專利名稱：：一種生產(chǎn)蟲(chóng)草素的方法及高產(chǎn)蛹蟲(chóng)草菌株byb-08的選育與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種蟲(chóng)草素的生產(chǎn)方法以及用于該方法的蛹蟲(chóng)草菌株的選育與應(yīng)用。技術(shù)背景蛹蟲(chóng)草[Cor辦"戸w邊'/"&]，又名北冬蟲(chóng)夏草(簡(jiǎn)稱北蟲(chóng)草)、蠶蟲(chóng)草，屬子囊菌亞門(mén)(/4，附戸"—核菌綱CP戸wo附拜to)球殼目(S//am'w/ey)麥角菌禾斗(C7a順c//,flfceae)蟲(chóng)草屬(Coe辦ce戸)，是我國(guó)名貴中藥材之一。蛹蟲(chóng)草無(wú)性型是蛹蟲(chóng)草擬青霉(Paec"o，cesm!7ton'sLiang)，其無(wú)性型在單孢子菌株水平上，菌落特征、有性子實(shí)體形成能力、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等方面差異較大。蛹蟲(chóng)草和冬蟲(chóng)夏草[Cora[yce戸w'"ew^(Berk.)Sacc.]都是蟲(chóng)草屬真菌的模式種，是由子座與菌核(即昆蟲(chóng)蛹或幼蟲(chóng)的尸體部分)兩部分組成的復(fù)合體。蛹蟲(chóng)草宿主主要是鱗翅目蠶蛾科、舟蛾科、天蠶蛾科等科的昆蟲(chóng),這些昆蟲(chóng)冬季蟄居土里,菌類(lèi)寄生其中吸收營(yíng)養(yǎng)，最后昆蟲(chóng)體內(nèi)充滿菌絲而死亡。春末夏初氣溫轉(zhuǎn)暖后,從其尸體上長(zhǎng)出子座，形似草，夏至前后采集菌核和子座復(fù)合體而得。主要分布在吉林、遼寧、陜西、廣東等地。除我國(guó)之外，亞洲、歐洲、北美洲等很多國(guó)家和地區(qū)都有分布。國(guó)內(nèi)外報(bào)道蟲(chóng)草種類(lèi)計(jì)300多種，我國(guó)有57種以上，是蟲(chóng)草資源分布最多最廣的國(guó)家之一。中醫(yī)常用的冬蟲(chóng)夏草主產(chǎn)于我國(guó)青海、云貴高原、橫斷山脈及祁連山等高寒灌叢或草甸地帶，然而其產(chǎn)量卻極為有限。國(guó)內(nèi)外對(duì)冬蟲(chóng)夏草雖作了多方面的培養(yǎng)研究，但至今未能實(shí)現(xiàn)有效的子實(shí)體人工培養(yǎng)及規(guī)?；a(chǎn)。國(guó)內(nèi)外對(duì)已經(jīng)成功誘導(dǎo)形成的蟲(chóng)草子實(shí)體研究表明，蛹蟲(chóng)草食用和藥用價(jià)值可與天然冬蟲(chóng)夏草相媲美，不僅具有營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)功能，而且能有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)和病毒繁殖，并具有其它多種藥用功能，而蛹蟲(chóng)草中的蟲(chóng)草素含量遠(yuǎn)高于冬蟲(chóng)夏草中蟲(chóng)草素的含量，是冬蟲(chóng)夏草最理想的替代品，這一發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致世界各地對(duì)蛹蟲(chóng)草的需求量激增，但野生蛹蟲(chóng)草與野生冬蟲(chóng)夏草一樣，在自然界中極為稀少且價(jià)格昂貴。液體深層發(fā)酵培養(yǎng)可以有效提高蛹蟲(chóng)草代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，如初級(jí)代謝產(chǎn)物(氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、核酸、類(lèi)脂、多糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等)和次級(jí)代謝產(chǎn)物(抗菌素、生物堿、色素、植物生長(zhǎng)因子等)。這兩大類(lèi)物質(zhì)在營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)藥上都有重要作用，特別是蟲(chóng)草素所具有的對(duì)人體抗腫瘤細(xì)胞和治療白血病的功效，被許多醫(yī)學(xué)研究所證實(shí)，其治療白血病的功能在美國(guó)已經(jīng)進(jìn)入第三期臨床驗(yàn)證。如果從藥用菌子實(shí)體中提取代謝產(chǎn)物，不僅生產(chǎn)環(huán)節(jié)多，耗時(shí)多，而且成本高，產(chǎn)量底，而液體培養(yǎng)可以克服以上缺點(diǎn)。因此，人工培育具有自然形態(tài)的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體和液體培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草菌絲體發(fā)酵液具有特殊意義。