。統(tǒng)計(jì)了衛(wèi)生部公布的國(guó)內(nèi)近十年公布的微生物性食物中毒病例，綜合國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)部分資料的分析的動(dòng)態(tài)情況，天津出入境檢驗(yàn)檢疫局提供的調(diào)查統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，確定水產(chǎn)品致病菌檢測(cè)芯片檢測(cè)范圍為下列常見(jiàn)的IO類(lèi)菌化膿性鏈球菌，志賀氏菌(包含福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、鮑氏志賀菌和痢疾志賀氏菌共4個(gè)種)，沙門(mén)氏菌，金黃色葡萄球菌，副溶血弧菌，霍亂弧菌，單增李斯特菌，奇異變形桿菌，潘氏變形桿菌和普通變形桿菌。我國(guó)目前對(duì)于水產(chǎn)品的病原菌檢測(cè)、鑒定手段仍停留常規(guī)的微生物學(xué)檢驗(yàn)水平，通常以分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)及血清學(xué)試驗(yàn)為主，具有操作復(fù)雜、手工勞動(dòng)量大、檢驗(yàn)周期長(zhǎng)(6-7天)、特異性不強(qiáng)等缺點(diǎn)，在相當(dāng)大的程度上限制了對(duì)食源性疾病病源水產(chǎn)品的快速檢測(cè)鑒定能力，并且在判斷是否為陽(yáng)性時(shí)只靠實(shí)驗(yàn)人員肉眼觀(guān)察，沒(méi)有足夠可靠的依據(jù)，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，不能達(dá)到新鮮水產(chǎn)品貯藏時(shí)間短、需要快速檢測(cè)的要求。一些簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)的方法如PCR、ELISA都有較高的假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，并且運(yùn)用PCR和ELISA得出3的結(jié)果都不能作為最終的檢測(cè)依據(jù)。日前丹麥、澳人利亞等一些歐洲和澳洲國(guó)家食源性病原菌的檢測(cè)結(jié)果綜合了實(shí)時(shí)熒光PCR和ELISA兩種技術(shù)在DNA和蛋白質(zhì)兩種水平上檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行判斷，并且實(shí)驗(yàn)操作只有l(wèi)h左右。因此我國(guó)有必要建立起水產(chǎn)品致病菌的高通量、快速、準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)體系，以確保在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)正確判定水產(chǎn)品的安全性，這是有效地預(yù)防和控制食源性疾病的重要前提。只有這樣才能在一定程度上提前消除由于水產(chǎn)品中的致病菌所造成的危害，提高我國(guó)食源性疾病的檢測(cè)和控制能力，為加入WTO后盡早與其他國(guó)家達(dá)成通關(guān)協(xié)議搭建雄厚的技術(shù)平臺(tái)。1997年7月，Affymetrix，Inc.(SantaClara，CA)公司的ThomasR.等人發(fā)明的第6，228，575號(hào)美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)了以生物芯片技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行定種和表型分析的方法。從二十世紀(jì)九十年代開(kāi)始，基因芯片技術(shù)作為一種全新的核酸分析檢測(cè)技術(shù)建立起來(lái)，并隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的開(kāi)展而逐步發(fā)展。該技術(shù)綜合運(yùn)用了分子生物學(xué)、集成電路制造、計(jì)算機(jī)、半導(dǎo)體、共聚焦激光掃描、熒光標(biāo)記等技術(shù)，使檢測(cè)過(guò)程具有敏感性高、特異性強(qiáng)、大規(guī)模集成化、自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)便快捷、效率高等特點(diǎn)，在基因表達(dá)相關(guān)研究和生物制藥研究等方面得到普遍應(yīng)用。因此，如果將基因芯片技術(shù)用于細(xì)菌的鑒定，不僅可以大大簡(jiǎn)化檢測(cè)手段，提高檢測(cè)速度，而且具有高準(zhǔn)確性、高靈敏度、高通量、可重復(fù)性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。目前最常使用的微生物鑒定的靶分子是16SrRNA和23SrRNA，國(guó)內(nèi)外已有很多文獻(xiàn)報(bào)道。利用16SrRNA和23SrRNA可將細(xì)菌微生物鑒定至種或?qū)?，但是?duì)于親緣關(guān)系較近的細(xì)菌種或?qū)俚蔫b定十分困難(BodrossyL，SessitschA.2004.Oligonucleotidemicroarraysinmicrobialdiagnostics.CurrentOpinioninMicrobiology.7:245-25)。