專利名稱：：耐高溫木聚糖酶XynA2和編碼該酶的基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種木聚糖酶，特別涉及在嗜熱脫氮芽孢桿菌(Ceo6acW7"st力e^K^e"^ri/Yca/^)NG80-2中對(duì)木聚糖酶XynA2基因進(jìn)行克隆表達(dá)、功能鑒定以及構(gòu)建大腸桿菌高效表達(dá)的耐高溫木聚糖酶和編碼該酶的基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著當(dāng)今社會(huì)的飛速發(fā)展，人口增長(zhǎng)和資源消耗使得可再生資源的開(kāi)發(fā)與利用成為國(guó)際社會(huì)和學(xué)術(shù)界共同關(guān)注的問(wèn)題。木聚糖是半纖維素的主要組成成份，廣泛分布于高等植物的細(xì)胞壁中，是自然界中一種巨大的可再生生物資源，也是最容易提取、降解和利用的一類半纖維素。木聚糖酶和0-木糖苷酶是降解木聚糖最主要的酶。在能源工業(yè)中，工農(nóng)業(yè)廢棄物中的木聚糖可被木聚糖酶和木糖苷酶轉(zhuǎn)化為木糖，而木糖又可被細(xì)菌及真菌轉(zhuǎn)化成酒精等有價(jià)值的燃料；在造紙工業(yè)的紙漿漂白中，e-木糖苷酶與木聚糖酶協(xié)同作用可以有效提高漂白性能；在醫(yī)藥行業(yè)中，木聚糖酶和木糖苷酶水解特定底物可產(chǎn)生在醫(yī)藥行業(yè)具有重要應(yīng)用價(jià)值的中間轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。因此對(duì)于木聚糖酶和木糖苷酶的研究具有廣泛而重要的用途。半纖維素是僅次于纖維素含量第二豐富的可利用自然資源，半纖維素中的木聚糖(xylan)根據(jù)來(lái)源不同，分枝程度不同，其主鏈和支鏈帶有多種不同的取代基團(tuán)。由于木聚糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，它的完全降解需要多種水解酶的參與共同作用完成。其中的4-內(nèi)切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)是木聚糖降解酶中最關(guān)鍵的酶。該酶以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈內(nèi)部的e-1,4-木糖苷鍵，使木聚糖降解為短鏈的寡聚木聚糖，并有少量木糖生成；而e-D-木糖苷酶(e-xylosidase，EC.3.2.1.37.)則作用于短鏈的寡聚木聚糖，通過(guò)催化寡聚木聚糖的末端來(lái)釋放木糖殘基。木聚糖酶在生物轉(zhuǎn)化、制漿造紙工業(yè)、食品工業(yè)、飼料工業(yè)上等都具有很大的應(yīng)用潛力和價(jià)值。它在自然界廣泛分布，海洋及陸地細(xì)菌、海洋藻類、真菌(包括酵母)、瘤胃和反芻動(dòng)物細(xì)菌、蝸牛、甲殼動(dòng)物、陸地植物組織和各種無(wú)脊椎動(dòng)物中都存在。由于微生物來(lái)源的木聚糖降解酶普遍存在于自然界且種類繁多應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，因此對(duì)于微生物木聚糖酶研究報(bào)道很多。目前，人們研究和應(yīng)用得最多的是細(xì)菌和霉菌來(lái)源的木聚糖酶。木聚糖酶來(lái)源不同，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不盡相同，且其pH適用范圍和最適范圍也各異。一般來(lái)說(shuō)，真菌來(lái)源的木聚糖酶多在酸性條件下具有最大活力，pH最適范圍為4.(f6.0，屬于酸性木聚糖酶；細(xì)菌和放線菌木聚糖酶屬中性或堿性木聚糖酶，其最適pH在6.08.0之間。同時(shí)，木聚糖酶的耐熱性和最適作用溫度也隨其來(lái)源不同而不同。一般而言，真菌來(lái)源的木聚糖酶最適作用溫度在50'C左右，而多數(shù)細(xì)菌和放線菌所產(chǎn)木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度在5(T6(TC之間，耐熱性比真菌木聚糖酶稍好一些。在木聚糖酶研究方面，涉及的嗜熱菌種有白腐菌(Ceri/^ri叩w^5T/力mr歷i5^ora)、(5a"'77wst力enz/a/7tarc"cus)、嗜熱偵!j孢霉(S/arotrz'c/7"歷t力er/nop力"e)、短梗霉(」"reo/7aw'di咖/"W〃Ja/AsATCC20524)、藍(lán)色鏈霉菌(5Yr印t(9歷ycescja/e〃5"SN32)、疏棉狀嗜熱絲孢菌(7力er歷o歷yce517a"〃^7770SfACAU44)、小單胞菌(CW7w7ow.肌'，Zj'咖sp.HY-12)、纖維單胞菌屬(6W7i/7o歷麵s、嗜熱毛殼菌(C力aeto油"力er卿力ii咖)、腸桿菌(￡>tero6actarsp.MTCC5112)、丙酮丁醇梭菌(C7ostrW咖acetoZ"W，ATCC824)、高溫單孢菌(T7e扁yz歸，rasp.)、(CaWAacj77i/sce/7w7oKor朋51)、熱纖梭菌(c7osm't/f脂z^/er歷。ce77咖)、芽孢桿菌(Saw'—7-7jassp.NG-27)、枯草芽孢桿菌(5aci'i7"s6'"力"7isC-01)、嗜熱溶胞芽孢桿菌(feo6a"'77ussp.MT-1)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(feci〃"s/Y」rMis)、耐熱芽孢桿菌(7y/ermoac^z'"o/z7ycest/zaJ;o;力j'JiAs)。關(guān)于木聚糖酶基因最新的專利報(bào)道。