由于蟲(chóng)草素將有可能投入藥用，其需求量的上升將給蟲(chóng)草素的生產(chǎn)帶來(lái)契機(jī)。國(guó)內(nèi)已有的生產(chǎn)蟲(chóng)草素的專利中，申請(qǐng)?zhí)枮?1124109.8的專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)蟲(chóng)草素的方法，利用20L生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蟲(chóng)草素，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量為7.1嗎/L。由于該文獻(xiàn)沒(méi)有公開(kāi)用于發(fā)酵的菌株來(lái)源，也沒(méi)有提交用于專利程序的生物材料樣品的保藏，導(dǎo)致該專利申請(qǐng)公開(kāi)不充分。申請(qǐng)?zhí)枮?1133167.7的生產(chǎn)蟲(chóng)草素的專利文獻(xiàn)，涉及一種液體培養(yǎng)蟲(chóng)草菌體及利用其培養(yǎng)液制備蟲(chóng)草素的方法，但該申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)未說(shuō)明液體培養(yǎng)基中蟲(chóng)草素的含量，人們無(wú)法評(píng)價(jià)其發(fā)明效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，研制一種提高蟲(chóng)草素產(chǎn)量的生產(chǎn)方法以及選育用于該方法的蛹蟲(chóng)草菌株。本發(fā)明還包括將本發(fā)明選育的蛹蟲(chóng)草菌株應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)蟲(chóng)草素及其制品生產(chǎn)上。本發(fā)明的特點(diǎn)是采用深層發(fā)酵培養(yǎng)和表層靜止發(fā)酵培養(yǎng)相結(jié)合的發(fā)酵方法提高蟲(chóng)草素的產(chǎn)量。本發(fā)明的方法能很好地控制蛹蟲(chóng)草菌絲體的生長(zhǎng)及代謝過(guò)程，以達(dá)到縮短培養(yǎng)周期，降低成本，從而有效提高了發(fā)酵液中蟲(chóng)草素的含量。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種生產(chǎn)蟲(chóng)草素的方法，采用液體深層發(fā)酵和表層發(fā)酵相結(jié)合的方法進(jìn)行發(fā)酵，其步驟如下(1)將保藏號(hào)為CCTCCNO:M207091的蛹蟲(chóng)草菌株BYB-08，接種于固體培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，于2028'C避光培養(yǎng)15d，再用散射光培養(yǎng)5d，用無(wú)菌水洗下分生孢子制成分生孢子懸液，備用；(2)將步驟(1)得到的分生孢子懸液接入發(fā)酵罐的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量按孢子懸液與液體培養(yǎng)基體積比為12%的量接入；(3)按照所述的液體深層發(fā)酵和表層發(fā)酵相結(jié)合的方法培養(yǎng)步驟(2)的培養(yǎng)物在發(fā)酵培養(yǎng)起始階段，控制發(fā)酵罐通氣量為120170ml/min，攪拌速度為150rpm200rpm，溫度為23°C27°C，培養(yǎng)34d后，待發(fā)酵液中還原糖濃度為0.050.09g/L時(shí)停止深層攪拌發(fā)酵，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至容器口蓋有滅菌紗布的廣口容器中，控制發(fā)酵溫度為2327'C，靜止表層發(fā)酵1620d后停止發(fā)酵，得到含蟲(chóng)草素的發(fā)酵原液；(4)將步驟(3)得到的蟲(chóng)草素發(fā)酵原液以3000rpm，25。C離心30分鐘，取上清液，將該上清液經(jīng)減壓濃縮至發(fā)酵原液體積的1/10左右，加入3倍體積的95%乙醇，去除其中的沉淀物，將剩余的發(fā)酵原液貯藏在2'C條件下，采用5000rpm離心10min后取上清，再經(jīng)減壓蒸出乙醇，將其濃縮至發(fā)酵原液體積的1/5左右，除去其中的蛋白，得到初步提純的蟲(chóng)草素溶液，其中步驟(1)所述的固體培養(yǎng)基組分為(按重量體積計(jì))馬鈴薯浸出粉20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，KH2P04lg，MgSO40.5g，VB110mg，瓊脂粉20g，補(bǔ)充自來(lái)水至lOOOml，調(diào)pH步驟(2)在發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基按照重量體積計(jì)為葡萄糖2%，豆粕8%，馬鈴薯浸出粉2%，腺苷0.6%，KH2P040.2%，MgS040.1%,補(bǔ)充自來(lái)水至100%，調(diào)pH至6.57.0，備用。