專利名稱：一種高產(chǎn)多糖和三萜類物質(zhì)的茶薪菇菌絲體的液體發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用食用菌茶薪恭生產(chǎn)多糖和三萜類物質(zhì)的液 體發(fā)酵工藝，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是利用生物體的培養(yǎng)、發(fā)酵而 生產(chǎn)已知的，或新的生物體，或其代謝物的技術(shù)。
背景技術(shù)：
茶薪菇(J^racyZ^ M^ri&)為擔子菌綱、糞銹傘科、田頭菇 屬真菌。是一種具有很高開發(fā)價值的珍稀食藥用真菌。食味獨特，營 養(yǎng)豐富，具有祛濕、利尿、健脾胃、明目、抗衰老、降低膽固醇、防 癌和抗癌的特殊功能，還可治療頭暈、頭痛、腹瀉、嘔吐等癥。茶薪 菇近年來在國內(nèi)已進行廣泛人工栽培，但由于人工栽培存在周期長、 成本高、受環(huán)境條件影響大等缺點，在一定程度上限制了對其開發(fā)利 用，而采用液體發(fā)酵技術(shù)是目前深度開發(fā)食用菌活性成分的有效方 法，并已成功在靈芝、香菇、灰樹花等珍稀食藥用菌實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。 有關(guān)茶薪菇液體深層發(fā)酵研究報道較少。已有研究主要集中在茶薪燕 菌絲體生物量、多糖或三萜類物質(zhì)的某一方面的發(fā)酵生產(chǎn)。
還有一些相關(guān)文獻報道茶薪菇液體發(fā)酵方法，但是，其主要生理 活性物質(zhì)均較低，至今尚無成熟的液體發(fā)酵法高產(chǎn)茶薪菇多糖和三萜 類物質(zhì)的方法，因此，盡快開發(fā)研究一種通過液體發(fā)酵法能夠同時高 產(chǎn)茶薪菇多糖和三萜類物質(zhì)的技術(shù)，達到"一罐兩藥"的目的，是人 們所迫切需要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述已有技術(shù)的不足而提供一種達到一 罐兩藥、降低成本，生產(chǎn)產(chǎn)量高的利用食用菌茶薪菇生產(chǎn)多糖和三萜 類物質(zhì)的液體發(fā)酵工藝。
本發(fā)明的目的可以通過如下措施來達到 一種高產(chǎn)多糖和三砲類物質(zhì)的茶薪菇菌絲體的液體發(fā)酵工藝，其特征在于其工藝流程為斜 面菌種活化培養(yǎng)—液體菌種制備~>液體發(fā)酵培養(yǎng)；具體步驟 如下
1、 斜面菌種活化培養(yǎng)將茶薪菇菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基上
活化后，轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，進行斜面菌種的培養(yǎng)，培養(yǎng)溫 度25 3(TC，培養(yǎng)時間5 10天；
2、 液體菌種制備
液體培養(yǎng)基組成馬鈴薯150 250 g/L、葡萄糖15 25g/L、酵 母膏l(xiāng) 5g/L、余量為蒸餾水；pH值自然。
培養(yǎng)條件挑取活化好的斜面菌種接種于三角瓶中，置于搖床中
培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100 180 r/min,溫度25 30。C，時間5 8天；
3、 液體發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖10 20 g/L、蛋白胨1 5 g/L、玉米 粉15 30g/L、大豆粉2 10g/L、余量為蒸餾水；
培養(yǎng)條件將制備的液體菌種接種于三角瓶中，置于搖床中發(fā)酵
培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速100 180 r/min，溫度25 30。C，時間5 8天；
為了進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述的液體培養(yǎng)基組成馬鈴薯
200g/L、葡萄糖20g/L、酵母膏2g/L、余量為蒸餾水。
為了進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖
16g/L、蛋白胨2.93g/L、玉米粉20.93g/L、大豆粉6. 44 g/L、余量
為蒸餾水。
為了進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述的液體菌種制備步驟的培養(yǎng) 條件中500mL三角瓶中裝有液體培養(yǎng)基50 200mL。
為了進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)步驟的培養(yǎng) 條件中500mL三角瓶中裝有液體培養(yǎng)基50 200mL。
為了進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)步驟的培養(yǎng) 條件中初始pH值4 8。
為了進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)步驟的培養(yǎng) 條件中接種量200 800呢濕重/L。 為了進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述的茶薪菇菌種為田頭菇屬真
菌茶薪菇(^roc力eae^/^a)，為普通栽培品種，購自中國普通微 生物菌種保藏中心，編號為CGMCC No. 5. 778。 多糖和三萜類物質(zhì)的提取與測定
從發(fā)酵培養(yǎng)的產(chǎn)物中收集茶薪菇菌絲體，采用常規(guī)的方法分離茶 薪菇多糖和三萜類物質(zhì)。
茶薪菇多糖可通過乙醇沉淀法獲得，三萜類物質(zhì)通過甲醇超聲提 取后經(jīng)過初步純化獲得，采用常規(guī)的分析方法對產(chǎn)物進行分析測試。
本發(fā)明同已有技術(shù)相比可產(chǎn)生如下積極效果本發(fā)明采用液體發(fā) 酵法同時高效生產(chǎn)茶薪菇多糖和三萜類物質(zhì)，且多糖和三萜類物質(zhì)產(chǎn)
