專利名稱：結(jié)合cd70的人類抗體及其用途的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)
本專利申請(qǐng)主張于2006年12月14日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/870,091、于2007年5月1日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/915,314以及于2007年11月30日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/991,702的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此合并作為參考。
背景技術(shù)：
細(xì)胞因子受體CD27是腫瘤壞死因子受體(TFNR)超家族的成員，它在細(xì)胞生長和分化中，以及在細(xì)胞凋亡或程序性死亡中起一定作用。CD27的配體是CD70，它屬于配體的腫瘤壞死因子家族。CD70是一個(gè)193個(gè)氨基酸的多肽，具有20個(gè)氨基酸親水的N末端結(jié)構(gòu)域以及包含2個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)的C末端結(jié)構(gòu)域(Goodwin，R.G.等人(1993)Cell73447-56；Bowman等人(1994)Immunol 1521756-61)?；谶@些特征，CD70被確定為具有細(xì)胞外C末端部分的II型跨膜蛋白。
已發(fā)現(xiàn)CD70瞬時(shí)出現(xiàn)于已激活的而非靜止態(tài)的T和B淋巴細(xì)胞以及樹突細(xì)胞(Hintzen等人(1994)J.Immunol.1521762-1773；Oshima等人(1998)Int.Immunol.10517-26；Tesselaar等人(2003)J.Immunol.17033-40)。除在正常細(xì)胞上表達(dá)外，已報(bào)道CD70在不同類型的癌細(xì)胞中表達(dá)，包括腎細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移型乳癌、腦腫瘤、白血病、淋巴瘤以及鼻咽癌(Junker等人(2005)J Urol.1732150-3；Sloan等人(2004)Am J Pathol.164315-23；Held-Feindt and Mentlein(2002)Int J Cancer 98352-6；Hishima等人(2000)Am J Surg Pathol.24742-6；Lens等人(1999)Br JHaematol.106491-503)。另外，發(fā)現(xiàn)CD70在用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑或ERK途徑抑制劑處理的T細(xì)胞上過量表達(dá)，可能導(dǎo)致藥物引起的或原發(fā)性狼瘡(Oelke等人(2004)Arthritis Rheum.501850-60)。已提出，CD70與CD27的相互作用在細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病以及抑制TNF-α的產(chǎn)生中起作用(Nakajima等人(2000)J.Neuroimmunol.109188-96)。
因此，CD70代表了用于治療以CD70表達(dá)為特征的癌癥、自身免疫紊亂以及許多其他疾病的有價(jià)值的靶標(biāo)。
概述 本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體，特別是人類單克隆抗體，這些抗體特異性結(jié)合CD70并且具有多種所希望的特性。這些特性包括結(jié)合人類CD70的高親和力、由表達(dá)CD70的細(xì)胞內(nèi)化、介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性的能力、結(jié)合腎細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞系的能力、和/或結(jié)合淋巴瘤細(xì)胞系(例如B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系)的能力。本發(fā)明的抗體可以用于例如檢測CD70蛋白或用于抑制表達(dá)CD70的細(xì)胞(如表達(dá)CD70的腫瘤細(xì)胞)的生長。
還提供了使用本發(fā)明分離的單克隆抗體及其組合物治療多種CD70介導(dǎo)的疾病的方法。
一方面，本發(fā)明涉及分離的單克隆抗體或該抗體的抗原結(jié)合部分，其中該抗體結(jié)合CD70，并且表現(xiàn)出以下特性中的至少一種 (a)以1×10-7M或更小的KD與人類CD70相結(jié)合； (b)結(jié)合腎細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞系； (c)結(jié)合淋巴瘤細(xì)胞系，例如B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系； (d)被表達(dá)CD70的細(xì)胞內(nèi)化； (e)表現(xiàn)出針對(duì)表達(dá)CD70的細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)；并且 (f)當(dāng)與細(xì)胞毒素相偶聯(lián)時(shí)在體內(nèi)抑制表達(dá)CD70的細(xì)胞的生長。
優(yōu)選地，該抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少兩種。更優(yōu)選地，該抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少三種。更優(yōu)選地，該抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的四種。甚至更優(yōu)選地，該抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的五種。甚至更優(yōu)選地，該抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的全部六種。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)該抗體與細(xì)胞毒素相偶聯(lián)時(shí)該抗體在體內(nèi)抑制表達(dá)CD70的腫瘤細(xì)胞的生長。
優(yōu)選地，該抗體結(jié)合腎細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系選自786-O(ATCC登錄號(hào)CRL-1932)、A-498(ATCC登錄號(hào)HTB-44)、ACHN(ATCC登錄號(hào)CRL-1611)、Caki-1(ATCC登錄號(hào)HTB-46)以及Caki-2(ATCC登錄號(hào)HTB-47)。
優(yōu)選地，該抗體結(jié)合B細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系選自Daudi(ATCC登錄號(hào)CCL-213)、HuT 78(ATCC登錄號(hào)TIB-161)、Raji(ATCC登錄號(hào)CCL-86)或Granta-519(DSMZ登錄號(hào)342)細(xì)胞。
優(yōu)選地，該抗體是人類抗體，雖然在可替代地實(shí)施方案中，該抗體可以是鼠類抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體以5.5×10-9M或更小的KD與人類CD70相結(jié)合，或以3×10-9M或更小的KD與人類CD70相結(jié)合，或以2×10-9M或更小的KD與人類CD70相結(jié)合，或以1.5×10-9M或更小的KD與人類CD70相結(jié)合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體與786-O腎細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的CD70結(jié)合后被那些細(xì)胞內(nèi)化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或該抗體的抗原結(jié)合部分，其中該抗體交叉競爭結(jié)合CD70上由參考抗體所識(shí)別的表位，其中該參考抗體(a)以1×10-7M或更小的KD結(jié)合人類CD70；并且(b)結(jié)合腎細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞系。
在不同的實(shí)施方案中，該參照抗體包括 (a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO1；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO7； 或該參照抗體包括(a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO2；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO8； 或該參照抗體包括(a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO3；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO9； 或該參照抗體包括(a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO4；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO10； 或該參照抗體包括(a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO5或73；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO11； 或該參照抗體包括(a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO6；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO12。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的參考抗體為抗體69A7Y。69A7Y與抗體69A7相同，但在氨基酸序列SEQ ID NO5的VH中含保守修飾，導(dǎo)致在氨基酸位置100處C(半胱氨酸)突變?yōu)閅(酪氨酸)。69A7Y的VH氨基酸序列由SEQ ID NO73給出。從C到Y(jié)的突變是由在69A7的VH核苷酸序列(SEQ ID NO53)的核苷酸位置323處發(fā)生從G到A的單一堿基對(duì)取代所形成的。69A7Y的VH核苷酸序列由SEQ ID NO74給出。69A7Y具有重鏈可變區(qū)CDR3，包括如SEQ ID NO75所給出的氨基酸序列。
另一方面，本發(fā)明涉及與治療劑相連接的分離的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，該單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分包括作為人類VH 3-30.3基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合CD70。本發(fā)明還提供分離的單克隆抗體，包括連接到治療劑上的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括作為人類VH 3-33基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與CD70特異性結(jié)合。本發(fā)明還提供了分離的單克隆抗體，包括連接到治療劑上的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括作為人類VH 4-61基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與CD70特異地結(jié)合。本發(fā)明還提供了分離的單克隆抗體，包括連接到治療劑上的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括作為人類VH 3-23基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性地結(jié)合CD70。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了分離的單克隆抗體，包括連接到治療劑上的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括作為人類VK L6基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異地結(jié)合CD70。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了分離的單克隆抗體，包括連接到治療劑上的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括作為人類VKL18基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異地結(jié)合CD70。本發(fā)明進(jìn)一步提供了分離的單克隆抗體，包括連接到治療劑上的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括作為人類VKL15基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異地結(jié)合CD70。本發(fā)明進(jìn)一步提供了分離的單克隆抗體，包括連接到治療劑上的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，其中該抗體包括作為人類VKA27基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異地結(jié)合CD70。