為了獲得高產(chǎn)蛹蟲(chóng)草菌株，申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)獲得了1株蛹蟲(chóng)草菌株(Cor辦cre;wm,7/ton'"BYB-08，該菌株于2007年6月29日送交中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(英文簡(jiǎn)稱；CCTCC)保藏，獲得保藏號(hào)為CCTCCNO:M207091(具體選育方法參見(jiàn)實(shí)施例)。蛹蟲(chóng)草菌株BYB-08的生物學(xué)特征菌絲管狀、無(wú)色、透明、有隔，菌絲體頂端可形成分生孢子梗，分生孢子球形或橢圓形，表面有刺狀突起，2x3.2|iimxl.53|_un，分生孢子梗獨(dú)生或在輪生部上分枝，3040|iimxl2pm，前端稍膨大。在蛹蟲(chóng)草栽培培養(yǎng)基(大米50g，蛋白胨15.625g，葡萄糖20g，酵母膏6.25g，馬鈴薯200g，加水定容至1000mL)上，菌落白色，見(jiàn)光后轉(zhuǎn)色呈淡黃或橙黃。菌絲體長(zhǎng)滿栽培瓶后，每天10h以上200lux左右光照，同時(shí)給予不少于6h的IO'C以上的溫差刺激時(shí)，菌絲體開(kāi)始分化扭結(jié)形成原基，原基繼續(xù)生長(zhǎng)形成子座。子座單生或叢生，橙黃色，幼嫩的子座呈圓錐狀，成熟的子座呈棒狀，多為雙叉分枝，常有縱溝或略扭曲，粗壯，生長(zhǎng)整齊，長(zhǎng)20100mm，粗0.54.5mm，平均鮮重0.41g，平均長(zhǎng)度4.2cm。子實(shí)體子座上部外圍有子囊殼環(huán)狀排列，子囊殼突出呈卵形或瓶型，孔口向外半埋生于子座中，側(cè)壁由擬薄壁組織形成，厚1020pm。子囊殼內(nèi)有多個(gè)圓柱形子囊，18個(gè)子囊孢子在子囊內(nèi)線狀排列，多隔，成熟后斷裂成次生子囊。在人工栽培條件下，成熟的子座外周會(huì)長(zhǎng)出許多白色營(yíng)養(yǎng)菌絲。上述蛹蟲(chóng)草菌株BYB-08已經(jīng)成功地應(yīng)用本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)中，獲得良好的生產(chǎn)效果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下積極效果申請(qǐng)?zhí)枮?1124109.8的發(fā)明是利用20L生物反應(yīng)器中大規(guī)模生產(chǎn)蟲(chóng)草素，發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量為7.1pg/L。本發(fā)明生產(chǎn)的發(fā)酵原液中，蟲(chóng)草素的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)用其它培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基發(fā)酵獲得發(fā)酵原液中蟲(chóng)草素的含量，所獲得的發(fā)酵原液中蟲(chóng)草素產(chǎn)量達(dá)到3028pg/mL。與申請(qǐng)?zhí)枮?1124109.8的方法的產(chǎn)量相比，本發(fā)明發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量是其專利文獻(xiàn)所報(bào)導(dǎo)的420多倍，是蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲(chóng)草素取得的重大突破。圖l:本發(fā)明的技術(shù)路線圖；圖2:是本發(fā)明制備的蛹蟲(chóng)草53個(gè)原生質(zhì)體再生菌株酯酶同工酶模式圖。圖2A是蛹蟲(chóng)草親本菌株NO4(SHN4)、N08(B1-0I)和25個(gè)原生質(zhì)體再生菌株酯酶同工酶模式圖，圖2B是蛹蟲(chóng)草28個(gè)原生質(zhì)體再生菌株酯酶同工酶模式圖；圖3:是本發(fā)明先U備的引物P6對(duì)蛹蟲(chóng)草53個(gè)原生質(zhì)體再生菌株P(guān)CR擴(kuò)增的結(jié)果。圖M是引物PG對(duì)蛹蟲(chóng)草親本菌株N04(SHN4)、N08(B1-01)和26個(gè)原生質(zhì)體再生菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果,圖3B是引物P6對(duì)蛹蟲(chóng)草親本菌株N04(SHN4)、N08(B1-01)和31個(gè)原生質(zhì)體再生齒株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果；圖4:是本發(fā)明制備的蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品及菌株BYB-08菌絲體的HPLC色譜圖。