目前利用16S-23SrRNA間區(qū)作為靶分子進(jìn)行細(xì)菌的鑒定已經(jīng)逐漸成為研究的熱點(diǎn)(NubelU，SchmidtPM，ReiPE，etal.2004.OligonucleotidemicroarrayforidentificationofBacillusanthracisbasedonintergenictranscribedspacersinribosomalDNA.FEMSMicrobiologyLetters240:215-223.)，它的變異速率相當(dāng)于16SrRNA或者23SrRNA的十倍，因此具有更高的分辨率，甚至可將細(xì)菌區(qū)分到型，對(duì)于親緣關(guān)系較近的種屬的區(qū)分具有16SrRNA和23SrRNA不可比擬的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)兩端是保守的16SrRNA基因和23SrRNA基因區(qū)，可在兩端的保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物可避免了多對(duì)引物帶來(lái)的引物二聚體的問(wèn)題，長(zhǎng)度在200bp-1000bp之間，大小易于操作，因而靶序列的擴(kuò)增和標(biāo)記過(guò)程更加簡(jiǎn)化，也更容易控制，符合操作簡(jiǎn)便快捷的實(shí)際要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)水產(chǎn)品中重要致病菌的基因芯片，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)常見(jiàn)水產(chǎn)品致病菌檢測(cè)技術(shù)存在的費(fèi)時(shí)耗力的缺陷，擴(kuò)展病原菌檢測(cè)范圍，提高檢測(cè)靈敏度和特異性，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，縮短檢測(cè)周期。本發(fā)明所述的檢測(cè)水產(chǎn)品中重要致病菌的基因芯片包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其中所述固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針包含從以下序列中選取的一種或多種(1)從沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、潘氏變形桿菌的16S-23SrDNA間區(qū)以及志賀氏菌的ipaH(invasionplasmidantigengene)毒力基因中選取的DNA序列；(2)上述(1)中選取的DNA序列的互補(bǔ)DNA序列；(3)上述(1)或(2)中選取的DNA序列的互補(bǔ)RNA序列。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針具有SEQIDNO:2-SEQIDNO:26所示的DNA序列中的一種或多種。本發(fā)明所述的基因芯片，還包含陽(yáng)性對(duì)照探針、陰性對(duì)照探針或熒光探針。本發(fā)明所述的基因芯片中，所述陽(yáng)性對(duì)照探針選自細(xì)菌16SrDNA保守區(qū)中的DNA片段或者其互補(bǔ)的DNA或RNA序列。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述陽(yáng)性對(duì)照探針具有SEQIDNO:1所示的DNA序列。本發(fā)明還提供所述的基因芯片的應(yīng)用，主要為在檢測(cè)志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、潘氏變形桿菌中至少一種致病菌的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，包含使用檢測(cè)引物，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述檢測(cè)引物具有SEQIDN0:27-SEQIDNO:30所示的DNA序列或其互補(bǔ)序列中的至少一種。本發(fā)明還提供一種試劑盒，其包含權(quán)利上述的基因芯片。本發(fā)明所述的試劑盒，還包括檢測(cè)引物，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述檢測(cè)引物具有SEQIDN0:27-SEQIDNO:30所示的DNA序列或其互補(bǔ)序列中的至少一種。本發(fā)明還提供上述的試劑盒的應(yīng)用，其主要為在檢測(cè)志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、潘氏變形桿菌中至少一種致病菌的應(yīng)用。由上述的技術(shù)方案可見(jiàn)，本發(fā)明首次將基因芯片技術(shù)引入水產(chǎn)品中重要致病菌檢測(cè)領(lǐng)域同時(shí)檢測(cè)10類(lèi)致病菌，建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性強(qiáng)的全新的用于檢測(cè)水產(chǎn)品中重要致病菌的基因芯片及其檢測(cè)方法，利用本發(fā)明的基因芯片可以達(dá)到檢測(cè)水產(chǎn)品中重要致病菌的目的，由于操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性強(qiáng)，可用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、食品安全檢驗(yàn)、進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫和流行病學(xué)調(diào)查。