國(guó)內(nèi)專利有詹志春報(bào)道了一種木聚糖酶及其基因(第200510018452.3號(hào)，申請(qǐng)日期2005.03.25);袁建國(guó)等人報(bào)道了短小芽孢桿菌(fe^77"wmw'7m)木聚糖酶及其基因(第200510042557.2號(hào)，申請(qǐng)日期2005.03.10);董志揚(yáng)等人分別報(bào)道了短小芽孢桿菌BP19的木聚糖酶及其基因(第02131439.X號(hào)，申請(qǐng)日期2002.10.14)和巴氏畢赤酵母(尸J'c力yaPGX722木聚糖酶及其基因(第200310103246.3號(hào)，申請(qǐng)日期2003.11.03);江正強(qiáng)等人報(bào)道了海棲熱袍菌(7力e/7Ho^卵/Hari"鵬)MSB8木聚糖酶及其基因(第02156022.6號(hào)，申請(qǐng)日期2002.12.11);李穎等人報(bào)道了一種木聚糖酶及其基因(第200310113562.9號(hào)，申請(qǐng)日期2003.11.17);屠俊等人報(bào)道了酵母基因工程菌GS115/HB705木聚糖酶及其基因(第200510018574.2號(hào)，申請(qǐng)日期2005.04.19);宋永霖報(bào)道了里氏木霉(Trichodermareesei)木聚糖酶及其基因(第02823195.3號(hào)，申請(qǐng)日期2002.11.20);張桂敏等人報(bào)道了一種木聚糖酶及其基因(第200610020049.9號(hào)，申請(qǐng)日期2006.08.29);V格羅比爾等人報(bào)道了一種從厭氧嗜熱細(xì)菌獲得熱穩(wěn)定性木聚糖酶及其基因(第95190553.8號(hào)，申請(qǐng)日期1995.06.14)。國(guó)際專利有DeBuyl等人報(bào)道了一種從芽孢桿菌(5acy""ssp.)720/1獲得的木聚糖酶及其基因(第09/909，207號(hào)，申請(qǐng)日期2001.7.19);Sung等人報(bào)道了一種熱穩(wěn)定性木聚糖酶及其基因(第09/856，025號(hào)，申請(qǐng)日期1999.11.16);Bhosle等人報(bào)道了一種從施氏假單胞菌(/^e^yo/Z7o/7asst""eri)獲得的嗜熱耐堿木聚糖酶及其基因(第10/223，852號(hào)，申請(qǐng)日期2002.8.20);Bentzien等人報(bào)道了一種嗜熱耐堿木聚糖酶及其基因(第09/570，856號(hào)，申請(qǐng)日期2000.5.12);Dunlop等人報(bào)道了一種從枯草芽孢桿菌(^3w77mm力"7&)獲得的嗜熱耐堿木聚糖酶及其基因(第09/639，354號(hào)，申請(qǐng)日期2000.4.16);DeBuyl等人報(bào)道了一種從芽孢桿菌(5aw77"ssp.)720/1獲得的寬pH范圍的木聚糖酶及其基因(第08/470,953號(hào)，申請(qǐng)日期1995,6.6);Williams等人報(bào)道了一種從嗜堿性細(xì)菌中獲得的嗜熱耐堿木聚糖酶及其基因(第08/501，126號(hào)，申請(qǐng)日期1995.12.29);Morgan等人報(bào)道了一種從柔曲小四孢菌(Wor"etrs邵ora/7e;nyosa)獲得的嗜熱耐堿木聚糖酶及其基因(第08/732，242號(hào)，申請(qǐng)日期1997.4.7);Gronberg等人報(bào)道了一種嗜熱木聚糖酶及其基因(第08/591,685號(hào)，申請(qǐng)日期1997.2.5);0uttrup等人報(bào)道了一種從嗜堿性芽孢桿菌(5a"77iASsp.)AC13獲得的耐堿木聚糖酶及其基因(第08/470,398號(hào)，申請(qǐng)日期1995.6.6);Vehmaa叩era等人報(bào)道了一種從放線菌(v4cW/7o鵬^/raspp.)獲得的熱穩(wěn)定性木聚糖酶及其基因(第08/468，812號(hào)，申請(qǐng)日期1995.6.6);Rele等人報(bào)道了一種從頭胞菌(Ccp力Wo印oW咖)中獲得的堿性木聚糖酶及其基因(第08/294,068號(hào)，申請(qǐng)日期1994.8.22);Casimir-Schenkel等人報(bào)道了一種從褐色高溫單胞菌(r力e777o歷oyKW/7ara/ksca)中獲得的熱穩(wěn)定性木聚糖酶及其基因(第08/292，147號(hào)，申請(qǐng)日期1994.4.17);Rosenberg等人報(bào)道了一種從嗜熱脂肪芽孢桿菌(泡"〃m"earot力er歷叩/l7"s)NCIMB40221中獲得的嗜熱耐堿木聚糖酶及其基因(第08/063，551號(hào)，申請(qǐng)日期1993.5.18);Campbell等人報(bào)道了一種從環(huán)狀芽孢桿菌(feci7^ascirc"7朋s)中獲得的熱穩(wěn)定性木聚糖酶及其基因(第08/044,621號(hào)，申請(qǐng)日期1993.4.8);Yu等人報(bào)道了一種熱穩(wěn)定性木聚糖酶及其基因(第07/340，307號(hào)，申請(qǐng)日期1989.4.19)等等。盡管關(guān)于木聚糖酶基因的專利報(bào)道有多篇，但從嗜熱脫氮芽孢桿菌中獲得熱穩(wěn)定性木聚糖酶及其編碼的基因尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明人首次公開(kāi)了在嗜熱石油降解細(xì)菌中，采用嗜熱脫氮芽孢桿菌(6^^aw7^^^e77zo(/e/7^ri/yca/7s)NG80-2對(duì)木聚糖酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)、功能鑒定以及構(gòu)建大腸桿菌高效表達(dá)工程菌株。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)和分析，證明本發(fā)明的木聚酶XynA2基因編碼的蛋白與已知的嗜熱脂肪芽孢桿菌(feo力a"77iAsWear"力e/m^/l7"WT6中的編碼木聚糖酶XynA2的基因(GenBankaccessionno.ABI49937)相似性最高(氨基酸序列一致性為87%),但feoZa"77us"earot力erffl叩h7usT6中的木聚糖酶XynA2未進(jìn)行酶活力測(cè)定。與其他已知的木聚糖酶最相似的為土壤芽孢桿菌(6^^a"77"ssp.)MT-1中的木聚糖酶，相似性為86%(GenBankaccessionno.AAZ74783)。該酶屬于GH10族。本發(fā)明木聚糖酶XynA2的氨基酸序列第3位、128位、134位、330位是纈氨酸，第4位、31位、38位、115位、143位、148位、325位是絲氨酸，第5位、308位是谷氨酰胺，第12位、274位、288位、32位2是谷氨酸，第43位是亮氨酸，第60位、74位是精氨酸，第64位、236位是天冬氨酸，第65位、104位、160位、333位是異亮氨酸，第77位、168位、254位、304位是組氨酸，第119位、331位是丙氨酸，第145位是色氨酸，第166位是半胱氨酸，第187位、256位是賴氨酸，第263位是天冬酰胺，第193位、299位是酪氨酸，第194位、218位、278位是蘇氨酸，第295位是甲硫氨酸，第315位是苯丙氨酸。