特別優(yōu)選的抗體或其抗原結(jié)合部分包括 (a)包括SEQ ID NO13的重鏈可變區(qū)CDR1； (b)包括SEQ ID NO19的重鏈可變區(qū)CDR2； (c)包括SEQ ID NO25的重鏈可變區(qū)CDR3； (d)包括SEQ ID NO31的輕鏈可變區(qū)CDR1； (e)包括SEQ ID NO37的輕鏈可變區(qū)CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO43的輕鏈可變區(qū)CDR3。
另一種優(yōu)選的組合包括 (a)包括SEQ ID NO14的重鏈可變區(qū)CDR1； (b)包括SEQ ID NO20的重鏈可變區(qū)CDR2； (c)包括SEQ ID NO26的重鏈可變區(qū)CDR3； (d)包括SEQ ID NO32的輕鏈可變區(qū)CDR1； (e)包括SEQ ID NO38的輕鏈可變區(qū)CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO44的輕鏈可變區(qū)CDR3。
另一種優(yōu)選的組合包括 (a)包括SEQ ID NO15的重鏈可變區(qū)CDR1； (b)包括SEQ ID NO21的重鏈可變區(qū)CDR2； (c)包括SEQ ID NO27的重鏈可變區(qū)CDR3； (d)包括SEQ ID NO33的輕鏈可變區(qū)CDR1； (e)包括SEQ ID NO39的輕鏈可變區(qū)CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO45的輕鏈可變區(qū)CDR3。
另一種優(yōu)選的組合包括 (a)包括SEQ ID NO16的重鏈可變區(qū)CDR1； (b)包括SEQ ID NO22的重鏈可變區(qū)CDR2； (c)包括SEQ ID NO28的重鏈可變區(qū)CDR3； (d)包括SEQ ID NO34的輕鏈可變區(qū)CDR1； (e)包括SEQ ID NO40的輕鏈可變區(qū)CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO46的輕鏈可變區(qū)CDR3。
另一種優(yōu)選的組合包括 (a)包括SEQ ID NO17的重鏈可變區(qū)CDR1； (b)包括SEQ ID NO23的重鏈可變區(qū)CDR2； (c)包括SEQ ID NO29或75的重鏈可變區(qū)CDR3； (d)包括SEQ ID NO35的輕鏈可變區(qū)CDR1； (e)包括SEQ ID NO41的輕鏈可變區(qū)CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO47的輕鏈可變區(qū)CDR3。
另一種優(yōu)選的組合包括 (a)包括SEQ ID NO18的重鏈可變區(qū)CDR1； (b)包括SEQ ID NO24的重鏈可變區(qū)CDR2； (c)包括SEQ ID NO30的重鏈可變區(qū)CDR3； (d)包括SEQ ID NO36的輕鏈可變區(qū)CDR1； (e)包括SEQ ID NO42的輕鏈可變區(qū)CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO48的輕鏈可變區(qū)CDR3。
本發(fā)明其他優(yōu)選的抗體具有抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO1的重鏈可變區(qū)；以及(b)包括氨基酸序列SEQID NO7的輕鏈可變區(qū)。
另一種優(yōu)選的組合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO2的重鏈可變區(qū)；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO8的輕鏈可變區(qū)。
另一種優(yōu)選的組合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO3的重鏈可變區(qū)；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO9的輕鏈可變區(qū)。
另一種優(yōu)選的組合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO4的重鏈可變區(qū)；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO10的輕鏈可變區(qū)。
另一種優(yōu)選的組合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO5或73的重鏈可變區(qū)；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO11的輕鏈可變區(qū)。
另一種優(yōu)選的組合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO6的重鏈可變區(qū)；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO12的輕鏈可變區(qū)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種抗體是抗體69A7Y。69A7Y與抗體69A7相同，但在SEQ ID NO5的VH氨基酸序列中包含保守修飾，導(dǎo)致在氨基酸位置100處C(半胱氨酸)突變?yōu)閅(酪氨酸)。69A7Y的VH氨基酸序列由SEQ ID NO73給出。從C到Y(jié)的突變是在69A7的VH核苷酸序列(SEQ ID NO53)的核苷酸位置323處發(fā)生從G到A的單一堿基對(duì)取代形成的。69A7Y的VH核苷酸序列由SEQ ID NO74給出。69A7Y具有重鏈可變區(qū)CDR3，包含如SEQ ID NO75所給出的氨基酸序列。
例如，本發(fā)明的抗體可以是全長抗體，例如IgG1或IgG4同種型?？商娲?，該抗體可以是諸如Fab或Fab’2片段或單鏈抗體的抗體片段。
本發(fā)明還提供了免疫偶聯(lián)物，包括連接到治療劑(例如細(xì)胞毒素或放射性同位素)的本發(fā)明的抗體或它的抗原結(jié)合部分。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了免疫偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含連接到細(xì)胞毒素(例如，此處說明的細(xì)胞毒素或參見于2006年12月28日申請(qǐng)的美國專利申請(qǐng)60/882,461或2007年11月30日申請(qǐng)的美國專利申請(qǐng)?zhí)?0/991,300中，其全文在此合并作為參考)(例如通過硫羥醇基連接)的本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分。在某些實(shí)施方案中，該免疫偶聯(lián)物的細(xì)胞毒素以及連接物具有N1或N2結(jié)構(gòu)。
例如，在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了以下優(yōu)選的免疫偶聯(lián)物 (i)免疫偶聯(lián)物，包括抗體或其抗原結(jié)合部分，包括 (a)包括氨基酸序列SEQ ID NO1的重鏈可變區(qū)和包括氨基酸序列SEQ ID NO7的輕鏈可變區(qū)； (b)包括氨基酸序列SEQ ID NO2的重鏈可變區(qū)和包括氨基酸序列SEQ ID NO8的輕鏈可變區(qū)； (c)包括氨基酸序列SEQ ID NO3的重鏈可變區(qū)和包括氨基酸序列SEQ ID NO9的輕鏈可變區(qū)； (d)包括氨基酸序列SEQ ID NO4的重鏈可變區(qū)和包括氨基酸序列SEQ ID NO10的輕鏈可變區(qū)； (e)包括氨基酸序列SEQ ID NO5或73的重鏈可變區(qū)和包括氨基酸序列SEQ ID NO11的輕鏈可變區(qū)，以及 (f)包括氨基酸序列SEQ ID NO6的重鏈可變區(qū)和包括氨基酸序列SEQ ID NO12的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體或其抗原結(jié)合部分連接到細(xì)胞毒素上； (ii)一種免疫偶聯(lián)物，包括抗體或其抗原結(jié)合部分，包括 (a)包括SEQ ID NO13的重鏈可變區(qū)CDR1； (b)包括SEQ ID NO19的重鏈可變區(qū)CDR2； (c)包括SEQ ID NO25的重鏈可變區(qū)CDR3； (d)包括SEQ ID NO31的輕鏈可變區(qū)CDR1； (e)包括SEQ ID NO37的輕鏈可變區(qū)CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO43的輕鏈可變區(qū)CDR3； 或者抗體或其抗原結(jié)合部分，包括 (a)包括SEQ ID NO14的重鏈可變區(qū)CDR1； (b)包括SEQ ID NO20的重鏈可變區(qū)CDR2； (c)包括SEQ ID NO26的重鏈可變區(qū)CDR3； (d)包括SEQ ID NO32的輕鏈可變區(qū)CDR1； (e)包括SEQ ID NO38的輕鏈可變區(qū)CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO44的輕鏈可變區(qū)CDR3； 或者抗體或其抗原結(jié)合部分，包括 (a)包括SEQ ID NO15的重鏈可變區(qū)CDR1； (b)包括SEQ ID NO21的重鏈可變區(qū)CDR2； (c)包括SEQ ID NO27的重鏈可變區(qū)CDR3； (d)包括SEQ ID NO33的輕鏈可變區(qū)CDR1； (e)包括SEQ ID NO39的輕鏈可變區(qū)CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO45的輕鏈可變區(qū)CDR3； 或者抗體或其抗原結(jié)合部分，包括 (a)包括SEQ ID NO16的重鏈可變區(qū)CDR1； (b)包括SEQ ID NO22的重鏈可變區(qū)CDR2； (c)包括SEQ ID NO28的重鏈可變區(qū)CDR3； (d)包括SEQ ID NO34的輕鏈可變區(qū)CDR1； (e)包括SEQ ID NO40的輕鏈可變區(qū)CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO46的輕鏈可變區(qū)CDR3； 或者種抗體或其抗原結(jié)合部分，包括 (a)包括SEQ ID NO17的重鏈可變區(qū)CDR1，； (b)包括SEQ ID NO23的重鏈可變區(qū)CDR2，； (c)包括SEQ ID NO29或75的重鏈可變區(qū)CDR3，； (d)包括SEQ ID NO35的輕鏈可變區(qū)CDR1； (e)包括SEQ ID NO41的輕鏈可變區(qū)CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO47的輕鏈可變區(qū)CDR3； 或者抗體或其抗原結(jié)合部分，包括 (a)包括SEQ ID NO18的重鏈可變區(qū)CDR1； (b)包括SEQ ID NO24的重鏈可變區(qū)CDR2； (c)包括SEQ ID NO30的重鏈可變區(qū)CDR3； (d)包括SEQ ID NO36的輕鏈可變區(qū)CDR1； (e)包括SEQ ID NO42的輕鏈可變區(qū)CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO48的輕鏈可變區(qū)CDR3， 其中該抗體或其抗原結(jié)合部分連接到細(xì)胞毒素上；以及 (iii)一種免疫偶聯(lián)物，包括連接到細(xì)胞毒素上的抗體或其抗原結(jié)合部分，它結(jié)合由下述抗體所識(shí)別的相同表位(如與該抗體交叉競爭結(jié)合人類CD70)，該抗體包括 (a)包括氨基酸序列SEQ ID NO1的重鏈可變區(qū)和包括氨基酸序列SEQ ID NO7的輕鏈可變區(qū)； (b)包括氨基酸序列SEQ ID NO2的重鏈可變區(qū)和包括氨基酸序列SEQ ID NO8的輕鏈可變區(qū)； (c)包括氨基酸序列SEQ ID NO3的重鏈可變區(qū)和包括氨基酸序列SEQ ID NO9的輕鏈可變區(qū)； (d)包括氨基酸序列SEQ ID NO4的重鏈可變區(qū)和包括氨基酸序列SEQ ID NO10的輕鏈可變區(qū)； (e)包括氨基酸序列SEQ ID NO5或73的重鏈可變區(qū)和包括氨基酸序列SEQ ID NO11的輕鏈可變區(qū)；以及 (f)包括氨基酸序列SEQ ID NO6的重鏈可變區(qū)和包括氨基酸序列SEQ ID NO12的輕鏈可變區(qū)。
本發(fā)明還提供了雙特異性分子，該雙特異性分子包括本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，該抗體或其抗原結(jié)合部位與第二個(gè)功能部分相連接，該第二功能部分具有與所述抗體或其抗原結(jié)合部分相比不同的結(jié)合特異性。