圖4A是蟲(chóng)草素標(biāo)樣HPLC色譜圖，圖4B是菌株BYB-08HPLC色譜圖；圖5:蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖6:本發(fā)明的實(shí)施例中表層發(fā)酵時(shí)間對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響；圖7:本發(fā)明的實(shí)施例中深層發(fā)酵時(shí)間對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響；圖8:蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖；圖9:本發(fā)明實(shí)施例中不同發(fā)酵階段蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中腺苷和蟲(chóng)草素含量的色譜對(duì)照?qǐng)D；圖10:本發(fā)明實(shí)施例中發(fā)酵終止時(shí)蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液的高效液相色譜圖；圖11:本發(fā)明實(shí)施例中不同發(fā)酵初始pH對(duì)蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量的影響。具體實(shí)施方法實(shí)施例1:蛹蟲(chóng)草高產(chǎn)菌株BYB-08的選育本發(fā)明生產(chǎn)工藝所用的菌株為申請(qǐng)人所在的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用真菌研究所采用滅活原生質(zhì)體融合法選育的1株高產(chǎn)蛹蟲(chóng)草菌株，申請(qǐng)者將該菌株命名為BYB-08。該株蛹蟲(chóng)草菌株(Cw辦ce;w7w7z'to&)BYB-08于2007年6月29日送交中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，獲得保藏號(hào)為CCTCCNO:M207091。具體步驟如下(1)原生質(zhì)體融合親本菌株篩選從全國(guó)各地收集9個(gè)蛹蟲(chóng)草菌株，分別編號(hào)為NOlN09。制備以下培養(yǎng)基(1)菌絲體培養(yǎng)基(配方如下葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏20g，MgS04-7H200.5g，KH2P040.46g，K2HP(V3H20l.Og，瓊脂18g，補(bǔ)充自來(lái)水至1000mL，pH6.57.5)，(2)栽培培養(yǎng)基(容量為1.5L的玻璃瓶每瓶裝商品大米50g，蛋白胨15.625g，葡萄糖20g，酵母膏6.25g，馬鈴薯200g，補(bǔ)充自來(lái)水至1000mL，pH6.57.5)，(3)固體再生培養(yǎng)基(配方麥芽糖10g,葡萄糖4g，酵母粉4g，瓊脂18g，補(bǔ)充蒸餾水至1000ml;穩(wěn)滲劑為0.6M蔗糖；硫酸鏈霉素和青霉素鈉各5萬(wàn)單位，pH6.57.5)，(4)半固體再生培養(yǎng)基(配方同上述固體再生培養(yǎng)基，但瓊脂含量減半，pH6.57.5)進(jìn)行栽培(按照常規(guī)濕熱滅菌法滅菌，即在12rC高壓蒸汽下滅菌40分鐘至1小時(shí))，觀察其農(nóng)藝性狀，并釆用通用的高效液相法(HPLC)測(cè)定菌絲體胞內(nèi)蟲(chóng)草素、腺苷和尿苷的含量。結(jié)果表明蛹蟲(chóng)草菌株SHN4(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供)原基分化早，分化率高；菌株B1-01(貴州大學(xué)真菌資源研究室提供)子實(shí)體粗壯、生長(zhǎng)整齊，蟲(chóng)草素及胞內(nèi)糖含量高于其它菌株。因此選定SHN4和Bl-Ol菌株作為滅活原生質(zhì)體的親本。(2)滅活原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體的親本菌株酶解條件和融合條件按參考文獻(xiàn)(LiangZR，AnMP，TongZYPolarizedprotoplastfosionbetweenP/ewrafiwsq/orca/wandiSt/H.zo//^//w;co/w附wrte[7].Mycosystema.2001.20(1):Ul115);菌株SHN4采用紫外線G0W紫外燈，置于距超凈工作臺(tái)臺(tái)面上原生質(zhì)體懸浮液30cm處)滅活8min，將菌株Bl-Ol采用60。C熱水浴滅活14min。將濃度為108個(gè)/ml的兩個(gè)親本菌株滅活原生質(zhì)體懸浮液等量混合，3000rpm離心10分鐘，去上清液，加30°/。PEG(聚乙二醇)，3(TC保溫10min;再加Ca2+緩沖液(0.05MCaCl22H20，0.05M氨基乙酸，0.6M蔗糖，pH79)稀釋，靜置15min，3000rpm離心10min，去上清液，滲透壓穩(wěn)定劑(0.6MMgSO4)洗滌沉淀3次，加適量滲透壓穩(wěn)定劑(0.6MMgS04)懸浮沉淀后培養(yǎng)。