這與6"eo力aw77^ssp.MT-1的木聚糖酶的氨基酸序列不同(見(jiàn)圖12)，因此表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性。對(duì)這個(gè)XynA2基因進(jìn)行了進(jìn)一步功能鑒定，并與"eo力aw77"ssp.MT-1中的木聚糖酶活性進(jìn)行了比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的木聚糖酶XynA2是一種新型的酶，這種酶不但耐高溫，而且熱穩(wěn)定性優(yōu)良，從而完成了本發(fā)明的工作。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一個(gè)目的是公開(kāi)了一種耐高溫重組木聚糖酶XynA2。本發(fā)明另一目的是公開(kāi)了編碼本發(fā)明的木聚糖酶XynA2基因。本發(fā)明再一目的是公開(kāi)了一種表達(dá)木聚糖酶的重組質(zhì)粒，其中至少包括上述的木聚糖酶XynA2的編碼基因。本發(fā)明還一目的是公開(kāi)了一種導(dǎo)入了上述的木聚糖酶XynA2編碼基因，產(chǎn)生木聚糖酶的重組菌，例如含有重組質(zhì)粒的重組菌株H1398。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種編碼木聚糖酶XynA2的基因，該基因具有選自下組的核苷酸序列-a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或b)不同于SEQIDNO:1但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:1所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或c)在嚴(yán)格雜交條件下與所述的a)或b)中的序列雜交，并且編碼具有活性的木聚糖酶核苷酸序列。應(yīng)當(dāng)指出的是，上述提到的術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格條件"在本說(shuō)明書(shū)中的含義是指在該條件下形成了所謂特異雜交而沒(méi)有形成非特異的雜交。例如，該嚴(yán)格條件可以是，相互之間的同源性不小于70%的DNA之間可以雜交而低于上述數(shù)值的DNA之間不能雜交，優(yōu)選的是同源性不少于90%的DNA之間可以雜交。相對(duì)于Southern雜交中普通洗滌條件而言，可以例如為如下的雜交條件將雜交膜置于預(yù)雜交液(O.25mol/L磷酸鈉緩沖液，PH7.0，7%SDS)中，50'C預(yù)雜交30min;棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.0，7%SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，5(TC雜交12hr;棄雜交液，加入洗膜液I(2XSSC和0.1%SDS)，50。C洗膜2次，每次30min;加入洗膜液II(0.5XSSC和0.1%SDS)，50。C洗膜30min。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種木聚糖酶XynA2，該酶具有核苷酸序列編碼的氨基酸序列。或者最好具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或上述中缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸后、并且具有所述木聚糖酶活性的氨基酸序列。本發(fā)明再進(jìn)一步公開(kāi)了重組表達(dá)質(zhì)粒及重組菌，它含有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的基因。所述的重組質(zhì)粒的載體為pET-28a(+)，重組質(zhì)粒為pLW1178。含有重組質(zhì)粒的重組菌株H1380，這些均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增木聚糖酶XynA2中任意片段的引物對(duì)，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，上述木聚糖酶XynA2的最適底物為山毛櫸木聚糖；本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，上述木聚糖酶的反應(yīng)溫度為30-C-10(TC，優(yōu)選7(TC。本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，上述木聚糖酶反應(yīng)pH值為7.6-10.6，優(yōu)選最適反應(yīng)pH值為9.0。本發(fā)明提供的表達(dá)木聚糖酶的重組質(zhì)粒為pLW1178，至少包括上述的木聚糖酶XynA2的編碼基因。本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，上述的重組質(zhì)粒的載體為pET-28a(+)。本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，木聚糖酶的重組菌內(nèi)導(dǎo)入了木聚糖酶XynA2的編碼基因。所述的重組菌為大腸桿菌。優(yōu)選為大腸桿菌BL21菌株。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該知道，本發(fā)明編碼木聚糖酶的DNA序列，還包括編碼對(duì)SEQIDNO:1所示核苷酸序列所表達(dá)的酶分子的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入或缺失并仍具有該酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。另外，對(duì)本發(fā)明的木聚糖酶基因所表達(dá)的酶分子的氨基酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入或缺失所得到的蛋白質(zhì)，也能達(dá)到本發(fā)明的目的。