為保證本發(fā)明的上述和其它目的特征和優(yōu)點(diǎn)更明顯易懂，下面特舉較佳實(shí)施例，并配合說(shuō)明書(shū)附圖，作詳細(xì)說(shuō)明如下。圖l為本發(fā)明基因芯片的-圖2為本發(fā)明基因芯片的-圖3A為利用本發(fā)明的基因圖3B為利用本發(fā)明的基因圖3C為利用本發(fā)明的基因圖3D為利用本發(fā)明的基因圖3E為利用本發(fā)明的基因圖3F為利用本發(fā)明的基因圖3G為利用本發(fā)明的基因圖3H為利用本發(fā)明的基因圖31為利用本發(fā)明的基因-個(gè)實(shí)施例的外形示意圖。-個(gè)實(shí)施例上單一點(diǎn)陣探針排布規(guī)律示意圖,芯片檢測(cè)化膿性鏈球時(shí)的雜交結(jié)果。芯片檢測(cè)志賀氏菌時(shí)的雜交結(jié)果。芯片檢測(cè)金黃色葡萄球菌時(shí)的雜交結(jié)果。芯片檢測(cè)沙門(mén)氏菌時(shí)的雜交結(jié)果。芯片檢測(cè)單增李斯特氏菌時(shí)的雜交結(jié)果。芯片檢測(cè)副溶血弧菌時(shí)的雜交結(jié)果。芯片檢測(cè)霍亂弧菌時(shí)的雜交結(jié)果。芯片檢測(cè)奇異變形桿菌時(shí)的雜交結(jié)果。芯片檢測(cè)潘氏變形桿菌時(shí)的雜交結(jié)果。圖3J為利用本發(fā)明的基因芯片檢測(cè)普通變形桿菌時(shí)的雜交結(jié)果。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1探針的設(shè)i十和制備1.序列獲得(1)細(xì)菌16SrDNA序列的獲得從GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到十種菌的全部16SrDNA序列。(2)16S-23SrDNA間區(qū)序列的獲得從GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、及它們的近緣菌的所有16S-23SrDNA間區(qū)序列。為滿(mǎn)足靶序列分析時(shí)種內(nèi)保守種間特異的需要，針對(duì)ITS資源極少的變形桿菌屬，選取了48株變形桿菌(包含該屬全部4個(gè)種奇異變形桿菌22株，普通變形桿菌14株，潘氏變形桿菌10株，產(chǎn)粘變形桿菌2株)進(jìn)行了間區(qū)的測(cè)序，測(cè)得831條ITS序列。用上述從16sSrDNA和23SrDNA序列設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增間區(qū)，PCR產(chǎn)物純化后連接到T載體上，后電轉(zhuǎn)進(jìn)DH5a感受態(tài)中，挑取含500bp-1000bp的質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序儀ABI3700。測(cè)得的序列用StadenPackage軟件拼接，從而得到奇異變形桿菌和普通變形桿菌及其近緣菌的間區(qū)序列。(3)ipaH基因序列的獲得從GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到志賀氏菌四個(gè)種的全部ipaH基因序列。2.探針設(shè)計(jì)(1)細(xì)菌的通用探針10類(lèi)菌全部的16SrDNA序列及其他菌的16SrDNA序列導(dǎo)入GlustalX軟件中，選取靠近間區(qū)的一段16SrDNA保守序列作為探針，滿(mǎn)足長(zhǎng)度35士2bp，Tm75°C±_2°C。(2)間區(qū)探針?lè)謩e將沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、潘氏變形桿菌的所有16S-23SrDNA間區(qū)序列導(dǎo)入GlustalX軟件中，從而得知該菌的間區(qū)序列有幾種類(lèi)型，每種類(lèi)型選取一條代表序列在公共數(shù)據(jù)NCBI中作Blastn比對(duì)，確定可否作為特異靶點(diǎn)以及特異靶點(diǎn)的位置。對(duì)照GlustalX比對(duì)結(jié)果，選取滿(mǎn)足不同株間該區(qū)段都保守的性質(zhì)，同時(shí)長(zhǎng)度35±2bp，Tm75°C±2°C。(3)ipaH基因探針將上述從GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到的志賀氏菌四個(gè)種的ipaH基因序列用序列比對(duì)軟件GlustalX比對(duì)，找到該基因的保守區(qū)段，將該保守區(qū)段導(dǎo)入01igoArray2.0軟件中，參數(shù)設(shè)定如下-n20;-130;-L40;-D3000;-t79;-T90;-sG5°G;—x65°G;—N2;—p33，—P65;—mGGGGGCCGGCTTTTTAAAAA;—g15。運(yùn)行程序在線(xiàn)設(shè)計(jì)探針。從輸出結(jié)果中選擇長(zhǎng)度在35bp士2bp，Tm值75t:士2t:的探針。3.探針合成將下表l中的探針序列的5'端延長(zhǎng)10個(gè)T(表1所示的熒光探針序列中已包含了延長(zhǎng)的IO個(gè)T)并氨基化后委托探針合成公司(北京奧科公司)合成，備用。4.探針篩選將合成好的探針溶解并適量稀釋后用基因芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)在玻璃片基上制成基因芯片，通過(guò)雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探針篩選，最終得到用于制備本發(fā)明基因芯片所需的特異、靈敏的探針。