還提供了組合物，包括本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子，以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明抗體或它們的抗原結(jié)合部分的核酸分子以及包括此類核酸的表達(dá)載體以及包括此類表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。還提供了使用包括此類表達(dá)載體的宿主細(xì)胞制備抗CD70抗體的方法，并且這些方法可包括的步驟有(i)在宿主細(xì)胞中表達(dá)該抗體以及(ii)從宿主細(xì)胞中分離該抗體。
在又另一方面中，本發(fā)明涉及制備抗CD70抗體的方法。該方法包括 (a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，包括選自SEQ ID NO13至18的CDR1序列；選自SEQ ID NO19至24的CDR2序列；和/或選自SEQID NO25至30及75的CDR3序列；和/或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，包括選自SEQ ID NO31至36的CDR1序列；選自SEQ ID NO37至42的CDR2序列，和/或選自SEQ ID NO43至48的CDR3序列； (b)在重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列中改變至少一個(gè)氨基酸殘基，以產(chǎn)生至少一種被改變的抗體序列；并且 (c)將被改變的抗體序列表達(dá)成蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了以高親和力與CD70特異性結(jié)合的分離的抗CD70抗體-配偶體分子偶聯(lián)物，特別是那些包含人類單克隆抗體的抗CD70抗體-配偶體分子偶聯(lián)物。此類抗體-配偶體分子偶聯(lián)物中有某些能被內(nèi)化至表達(dá)CD70的細(xì)胞中，并且能介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性作用。本發(fā)明還提供了使用在此披露的抗CD70抗體-配偶體分子偶聯(lián)物治療癌癥的方法，這些癌癥例如腎細(xì)胞癌或者淋巴瘤。
還提供了包括與本發(fā)明的配偶體分子相偶聯(lián)的抗體或其抗原結(jié)合部分的組合物?？梢杂欣嘏c在此披露的抗體配偶體分子偶聯(lián)物中的抗體相偶聯(lián)的配偶體分子包括但不限于作為藥物的分子、細(xì)胞毒素、標(biāo)記分子(如放射性同位素)、蛋白質(zhì)以及治療劑。還在此披露了包括抗體-配偶體分子偶聯(lián)物以及藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
一方面，此類抗體-配偶體分子偶聯(lián)物通過化學(xué)連接物相偶聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，該連接物是肽基連接物，并在此被表示為(L4)p-F-(L1)m。其他連接物包括肼以及二硫化物連接物，并在此被分別表示為(L4)p-H-(L1)m或(L4)p-J-(L1)m。除了與配偶體相結(jié)合的連接物之外，本發(fā)明還提供了適用于結(jié)合至基本上任何分子種類的可切割的連接臂。
另一方面，本發(fā)明涉及抑制表達(dá)CD70的腫瘤細(xì)胞生長的方法。該方法包括將表達(dá)CD70的腫瘤細(xì)胞與本發(fā)明的抗體-配偶體分子偶聯(lián)物相接觸，使得表達(dá)CD70的腫瘤細(xì)胞的生長受到抑制。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該配偶體分子是治療劑，如細(xì)胞毒素。特別優(yōu)選的表達(dá)CD70的腫瘤細(xì)胞是腎癌細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及治療受試者的癌癥的方法。該方法包括給予該受試者本發(fā)明的抗體-配偶體分子偶聯(lián)物，使得該受試者的癌癥得到治療。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該配偶體分子是治療劑，如細(xì)胞毒素。特別優(yōu)選的能治療的癌癥是腎癌以及淋巴瘤。
另一方面，本發(fā)明涉及治療受試者的自身免疫病、炎癥或者病毒感染的方法。該方法包括給予該受試者本發(fā)明的抗體-配偶體分子偶聯(lián)物，使得該受試者的自身免疫紊亂得到治療。
以下詳細(xì)的說明書以及實(shí)施例將清楚地說明本發(fā)明的其他特征及優(yōu)點(diǎn)，這些說明書與實(shí)施例不得被解釋為是對(duì)本發(fā)明的限制。本申請(qǐng)全文引用的所有參考文獻(xiàn)、Genbank登錄號(hào)、專利以及已公開的專利申請(qǐng)都明確地合并入本文作為參考。
附圖簡要說明

圖1A示出了2H5人類單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO49)以及氨基酸序列(SEQ ID NO1)。描述了CDR1(SEQ ID NO13)、CDR2(SEQ ID NO19)以及CDR3(SEQ ID NO25)區(qū)，并指明了V與J的種系來源(germline derivations)。
圖1B示出了2H5人類單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO55)以及氨基酸序列(SEQ ID NO7)。描述了CDR1(SEQ ID NO31)、CDR2(SEQ ID NO37)以及CDR3(SEQ ID NO43)區(qū)，并指明了V與J的種系來源。
圖2A示出了10B4人類單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO50)以及氨基酸序列(SEQ ID NO2)。描述出了CDR1(SEQ IDNO14)、CDR2(SEQ ID NO20)以及CDR3(SEQ ID NO26)區(qū)，并指明了V、D以及J的種系來源。
圖2B示出了10B4人類單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO56)以及氨基酸序列(SEQ ID NO8)。描述了CDR1(SEQ ID NO32)、CDR2(SEQ ID NO38)以及CDR3(SEQ ID NO44)區(qū)，并指明了V與J的種系來源。
圖3A示出了8B5人類單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO51)以及氨基酸序列(SEQ ID NO3)。描述了CDR1(SEQ ID NO15)、CDR2(SEQ ID NO21)以及CDR3(SEQ ID NO27)區(qū)，并指明了V、D以及J的種系來源。
圖3B示出了8B5人類單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO57)以及氨基酸序列(SEQ ID NO9)。描述了CDR1(SEQ ID NO33)、CDR2(SEQ ID NO39)以及CDR3(SEQ ID NO45)區(qū)，并指明了V與J的種系來源。
圖4A示出了18E7人類單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO52)以及氨基酸序列(SEQ ID NO4)。描述了CDR1(SEQ ID NO16)、CDR2(SEQ ID NO22)以及CDR3(SEQ ID NO28)區(qū)，并指明了V、D以及J的種系來源。
圖4B示出了18E7人類單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO58)以及氨基酸序列(SEQ ID NO10)。描述了CDR1(SEQ ID NO34)、CDR2(SEQ ID NO40)以及CDR3(SEQ ID NO46)區(qū)，并指明了V與J的種系來源。
圖5A示出了69A7人類單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO53)以及氨基酸序列(SEQ ID NO5)。描述了CDR1(SEQ ID NO17)、CDR2(SEQ ID NO23)以及CDR3(SEQ ID NO29)區(qū)，并指明了V、D及J的種系來源。
圖5B示出了69A7人類單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO59)以及氨基酸序列(SEQ ID NO11)。描述了CDR1(SEQ IDNO35)、CDR2(SEQ ID NO41)以及CDR3(SEQ ID NO47)區(qū)，并指明了V與J的種系來源。
圖6A示出了1F4人類單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO54)以及氨基酸序列(SEQ ID NO6)。描述了CDR1(SEQ ID NO18)、CDR2(SEQ ID NO24)以及CDR3(SEQ ID NO30)區(qū)，并指明了V、D以及J的種系來源。
圖6B示出了1F4人類單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO60)以及氨基酸序列(SEQ ID NO12)。描述了CDR1(SEQ ID NO36)、CDR2(SEQ ID NO42)以及CDR3(SEQ ID NO48)區(qū)，并指明了V與J的種系來源。
圖7示出了2H5和10B4的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人類種系VH3-30.3氨基酸序列(SEQ ID NO61)的比對(duì)。
圖8示出了8B5和18E7的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人類種系VH3-33氨基酸序列(SEQ ID NO62)的比對(duì)。
圖9示出了69A7的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人類種系VH 4-61氨基酸序列(SEQ ID NO63)的比對(duì)。
圖10示出了1F4的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人類種系VH 3-23氨基酸序列(SEQ ID NO64)的比對(duì)。
圖11示出了2H5的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人類種系VK L6氨基酸序列(SEQ ID NO65)的比對(duì)。
圖12示出了10B4的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人類種系VK L18氨基酸序列(SEQ ID NO66)的比對(duì)。
圖13示出了8B5和18E7的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人類種系VKL15氨基酸序列(SEQ ID NO67)的比對(duì)。
圖14示出了69A7的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人類種系VK L6氨基酸序列(SEQ ID NO65)的比對(duì)。
圖15示出了1F4的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人類種系VK A27氨基酸序列(SEQ ID NO68)的比對(duì)。
圖16示出了ELSIA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明針對(duì)人類CD70的人類單克隆抗體特異性結(jié)合CD70。
圖17示出了流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明抗-CD70人類單克隆抗體2H5與腎癌細(xì)胞系結(jié)合。
圖18A與B示出了流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明針對(duì)人類CD70的人類單克隆抗體以濃度依賴性的方式與腎細(xì)胞癌(RCC)細(xì)胞系結(jié)合。(A)786-ORCC細(xì)胞系(B)A498RCC細(xì)胞系。
圖18C示出了流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明針對(duì)人類CD70的人類單克隆抗體與786-O腎癌細(xì)胞系結(jié)合。
圖18D示出了流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明針對(duì)人類CD70的HuMAb69A7抗體以濃度依賴性的方式與腎細(xì)胞癌(RCC)細(xì)胞系786-O結(jié)合。
圖19示出了流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明抗CD70人類單克隆抗體2H5與人類淋巴瘤細(xì)胞系結(jié)合。
圖20A與B示出了流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明抗-CD70人類單克隆抗體2H5以濃度依賴性的方式與人類淋巴瘤細(xì)胞系結(jié)合。(A)Raji淋巴瘤細(xì)胞系(B)Granta-519淋巴瘤細(xì)胞系。
圖20C示出了流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明針對(duì)人類CD70的人類單克隆抗體結(jié)合Raji淋巴瘤細(xì)胞系。
圖20D示出了競爭性流式細(xì)胞術(shù)測定的結(jié)果，證明HuMAb 2H5與69A7共用類似的結(jié)合表位。
圖20E示出了流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明針對(duì)人類CD70的人類單克隆抗體與Daudi淋巴瘤細(xì)胞系以及786-O腎癌細(xì)胞系結(jié)合。