因而本發(fā)明還包括與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少70%的同源性，優(yōu)選具有至少90%的同源性，但同時(shí)具有木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)。上面使用的術(shù)語(yǔ)"多個(gè)"可以是小于IOO的數(shù)目，優(yōu)選為小于10的數(shù)目。本發(fā)明所述的XynA2基因，它是以從嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2中分離的木聚糖酶XynA2(GTNG—1774基因編碼)基因組DNA為模板，根據(jù)XynA2基因全序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，有效地?cái)U(kuò)增出了XynA2基因片段并進(jìn)行拓?fù)?、克隆和DNA序列測(cè)定，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示木聚糖酶XynA2將木聚糖的長(zhǎng)鏈打斷為寡聚木聚糖，然后通過(guò)木糖苷酶將寡聚木聚糖徹底降解(如圖1)。本發(fā)明提出的XynA2和已知的木聚糖酶相比，本發(fā)明提出的XynA2木聚糖酶屬于新型酶，不但耐高溫，而且熱穩(wěn)定性優(yōu)良。目前已公開(kāi)發(fā)表的文章介紹木聚糖酶熱穩(wěn)定性較長(zhǎng)的有嗜熱脂肪芽孢桿菌(feo力acW7"s"ear"力e頂o/^7"s)T6中的木聚糖酶在65。C中能保存10小時(shí)(Khasin，A.，etal,Purificationandcharacterizationofathermostablexylanasefromfec_z'7_Zf/sstearot力ei"歷cip力J'7i/51T—6.Appl.Environ.Microbiol.1993.59:1725-30.);放線菌(5Yre/^o/zycescja/ews)SN32中的木聚糖酶在60。C中倉(cāng)旨保存1小時(shí)(Ni麗e，S.，etal，Purificationandcharacterizationofextracellularxylanasefrom5Yre/to/7yces1cya/2ei/51SN32,Bioresour.Technol.2007.);纖維單胞菌(CeL^/o忍o/asxaiaie朋)中的木聚糖酶在55或60。C中能保存1小時(shí)(Santiago—Herndndez，A.，etal，Purificationandcharacterizationoftwosugarcanebagasse—absorbablethermophilicxylanasesfromthemesophilicCe77w7,腦J脂'《e/a，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2007.34:331-338);陰溝腸桿菌(&teroZactersp.)MTCC5112中的木聚糖酶在50'C中能保存50小時(shí)(Khandeparkax,R.，etal，Purificationandcharacterizationofthermoalkalophilicxylanaseisolatedfromthe^/tero力3"ersp.MTCC5112，Res.Microbiol.2006.157:315-325);出芽短梗霉(J"reo6asJ't/j'"歷p"77"7朋s)ATCC20524中的木聚糖酶在65。C中能保存半小時(shí)(Tanaka，H.，etal，Purificationandpropertiesofafamily-lOxylanasefromJ"i-eo力357W咖/w77i/7s"51ATCC20524andcharacterizationoftheencodinggene,Appl.Microbiol.Biotechnol.2006.70:202-211);堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(&cj77"s/YrM/s)中的木聚糖酶在62'C中能保存16小時(shí)(Chang,P.,etal，Cloningandcharacterizationoftwothermostablexyianasesfromanalkaliphilic5a"77us/Yraus,BiochenuBioph.Res.Co.2004.319:1017-1025);嗜熱芽孢桿菌(fecj77wt力er歷朋ter"ic〃s)中的木聚糖酶在60。C中能保存24小時(shí)(Lama，L,etal,PurificationandcharacterizationofthermostablexyianaseandP—xylosidasebythethermophilicbacterium5aci77i/st力er翻tarc",，Res.Microbiol.2004.155:283-289);丙酮丁醇梭菌("ostrW咖ace"力"Wic柳)ATCC82中的木聚糖酶在60。C中能保存1小時(shí)(Ali，M.K.etal，Thermostablexyl肌ase10BfromC7ostrjW咖scetoZt/0^'c"/zATCC824,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2004.31:229-234);高溫單孢菌(T力e擺羅卿orasp.)中的木聚糖酶在60。C中能保存8小時(shí)(Geore,S.P.，etal,Anovelthermostablexylanasefromr力er歷cyz0/70s/Qrasp.:influenceofadditivesonthermostability,Bioresour.TechnoL2001.78:22卜224);高溫放線菌(r力e層sc"層，st力a7一D中的木聚糖酶在65。C中能保存2小時(shí)(Kohli，U.etal,Thermostable,alkalophilicandcellulasefreexyianaseproductionbyT^er/ffosct/no/Hycest力a7o/力j7iASsubgroupC，EnzymeMicrob.Technol.2001.28:606-610)。本發(fā)明的木聚糖酶XynA2與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果在于與已知的木聚糖酶相比該酶的熱穩(wěn)定性高，且在55'C下孵育24小時(shí)后仍具有5C^以上的活性，在70'C下活性能保存2小時(shí)，在75。