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，選擇了28條長(zhǎng)度在35bp士2bp、Tm75°C士2。C的探針，并通過(guò)360次雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探針篩選，最終得到如表1所示的探針。其中，編號(hào)為NO.l(SEQIDN0:1)的探針序列選自所有細(xì)菌的16SrDNA，作為陽(yáng)性對(duì)照用來(lái)檢測(cè)是否有細(xì)菌，編號(hào)為NO.2的探針作為熒光探針，編號(hào)為NO.3的探針為多聚T片段，用作陰性對(duì)照，編號(hào)為N0.4的探針為50X的DMS0，用作空白對(duì)照，編號(hào)N0.5-N0.25的21條探針序列(SEQIDNO:2-SEQIDN0:22)選自常見(jiàn)致病菌(沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、潘氏變形桿菌)的16S-23SrDNA間區(qū)，編號(hào)NO.26-NO.29(SEQIDNO:23-SEQIDNO:26)的4條探針序列選自志賀氏菌的ipaH基因。表1:本發(fā)明基因芯片上選用的寡核苷酸探針序列及可檢測(cè)出的致病菌探針編號(hào)SEQID探針序列(5'-3')可檢測(cè)出的致病菌NO.1NO:1TTGTACACACCGCCCGTCACACCAT細(xì)菌正對(duì)照NO.2Gy3mmmmmmmm熒光探針TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTNO.3==麗麗麗陰性對(duì)照NO.450%DMSO空白對(duì)照NO.5NO:2GGCTCCATCAGGATACAATCCTACTAAACTT化膿性鏈球菌NO.6NO:3CACATGGTCAGATTCCTAATTTTCTACAGA化膿性鏈球菌NO.7NO:4GCTAAAGCGAGCGTTGCTTAGTATCCTA化膿性鏈球菌NO.8NO:5GCTTATGCGAGCGCTTGACAATCTATTCT金黃色葡萄球菌NO.9NO:6TAAAGCAGTATGCGAGCGCTTGACTAAA金黃色葡萄球菌NO.10NO:7ATGTGAACGTTTGACTTATAAAAATGGTGG金黃色葡萄球菌7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例2引物的設(shè)i十和制備1.序列獲得同前設(shè)計(jì)探針的序列。2.設(shè)計(jì)引物:(1)擴(kuò)增間區(qū)序列引物的設(shè)計(jì)從公共數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI中下載得到的十種細(xì)菌的16SrDNA用序列比對(duì)軟件GlustalX比對(duì)后，選取靠近間區(qū)的一段16SrDNA保守序列作為上游引物，長(zhǎng)度符合Tm值50。C士5。C、長(zhǎng)度17bp士2bp、Hairpin:NONE、Dimer:NONE、FalsePriming:NONE、CrossDimer:NONE，且包含細(xì)菌通用探針序列在內(nèi)。(2)擴(kuò)增ipaH基因序列引物的設(shè)計(jì)將上述從GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到的志賀氏菌四個(gè)種的ipaH基因序列用序列比對(duì)軟件GlustalX比對(duì)，找到該基因的保守區(qū)段，將該保守區(qū)段導(dǎo)入引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0軟件中，相應(yīng)參數(shù)設(shè)定如下SearchFor:PCRPrimers,Searchtypes:Both.SearchRanges:SensePrimer1to672，Anti_sensePrimer1to672，PCRProductSize:100bptolOOObp.PrimerLength:20bp±2bp.SearchMode:Automatic。從輸出結(jié)果中選取Tm值50。C±5°C、長(zhǎng)度17bp士2bp、Hairpin:顯E、Dimer:顯E、FalsePriming:顯E、CrossDimer:顯E且包含探針序列在內(nèi)的引物。3.引物合成將下表2中的引物序列委托引物合成公司(北京奧科)合成，備用。4.引物篩選將合成好的引物溶解并適量稀釋?zhuān)环矫嫱ㄟ^(guò)PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增16S-23SrDNA間區(qū)和志賀氏菌ipaH基因序列檢測(cè)引物的擴(kuò)增性，另一發(fā)面，兩對(duì)引物同時(shí)對(duì)IO類(lèi)菌的不同菌株進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)兩對(duì)引物的相容性，最終得到用于制備本發(fā)明基因芯片所需的特異、靈敏的引物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，選取了既包含探針又適合同時(shí)使用2對(duì)引物擴(kuò)增10類(lèi)水產(chǎn)品中重要致病菌(志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、潘氏變形桿菌)DNA的引物4條，為適應(yīng)同時(shí)兩對(duì)引物的PCR，經(jīng)生物信息學(xué)初篩并通過(guò)大量PCR實(shí)驗(yàn)篩選，篩選出如表2所示的適用引物。