圖21示出了Hum-Zap內(nèi)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明針對(duì)人類CD70的人類單克隆抗體可以內(nèi)化進(jìn)入CD70陽性細(xì)胞中。
圖22A至C示出了細(xì)胞增殖測定的結(jié)果，證明偶聯(lián)細(xì)胞毒素的人類單克隆抗-CD70抗體殺死腎細(xì)胞癌細(xì)胞(RCC)系。(A)Caki-2RCC(B)786-ORCC(C)ACHN RCC。
圖23A至D示出了ADCC測定的結(jié)果，證明人類單克隆抗-CD70抗體以ADCC依賴的方式殺死人類白血病以及淋巴瘤細(xì)胞系。(A)ARH-77白血病細(xì)胞系(B)HuT 78淋巴瘤細(xì)胞系(C)Raji淋巴瘤細(xì)胞系以及(D)L-540細(xì)胞系，它不表達(dá)CD70。
圖24示出了細(xì)胞增殖測定的結(jié)果，證明偶聯(lián)細(xì)胞毒素的人類單克隆抗-CD70抗體殺死人類淋巴瘤細(xì)胞系。
圖25A至B示出了細(xì)胞增殖測定的結(jié)果，證明偶聯(lián)細(xì)胞毒素的人類單克隆抗-CD70抗體顯示出在(A)洗滌三小時(shí)以及(B)持續(xù)洗滌時(shí)對(duì)Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
圖26A至B示出了在體內(nèi)小鼠腫瘤模型研究的結(jié)果，證明用偶聯(lián)細(xì)胞毒素的抗-CD70抗體2H5治療對(duì)腎細(xì)胞癌(RCC)腫瘤具有直接的體內(nèi)抑制作用。(A)A-498RCC腫瘤(B)ACHN RCC腫瘤。
圖27A至F示出了ADCC測定的結(jié)果，證明非巖藻糖化的人類單克隆抗-CD70抗體對(duì)人類白血病細(xì)胞具有以ADCC依賴方式的增加的細(xì)胞毒性。(A)ARH-77細(xì)胞；(B)MEC-1細(xì)胞；(C)用抗-CD16抗體處理的MEC-1細(xì)胞；(D)SU-DHL-6細(xì)胞；(E)IM-9細(xì)胞；(F)HuT 78細(xì)胞。
圖28示出了ADCC測定的結(jié)果，證明人類單克隆抗-CD70抗體以ADCC濃度依賴性方式殺死人類白血病細(xì)胞。
圖29示出了抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)測定的結(jié)果，證明人類單克隆抗-CD70抗體以ADCC依賴性方式殺死人類白血病細(xì)胞，但是細(xì)胞毒性依賴于CD16。
圖30示出了ADCC測定的結(jié)果，證明人類單克隆抗-CD70抗體殺死人類已激活的T細(xì)胞，并且該作用可隨抗-CD16抗體的加入得到逆轉(zhuǎn)。
圖31示出了阻斷測定的結(jié)果，證明一些人類單克隆抗-CD70抗體阻斷CD70與CD27的結(jié)合，而其他人類單克隆抗-CD70抗體不阻斷CD70與CD27的結(jié)合。
圖32A至B示出了在體內(nèi)小鼠腫瘤模型研究的結(jié)果，證明裸露的抗-CD70抗體2H5的治療對(duì)淋巴瘤具有直接的體內(nèi)抑制作用。(A)Raji腫瘤(B)ARH-77腫瘤。
圖33A至C示出了在體內(nèi)小鼠腫瘤模型研究的結(jié)果，證明用偶聯(lián)細(xì)胞毒素的抗-CD70抗體2H5的治療對(duì)淋巴瘤具有直接的體內(nèi)抑制作用。(A)ARH-77腫瘤；(B)Granta 519腫瘤；(C)Raji腫瘤。
圖34示出了一項(xiàng)研究結(jié)果，表明抗-CD70抗體69A7與在恒河猴CD70陽性B淋巴瘤細(xì)胞系上表達(dá)的CD70進(jìn)行交叉反應(yīng)。
圖35示出了阻斷測定的結(jié)果，證明人類抗-CD70抗體阻斷已知小鼠抗-人類CD70抗體的結(jié)合。
圖36A與B示出了用抗-CD70抗體或該抗體的非巖藻糖化形式處理的結(jié)果。(A)抗-CD70抗體以劑量依賴的方式抑制CD70共刺激的細(xì)胞的增殖。(B)抗-CD70抗體以劑量依賴的方式抑制CD70共刺激的IFN-γ分泌。
圖37A至C示出了用抗-CD70抗體或該抗體的非巖藻糖化形式在肽刺激的細(xì)胞上處理的結(jié)果。(A)抗-CD70抗體抑制肽特異性的CD8陽性T細(xì)胞的增殖(expansion)。(B)沒有觀察到總細(xì)胞生存力的明顯下降。(C)沒有觀察到總CD8陽性細(xì)胞數(shù)的明顯下降。
圖38示出了抗-CD70抗體對(duì)肽特異性的CD8陽性T細(xì)胞增殖的作用被外加的抗-CD16抗體阻斷。
圖39A至B示出了在體內(nèi)小鼠腫瘤模型研究的結(jié)果，證明用細(xì)胞毒素偶聯(lián)的抗-CD70抗體2H5的治療對(duì)腎癌腫瘤具有直接的體內(nèi)抑制作用。(A)786-O腫瘤(B)Caki-1腫瘤。
圖40示出了免疫偶聯(lián)物抗-CD70-N1與抗-CD70-N2在786-O腎細(xì)胞癌異種移植NOD-SCID小鼠模型中體內(nèi)抵抗腫瘤形成的功效。
圖41示出了單一劑量的免疫偶聯(lián)物抗-CD70-N2在786-O腎細(xì)胞癌異種移植SCID小鼠模型中體內(nèi)抵抗腫瘤形成的功效。
圖42示出了不同劑量的免疫偶聯(lián)物抗-CD70-N2在786-O腎細(xì)胞癌異種移植SCID小鼠模型中體內(nèi)抵抗腫瘤形成的功效。
圖43示出了不同劑量的免疫偶聯(lián)物抗-CD70-N2在Caki-1腎細(xì)胞癌異種移植SCID小鼠模型中體內(nèi)抵抗腫瘤形成的功效。
圖44示出了免疫偶聯(lián)物抗-CD70-N2在Raji細(xì)胞淋巴瘤SCID小鼠模型中體內(nèi)抵抗腫瘤形成的功效。
圖45示出了在BALB/c小鼠中免疫偶聯(lián)物抗-CD70-N2在體內(nèi)的安全性。
圖46A至D示出與在犬中游離的藥相比，免疫偶聯(lián)物抗-CD70-N2在體內(nèi)的安全性。
圖47示出了ADCC測定的結(jié)果。hIgG1nf Neg Ctrl＝人類IgG1NF陰性對(duì)照抗體。hIgG1Neg Ctrl＝人類IgG1陰性對(duì)照抗體。mIgG1NegCtrl＝小鼠IgG1陰性對(duì)照抗體。(A)2H5結(jié)合至已激活的B細(xì)胞上的FACS分析。(B)在已激活的人類B細(xì)胞上的2H5NF和2H5的ADCC測定。(C)加入抗CD16抗體的ADCC測定。
圖48描述了抗-CD70抗體通過ADCC利用在受刺激的人類PBMC培養(yǎng)物中天然存在的效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)經(jīng)Ag激活、CD70陽性人類T細(xì)胞裂解的能力。
圖49描述了抗-CD70抗體對(duì)天然表達(dá)CD70陽性的人類癌細(xì)胞系786-0細(xì)胞的結(jié)合特性。
圖50描述了巖藻糖化的以及非巖藻糖化的抗-CD70抗體在CD70陽性淋巴瘤細(xì)胞系A(chǔ)RH77上介導(dǎo)ADCC的能力。
圖51顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素E在786-O腎細(xì)胞癌異種移植SCID小鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖52顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素E在A498腎細(xì)胞癌異種移植SCID小鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖53顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素E在Caki-1腎細(xì)胞癌異種移植SCID小鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖54顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素E在Raji細(xì)胞淋巴瘤SCID小鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖55顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素E在Dauli細(xì)胞淋巴瘤SCID小鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖56顯示抗CD70-細(xì)胞毒素E在Caki-1腎細(xì)胞癌異種移植大鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖57顯示抗CD70-細(xì)胞毒素E在BALB/c小鼠中的體內(nèi)安全性。
圖58顯示抗CD70-細(xì)胞毒素E在犬中的體內(nèi)安全性。
圖59顯示抗CD70-細(xì)胞毒素E在猴子中的體內(nèi)安全性。
圖60顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素F在786-O腎細(xì)胞癌異種移植SCID小鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖61顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素F在Caki-1腎細(xì)胞癌異種移植SCID小鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖62顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素F在Raji細(xì)胞淋巴瘤SCID小鼠模型中的抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖63顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素G在786-O腎細(xì)胞癌異種移植SCID小鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖64顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素G在Caki-1腎細(xì)胞癌異種移植SCID小鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖65顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素H在A498腎細(xì)胞癌異種移植SCID小鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖66顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素H在Caki-1腎細(xì)胞癌異種移植SCID小鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖67顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素I在786-O腎細(xì)胞癌異種移植SCID小鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖68顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素I在Caki-1腎細(xì)胞癌異種移植大鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖69顯示單一劑量的抗CD70-細(xì)胞毒素J在786-O腎細(xì)胞癌異種移植SCID小鼠模型中抵抗腫瘤形成的體內(nèi)功效。
圖70顯示抗-CD70抗體2H5功能性地阻斷CD70刺激的人類T細(xì)胞增殖。
圖71是細(xì)胞毒素B的結(jié)構(gòu)。
圖72是細(xì)胞毒素C的結(jié)構(gòu)。
圖73是細(xì)胞毒素D的結(jié)構(gòu)。
圖74是細(xì)胞毒素E的結(jié)構(gòu)。
圖75是細(xì)胞毒素F的結(jié)構(gòu)。
圖76是細(xì)胞毒素G的結(jié)構(gòu)。
圖77是細(xì)胞毒素H的結(jié)構(gòu)。
圖78是細(xì)胞毒素I的結(jié)構(gòu)。
圖79是細(xì)胞毒素J的結(jié)構(gòu)。
詳細(xì)說明 本發(fā)明涉及分離的單克隆抗體，特別是人類單克隆抗體，這些抗體結(jié)合人類CD70并且具有所希望的功能特性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體衍生自特定的重鏈及輕鏈種系序列和/或包含特定的結(jié)構(gòu)特征，例如包括特定氨基酸序列的CDR區(qū)。本發(fā)明提供了分離的抗體，制備此類抗體、抗體-配偶體分子偶聯(lián)物以及包括此類抗體的雙特異性分子的方法，以及包含本發(fā)明的抗體、抗體-配偶體分子偶聯(lián)物或雙特異性分子的藥物組合物。本發(fā)明還涉及使用該抗體來例如檢測CD70蛋白質(zhì)的方法，以及使用本發(fā)明的抗CD70抗體來抑制表達(dá)CD70的細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)的生長的方法。因此，本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的抗CD70抗體以及抗體-配偶體分子偶聯(lián)物治療多種類型的癌癥的方法，例如，治療腎細(xì)胞癌或者淋巴瘤。
為了更容易地理解本發(fā)明，首先定義了某些術(shù)語。其他定義在整個(gè)詳細(xì)說明中給出。
