pIRES/TgDHFR-TS真核表達(dá)重組質(zhì)粒及其構(gòu)建和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是將剛地弓形蟲二氫葉酸還原酶-胸 苷酸合成酶基因引入到pIRES表達(dá)載體中，構(gòu)建一種新的真核表達(dá)重組質(zhì)粒。本發(fā)明構(gòu)建 的質(zhì)粒能夠通過轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)入弓形蟲速殖子中，通過加入乙胺嘧啶進(jìn)行過表達(dá)穩(wěn)定速殖 子克隆的篩選。
【背景技術(shù)】
[0002] 剛地弓形蟲goflt/ii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，可感染人類和其 他溫血?jiǎng)游?，全球約1/3的人感染弓形蟲。剛地弓形蟲一般為隱性感染，患者無明顯的臨床 癥狀，但其感染孕婦后，常導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)、畸形等異常妊娠結(jié)局，存活者中80%有智 力發(fā)育障礙。先天性弓形蟲病在新生兒中的發(fā)生率高達(dá)1%。?6%。。近年來，隨著醫(yī)源性免 疫抑制、器官移植以及艾滋病患者的增多，弓形蟲病的發(fā)病率有升高的趨勢(shì)，甚至造成致死 性損害。因此，弓形蟲致病基因功能及其致病機(jī)制的研宄，有助于揭示弓形蟲的致病機(jī)理， 同時(shí)為弓形蟲病的防治提供新的思路。
[0003] 目前基因或蛋白質(zhì)功能的研宄通常采用兩種策略，其一是構(gòu)建該基因的真核表達(dá) 重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，篩選出穩(wěn)定表達(dá)該基因的細(xì)胞克隆（overexpression)， 進(jìn)行基因或蛋白質(zhì)的研宄；其二是將該基因從宿主細(xì)胞中敲低（knockdown)或敲除 (knockout)，再研宄該基因的功能。
[0004] 乙胺喃啶（pyrimethamine)是目前治療弓形蟲感染的主要藥物之一，其作用機(jī) 理是通過阻礙二氫葉酸的合成，導(dǎo)致四氫葉酸生成減少，阻止弓形蟲核酸合成，從而達(dá)到 抑制弓形蟲增殖的作用。而在弓形蟲體內(nèi)過表達(dá)二氫葉酸還原酶-胸苷酸合成酶基因 (DHFR-TS)及其編碼的蛋白質(zhì)，可以補(bǔ)償由于乙胺嘧啶作用導(dǎo)致的二氫葉酸合成障礙，繼續(xù) 其生活周期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種pIRES/7y)HFR-TS真核表達(dá)重組質(zhì)粒，以及該重組質(zhì)粒 的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的pIRES/T^DHFR-TS真核表達(dá)重組質(zhì)粒由二氫葉酸還原酶-胸苷酸合 成酶基因T^DHFR-TS片段與表達(dá)載體pIRES重組獲得，具有SEQIDNO. 4所示的核苷酸序 列，所述序列共計(jì)7973bp。本發(fā)明在所述真核表達(dá)重組質(zhì)粒中引入HA標(biāo)簽序列。
[0007] 本發(fā)明所述真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法是設(shè)計(jì)具有SEQIDNO. 1和SEQID NO. 2所示核苷酸序列的引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)方法從弓形蟲速殖子的cDNA中克 隆得到7^DHFR-TS，并將通oI和及I雙酶切的ADHFR-TS基因PCR產(chǎn)物連接在同樣雙 酶切的真核表達(dá)載體pIRES的B克隆位點(diǎn)，構(gòu)建重組的pIRES/T^DHFR-TS真核表達(dá)重組質(zhì) 粒。
[0008] 其中，PIRES是一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的單啟動(dòng)子雙表達(dá)載體，該載體含有兩個(gè)多克 隆位點(diǎn)（A和B)，兩個(gè)多克隆位點(diǎn)之間含有腦炎心肌炎病毒（ECMV)的核糖體內(nèi)插入位點(diǎn) (IRES)，允許兩個(gè)雙順反子mRNA轉(zhuǎn)錄本的同時(shí)高效表達(dá)。在多克隆位點(diǎn)A的上游含有巨細(xì) 胞病毒啟動(dòng)子，可以高效啟動(dòng)兩個(gè)多克隆位點(diǎn)引入基因的轉(zhuǎn)錄。
[0009] 本發(fā)明首先成功克隆了二氫葉酸還原酶-胸苷酸合成酶基因7y)HFR-TS，并將該 基因引入pIRES的多克隆位點(diǎn)B處，構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pIRES/7y)HFR-TS。