C下活性能保存30分鐘。本發(fā)明的木聚糖酶XynA2性能不同于已報(bào)道的木聚糖酶，該木聚糖酶XynA2具有在高溫、高pH條件下保持高活性的特征。木聚糖酶XynA2最適反應(yīng)溫度為7(TC;最適反應(yīng)pH9.0。在堿性環(huán)境中熱穩(wěn)定性好。適合分解半纖維素中的木聚糖生產(chǎn)功能性寡聚木聚糖。圖1是本發(fā)明的木聚糖瞎降解木聚糖作用示意圖2為本發(fā)明實(shí)施例中的木聚糖酶基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建模式圖圖3表示本發(fā)明木聚糖酶SDS-PAGE電泳圖。圖4表示本發(fā)明木聚糖酶對(duì)不同底物的相對(duì)活力。圖5表示本發(fā)明木聚糖酶在不同溫度下的相對(duì)活力。圖6表示本發(fā)明木聚糖酶在不同pH值下的相對(duì)活力。圖7表示本發(fā)明木聚糖酶的在55'C下的熱穩(wěn)定性。圖8表示本發(fā)明木聚糖酶的在7(TC下的熱穩(wěn)定性。圖9表示本發(fā)明木聚糖酶的在75'C下的熱穩(wěn)定性。圖IO表示本發(fā)明木聚糖酶SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。圖11表示本發(fā)明木聚糖酶SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。圖12表示本發(fā)明木聚糖酶XynA2與feo力ac/77w印.MT-1中的木聚糖酶氨基酸序列的比較。具體實(shí)施例方式為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說(shuō)明。下面的具體實(shí)施例僅僅是用于說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例一1.嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2(CGMCCNo.1228)總DNA的提取嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2(CGMCCNo.1228)總DNA的提取研究證明由嗜熱脫氮芽孢桿菌(6"eo力aci77i/s"e/wo^e/H'tri/yca/w)NG80-2基因組能夠分離出編碼醇脫氫酶的基因。因此，在本實(shí)施例中，采用從中國(guó)天津大港油田官69-8區(qū)塊油井地層水分離獲得的嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2(其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCCNo.1228，保藏日期為2004年10月09日，已申請(qǐng)國(guó)內(nèi)發(fā)明專利并獲得授權(quán)，發(fā)明名稱嗜熱脫氮芽孢桿菌及其篩選和應(yīng)用，專利號(hào)ZL200410072759.7),取其過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)物3ml,離心收集菌體，菌體懸于250u150mMTris緩沖液中(pH8.0)，加入lOul0.4MEDTA(pH8.0),混勻后37。C保溫20min，之后加入30u120mg/ml溶菌酶，混勻后37。C再保溫20min，再加入5u120mg/ml蛋白酶K，溫柔混勻后，再加入20!U1(^SDS，5(TC保溫至溶液澄清，分別用等體積酚氯仿:異戊醇抽提兩次，氯仿:異戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于10011lTE緩沖液(pH8.0,10mMTris，lraMEDTA),加入10mg/mlRNase2p1，65。C保溫30min，分別用酚氯仿異戊醇、氯仿異戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50U1TE緩沖液。DNA溶液的紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果為A260/A280=1.95,A260=0.73。2.木聚糖酶基因XynA2的克隆和篩選取嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2(CGMCCNo.1228)總DNA溶液0.5u1(約10ng)作為模板，以下列寡核苷酸序列作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)混合物(50ul)如下ddH20，34ul;10XPCRBuffer,5ul;MgCl2Buffer,5ul;dNTPMix,2ul;上游引物，lul;下游引物，lul;NG80-2基因組DNA，lul;TaqDNApolymerase,lul。引物序列如下上游引物為SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，下游引物為SEQIDNO:4所示的核苷酸序列設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)如下-95。C，5min;95°C，30s;50°C，45s:72°C，2min;72°C，lOmin;4°C，2hr。按上述設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)PCR。上述PCR產(chǎn)物用7Vfco[和Z力ol雙酶切，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收酶切產(chǎn)物片斷。與經(jīng)同樣限制型內(nèi)切酶酶解并切膠回收的質(zhì)粒pET-28a(+)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5a后，涂于含50ug/mlKan(卡那霉素)的LB固體培養(yǎng)基上。