如此處使用的術(shù)語“CD70”包括變異體、同種型、同系物、直向同源物以及種內(nèi)同源物。例如對(duì)人類CD70蛋白具有特異性的抗體在某些情況下可以與來自除人類之外的物種的CD70蛋白進(jìn)行交叉反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)人類CD70蛋白具有特異性的抗體對(duì)于人類CD70蛋白可能是完全特異的，并且可能不表現(xiàn)出物種或其他類型的交叉反應(yīng)性，或者可能與來自某些其他物種但不是所有其他物種的CD70進(jìn)行交叉反應(yīng)(如與靈長類CD70進(jìn)行交叉反應(yīng)但不與小鼠CD70進(jìn)行交叉反應(yīng))。術(shù)語“人類CD70”指人類序列CD70，如具有Genbank登錄號(hào)P32970的人類CD70的完整氨基酸序列(SEQ ID NO76)。術(shù)語“小鼠CD70”指小鼠序列CD70，如具有Genbank登錄號(hào)NP_035747的小鼠CD70的完整氨基酸序列。通過具有例如保守突變或在非保守區(qū)的突變，人類CD70序列可能不同于Genbank登錄號(hào)P32970的人類CD70，而該CD70具有基本上與Genbank登錄號(hào)P32970的人類CD70相同的生物功能。例如，人CD70的一個(gè)生物功能是結(jié)合細(xì)胞因子受體CD27。
特定的人類CD70序列與Genbank登錄號(hào)P32970的人類CD70在氨基酸序列上通常會(huì)有至少90％的同一性，并且含有這樣的氨基酸殘基，當(dāng)與其他物種(如鼠類)的CD70氨基酸序列相比時(shí)，這些氨基酸殘基將該氨基酸序列鑒定為是人源的。在某些情況下，人類CD70與Genbank登錄號(hào)為P32970的CD70在氨基酸序列上可具有至少95％，或者甚至至少96％、97％、98％或99％的同一性。在某些實(shí)施方案中，與Genbank登錄號(hào)P32970的CD70序列相比，人類CD70序列可展示出不超過10個(gè)氨基酸的差異。在某些實(shí)施方案中，與Genbank登錄號(hào)P32970的CD70序列相比，該人類CD70可展示出不超過5個(gè)，或者甚至不超過4、3、2或1個(gè)氨基酸的差異。百分比同一性可以如此處所說明進(jìn)行確定。
術(shù)語“免疫應(yīng)答”指例如淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞以及由以上細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子以及補(bǔ)體)的作用，該作用導(dǎo)致對(duì)侵入性病原體、被病原體感染的細(xì)胞或組織、癌細(xì)胞或者在自身免疫炎癥或病理炎癥情況下的正常人類細(xì)胞或組織的選擇性損害、破壞或?qū)⑺鼈儚娜梭w中清除。
“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”指在多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的生物化學(xué)關(guān)系，這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在信號(hào)從細(xì)胞的一部分傳遞至細(xì)胞的另一部分的轉(zhuǎn)遞中發(fā)揮作用。此處使用的短語“細(xì)胞表面受體”包括，例如，能夠接受信號(hào)并將這種信號(hào)傳遞穿過細(xì)胞的細(xì)胞膜的分子及分子的復(fù)合物。本發(fā)明的“細(xì)胞表面受體”的一個(gè)實(shí)例是CD70受體。
此處提及的術(shù)語“抗體”包括完整抗體以及它們的任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或它們的單鏈?！翱贵w”指包括至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的糖蛋白或其抗原結(jié)合部分，其中兩條重鏈以及兩條輕鏈之間通過二硫鍵相互連接。每一條重鏈均包括重鏈可變區(qū)(在此縮寫為VH)以及重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2以及CH3構(gòu)成。每一條輕鏈均包括輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為VL或Vk)以及輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包括一個(gè)結(jié)構(gòu)域，CL。VH以及VL區(qū)可以進(jìn)一步被分為高變區(qū)(稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))，其間散布有較保守的稱為框架區(qū)(FR)的區(qū)。每個(gè)VH以及VL均由三個(gè)CDR及四個(gè)FR構(gòu)成，按照以下順序從氨基端至羧基端排布FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，這些宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)以及經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。
在此所使用的術(shù)語“抗體的片段”以及抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱為“抗體部分”)指一個(gè)或多個(gè)保留了特異性結(jié)合抗原的能力的抗體的片段(如CD70)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段來實(shí)現(xiàn)。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”所涵蓋的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab′)2片段，包括通過在鉸鏈區(qū)的二硫橋鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)Fab’片段，它實(shí)質(zhì)上是帶有鉸鏈區(qū)部分的Fab(參見，F(xiàn)UNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul編著，第三版，1993)；(iv)由VH及CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(v)由抗體單臂的VL及VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(vi)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341544-546)，它由VH結(jié)構(gòu)域組成；(vii)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)；以及(viii)納米抗體(nanobody)，含有單一可變結(jié)構(gòu)域及兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。此外，雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL與VH是由單獨(dú)的基因編碼的，但是可以使用重組方法通過合成接頭將它們連接起來，使它們形成單一蛋白鏈，其中VL與VH區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，如Bird等人(1988)Science242423-426；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”也旨在涵蓋此類單鏈抗體。這些抗體片段是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得，并且對(duì)這些片段采用與完整抗體相同的方式進(jìn)行有用性篩選。
此處所使用的“分離的抗體”旨在指基本上沒有具備不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，特異性結(jié)合CD70的分離的抗體是基本上沒有特異性結(jié)合除CD70以外的抗原的抗體)。然而，特異地結(jié)合CD70的分離的抗體對(duì)其他抗原(例如來自其他物種的CD70分子)可能具有交叉反應(yīng)性。在某些實(shí)施方案中，分離的抗體特異性結(jié)合人類CD70而不與其它非人類CD70抗原交叉反應(yīng)。此外，分離的抗體可能基本上不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)品。
此處使用的術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指具有單一分子組成的抗體分子的制品。單克隆抗體組合物展示了針對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性及親和力。
此處使用的術(shù)語“人類抗體”旨在包括具有這樣可變區(qū)的抗體，在這些可變區(qū)中，框架區(qū)及CDR區(qū)均衍生自人類種系免疫蛋白序列。此外，如果該抗體包括恒定區(qū)，則該恒定區(qū)也衍生自人類種系免疫球蛋白序列。人類抗體可以包括隨后的修飾，包括天然或者合成的修飾。本發(fā)明的人類抗體可以包括不通過人類種系免疫球蛋白序列進(jìn)行編碼的氨基酸殘基(例如，在體外由隨機(jī)或定點(diǎn)特異性誘變或在體內(nèi)由體細(xì)胞突變引入的突變)。然而，在此所使用的術(shù)語“人類抗體”并非旨在包括這樣的抗體，其中來自另外的哺乳動(dòng)物物種(如小鼠)種系的CDR序列已經(jīng)被移植到人類框架序列上。
術(shù)語“人類單克隆抗體”指展示出單一結(jié)合特異性的抗體，這些抗體具有其中框架區(qū)以及CDR區(qū)均衍生自人類種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人類單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的，該雜交瘤細(xì)胞包括融合至無限增殖化細(xì)胞的從轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)處獲得的B細(xì)胞，其具有包括人類重鏈轉(zhuǎn)基因及輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。
此處使用的術(shù)語“重組人類抗體”包括由重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人類抗體，例如(a)從動(dòng)物(例如小鼠)或是由其制備出的雜交瘤(以下將進(jìn)一步說明)中分離的抗體，該動(dòng)物對(duì)于人類免疫球蛋白基因是轉(zhuǎn)基因性的或轉(zhuǎn)染色體性的；(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)人類抗體的宿主細(xì)胞(例如，從轉(zhuǎn)染瘤)中分離的抗體，(c)從重組的、組合的人類抗體文庫中分離的抗體，以及(d)由其他方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，這些方法涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列。此類重組人類抗體具有其中框架區(qū)及CDR區(qū)均衍生自人類種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。然而，在某些實(shí)施方案中，此類重組的人類抗體可進(jìn)行體外誘變(或者，當(dāng)使用針對(duì)人類Ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，進(jìn)行體內(nèi)體誘變)，并且因此重組抗體VH和VL區(qū)的氨基酸序列是也許并不天然存在于體內(nèi)人類抗體種系表達(dá)譜中的序列，盡管它們衍生自人類種系的VH和VL序列并與其相關(guān)。
此處使用的“同種型”指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體種類(例如IgM或IgG1)。
短語“識(shí)別抗原的抗體”以及“對(duì)抗原特異的抗體”此處可以與術(shù)語“特異性結(jié)合抗原的抗體”互換使用。
術(shù)語“人類抗體衍生物”指人類抗體的任何經(jīng)修飾的形式，例如，該抗體與另一種試劑或抗體的偶聯(lián)物。
術(shù)語“人源化抗體”旨在表示其中衍生自另一個(gè)哺乳動(dòng)物物種(如小鼠)種系的CDR序列已被移植到人類框架序列上的抗體?？稍谌祟惪蚣苄蛄兄羞M(jìn)行額外的框架區(qū)修飾。
術(shù)語“嵌合抗體”旨在表示其中可變區(qū)序列衍生于一個(gè)物種而恒定區(qū)序列衍生于另一個(gè)物種的抗體，如其中可變區(qū)序列衍生于小鼠抗體而恒定區(qū)序列衍生于人類抗體的抗體。
術(shù)語“抗體模擬物”旨在表示能夠模擬抗體的結(jié)合抗原能力的分子，但是它們不局限于天然抗體結(jié)構(gòu)。此類抗體模擬物的實(shí)例包括但不限于親和體(Affibody)、經(jīng)設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin)、抗運(yùn)載蛋白(Anticalin)、高親和性多聚體(Avimer)以及反向抗體(Versabody)，在模擬傳統(tǒng)抗體結(jié)合時(shí)，所有這些抗體模擬物采用從不同機(jī)理產(chǎn)生并通過不同機(jī)理發(fā)揮作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)。
此處使用的術(shù)語“配偶體分子”指在抗體-配偶體分子偶聯(lián)物中偶聯(lián)至抗體的實(shí)體。配偶體分子的實(shí)例包括藥物、毒素、標(biāo)記分子(包括但不限于肽以及小分子標(biāo)記物，如熒光染料標(biāo)記物，以及單原子標(biāo)記物，如放射性同位素)、蛋白質(zhì)以及治療劑。