[0010] 本發(fā)明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切和序列測序分析表明，載體上7y)HFR-TS 基因讀碼框完整，插入方向正確，并且保留了羧基端的HA標(biāo)簽，便于后期通過檢測HA標(biāo)簽 來判斷7^DHFR-TS的表達(dá)。
[0011] 進(jìn)而，本發(fā)明構(gòu)建的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pIRES/7y)HFR-TS可以作為新的載體，在 其多克隆位點(diǎn)A處引入需要研宄的目標(biāo)基因。具體的，所引入的目標(biāo)基因?yàn)楣蜗x基因，如 SAG、ROP17等基因，轉(zhuǎn)染弓形蟲速殖子后便于進(jìn)一步研宄該基因的功能。
[0012] 通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，將pIRES/7y)HFR-TS真核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì) 胞，RT-PCR和Westernblotting結(jié)果顯示，該基因能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)。
[0013] 乙胺嘧啶可以有效抑制弓形蟲的增殖，在弓形蟲速殖子中引入本發(fā)明所述的真核 表達(dá)重組質(zhì)粒，可以拮抗乙胺嘧啶的作用，使速殖子繼續(xù)增殖。因此，本發(fā)明真核表達(dá)重組 質(zhì)粒pIRES/7y)HFR-TS可以作為一種新的質(zhì)粒載體，將需要研宄的弓形蟲的其他基因引入 速殖子中，通過加入乙胺嘧啶進(jìn)行過表達(dá)感興趣基因穩(wěn)定速殖子克隆的篩選，為進(jìn)一步研 宄目標(biāo)基因在弓形蟲中的功能提供有力的工具支持。
【附圖說明】
[0014] 圖1是pIRES/7y)HFR-TS真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。
[0015] 圖2是弓形蟲DHFR-TS基因的PCR產(chǎn)物。
[0016] 圖中，M:DNA分子標(biāo)記；1 : 7^DHFR-TSRT-PCR產(chǎn)物；2 :陰性對(duì)照。
[0017] 圖3是pIRES/7y)HFR-TS重組質(zhì)粒的菌落PCR和雙酶切鑒定圖。
[0018] 圖中，A:M:DNA分子標(biāo)記；1，2,3,4 :pIRES/7^DHFR-TS菌液PCR產(chǎn)物；5 :陰性對(duì) 照；B:M:DNA分子標(biāo)記；1，2 :pIRES/7^DHFR-TS雙酶切產(chǎn)物。
[0019] 圖4是RT-PCR(A)和Westernblotting(B)檢測pIRES/7y)HFR-TS在HEK293T 細(xì)胞中的表達(dá)。
[0020] 圖中，A:M:DNA分子標(biāo)記；1 :轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞；2 :轉(zhuǎn)染pIRES/7y)HFR-TS的細(xì) 胞；B:1 :轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞；2 :轉(zhuǎn)染pIRES/7y)HFR-TS的細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 本發(fā)明實(shí)施例中使用的構(gòu)建材料和主要試劑的來源。
[0022] 剛地弓形蟲RH株：本實(shí)驗(yàn)室保存，小鼠腹腔接種傳代。真核表達(dá)載體：pIRES，購自 美國Clontech公司。HEK293T細(xì)胞，購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心。大腸埃希菌 DH5a，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0023] 限制性內(nèi)切酶油aI和AfotI，購自寶生物工程(大連）有限公司；Trizol、 HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒、2XEsTaqMasterMix、T4DNA連接酶、瓊脂糖凝膠回 收試劑盒、DL2000DNAMarker、質(zhì)粒小提試劑盒、小鼠抗HA單克隆抗體、小鼠抗0-actin 抗體，購自北京康為世紀(jì)有限公司；預(yù)染蛋白Marker，購自加拿大Fermentas公司；辣根酶 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，購自北京中山金橋有限公司；ECL發(fā)光液，購自北京英格恩公司。