37'C培養(yǎng)12小時(shí)，挑取單克隆轉(zhuǎn)接到20mlLB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(50ug/mlKan)，37'C培養(yǎng)12小時(shí)后，提取質(zhì)粒鑒定，插入有SEQIDNO:1的DNA序列的pET-28a(+)質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pLW1178(見(jiàn)圖2)，將重組質(zhì)粒pLW1178轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(該菌株可向天津開(kāi)發(fā)區(qū)厚普生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司訂購(gòu),貨號(hào)為69387-3)中，得到含有該重組質(zhì)粒的重組菌株為H1398,此重組質(zhì)粒pLW1178可高頻轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達(dá)木聚糖酶活性和抗卡那霉素性能。其中的酶切及連接反應(yīng)均參照表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>g10XBuffer3.OpL載體DNA片斷550ng限制性內(nèi)切酶110~20U1OXT4ligasebuffer1限制性內(nèi)切酶21(T20UTi腿ligase10UddH20X總體積lOuL總體積303.XynA2DNA片段的測(cè)定采用Sanger法對(duì)此DNA片段進(jìn)行了測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示PLW1178中的插入片段含有長(zhǎng)1002bp(SEQIDNO:1)的開(kāi)放閱讀框架，編碼由333(SEQIDNO:2)個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。實(shí)施例二重組木聚糖酶的表達(dá)純化和特性將上述重組菌H1398單克隆接入20ml含50ug/mlKan的LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm培養(yǎng)12小時(shí)，然后將培養(yǎng)物按1%(v/v)接種量接入200ml含50iig/mlKan的LB培養(yǎng)基，37°C,220rpm培養(yǎng)至0D600為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.lmM，在37。C、180rpm誘導(dǎo)3小時(shí)。5000rpm離心5min收集菌體，懸于含50mMTris-HC1(pH8.0)緩沖液中，利用超聲波破碎細(xì)胞，14000g離心20min，上清液為醇脫氫酶的粗提液。此上清液經(jīng)螯合瓊脂糖凝膠(ChelatingS印harose)鎳親合柱層析純化，得到的酶制劑在SDS-PAGE上顯示一條帶(見(jiàn)圖3)。利用已知的蛋白質(zhì)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定此酶系的基本特性。用SDS-PAGE測(cè)得的重組酶的分子量為40kDa，與理論上推算的分子量(39027Da)相似；等電點(diǎn)沉淀法測(cè)得的重組酶的等電點(diǎn)pl為5.7。實(shí)施例三1.測(cè)定本發(fā)明木聚糖酶作用于不同來(lái)源的底物時(shí)的比活力將木聚糖酶添加于動(dòng)物飼料或者造紙紙漿中，應(yīng)當(dāng)考慮其對(duì)不同來(lái)源的木聚糖的活性及專一性對(duì)應(yīng)用的影響，燕麥木聚糖作為麥類作物(小麥、黑麥和小黑麥)木聚糖模式底物，山毛櫸木聚糖和樺樹(shù)木聚糖作為木材來(lái)源木聚糖模式底物考察其對(duì)不同來(lái)源木聚糖的比活力。上述實(shí)施例二中制得的木聚糖酶能降解不同來(lái)源的木聚糖，本實(shí)驗(yàn)對(duì)目前可購(gòu)買(mǎi)到的三種木聚糖底物燕麥木聚糖(Sigma貨號(hào)為X0627)、山毛櫸木聚糖(Sigma貨號(hào)為X4252)、樺樹(shù)木聚糖(Sigma貨號(hào)為X0502),進(jìn)行了酶活力檢測(cè)。具體方法為配制木聚糖酶XynA2反應(yīng)體系(100ul)為加入燕麥木聚糖、山毛櫸木聚糖、樺樹(shù)木聚糖底物至終濃度1%(w/v)，一定濃度的木聚糖酶XynA2，用50mMpH9.0的glycine-NaOH緩沖液補(bǔ)至100ul?；靹?，在70'C水浴中反應(yīng)15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴終止反應(yīng)，加入150ul的WDNS試劑(3，5二硝基水楊酸1%;苯酚0.2%;硫酸鈉O.05%;酒石酸鉀鈉20%;氫氧化鈉1%。避光放置兩周后使用。)沸水浴10分鐘，然后在540nm處測(cè)定光吸收。以木糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每分鐘生成lixmol還原糖所需酶量，定義為l個(gè)酶活力單位。測(cè)定結(jié)果參見(jiàn)圖4，從該圖中可以看出，木聚糖酶對(duì)三種不同來(lái)源的商品化木聚糖均能降解，其最適底物為山毛櫸木聚糖。2.測(cè)定本發(fā)明木聚糖酶在不同溫度下的比活力-對(duì)上述實(shí)施例二中制得的木聚糖酶進(jìn)行最適反應(yīng)溫度的測(cè)定，具體方法為配制木聚糖酶XynA2反應(yīng)體系(100ul)為加入燕麥木聚糖底物至終濃度1%(w/v)，一定濃度的木聚糖酶XynA2，用50mMpH9.0的glycine-NaOH緩沖液補(bǔ)至lOOP1?；靹?，分別于25、00'C水浴中反應(yīng)15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴終止反應(yīng)。加入150y1的DNS試劑沸水浴10分鐘，然后在540nm處測(cè)定光吸收。以木糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每分鐘生成lumol還原糖所需酶量，定義為l個(gè)酶活力單位。測(cè)定結(jié)果參見(jiàn)圖5。從該圖中可以看出，木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度約為70'C。3.測(cè)定本發(fā)明木聚糖酶在不同pH下的比活力對(duì)上述實(shí)施例二中制得的木聚糖酶進(jìn)行最適反應(yīng)pH值的測(cè)定，具體方法為配制100u1反應(yīng)體系，底物燕麥木聚糖的終濃度為1%(M/V)，一定濃度的木聚糖酶XynA2，分別用50mMpH3-11.9的緩沖液(配方見(jiàn)表2)補(bǔ)至100u1。