滅活原生質(zhì)體融合后，25。C培養(yǎng)4d，隨機(jī)挑取228個(gè)再生菌株。(3)融合子鑒定采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和ISSRPCR反應(yīng),對(duì)再生菌株進(jìn)行融合子鑒定，篩選出真正的融合子。聚丙烯酰胺凝膠電泳采用濃縮膠5.0%，分離膠8.0%，菌絲體培養(yǎng)20d，操作方法參照邊銀丙等報(bào)道的方法(邊銀丙等，木耳栽培菌株酯酮同工酶的酶譜多樣性研究m，菌物系統(tǒng),2000,19(1):9196)。將隨機(jī)挑取的228個(gè)再生菌株進(jìn)行酯酶同工酶電泳分析，同時(shí)具有親本菌株SHN4和Bl-Ol特有帶Rf0.225和Rf0.75的再生菌株共53個(gè)菌株。根據(jù)酯酶同工酶酶譜，初步判定這53個(gè)再生菌株為融合子(見(jiàn)圖2A,圖2B)。ISSRPCR反應(yīng)條件與唐利華等報(bào)道的方法(參見(jiàn):唐利華，肖揚(yáng)，邊銀丙，黑木耳ISSRPCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化[J]，菌物研究，2005，3(4):1518)基本相同，但每條引物擴(kuò)展時(shí)退火溫度不同，采用的13條ISSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物的序列和退火溫度見(jiàn)表l。表1供試的13條引物編號(hào)及序列引物編號(hào)序列(5'—3')sequenceTm('C)P3GAGAGAGAGAGAGAGAT52.2P4GAGAGAGAGAGAGAGAC54.6P5AGAGAGAGAGAGAGAGG54.6P6AGAGAGAGAGAGAGAGC54.6P9GSGGTGTGTGTGTGTGTGT50.8P10AGAGAGAGAGAGAGAGT52.2P16TCTCTCTCTCTCTCTCC54.6P21AGAGAGAGAGAGAGAGYA52.7P22AGAGAGAGAGAGAGAGYC55.0P25GAGAGAGAGAGAGAGAYC55.0P26GAGAGAGAGAGAGAGAYT52.7P27GAGAGAGAGAGAGAGAYG55.0P30GAGAGAGAGAGAGAGAA54.6選用P6、P22、P27等3條能同時(shí)擴(kuò)增出親本特有帶的引物，對(duì)初篩的53個(gè)菌株進(jìn)行ISSRPCR反應(yīng)，根據(jù)兩個(gè)親本特有擴(kuò)增帶的有無(wú)，從分子水平上對(duì)53個(gè)初篩菌株進(jìn)行融合子鑒定。引物P6對(duì)53個(gè)初篩菌株擴(kuò)增結(jié)果顯示，20個(gè)菌株同時(shí)具有親本SHN4和Bl-01的特異帶(圖3A,圖3B)。ISSRPCR分析與酯酶同工酶酶譜分析相結(jié)合，鑒定出26個(gè)再生菌株是真正的融合子。(4)融合子蟲(chóng)草素含量測(cè)定對(duì)生長(zhǎng)良好的原生質(zhì)體融合再生菌株進(jìn)行蟲(chóng)草素含量分析。樣品處理及高效液相色譜條件參考文獻(xiàn)(鞠建明等，HPLC測(cè)定冬仙膠囊中蟲(chóng)草素的含量[J].中成藥，2005，27(2)Vol.27,No.2:215216.)進(jìn)行。采用Varian高效液相色譜儀，依利特高效液相色譜柱SinoChromODSBP;蟲(chóng)草素標(biāo)樣購(gòu)于sigma公司。蟲(chóng)草素含量測(cè)定結(jié)果顯示，融合子中有部分菌株蟲(chóng)草素含量低于和近似于兩個(gè)親本菌株，部分融合子蟲(chóng)草素含量高于親本菌株B1-01，其中BYB-08是所有融合子和親本菌株中蟲(chóng)草素含量最高的菌株(見(jiàn)圖4B)。實(shí)施例2:本發(fā)明的菌株應(yīng)用于蟲(chóng)草素的生產(chǎn)舉例(1)菌種制備采用固體培養(yǎng)基制備菌種(菌株為本發(fā)明選育的蛹蟲(chóng)草菌BYB-08，保藏號(hào)為CCTCCNO:M207091)。該培養(yǎng)基的組分及配比為(按照重量體積計(jì))馬鈴薯浸出粉(購(gòu)自商品)20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，KH2P04lg,MgSO40.5g，VBdOmg,瓊脂粉20g，補(bǔ)充自來(lái)水至1000ml，調(diào)pH至6.57.5。按照常規(guī)方法在12rC高壓蒸汽滅菌45分鐘1小時(shí)，備用。在每個(gè)滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中倒入滅菌的上述培養(yǎng)基20ml，待凝固冷卻后接入大小為lci^左右的保藏號(hào)為CCTCCNO:M207091的蛹蟲(chóng)草菌株BYB-08菌絲塊；將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中于20。