量分別達到2. 10g/L以上和842. 51mg/L以上，均高于現(xiàn)有文獻報道 水平，為采用"一罐兩藥"進行工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)；本發(fā)明所篩 選的以玉米粉和大豆粉為主要原料的發(fā)酵培養(yǎng)基有利于進一步降低 工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)成本。
具體實施方式
-
采用的菌種菌種為田頭菇屬真菌茶薪菇(^rocj^eae^77'te)， 為普通栽培品種，購自中國普通微生物菌種保藏中心，編號為CGMCC No. 5.778。茶薪菇菌種還可采用其他普通栽培品種。
實施例1
(1) 斜面菌種活化培養(yǎng)將茶薪菇菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基 上活化后，轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，進行斜面菌種的培養(yǎng)，培養(yǎng) 溫度27'C,培養(yǎng)時間7天。
(2) 液體菌種制備
液體培養(yǎng)基組成馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、酵母膏2g/L、 余量為蒸餾水；pH值自然。
培養(yǎng)條件挑取活化好的斜面菌種3塊，接種于500mL三角瓶中 (裝有液體培養(yǎng)基100mL),置于搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150r/min，溫度 27°C，時間7天。
(3) 液體發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖16 g/L、蛋白胨2. 93 g/L、玉米粉20. 93
g/L、大豆粉6.44g/L，余量為蒸餾水。
培養(yǎng)條件將制備的液體菌種接種于500mL三角瓶中(裝有液體 培養(yǎng)基100mL)，置于搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，初始pH值6，接種量500mg 濕重/L，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度27。C，時間7天；
茶薪菇多糖和三萜類物質(zhì)提取和測定
從發(fā)酵培養(yǎng)的產(chǎn)物中收集茶薪菇菌絲體，菌絲體在45。C干燥至 恒重，研磨成粉末，取100mg，用15mL85Q/d乙醇于6(TC浸提30min， 重復(fù)2次，去除單糖、雙糖、低聚糖等干擾成分，再于沸水浴中浸 提lh。 3000r/min，離心20min，取上清液定容至100mL，濃硫酸 苯酚法測定多糖含量為2. lg/L。
lg樣品中加50mL甲醇超聲提取3h，過濾，上清蒸干，加甲醇定 容至5mL，紫外比色法測定三萜類物質(zhì)含量為842. 51mg/L。
實施例2:
(1) 斜面菌種活化培養(yǎng)將茶薪菇菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基 上活化后，轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，進行斜面菌種的培養(yǎng)，培養(yǎng) 溫度25。C，培養(yǎng)時間10天。
(2) 液體菌種制備
液體培養(yǎng)基組成馬鈴薯150g/L、葡萄糖15g/L、酵母膏l(xiāng)g/L、 余量為蒸餾水；pH值自然。
培養(yǎng)條件挑取活化好的斜面菌種2塊，接種于500mL三角瓶中 (裝有液體培養(yǎng)基50mL)，置于搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度 25°C，時間8天。
(3) 液體發(fā)酵培養(yǎng)-
發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖10g/L、蛋白胨lg/L、玉米粉15g/L、 大豆粉2g/L，余量為蒸餾水。
培養(yǎng)條件將制備的液體菌種接種于500mL三角瓶中(裝有液體 培養(yǎng)基50mL)，置于搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，初始pH值4，接種量200mg濕 重/L，搖床轉(zhuǎn)速IOO r/min，溫度25。C，時間8天；
茶薪菇多糖和三萜類物質(zhì)提取和測定-
從發(fā)酵培養(yǎng)的產(chǎn)物中收集茶薪菇菌絲體，菌絲體在45'C干燥至
恒重，研磨成粉末，取100mg，用15mL8596乙醇于6(TC浸提30min， 重復(fù)2次，去除單糖、雙糖、低聚糖等干擾成分，再于沸水浴中浸 提lh。 3000r/min，離心20min，取上清液定容至100mL，濃硫酸 苯酚法測定多糖含量為1. 60g/L。
lg樣品中加50mL甲醇超聲提取3h，過濾，上清蒸干，加甲醇定 容至5mL，紫外比色法測定三萜類物質(zhì)含量為543. 39mg/L。
實施例3:
(1) 斜面菌種活化培養(yǎng)將茶薪菇菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基 上活化后，轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，進行斜面菌種的培養(yǎng)，培養(yǎng) 溫度3(TC，培養(yǎng)時間5天。
(2) 液體菌種制備
液體培養(yǎng)基組成馬鈴薯250 g/L、葡萄糖25 g/L、酵母膏5g/L、 余量為蒸餾水；pH值自然。
培養(yǎng)條件挑取活化好的斜面菌種4塊，接種于500mL三角瓶中 (裝有液體培養(yǎng)基200mL)，置于搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180r/min，溫度 30°C，時間5天。
(3) 液體發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖16 g/L、蛋白胨2. 93 g/L、玉米粉20. 93 g/L、大豆粉6.44g/L，余量為蒸餾水。