此處使用的“特異性結(jié)合人類CD70”的抗體旨在指以5×10-8M或更小的KD結(jié)合人類CD70，更優(yōu)選以1×10-8M或更小，更優(yōu)選6×10-9M或更小，更優(yōu)選3×10-9M或更小，甚至更優(yōu)選2×10-9M或更小的KD結(jié)合人類CD70的抗體。
此處使用的術(shù)語“Kassoc”或“Ka”旨在指特定的抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率，而此處使用的術(shù)語“Kdis”或“Kd，”旨在指特定的抗體-抗原相互作用的解離速率。此處使用的術(shù)語“KD”旨在指解離常數(shù)，它是由Kd與Ka之比(即Kd/Ka)得到，并表示為摩爾濃度(M)?？贵w的KD值可以使用本領(lǐng)域已經(jīng)充分確定的方法進(jìn)行確定。確定抗體的KD的優(yōu)選方法是通過使用表面等離子共振，優(yōu)選使用諸如

系統(tǒng)的生物傳感器系統(tǒng)。
此處使用的術(shù)語IgG抗體的“高親和力”是指對(duì)于靶抗原抗體具有的KD為1×10-7M或更小，更優(yōu)選為1×10-8M或更小，更優(yōu)選為1×10-9M或更小，并且甚至更優(yōu)選為1×10-10M或更小。然而，對(duì)于其他抗體同種型而言，“高親和力”結(jié)合可以發(fā)生變化。例如，對(duì)于IgM同種型而言，“高親和力”結(jié)合是指抗體具有的KD值為1×10-7M或更小，更優(yōu)選為1×10-8M或更小，甚至更優(yōu)選為1×10-9M或更小。
此處使用的術(shù)語“基本上不結(jié)合”蛋白質(zhì)或細(xì)胞是指不結(jié)合或不以高親和力結(jié)合蛋白質(zhì)或細(xì)胞，即，以1×10-6M或更大，更優(yōu)選為1×10-5M或更大，更優(yōu)選為1×10-4M或更大，更優(yōu)選為1×10-3M或更大，甚至更優(yōu)選為1×10-2M或更大的KD結(jié)合蛋白質(zhì)或細(xì)胞。
此處使用的術(shù)語“受試者”包括任何人類或非人類動(dòng)物。術(shù)語“非人類動(dòng)物”包括所有脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物及非哺乳動(dòng)物，例如非人靈長類動(dòng)物、綿羊、犬、貓、馬、牛、雞、兩棲動(dòng)物、魚、爬行動(dòng)物等等。
符號(hào)“-”，不論是用作鍵或顯示為垂直于鍵時(shí)均表示這樣的點(diǎn)，在該點(diǎn)處所展示的部分連接到分子、固相支撐部分等的其余部分上。
除非另作說明，術(shù)語“烷基”就其本身或作為另一個(gè)取代基的部分而言指直鏈或支鏈或環(huán)烴基或它們的組合，它可能是完全飽和的、單不飽和的或多不飽和的，并且能包括二價(jià)以及多價(jià)基，具有所指定的碳原子數(shù)目(即C1-C10是指1至10個(gè)碳原子)。飽和烴基的實(shí)例包括但不限于以下基團(tuán)，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基以及例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物或異構(gòu)體，等等。不飽和烷基是具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵或三鍵的基團(tuán)。不飽和烷基的實(shí)例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基以及3-丙炔基、3-丁炔基，以及更高級(jí)同系物以及異構(gòu)體。除非另有說明，術(shù)語“烷基”還意在包括那些以下詳細(xì)說明的烷基衍生物，如“雜烷基”。限于烴基的烷基基團(tuán)被稱為“同型烷基”。
術(shù)語“亞烷基”就其本身或作為另一個(gè)取代基的部分而言是指衍生自烷烴的二價(jià)基團(tuán)，例如但不局限于-CH2CH2CH2CH2-，并且進(jìn)一步包括那些如下說明為“雜亞烷基”的基團(tuán)。一般，烷基(或亞烷基)應(yīng)具有1到24個(gè)碳原子，其中具有10個(gè)或更少的碳原子的那些基團(tuán)在本發(fā)明中是優(yōu)選的。“低級(jí)烷基”或“低級(jí)亞烷基”是較短的鏈烷基或亞烷基，一般具有八個(gè)或更少的碳原子。
除非另作說明，術(shù)語“雜烷基”就其本身或與另一個(gè)術(shù)語組合，是指穩(wěn)定的直鏈或支鏈或環(huán)烴基或它們的組合，由所提及數(shù)目的碳原子以及至少一個(gè)雜原子組成，該雜原子選自O(shè)、N、Si以及S，并且其中氮、碳以及硫原子可任選地受到氧化，并且氮雜原子可任選地受到季銨化。一個(gè)或多個(gè)雜原子O、N、S及Si可位于雜烷基的任何內(nèi)部位置，或可位于烷基連接于該分子其余部分的位置上。實(shí)例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2，-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3以及-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多兩個(gè)雜原子可以是連續(xù)的，例如-CH2-NH-OCH3以及-CH2-O-Si(CH3)3。類似地，術(shù)語“雜亞烷基”就其本身或作為另一個(gè)取代基的部分而言是指衍生自雜烷基的二價(jià)基，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-以及-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對(duì)于雜亞烷基，雜原子也可占據(jù)鏈末端的任一端或兩端(例如，亞烷基氧基、亞烷基二氧基、亞烷基氨基、亞烷基二氨基以及類似物)。術(shù)語“雜烷基”與“雜亞烷基”包括聚(乙二醇)及其衍生物(參見例如，Shearwater PolymersCatalog，2001)。此外，對(duì)于亞烷基以及雜亞烷基連接基團(tuán)，書寫連接基團(tuán)的式的方向并不表示連接基團(tuán)的方向。例如，式-C(O)2R’-代表-C(O)2R’-以及-R’C(O)2-。
與術(shù)語“烷基”或“雜烷基”組合使用的術(shù)語“低級(jí)”是指具有1到6個(gè)碳原子的部分。
術(shù)語“烷氧基”、“烷氨基”、“烷基磺?；币约啊巴榱蚧?或硫代烷氧基)都是以它們的常規(guī)意義使用，并分別指通過氧原子、氨基基團(tuán)、SO2基團(tuán)或硫原子連接于該分子其余部分的那些烷基基團(tuán)。術(shù)語“芳基磺?；笔侵竿ㄟ^SO2基團(tuán)連接于分子其余部分的芳基，且術(shù)語“巰基”是指SH基團(tuán)。
一般而言，“?；〈币策x自以上所給出的組。在此使用的術(shù)語“?；〈敝高B接于羰基碳并滿足其化合價(jià)的基團(tuán)，該羰基碳直接或間接地連接于本發(fā)明化合物的多環(huán)核上。
除非另作說明，術(shù)語“環(huán)烷基”與“雜環(huán)烷基”，就它們本身或與其他術(shù)語組合而言，分別表示環(huán)型的取代或未取代的“烷基”以及取代或未取代的“雜烷基”。另外，對(duì)于雜環(huán)烷基，雜原子可占據(jù)雜環(huán)連接于分子的其余部分的位置。環(huán)烷基的實(shí)例包括但不限于環(huán)戊基、環(huán)己基、1-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基以及類似物。雜環(huán)烷基的實(shí)例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基以及類似物。環(huán)結(jié)構(gòu)的雜原子以及碳原子可任選地受到氧化。
除非另作說明，術(shù)語“鹵”或“鹵素”，就它們自身或作為另一個(gè)取代基的部分而言是指氟、氯、溴或碘原子。此外，術(shù)語如“鹵烷基”是指包括單鹵烷基以及聚鹵烷基。例如，術(shù)語“鹵(C1-C4)烷基”旨在包括但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯代丁基、3-溴丙基以及類似物。
除非另作說明，術(shù)語“芳基”是指取代或未取代的多不飽和的芳香烴取代基，它可以是單環(huán)或多環(huán)(優(yōu)選地從1至3個(gè)環(huán))的，這些環(huán)稠合在一起或以共價(jià)鍵相連接。術(shù)語“雜芳基”指含有從一至四個(gè)選自N、O以及S雜原子的芳基基團(tuán)(或環(huán))，其中氮、碳以及硫原子可任選地被氧化，并且氮原子可任選地被季銨化。雜芳基可以通過雜原子連接于分子的其余部分。芳基以及雜芳基的非限制性實(shí)例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。以上提到的每一個(gè)芳基以及雜芳基環(huán)體系的取代基選自以下說明的可接受的取代基?！胺蓟币约啊半s芳基”也包括環(huán)體系，其中一個(gè)或多個(gè)非芳香族環(huán)體系被稠合或者以其他方式結(jié)合至芳基或雜芳基體系上。
簡言之，術(shù)語“芳基”當(dāng)與其他術(shù)語組合使用時(shí)(如芳氧基、芳基硫氧基(arylthioxy)、芳烷基)包括以上定義的芳基環(huán)以及雜芳基環(huán)。因此，術(shù)語“芳基烷基”意在包括那些基團(tuán)，其中芳基連接于烷基(例如苯甲基、苯乙基、吡啶甲基以及類似物)；該烷基包括其中碳原子(例如，亞甲基基團(tuán))已被例如氧原子替換的那些烷基基團(tuán)(如苯氧甲基、2-吡啶氧甲基、3-(1-萘氧基)丙基以及類似物)。
以上術(shù)語(如“烷基”、“雜烷基”、“芳基”以及“雜芳基”)各自均包括指定基團(tuán)的取代以及未取代這兩種形式。以下提供每個(gè)類型基團(tuán)的優(yōu)選取代基。
烷基以及雜烷基(包括那些經(jīng)常提到的如亞烷基、鏈烯基、雜亞烷基、雜烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基以及雜環(huán)烯基)的取代基一般分別稱為“烷基取代基”以及“雜烷基取代基”，并且它們可以是下述多種基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)，這些基團(tuán)選自但不限于-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R’”、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R’”、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN以及-NO2，數(shù)量在從0到(2m’+1)的范圍內(nèi)，其中m’是這種基團(tuán)的碳原子的總數(shù)。R’、R”、R’”以及R””各自均優(yōu)選獨(dú)立地指氫、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基，例如1至3個(gè)鹵素取代的芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。當(dāng)本發(fā)明的化合物包括多于一個(gè)R基團(tuán)時(shí)，例如，當(dāng)這些基團(tuán)中多于一個(gè)基團(tuán)存在時(shí)，每個(gè)R基團(tuán)獨(dú)立地選擇，如對(duì)每個(gè)R’、R”、R’”以及R””基團(tuán)選擇一樣。當(dāng)R’和R”連接于相同的氮原子時(shí)，它們可與氮原子組合成5、6或7元環(huán)。例如，-NR’R”旨在包括但不局限于，1-吡咯烷基以及4-嗎啉基。從以上取代基的討論中，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員會(huì)明白術(shù)語“烷基”旨在包括結(jié)合到不是氫基的基團(tuán)上的碳原子的基團(tuán)，例如鹵烷基(如-CF3以及-CH2CF3)以及?；?如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3以及類似物)。
類似于對(duì)烷基所說明的取代基，芳基取代基以及雜芳基取代基通常分別稱為“芳基取代基”以及“雜芳基取代基”，并且是可改變的和選自，例如鹵素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R’”、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R’”、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN以及-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基以及氟(C1-C4)烷基，并且其數(shù)目從0到芳香環(huán)體系上開放(open)化合價(jià)的總數(shù)的范圍內(nèi)；以及其中R’、R”、R’”以及R””優(yōu)選獨(dú)立地選自氫、(C1-C8)烷基以及雜烷基、未取代的芳基以及雜芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基以及(未取代的芳基)氧-(C1-C4)烷基。當(dāng)本發(fā)明的化合物包括多于一個(gè)R基團(tuán)時(shí)，例如，當(dāng)這些基團(tuán)中多于一個(gè)基團(tuán)存在時(shí)，每個(gè)R基團(tuán)獨(dú)立地選擇，如對(duì)每個(gè)R’、R”、R’”以及R””基團(tuán)選擇一樣。