表2用于腸道中10類(lèi)常見(jiàn)致病菌檢測(cè)DNA的PCR擴(kuò)增的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>棚列3細(xì)猛燃——K鵬1.溶解探針將實(shí)施例1中合成的探針?lè)謩e溶解于50%匿SO溶液中，稀釋使探針的終濃度達(dá)到IPg/iil。2.加板將溶解好的探針加入384孔板的相應(yīng)位置，每孔10。3.點(diǎn)樣將如圖1所示的57.5mmX25.5mmXlmm(長(zhǎng)X寬X高)的潔凈的醛基化玻片(C即italBioCorp.，China)放到芯片點(diǎn)樣儀(Spotarray72)的載物臺(tái)上，使用SpotArray的控制軟件(Telechemsmp3stealtypin)，運(yùn)行程序，按圖2所示的排布方式點(diǎn)在醛基化的玻片上4.5mmX4.5mm的點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)，構(gòu)成中低密度DNA微矩陣，玻片上的六個(gè)點(diǎn)陣區(qū)內(nèi)陣列排布規(guī)律相同。點(diǎn)陣區(qū)域尺寸3mmX2mm，該點(diǎn)陣內(nèi)點(diǎn)間距250ym，矩陣12X8，12X250iim=3mm，8X250iim=2mm，標(biāo)準(zhǔn)片基尺寸75.5mmX25.5mmXlmm。4.干燥將點(diǎn)好的芯片室溫下過(guò)夜干燥，然后在45t:烘箱干燥2小時(shí)。5.交聯(lián)用交聯(lián)儀(uvpcl-2000MultracioletCrosslinker)600J交聯(lián)2次。將交聯(lián)好的芯片放回潔凈芯片盒中，備用。由圖2可見(jiàn)，每個(gè)點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)為12(行)X8(列)個(gè)探針點(diǎn)。NO.l框區(qū)示意的位置為檢測(cè)細(xì)菌的正對(duì)照探針，NO.2框區(qū)示意的位置為熒光探針，NO.3框區(qū)示意的位置為負(fù)對(duì)照探針，N0.4框區(qū)示意的是空白對(duì)照，其它為各致病菌的特異探針(對(duì)應(yīng)于表1中的相應(yīng)探針編號(hào))。輔你l4糊細(xì)総,翻^口口口巾魏致儲(chǔ)1.樣品處理按照國(guó)標(biāo)的操作方法，用滅菌棉簽，無(wú)菌操作，涂抹魚(yú)、蝦、蟹等水產(chǎn)品的腮和腸道等部位，放入配制好的2YT培養(yǎng)基中，37°C，200rpm過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。2.提取基因組lml過(guò)夜培養(yǎng)的樣品8000rpm離心5分鐘沉淀可能存在的致病菌菌體，棄上清(盡量空干)。向沉淀中加入100ul去離子水重懸，8000rpm，離心5分鐘，去除上清。加入100ul的裂解液(配方如下)，IO(TC沸水浴15分鐘，12000rpm離心3分鐘，上清即為粗提的DNA模板。附裂解液配方1XPCR緩沖液(含Mg+)0.5%的NP400.5%的Tween203.擴(kuò)增靶序列取上述基因組提取方法提取的3ul中層上清作為模板加入PCR反應(yīng)混合液中，PCR反應(yīng)混合液配方如下表3所示。(注以下表3-表4中的PCR緩沖液、MgCl2、dNTP混合物，Taq酶均購(gòu)自Sangon公司)表3MultiplexPCR反應(yīng)混合液配方成分濃度加樣量(W)ddH20-3610xPCR緩沖液10xMgCl225mMdNTP混合物10mM0.5P-l和P-2各lP-3和P-4lO(iM各0.3Taq酶5U/pl0.5注表中P-l至P-2以及P-3和P-4為表2中所列的引物。將反應(yīng)管放入PCR儀(Biometra)中，設(shè)定的循環(huán)參數(shù)如下94°C5分鐘94。C30秒50°C30秒72°C1分鐘回到第二步，共35個(gè)循環(huán)72°C5分鐘4°C20分鐘3.純化將上述獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用純化柱(MILIPORE公司)純化，具體步驟如下(1)將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至純化柱中，加水補(bǔ)足至400ill。(2)25。C、6000rpm離心15分鐘，丟棄收集管。(3)將純化柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml的離心管中，加入25iU的超純水(MilliQ)，37°C放置5分鐘。(4)將純化柱倒置放在1.5ml的離心管上，6000rpm離心2分鐘，收集產(chǎn)物。4.標(biāo)記靶序列取12ill純化產(chǎn)物，加入標(biāo)記混合液中，標(biāo)記反應(yīng)混合液配方如下表4所示。表4標(biāo)記混合液配方濃度加樣量成分ddH20-9.310xPCR緩沖液3MgCl225mM3dNTP混合物10mM0.3P-2和P-4IOjiM各0.6Cy3-dUTP25nM0,3Taq酶5，0.3注表中P-2和P-4為表2中所列的引物。將反應(yīng)管放入PCR儀(Biometra)中，設(shè)定的循環(huán)參數(shù)如下94°C5分鐘94°C30秒50°C30秒72°C1分鐘回到第二步，共35個(gè)循環(huán)72"C5分鐘4。C20分鐘5.烘干將標(biāo)記產(chǎn)物置65t:烘箱烘干。6.雜交向雜交盒(博奧公司)內(nèi)預(yù)加入70ii1ddH20以保持濕度。