混勻，在70'C水浴中反應(yīng)15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴終止反應(yīng)。加入150pl的DNS試劑沸水浴10分鐘，然后在540mn處測(cè)定光吸收。以木糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每分鐘生成1ymol還原糖所需酶量，定義為1個(gè)酶活力單位。測(cè)定結(jié)果參見(jiàn)圖6,從該圖中可以看出，木聚糖酶的pH值為7.6-10.6，優(yōu)選最適反應(yīng)pH值為9.0。這種在堿性范圍內(nèi)穩(wěn)定的特性有利于工業(yè)上應(yīng)用。表2木聚糖酶活測(cè)定中所用的緩沖液pH范圍緩沖液pH3-6citrate—sodiumcitratepH6-8K2HP04-KH2P04pH8-9Tris-HC1pH8.6-10.6glycine-NaOHpH11-11.9Na細(xì)廣NaOH4.測(cè)定本發(fā)明木聚糖酶的熱穩(wěn)定性-對(duì)上述實(shí)施例二中制得的木聚糖酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性的測(cè)定，具體方法為將一定濃度的木聚糖酶XynA2放入55和70"C水浴中溫浴，每隔一小時(shí)取出一部分酶做酶活反應(yīng)。配制木聚糖酶XynA2反應(yīng)體系(100u1)為加入燕麥木聚糖底物至終濃度1%"/"，一定濃度的木聚糖酶XynA2，用50mMpH9.0的Glycine-NaOH緩沖液補(bǔ)至lOOu1?；靹?，在7(TC水浴中反應(yīng)15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴終止反應(yīng)。加入150ul的DNS試劑沸水浴IO分鐘，然后在540nm處測(cè)定光吸收。以木糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每分鐘生成lumol還原糖所需酶量，定義為l個(gè)酶活力單位。測(cè)定結(jié)果參見(jiàn)圖7、8、9。從圖中可以看出，木聚糖酶XynA2在55'C溫浴24小時(shí)后仍保持約5(^的酶活性，在7(TC溫浴2小時(shí)后有2.6%的酶活性，在75°。溫浴30分鐘后有6.3%的酶活性。實(shí)施例四1.將本發(fā)明木聚糖酶XynA2的氨基酸序列與feo力aw77"ssp.MT-1木聚糖酶的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果參見(jiàn)圖12。2.本發(fā)明木聚糖酶XynA2與6"eo力acj77wsstearot力eryzc!p力j7iAST6和CeoZacj7Jw51sp,MT-1中的木聚糖酶各項(xiàng)酶學(xué)參數(shù)均有不同，詳見(jiàn)表3。表3XynA2與6"eO;6acj77i/ssfearot/e77no//j'JiAsT6和Geote"'JJiAssp.MT-1中的木聚糖酶酶學(xué)參數(shù)的比較NG80—2T6MT-1最適反應(yīng)溫度rc)最適反應(yīng)pH707.6未鑒定未鑒定707.0熱穩(wěn)定性55'C溫浴24小時(shí)后仍有5(W以上活性，70'C下未鑒定75'C溫浴30分鐘活性能保存2小時(shí)，75'C下活性能保存30分鐘內(nèi)即失活比活力(U/mg)368.76未鑒定289從圖12和表3可以看出，由于氨基酸的變化，NG80-2中的木聚糖酶XynA2比f(wàn)e"aci77"ssp.MT-l中的木聚糖酶活性更高，更耐堿嗜熱，更具熱穩(wěn)定性。雖然本發(fā)明己以較佳實(shí)施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍所做的更動(dòng)與改進(jìn)，都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表<110>南開(kāi)大學(xué)<120>耐高溫木聚糖酶XynA2和編碼該酶的基因與應(yīng)用<160>4<210>1<211>1002<212>DNA<213>嗜熱脫氮芽孢桿菌(Ge<6fl"7/WAerwfe"http://wyJaHW)NG80-2<220><221>gene<222>(1)..(1002)<400>1atgagcgtgagtcaatcgctcccctccctccgtgaagtatttgcgaatgactttcgcatt60ggagcggcagttaatccggtgaccattgaaagctgttgattagccacgtc120aacagccttacagccgaaaacca±atgaagttcgaacatccttcagccggaagaagggcgg180ttcacgtttgacatcgccgatcgaatcgtcgatttcgctcgttcccatcacatggcggtt240cgcgggcatacgctcgtatgacgccggattgggtgtttcaggatggtcaa300ggtcatttcatcagcagggatgtgttgcttgagcggatgaagtcccacatttctgcagtt360gtacggcggtacaaggggaaagtgtattgctgggatgtggtcaacgaagcggtggctgac420gaggggsgcg祖tggttgcgttcstcga^gtggcgcc站aitcsttggggeicgattttatt480gaacaggcgtttctctgtgctcatgaagccgacccagacgcgttgttgttttacaatgat540tataatgaatgttttccgaaaaaacgcgagaagatctatacactagttaaatctttgcga600gacaaagggattcccattcscggcatcggtatgcaggcgcattggagcctgacgcgcccg660tcattggacgaaattcgagcagccattgaacgatatgcgtctctcgatgtggttcttcac720attacggagcttgatgtatctatgtttgaatttcacgaccatcgcaaggacttagctgcc780cctacaaacgaaatgatcgaacgacaggcagagcggtacg站ca站ttttcsctctattc840aaggagtatcgtgacgtaattgaaagtgtaacattttggggaatggccgatgactatacg900tggctcgatcactttccggtgcaagggagaaaaaactggccatttttgtttgatgaacaa960cacgaaccgaagtcagctttttggagagtggcgagtatct站1002<210>2<211>333bp<212>PRT<213>嗜熱脫氮芽孢桿菌(feo6a"J7〃st力er/zoc/e/n'^ri/Yc朋s)NG80-2<220><221>CHAIN<222>(1)..