可任選地，在芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個(gè)芳基取代基可由具有式為-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基替換，其中，T和U獨(dú)立為-NR-、-O-、-CRR’-或單鍵；且q是從0到3的整數(shù)?？商娲?，在芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個(gè)取代基可任選由具有式為-A-(CH2)r-B-的取代基代替，其中，A和B獨(dú)立地為-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或單鍵；且r是從1到4的整數(shù)。如此形成的新環(huán)的單鍵之一可任選由雙鍵代替?？商娲兀诜蓟螂s芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個(gè)取代基可任選地由具有式為-(CRR’)s-X-(CR”R’”)d-的取代基代替，其中s和d獨(dú)立地是從0至3的整數(shù)，并且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。優(yōu)選地，取代基R、R’、R”以及R’”獨(dú)立地選自氫或取代或未取代的(C1-C6)烷基。
此處使用的術(shù)語“二磷酸酯”包括但不局限于包含兩個(gè)磷酸酯基團(tuán)的磷酸的酯。術(shù)語“三磷酸酯”包括但不局限于包含三個(gè)磷酸酯基團(tuán)的磷酸的酯。例如，具有二磷酸酯或三磷酸酯的特定的藥物包括
此處使用的術(shù)語“雜原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)以及硅(Si)。
符號(hào)“R”是一個(gè)通用縮寫，它代表取代基，該取代基選自取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基以及取代或未取代的雜環(huán)基基團(tuán)。
在以下各分部中進(jìn)一步詳細(xì)地說明了本發(fā)明的不同方面。
具有特定功能特性的抗-CD70抗體 本發(fā)明抗體的特征為抗體的特定功能特征或特性。例如，該抗體特異地結(jié)合人類CD70，例如表達(dá)在細(xì)胞表面的人類CD70。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體以高親和力結(jié)合CD70，例如以1×10-7M或更小的KD，更優(yōu)選以5×10-8M或更小的KD，甚至更優(yōu)選以1×10-8M或更小的KD結(jié)合CD70。評(píng)估抗體對(duì)CD70的結(jié)合親和力的標(biāo)準(zhǔn)測定是本領(lǐng)域中已知的，包括例如ELISA、蛋白印跡法以及RIA。在實(shí)施例中詳細(xì)地說明了適宜的測定。也可以用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)測定評(píng)估抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(如結(jié)合親和力)，例如通過ELISA、Scatchard以及Biacore分析。作為另一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合腎癌腫瘤細(xì)胞系，例如786-O、A-498、ACHN、Caki-1或Caki-2細(xì)胞系。作為又另一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明的抗體可以結(jié)合B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系，例如Daudi、HuT 78、Raji或Granta-519細(xì)胞系。
本發(fā)明的抗-CD70抗體結(jié)合人類CD70，并且優(yōu)選地表現(xiàn)以下特性中的一種或多種 (a)以1×10-7M或更小的KD結(jié)合人類CD70；并且 (b)結(jié)合腎細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞系； (c)結(jié)合淋巴瘤細(xì)胞系，如B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系； (d)被表達(dá)CD70的細(xì)胞內(nèi)化； __(e)對(duì)表達(dá)CD70的細(xì)胞顯示出抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)；以及 (f)當(dāng)與細(xì)胞毒素相偶聯(lián)時(shí)在體內(nèi)抑制表達(dá)CD70的細(xì)胞的生長。
優(yōu)選地，該抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少兩種。更優(yōu)選地，該抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少三種。更優(yōu)選地，該抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的四種。甚至更優(yōu)選地，該抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的五種。甚至更優(yōu)選地，該抗體表現(xiàn)出全部六種特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體與CD70結(jié)合的親和力為5×10-9M或更小。在又另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)該抗體與細(xì)胞毒素相偶聯(lián)時(shí)在體內(nèi)抗體抑制表達(dá)CD70的腫瘤細(xì)胞的生長。
本發(fā)明的抗體與CD70的結(jié)合可用一種或多種本領(lǐng)域已建立的技術(shù)進(jìn)行評(píng)估。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體可用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測試，其中該抗體與表達(dá)人類CD70的細(xì)胞系進(jìn)行反應(yīng)，例如已經(jīng)得到轉(zhuǎn)染而能在其表面表達(dá)CD70的CHO細(xì)胞，或表達(dá)CD70的細(xì)胞系，如786-O、A498、ACHN、Caki-1、和/或Caki-2(參見如實(shí)施例4和5中的適宜測定，以及對(duì)細(xì)胞系的進(jìn)一步說明)。另外地或可選擇地，抗體的結(jié)合，包括結(jié)合動(dòng)力學(xué)(如KD值)可用BIAcore結(jié)合測定進(jìn)行測試。其他適宜的結(jié)合測定包括ELISA測定，例如利用重組的CD70蛋白(參見如實(shí)施例1中的適宜測定)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體與CD70蛋白結(jié)合的KD為5×10-8M或更小、與CD70蛋白結(jié)合的KD為3×10-8M或更小、與CD70蛋白結(jié)合的KD為1×10-8M或更小、與CD70蛋白結(jié)合的KD為7×10-9M或更小、與CD70蛋白結(jié)合的KD為6×10-9M或更小或者與CD70蛋白結(jié)合的KD為5×10-9M或更小。該抗體對(duì)CD70的結(jié)合親和力可以通過例如標(biāo)準(zhǔn)BIACORE分析來評(píng)估。
在本領(lǐng)域已知通過表達(dá)CD70的細(xì)胞用于評(píng)估抗-CD70抗體的內(nèi)化作用的標(biāo)準(zhǔn)測定(參見如在實(shí)施例7與21中說明的Hum-ZAP以及免疫熒光測定)。在本領(lǐng)域中也已知用于評(píng)估CD70與CD27的結(jié)合以及通過抗-CD70抗體對(duì)其抑制的標(biāo)準(zhǔn)測定(參見如在實(shí)施例17中說明的測定)。用于評(píng)估針對(duì)表達(dá)CD70的細(xì)胞的ADCC的標(biāo)準(zhǔn)測定在本領(lǐng)域中也是已知的(參見如在實(shí)施例9中說明的ADCC測定)。通過抗-CD70抗體以及其細(xì)胞毒素偶聯(lián)物用于評(píng)估在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長的標(biāo)準(zhǔn)測定在本領(lǐng)域中也是已知的(參見如在實(shí)施例18、19、24至31以及36至41中說明的腫瘤異種移植小鼠模型)。
本發(fā)明優(yōu)選的抗體是人類單克隆抗體。另外地或可替代地，該抗體可以是，例如嵌合的或人源化的單克隆抗體。
單克隆抗體2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4 本發(fā)明的示例性抗體包括人類單克隆抗體2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4，它們?nèi)缭趯?shí)施例1與2所說明的那樣進(jìn)行分離并且進(jìn)行結(jié)構(gòu)性表征。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VH氨基酸序列分別在SEQ ID NO1、2、3、4、5、73以及6中顯示。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VL氨基酸序列分別在SEQID NO7、8、9、10、11、11以及12中顯示(69A7與69A7Y均具有氨基酸序列SEQ ID NO11的VL)?？紤]到這些抗體中每一種均能結(jié)合CD70，可將VH和VL序列進(jìn)行“混合并匹配”，以產(chǎn)生本發(fā)明的其他抗-CD70結(jié)合分子?？梢允褂靡陨弦约霸趯?shí)施例中說明的結(jié)合測定(如FACS或ELISA)來測試此類“混合并匹配”的抗體與CD70的結(jié)合。優(yōu)選地，當(dāng)VH和VL鏈得到混合并匹配時(shí)，來自特定VH/VL對(duì)的VH序列由結(jié)構(gòu)相似的VH序列代替。同樣地，優(yōu)選來自特定VH/VL對(duì)的VL序列由結(jié)構(gòu)相似的VL序列代替。
因此，一方面，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包括 (a)重鏈可變區(qū)，包括選自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6以及73的氨基酸序列；以及 (b)輕鏈可變區(qū)，包括選自SEQ ID NO7、8、9、10、11以及12的氨基酸序列； 其中該抗體特異性地結(jié)合CD70。
優(yōu)選的重鏈及輕鏈組合包括 (a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO1；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO7；或 (a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO2；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO8；或 (a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO3；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO9；或 (a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO4；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括SEQ ID NO10的氨基酸序列；或 (a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO5或73；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO11；或 (a)重鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO6；以及(b)輕鏈可變區(qū)，包括氨基酸序列SEQ ID NO12。
另一方面，本發(fā)明提供了包括2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的重鏈和輕鏈CDR1、CDR2以及CDR3或它們的組合的抗體。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VH CDR1氨基酸序列分別在SEQ ID NO13、14、15、16、17、17以及18中顯示(69A7與69A7Y均具有SEQ ID NO17的VH CDR1序列)。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VH CDR2的氨基酸序列分別在SEQ ID NO19、20、21、22、23、23以及24中顯示(69A7與69A7Y均具有在SEQ ID NO23中顯示的VH CDR2序列)。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VH CDR3的氨基酸序列分別在SEQ ID NO25、26、27、28、29、75以及30中顯示。