12ill雜交液(配方如下所示)回溶烘干產(chǎn)物并加在實(shí)施例三中制備的腸道中常見(jiàn)致病菌檢測(cè)基因芯片的探針陣列區(qū)域，蓋上定制的蓋片(博奧公司)(注意蓋片和載玻片之間不能有氣泡)，蓋緊雜交盒，4(TC水浴鍋中雜交16小時(shí)。7.洗滌雜交到時(shí)，取出雜交盒，去除蓋片，將基因芯片依次在洗液A中洗滌3分鐘，洗液B中洗滌3分鐘，洗液C中洗滌90秒，空氣中風(fēng)干。雜交液配方10%硫酸葡聚糖(dextranSulfate);25%甲酰胺(formamide);0.1%SDS(十二烷基硫酸鈉)；6XSSPE洗液A:1XSSC(氯化鈉-檸檬酸鈉溶液)；0.1%SDS洗液B:0.05XSSC洗液C:95X乙醇8.掃描用GenePixpersonal4100A生物芯片掃描儀(AXONinstrument)掃描，所用參數(shù)如下12軟件及版本GenePixPro6.0officialname:575DF35PMTGain:550掃描分辨率10iim掃描結(jié)果存為JPG、TIF、GPR格式用本發(fā)明的基因芯片分別檢測(cè)常見(jiàn)的腸道中致病菌(志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、潘氏變形桿菌)時(shí)的雜交掃描結(jié)果如圖3A-3J所示。9.分析判讀由于此芯片檢測(cè)的目標(biāo)菌有10種，探針28條，屬于低密度芯片，檢測(cè)結(jié)果可由肉眼判斷。根據(jù)掃描出的雜交圖像，以正對(duì)照探針的位置作為圖像坐標(biāo)，判斷出現(xiàn)熒光信號(hào)的特異探針的位置，對(duì)照點(diǎn)陣排布圖判斷出致病菌。若只有正對(duì)照探針有信號(hào)，則不存在此io種致病菌。輔你l5乂寸細(xì)猛則灘鼎赫翻對(duì)實(shí)施例3中制備的水產(chǎn)品中重要致病菌檢測(cè)基因芯片的特異性進(jìn)行鑒定如下總計(jì)用197株致病菌的代表性菌株和檢出株以及他們的近緣菌株來(lái)鑒定實(shí)施例3中制備的水產(chǎn)品中重要致病菌檢測(cè)基因芯片的特異性。在該特異性鑒定試驗(yàn)中，使用的所有菌株情況見(jiàn)表5。利用本發(fā)明的基因芯片和上述檢測(cè)方法進(jìn)行雜交檢測(cè)，均顯示了正確的雜交結(jié)果，這說(shuō)明本發(fā)明的基因芯片具有良好的特異性。表5:特異性試驗(yàn)用到的菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>a，流行病學(xué)微生物學(xué)研究所(IEM)，中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究會(huì)。b，澳大利亞醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)學(xué)研究所(MVS)。c，中科院微生物研究所(As)。d，中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心(CMCC)。e，臺(tái)灣蘇州大學(xué)。f，中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心(ACCC)。g，瑞典哥德堡大學(xué)培養(yǎng)物保藏中心(CCUG)。h，捷克典型菌種保藏中心(Prk)。i，波蘭羅茲大學(xué)微生物學(xué)和免疫學(xué)研究所。j，捷克微生物保藏中心(CCM)。k，美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)。l，澳大利亞新南威爾士州疾病感染和微生物中心(CIDM)。m，比利時(shí)菌種中心(LMG)。n，中國(guó)獸醫(yī)學(xué)菌種國(guó)家保藏中心(CVCC)。o，來(lái)自天津出入境檢驗(yàn)檢疫局的檢出株。p，來(lái)自于天津中醫(yī)藥大學(xué)的臨床菌株。q，來(lái)自于天津人民醫(yī)院的臨床菌株。r，來(lái)自于天津一中心醫(yī)院的臨床菌株。s，來(lái)自于天津三中心醫(yī)院的臨床菌株。t，來(lái)自于天津兒童醫(yī)院的臨床菌株。u，來(lái)自于天津南開(kāi)醫(yī)院的臨床菌株。v，來(lái)自于天津血液研究所的臨床菌株。w，來(lái)自于天津胸科醫(yī)院的臨床菌株。x，來(lái)自于天津醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院的臨床菌株。對(duì)實(shí)施例3中制備的水產(chǎn)品中重要致病菌檢測(cè)基因芯片的靈敏度進(jìn)行檢測(cè)如下該基因芯片的檢測(cè)靈敏度經(jīng)過(guò)153次雜交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，0.lng的微量基因組DNA或104cfu/ml純菌樣品中菌落就可保證上述IO種致病菌具有穩(wěn)定、良好的雜交結(jié)果，這說(shuō)明本發(fā)明的基因芯片具有很高的檢測(cè)靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其較佳實(shí)施例的描述，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可以做出各種可能的等同改變或替換，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。