C28。C(優(yōu)選溫度為2225X:)避光培養(yǎng)15d，再用散射光條件下培養(yǎng)5d，待菌絲體由白轉(zhuǎn)變成金黃色，用無(wú)菌水洗下分生孢子后,配制成均勻的分生孢子懸液作為發(fā)酵培養(yǎng)的菌種，調(diào)節(jié)孢子懸液中分生孢子數(shù)達(dá)到每毫升3.2><109個(gè)，將上述孢子懸液置051:冰箱中保藏備用。(2)液體發(fā)酵罐中培養(yǎng)基制備與液體深層發(fā)酵培養(yǎng)將上述制備好的蛹蟲(chóng)草分生孢子懸液接入5L發(fā)酵罐(培養(yǎng)基的實(shí)際裝量按3L發(fā)酵罐的容量計(jì))，接種量按分生孢子懸液占液體培養(yǎng)基體積的12%的量接種到液體培養(yǎng)基中。在發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基配方為(按照重量體積計(jì))葡萄糖2%，豆粕8%，馬鈴薯浸出粉2%，腺苷0.6%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，補(bǔ)充自來(lái)水至100%，調(diào)pH至6.57.0，備用o為了提高本發(fā)明中蟲(chóng)草素的產(chǎn)量，申請(qǐng)人研制了一種液體深層發(fā)酵和表層發(fā)酵相結(jié)合的方法生產(chǎn)蟲(chóng)草素。具體步驟是在發(fā)酵培養(yǎng)起始階段，控制發(fā)酵罐通氣量為120ml/min170ml/min，攪拌速度控制為150rpm200rpm，溫度控制為23°C27°C，培養(yǎng)34d。待發(fā)酵液中還原糖濃度為Q.050.09g/1時(shí)，停止深層攪拌發(fā)酵，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至容器口蓋有滅菌紗布的廣口容器中，控制發(fā)酵溫度為23'C27。C,靜止表層發(fā)酵16d20d后停止發(fā)酵，得到含蟲(chóng)草素的發(fā)酵原液.(3)蟲(chóng)草素發(fā)酵原液的初步分離用商購(gòu)的大型離心機(jī)將上述步驟得到的發(fā)酵原液用3000rpm離心機(jī)在25。C下離心30分鐘，取上清液。將該上清液采用SHZ-D(m)循環(huán)水式真空泵(鄭州市亞榮儀器有限公司生產(chǎn)，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作)，進(jìn)行抽真空減壓蒸發(fā)，濃縮至發(fā)酵原液原體積的1/10左右時(shí)，再加入3倍體積的95%乙醇沉淀出其中的多糖等物質(zhì)，并將除去沉淀的發(fā)酵原液置4'C冰箱中靜置過(guò)夜；然后將冰箱貯藏的發(fā)酵液在4'C條件下，采用5000rpm離心10min后，取上清，再采用SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(鄭州市亞榮儀器有限公司生產(chǎn)，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作)，進(jìn)行減壓蒸發(fā)，蒸溜出乙醇；最后將該發(fā)酵液濃縮至發(fā)酵原液體積的1/5左右，得到最終濃縮液。用Sevage法(參見(jiàn)文獻(xiàn)李衛(wèi)旗等，啤酒酵母中P-(1-3)葡聚糖的提取及其性能分析[J]，浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，26(2):7579)除去濃縮液中的蛋白質(zhì)，所得溶液為初步提純的蟲(chóng)草素溶液，作為進(jìn)一步制作蟲(chóng)草素精制品的原料。(4)發(fā)酵液中蟲(chóng)草素濃度的測(cè)定取上述步驟制備的最終濃縮液0.2ml，稀釋至lml，常溫下于12000rpm離心5min后，用高效液相色譜進(jìn)樣針取上清作為進(jìn)樣的樣品。高效液相(HPLC)色譜條件的選擇利用乙腈:水體積比7:93作為流動(dòng)相，流速為lml/min，使發(fā)酵液中蟲(chóng)草素與其它組分達(dá)到基線分離；蟲(chóng)草素的保留時(shí)間少于20min，在進(jìn)樣后10min左右出峰，做3個(gè)重復(fù)檢測(cè)，平均峰面積為36076456，根據(jù)蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)曲線所得值乘以稀釋倍數(shù)，即可以得到蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中蟲(chóng)草素濃度為3028昭/ml。蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品曲線見(jiàn)附圖5所示。蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖見(jiàn)附圖8所示。不同發(fā)酵階段的發(fā)酵液中腺苷和蟲(chóng)草素含量的對(duì)照?qǐng)D見(jiàn)附圖9所示。