(333)<400>2MetSerValSerGinSerLeuProSerLeuArgGluValPheAlaAsn151015AspPheArglieGly20LysGinLeuI^eulie35MetLysPheGluHis50lieAlaAspArglie6570ArgGlyHisThrLeu85GinAspGlyGinGly100MetLysSerHislie115TyrCysTrpAspVal130TrpIjeuArgSerSerAlaAlaValAsnProValThrlieGluSerGin2530SerHisValAsnSerLeuThrAlaGluAsnHis4045LeuGinProGluGluGlyArgPheThrPheAsp5560ValAspPheAlaArgSerHisHisMetAlaVal7580ValTrpHisAsnGinThrProAspTrpValPhe9095HisPhelieSerArgAspVall<eulieuGluArg105110SerAlaValValArgArgTyrLysGlyLysVal120125ValAsnGluAlaValAlaAspGluGlySerGlu135140LysTrpArgGinlielieGlyAspAspPhelie145150155160GluGinAlaPheLeuCysAlaHisGluAlaAspProAspAlaLeuLeu165170175PheTyrAsnAspTyrAsnGluCysPheProLysLysArgGluLyslie180185190TyrThrLeuValLysSerLeuArgAspLysGlylieProlieHisGly200205GinAlaHisTrpSerLeuThrArgProSerLeuAspGlu215220AlalieGluArgTyrAlaSerLeuAspValValLeuHis230235240LeuAspValSerMetPheGluPheHisAspHisArgLys245250255AlaProThrAsnGluMetlieGluArgGinAlaGluArg265270PheThrLeuPheLysGluTyrArgAspVallieGlu280285TrpGlyMetAlaAspAspTyrThrTrpLeuAspHis295300GlyArgLysAsnTrpProPheLeuPheAspGluGin310315320SerAlaPheTrpArgValAlaSerlie325330<210>3<211>32bp<212>DNA195lieGlyMet210lieArgAla225lieThrGluAspLeuAla260TyrGluGinlie275SerValThrPhe290PheProValGin305HisGluProLys<213>人工序列<4(,0>3acgaccatggtgagcgtgagtcaatcgctccc32<210>4<211>32bp<212>DNA<213>人工序列<400>4tgcactcgsgtg3tsctcgcC3ctctcc站ss3權(quán)利要求1、一種編碼木聚糖酶XynA2的基因，該基因具有選自下組的核苷酸序列a)SEQIDNO1所示的核苷酸序列；或b)不同于SEQIDNO1但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO1所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或c)在嚴(yán)格雜交條件下與所述的a)或b)中的序列雜交，并且編碼具有活性的木聚糖酶核苷酸序列。2、一種木聚糖酶XynA2，它具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；3、一種重組表達(dá)質(zhì)粒，它含有權(quán)利要求l所述的木聚糖酶XynA2編碼基因。4、權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)質(zhì)粒，所述的重組質(zhì)粒的載體為pET-28a(+)。5、權(quán)利要求l所述的木聚糖酶XynA2編碼基因，其特征在于所述的木聚糖酶于嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2中分離得到。6、權(quán)利要求l所述的木聚糖酶XynA2編碼基因，其特征在于所述的木聚糖酶的最適底物為山毛櫸木聚糖；最適反應(yīng)溫度均為70°C。7、權(quán)利要求1所述的木聚糖酶XynA2編碼基因，其特征在于所述的木聚糖酶pH值為9.08、一種產(chǎn)生木聚糖酶的重組菌，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的木聚糖酶XynA2編碼基因。9、權(quán)利要求8所述的木聚糖酶XynA2的重組菌，其特征在于所述的重組菌為大腸桿菌BL21菌株。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了由嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2基因組DNA借助PCR擴(kuò)增而得到的木聚糖酶XynA2構(gòu)建表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)出該基因編碼的重組木聚糖酶。該酶的最適反應(yīng)溫度為70℃，最適反應(yīng)pH為9.0，在堿性環(huán)境中熱穩(wěn)定性好。適合分解半纖維素中的木聚糖生產(chǎn)功能性寡聚木聚糖。文檔編號(hào)C12N1/21GK101429516SQ20081015307公開(kāi)日2009年5月13日申請(qǐng)日期2008年11月14日優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日發(fā)明者露馮,劉雪倩,磊王申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)