序列表〈110〉天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司〈120〉檢測(cè)水產(chǎn)品中重要致病菌的基因芯片和試劑盒〈130>8P13002-CN〈160>30〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>25〈212>DNA〈213〉陽(yáng)性探針序列〈400>1ttgtacacaccgcccgtcacaccat〈210>2〈211>31〈212>DNA16〈213〉用于檢測(cè)化膿性鏈球菌的寡核苷酸探針序列〈400>2ggctccatcaggatacaatcctactaaactt31〈210>3〈211>30〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)化膿性鏈球菌的寡核苷酸探針序列〈400>3cacatggtcagattcctaattttctacaga30〈210>4〈211>28〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)化膿性鏈球菌的寡核苷酸探針序列〈400>4gctaaagcgagcgttgcttagtatccta28〈210>5〈211>29〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的寡核苷酸探針序列〈400>5gcttatgcgagcgcttgacaatctattct29〈210>6〈211>28〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的寡核苷酸探針序列〈400>6taaagcagtatgcgagcgcttgactaaa28〈210>7〈211>30〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的寡核苷酸探針序列〈400>7atgtgaacgtttgacttataaaaatggtgg30〈210>8〈211>27〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的寡核苷酸探針序列〈400>8gaggttctgactacacgatggggctat27〈210>9〈211>25〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)單增李斯特氏菌的寡核苷酸探針序列〈400>9aggcactatgcttgaagcatcgcgc25〈210>10〈211>33〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)單增李斯特氏菌的寡核苷酸探針序列〈400>10gagaggttagtacttctcagtatgtttgttctt33〈210>11〈211>30〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)副溶血弧菌的寡核苷酸探針序列〈400>11aatggttacttcattagaagtgattagctc30〈210>12〈211>26〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)副溶血弧菌的寡核苷酸探針序列〈400>12ccgattagctccaccactgacttcct26〈210>13〈211>28〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)霍亂弧菌的寡核苷酸探針序列〈400>13ttttcgctgagaatgtttaaaaatggtt28〈210>14〈211>27〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)霍亂弧菌的寡核苷酸探針序列〈400>14ctttaagcgttttcgctgagaatgttt27〈210>15〈211>32〈212>DNA18〈213〉用于檢測(cè)奇異變形桿菌的寡核苷酸探針序列〈400>15gccttgcctaaagaaaaagcttcttattat32〈210>16〈211>35〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)奇異變形桿菌的寡核苷酸探針序列〈400〉16gaataactaagctaattcaaatgagttatcttact35〈210>17〈211>31〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)奇異變形桿菌的寡核苷酸探針序列〈400>17ccacccagatagtctttgaaagagacacttt31〈210>18〈211>33〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)奇異變形桿菌的寡核苷酸探針序列〈400〉18朋朋gg3gtggttetecgggtette朋3C3tte33〈210>19〈211>35〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)潘氏變形桿菌的寡核苷酸探針序列〈400>19朋3gg朋c3tttccgat朋g3朋g朋3gctgagte35〈210>20〈211>35〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)潘氏變形桿菌的寡核苷酸探針序列〈400>20gaatagttaagataattcgatgagttattttacct35〈210>21〈211>27〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)潘氏/普通變形桿菌寡核苷酸探針序列〈400>21agcgcacagtcagcgcaacatacatta27〈210>22〈211>27〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)普通變形桿菌的寡核苷酸探針序列〈400>22cccagacgtc3tt朋g朋g3朋catct27〈210>23〈211>27〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