終止發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液高效液相色譜圖見(jiàn)附圖IO所示。(5)發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化表2顯示了本發(fā)明的蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵過(guò)程中總糖、還原糖、氨態(tài)氮和蟲(chóng)草素含量的變化。由表2可以看出，蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵過(guò)程中總糖和還原糖在發(fā)酵進(jìn)行到第12d時(shí)幾乎消耗殆盡，氨基氮的含量先上升后下降，蟲(chóng)草素的含量在發(fā)酵的第8天開(kāi)始激增，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中蟲(chóng)草素的含量達(dá)到3028嗎/ml。表2蛹蟲(chóng)草發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液主要物質(zhì)的變化趨勢(shì)測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在本發(fā)明的實(shí)施例中，申請(qǐng)人比較了菌種3種不同制作方式對(duì)發(fā)酵液中蟲(chóng)草素得率的影響。試驗(yàn)采用的菌種為本發(fā)明所得的蛹蟲(chóng)草菌株BYB-08，按以下方案設(shè)計(jì)(1)培養(yǎng)皿固體菌種培養(yǎng)基接種，避光培養(yǎng)20d后制成分生孢子懸液；(2)培養(yǎng)皿固體菌種培養(yǎng)基接種，避光培養(yǎng)15d后，再加光照培養(yǎng)5d后制成分生孢子懸液；(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方同上述發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基)接種分生孢子并振蕩培養(yǎng)4d后作為菌種。將上述3種方式得到的菌種接種到發(fā)酵罐的液體培養(yǎng)基中，在22'C下避光培養(yǎng)712d。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3所示。表3菌種不同制備方法對(duì)發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量的影響(單位(ig/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>說(shuō)明表3使用的菌種為本發(fā)明獲得的蛹蟲(chóng)草BYB-0S菌株。表4顯示了不同接種量對(duì)蛹蟲(chóng)草發(fā)酵的影響。采用表3所制備的菌種進(jìn)行接種，接種量分別按菌種占培養(yǎng)基體積的1%，2%，3%，4%，5%進(jìn)行接種。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。表4菌種不同接種量對(duì)蛹蟲(chóng)草發(fā)酵的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從表3、表4、圖6、圖7和圖11試驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較可以看出，本發(fā)明所得的最佳工藝和菌種制作工藝為培養(yǎng)皿菌種固體培養(yǎng)基接種，避光培養(yǎng)15d后再光照培養(yǎng)5d，制成分生孢子懸液作為發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基用菌種；深層振蕩發(fā)酵4d，再表層靜止發(fā)酵16d，接種量為培養(yǎng)基體積的12%(分生孢子懸液濃度為3.2xl0MVmL)，發(fā)酵初始pH為6.57.0。同其它對(duì)照相比，本發(fā)明的生產(chǎn)工藝所得蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量最高。本發(fā)明中不同培養(yǎng)基的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。表5本發(fā)明液體發(fā)酵培養(yǎng)基中不同配方對(duì)蟲(chóng)草素含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表5可知，本發(fā)明中液體培養(yǎng)基配方中以試驗(yàn)2、3、4、6、7培養(yǎng)效果較好，其中試驗(yàn)3效果最好，發(fā)酵液中的蟲(chóng)草素含量最高達(dá)3167嗎/mL，平均含量為3028嗎/mL。