培養(yǎng)條件將制備的液體菌種接種于500mL三角瓶中(裝有液體 培養(yǎng)基200mL)，置于搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，初始pH值8，接種量800mg 濕重/L，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度30。C，時間5天；
茶薪菇多糖和三萜類物質(zhì)提取和測定
從發(fā)酵培養(yǎng)的產(chǎn)物中收集茶薪菇菌絲體，菌絲體在45。C干燥至 恒重，研磨成粉末，取100mg，用15亂85%乙醇于60。C浸提30min， 重復(fù)2次，去除單糖、雙糖、低聚糖等干擾成分，再于沸水浴中浸 提lh。 3000r/min,離心20min,取上清液定容至100mL，濃硫酸 苯酚法測定多糖含量為2. 07g/L。
lg樣品中加50mL甲醇超聲提取3h，過濾，上清蒸干，加甲醇定 容至5mL，紫外比色法測定三萜類物質(zhì)含量為630. 76mg/L。
權(quán)利要求
1、一種高產(chǎn)多糖和三萜類物質(zhì)的茶薪菇菌絲體的液體發(fā)酵工藝，其特征在于其具體步驟如下(1)、斜面菌種活化培養(yǎng)將茶薪菇菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基上活化后，轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，進行斜面菌種的培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25～30℃，培養(yǎng)時間5～10天；(2)、液體菌種制備液體培養(yǎng)基組成馬鈴薯150～250g/L、葡萄糖15～25g/L、酵母膏1～5g/L、余量為蒸餾水；pH值自然。培養(yǎng)條件挑取活化好的斜面菌種接種于三角瓶中，置于搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100～180r/min，溫度25～30℃，時間5～8天；(3)、液體發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖10～20g/L、蛋白胨1～5g/L、玉米粉15～30g/L、大豆粉2～10g/L、余量為蒸餾水；培養(yǎng)條件將制備的液體菌種接種于三角瓶中，置于搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速100～180r/min，溫度25～30℃，時間5～8天，得到茶薪菇菌絲體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)多糖和三萜類物質(zhì)的茶薪菇 菌絲體的液體發(fā)酵工藝，其特征在于所述的液體培養(yǎng)基組成馬鈴薯 200g/L、葡萄糖20g/L、酵母膏2g/L、余量為蒸餾水。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)多糖和三萜類物質(zhì)的茶薪菇 菌絲體的液體發(fā)酵工藝，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖 16g/L、蛋白胨2.93g/L、玉米粉20.93g/L、大豆粉6. 44 g/L、余量為蒸餾水。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)多糖和三萜類物質(zhì)的茶薪菇 菌絲體的液體發(fā)酵工藝，其特征在于所述的液體菌種制備步驟的培養(yǎng) 條件中500mL三角瓶中裝有液體培養(yǎng)基50 200mL。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)多糖和三萜類物質(zhì)的茶薪菇菌絲體的液體發(fā)酵工藝，其特征在于所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)步驟的培養(yǎng)條件中500mL三角瓶中裝有液體培養(yǎng)基50 200mL。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)多糖和三萜類物質(zhì)的茶薪菇 菌絲體的液體發(fā)酵工藝，其特征在于所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)步驟的培養(yǎng)條件中初始pH值4 8。 ，
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)多糖和三萜類物質(zhì)的茶薪菇 菌絲體的液體發(fā)酵工藝，其特征在于所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)步驟的培養(yǎng)條件中接種量200 800mg濕重/L。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用食用菌茶薪菇生產(chǎn)多糖和三 萜類物質(zhì)的液體發(fā)酵工藝，其特征在于所述的茶薪菇菌種為田頭菇屬 真菌茶薪菇"^rocj^eaegen'ta)，為普通栽培品種，購自中國普通 微生物菌種保藏中心，編號為CGMCCNo. 5.778。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種高產(chǎn)多糖和三萜類物質(zhì)的茶薪菇菌絲體的液體發(fā)酵工藝，該工藝包括斜面菌種活化培養(yǎng)、液體菌種制備、液體發(fā)酵培養(yǎng)，該工藝以葡萄糖、玉米粉為碳源，以蛋白胨、大豆粉為氮源，采用液體好氧發(fā)酵方法進行生產(chǎn)，可以同時獲得茶薪菇多糖和三萜類物質(zhì)，茶薪菇多糖和三萜類物質(zhì)產(chǎn)量高達2.10g/L以上和842.51mg/L以上，本發(fā)明所述方法工藝簡單，可達到“一罐兩藥”的目的，是一種極具工業(yè)化前景的生產(chǎn)方法。
文檔編號C12N1/14GK101353680SQ200810138570
公開日2009年1月28日 申請日期2008年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月21日
發(fā)明者張桂春, 李杏偉, 玥 王, 王淑芳, 程顯好, 高興喜 申請人:魯東大學