)志賀氏菌的寡核苷酸探針序列〈400>23gataatgataccggcgctctgctctcc27〈210>24〈211>30〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)志賀氏菌的寡核苷酸探針序列〈400>24agatagaagtctacctggccttccagacca30〈210>25〈211>26〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)志賀氏菌的寡核苷酸探針序列〈400>25aggaaatgcgtttctatggcgtgtcg26〈210>26〈211>27〈212>DNA〈213〉用于檢測(cè)志賀氏菌的寡核苷酸探針序列〈400>26accatggcatgctgtactgaagcgtac27〈210>27〈211>17〈212>DNA〈213>16S-23SrDNA間區(qū)上游引物〈400>27tgtacacaccgcccgtc17〈210>28〈211>21〈212>DNA20〈213>16S-23SrDNA間區(qū)下游引物〈400>28ggtacttagatgtttcagttc〈210>29<211>17〈212〉DNA〈213〉志賀氏菌ipaH基因上游引物〈400>29tgaccgcctttccgata17〈210>30〈211〉19〈212>DNA〈213〉志賀氏菌ipaH基因下游引物〈400>30gccagtacctcgtcagtca19權(quán)利要求一種檢測(cè)水產(chǎn)品中致病菌的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其特征在于所述固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針包含從以下序列中選取的一種或多種(1)從沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、潘氏變形桿菌的16S-23SrDNA間區(qū)以及志賀氏菌的ipaH毒力基因中選取的DNA序列；(2)上述(1)中選取的DNA序列的互補(bǔ)DNA序列；(3)上述(1)或(2)中選取的DNA序列的互補(bǔ)RNA序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針具有SEQIDN0:2-SEQIDNO:26所示的DNA序列中的一種或多種。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于還包含陽(yáng)性對(duì)照探針、陰性對(duì)照探針或熒光探針。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述陽(yáng)性對(duì)照探針選自細(xì)菌16SrDNA保守區(qū)中的DNA片段或者其互補(bǔ)的DNA或RNA序列。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因芯片，其特征在于所述陽(yáng)性對(duì)照探針具有SEQIDN0:1所示的DNA序列。6.權(quán)利要求5所述的基因芯片的應(yīng)用，其特征在于在檢測(cè)志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、潘氏變形桿菌中至少一種致病菌的應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因芯片的應(yīng)用，其特征在于包含使用檢測(cè)引物，其中所述檢測(cè)引物具有SEQIDN0:27-SEQIDNO:30所示的DNA序列或其互補(bǔ)序列中的至少一種。8.—種試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的基因芯片。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于還包括檢測(cè)引物，其中所述檢測(cè)引物具有SEQIDN0:27-SEQIDNO:30所示的DNA序列或其互補(bǔ)序列中的至少一種。10.權(quán)利要求8或9所述的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于在檢測(cè)志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、潘氏變形桿菌中至少一種致病菌的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及檢測(cè)水產(chǎn)品中重要致病菌的基因芯片和試劑盒，該基因芯片包括固相載體和寡聚核苷酸探針，該寡聚核苷酸探針包含以下序列中選取的一種或多種(1)從沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、潘氏變形桿菌的16S-23SrDNA間區(qū)以及志賀氏菌的ipaH毒力基因中選取的DNA序列；(2)上述(1)中選取的DNA序列的互補(bǔ)DNA序列；(3)上述(1)或(2)中選取的DNA序列的互補(bǔ)RNA序列。利用本發(fā)明的基因芯片和試劑盒檢測(cè)水產(chǎn)品中的致病菌，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性強(qiáng)。文檔編號(hào)C12Q1/14GK101724686SQ200810172398公開(kāi)日2010年6月9日申請(qǐng)日期2008年11月3日優(yōu)先權(quán)日2008年11月3日發(fā)明者劉蕾,曹勃陽(yáng),王敏,王磊申請(qǐng)人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司