研究結(jié)果表明，本發(fā)明采用深層發(fā)酵培養(yǎng)和靜置表層發(fā)酵培養(yǎng)工藝相結(jié)合，所獲得的發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量比文獻(xiàn)公開(kāi)報(bào)道和專利文獻(xiàn)公開(kāi)的方法所獲得的蟲(chóng)草素產(chǎn)量有明顯提高。權(quán)利要求1、一種生產(chǎn)蟲(chóng)草素的方法，其特征在于，采用液體深層發(fā)酵和表層發(fā)酵相結(jié)合的方法進(jìn)行發(fā)酵，其步驟如下(1)將保藏號(hào)為CCTCCNOM207091的蛹蟲(chóng)草菌株BYB-08，接種于固體培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，于20～28℃避光培養(yǎng)15d，再用散射光培養(yǎng)5d，用無(wú)菌水洗下分生孢子制成分生孢子懸液，備用；(2)將步驟(1)得到的分生孢子懸液接入發(fā)酵罐的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量按孢子懸液與液體培養(yǎng)基體積比為1～2％的量接入；(3)按照所述的液體深層發(fā)酵和表層發(fā)酵相結(jié)合的方法培養(yǎng)步驟(2)的培養(yǎng)物在發(fā)酵培養(yǎng)起始階段，控制發(fā)酵罐通氣量為120～170ml/min，攪拌速度為150rpm～200rpm，溫度為23～27℃，培養(yǎng)3～4d后，待發(fā)酵液中還原糖濃度為0.05～0.09g/L時(shí)停止深層攪拌發(fā)酵，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至容器口蓋有滅菌紗布的廣口容器中，控制發(fā)酵溫度為23～27℃，靜止表層發(fā)酵16～20d后停止發(fā)酵，得到含蟲(chóng)草素的發(fā)酵原液；(4)將步驟(3)得到的蟲(chóng)草素發(fā)酵原液以3000rpm，25℃離心30分鐘，取上清液，將該上清液經(jīng)減壓濃縮至發(fā)酵原液體積的1/10左右，加入3倍體積的95％乙醇，去除其中的沉淀物，將剩余的發(fā)酵原液貯藏在2℃條件下，采用5000rpm離心10min后取上清，再經(jīng)減壓蒸出乙醇，將其濃縮至發(fā)酵原液體積的1/5左右，去除其中的蛋白，得到初步提純的蟲(chóng)草素溶液，其中步驟(1)所述的固體培養(yǎng)基組分為按重量體積計(jì)，馬鈴薯浸出粉20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，KH2PO41g，MgSO40.5g，VB110mg，瓊脂粉20g，補(bǔ)充自來(lái)水至1000ml，調(diào)pH至6.5～7.5；步驟(2)在發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基按照重量體積計(jì)為葡萄糖2％，豆粕8％，馬鈴薯浸出粉2％，腺苷0.6％，KH2PO40.2％，MgSO40.1％，補(bǔ)充自來(lái)水至100％，調(diào)pH至6.5～7.0，備用。2、一個(gè)選育的蛹蟲(chóng)草菌株(Co/^KceAS肌7itarj's)BYB-08，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCCNO:M207091。3、權(quán)利要求2所述的蛹蟲(chóng)草菌株BYB-08在生產(chǎn)蟲(chóng)草素及其制品中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種生產(chǎn)蟲(chóng)草素的方法，高產(chǎn)蛹蟲(chóng)草菌株的選育與應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)誘變選育得到一株高產(chǎn)蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris)菌株BYB-08，該菌株作為專利程序已于申請(qǐng)日前保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號(hào)為CCTCCNOM207091)。本發(fā)明公開(kāi)了本發(fā)明獲得的蛹蟲(chóng)草菌株BYB-08在優(yōu)化的深層發(fā)酵和靜置表層發(fā)酵培養(yǎng)相結(jié)合的方法中的成功實(shí)施例，本發(fā)明所獲得的發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量比現(xiàn)有專利文獻(xiàn)和非專利文獻(xiàn)報(bào)道的方法所獲得的蟲(chóng)草素生物學(xué)產(chǎn)量有非常明顯的提高。文檔編號(hào)C12P19/40GK101245361SQ20081010171公開(kāi)日2008年8月20日申請(qǐng)日期2008年3月11日優(yōu)先權(quán)日2008年3月11日發(fā)明者俞海峰,周洪英,邊銀丙申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)