2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VK CDR1的氨基酸序列分別在SEQ ID NO31、32、33、34、35、35以及36中顯示(69A7與69A7Y均具有在SEQ ID NO35中顯示的VK CDR1序列)。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VK CDR2的氨基酸序列分別在SEQID NO37、38、39、40、41、41以及42中顯示(69A7與69A7Y均具有在SEQ ID NO41中顯示的VK CDR2序列)。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VKCDR3的氨基酸序列分別在SEQ ID NO43、44、45、46、47、47以及48中顯示(69A7與69A7Y均有在SEQ ID NO47中顯示的VK CDR3序列)。這些CDR區(qū)是用Kabat系統(tǒng)繪出的(Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。
鑒于這些抗體中每一種均能夠結(jié)合CD70，并且主要由CDR1、CDR2及CDR3區(qū)提供抗原結(jié)合特異性，VH CDR1、CDR2、及CDR3序列以及Vk CDR1、CDR2、及CDR3序列可以得到“混合并匹配”(即，來自不同抗體的CDR可以得到混合并匹配，但是每種抗體均必須包含VH CDR1、CDR2、及CDR3，以及Vk CDR1、CDR2，及CDR3)，以產(chǎn)生本發(fā)明的其他抗-CD70結(jié)合分子。使用以上及在實(shí)施例中說明的結(jié)合測定(如FACS、ELISA、Biacore分析)可以測試此類“混和并匹配”的抗體的CD70結(jié)合。優(yōu)選地，當(dāng)VH CDR序列得到混合并匹配時(shí)，來自特定VH序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3序列由結(jié)構(gòu)相似的CDR序列代替。同樣地，當(dāng)VkCDR得到混合并且匹配時(shí)，來自特定Vk序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3序列由結(jié)構(gòu)相似的CDR序列代替。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員非常清楚的是，通過將來自在此披露的單克隆抗體2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的CDR序列的結(jié)構(gòu)類似序列代替一個(gè)或多個(gè)VH和/或VL CDR區(qū)序列，可以產(chǎn)生新的VH和VL序列。
因此，另一方面，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包括 (a)重鏈可變區(qū)CDR1，包括選自SEQ ID NO13、14、15、16、17以及18的氨基酸序列； (b)重鏈可變區(qū)CDR2，包括選自SEQ ID NO19、20、21、22、23以及24的氨基酸序列； (c)重鏈可變區(qū)CDR3，包括選自SEQ ID NO25、26、27、28、29、30以及75的氨基酸序列； (d)輕鏈可變區(qū)CDR1，包括選自SEQ ID NO31、32、33、34、35以及36的氨基酸序列； (e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括選自SEQ ID NO37、38、39、40、41以及42的氨基酸序列；以及 (f)輕鏈可變區(qū)CDR3，包括選自SEQ ID NO43、44、45、46、47以及48的氨基酸序列， 其中該抗體特異地結(jié)合CD70，優(yōu)選結(jié)合人類CD70。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體包括 (a)重鏈可變區(qū)CDR1，包括SEQ ID NO13； (b)重鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO19； (c)重鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQ ID NO25； (d)輕鏈可變區(qū)CDR1，包括SEQ ID NO31； (e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO37；以及 (f)輕鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQ ID NO43。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體包括 (a)重鏈可變區(qū)CDR1，包括SEQ ID NO14； (b)重鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO20； (c)重鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQ ID NO26； (d)輕鏈可變區(qū)CDR1，包括SEQ ID NO32； (e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO38；以及 (f)輕鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQ ID NO44。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體包括 (a)重鏈可變區(qū)CDR1，包括SEQ ID NO15； (b)重鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO21； (c)重鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQ ID NO27； (d)輕鏈可變區(qū)CDR1，包括SEQ ID NO33； (e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO39；以及 (f)輕鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQ ID NO45。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體包括 (a)重鏈可變區(qū)CDR1，包括SEQ ID NO16； (b)重鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO22； (c)重鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQ ID NO28； (d)輕鏈可變區(qū)CDR1，包括SEQ ID NO34； (e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO40；以及 (f)輕鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQ ID NO46。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體包括 (a)重鏈可變區(qū)CDR1，包括SEQ ID NO17； (b)重鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO23； (c)重鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQ ID NO29或75； (d)輕鏈可變區(qū)CDR1，包括SEQ ID NO35； (e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO41；以及 (f)輕鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQ ID NO47。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體包括 (a)重鏈可變區(qū)CDR1，包括SEQ ID NO18； (b)重鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO24； (c)重鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQ ID NO30； (d)輕鏈可變區(qū)CDR1，包括SEQ ID NO36； (e)輕鏈可變區(qū)CDR2，包括SEQ ID NO42；以及 (f)輕鏈可變區(qū)CDR3，包括SEQ ID NO48。
本領(lǐng)域熟知CDR3結(jié)構(gòu)域不依賴于CDR1和/或CDR2結(jié)構(gòu)域，可以獨(dú)自確定抗體對(duì)同族抗原的結(jié)合特異性，并且可預(yù)測地產(chǎn)生多種抗體，這些抗體具有基于共同的CDR3序列的相同結(jié)合特異性。參見例如，Klimka等人，British J.of Cancer 83(2)252-260(2000)(說明了僅使用鼠類抗CD30抗體Ki-4的重鏈可變結(jié)構(gòu)域CDR3來產(chǎn)生人源化抗CD30抗體)；Beiboer等人，J.Mol.Biol.296833-849(2000)(說明了僅使用親代鼠類MOC-31抗EGP-2抗體的重鏈CDR3序列的重組上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗體)；Rader等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.958910-8915(1998)(說明了使用鼠類抗整聯(lián)蛋白αvβ3抗體LM609的重鏈和輕鏈可變CDR3結(jié)構(gòu)域的一系列人源化抗整聯(lián)蛋白αvβ3抗體，其中每個(gè)成員抗體在CDR3結(jié)構(gòu)域之外均包含不同的序列，并均能與親代鼠類抗體一樣結(jié)合相同的表位，并且其結(jié)合親和力與親代鼠類抗體一樣高或比親代鼠類抗體更高)；Barbas等人，J.Am.Chem.Soc.1162161-2162(1994)(披露CDR3結(jié)構(gòu)域?qū)乖Y(jié)合的作用最大)；Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.922529-2533(1995)(說明了將三個(gè)針對(duì)人類胎盤DNA的Fab(SI-1、SI-40以及SI-32)的重鏈CDR3序列移植到抗破傷風(fēng)類毒素Fab的重鏈上，藉此替換存在的重鏈CDR3，并表明CDR3結(jié)構(gòu)域獨(dú)自賦予了結(jié)合特異性)；以及Ditzel等人，J.Immunol.157739-749(1996)(說明了移植研究，其中僅將親代多特異性Fab LNA3的重鏈CDR3移植到結(jié)合破傷風(fēng)類毒素Fab p313抗體的單特異性IgG重鏈上，就足以保留親代Fab的結(jié)合特異性)；Berezov等人，BIAjournal 8Scientific Review 8(2001)(說明了基于抗HER2單克隆抗體的CDR3的肽模擬物)；Igarashi等人，J.Biochem(Tokyo)117452-7(1995)(說明了對(duì)應(yīng)于抗磷脂酰絲氨酸抗體的CDR3結(jié)構(gòu)域的12個(gè)氨基酸的合成多肽)；Bourgeois等人，J.Virol 72807-10(1998)(顯示了衍生自抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗體的重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域的單肽能夠在體外中和該病毒)；Levi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.904374-8(1993)(說明了基于鼠類抗HIV抗體的重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域的肽)；Polymenis和Stoller，J.Immunol.1525218-5329(1994)(說明了通過移植Z-DNA結(jié)合抗體的重鏈CDR3區(qū)使得scFv能夠結(jié)合)；以及Xu和Davis，Immunity 1337-45(2000)(說明了重鏈CDR3的多樣性足以使得其他部分相同的IgM分子區(qū)分多種半抗原以及蛋白質(zhì)抗原)。還參見于美國專利號(hào)6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905；以及5,760,185，說明了由單一CDR結(jié)構(gòu)域定義的已獲得專利的抗體。這些參考文獻(xiàn)中每一篇的全文均由此合并作為參考。
因此，本發(fā)明提供包括來自衍生自人類或非人類動(dòng)物抗體的一個(gè)或多個(gè)重和/或輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，其中該單克隆抗體能夠特異性結(jié)合CD70。在某些方面，本發(fā)明提供包括來自非人類抗體(例如小鼠或大鼠抗體)的一個(gè)或多個(gè)重和/或輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，其中該單克隆抗體能夠特異性結(jié)合CD70。在一些實(shí)施方案中，此類創(chuàng)造性的抗體包括來自非人類抗體的一個(gè)或多個(gè)重和/或輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，與相應(yīng)的親代的非人類抗體比較，(a)能與其競爭而進(jìn)行結(jié)合；(b)保留功能特性；(c)結(jié)合到相同的表位；和/或(d)具有相似的結(jié)合親和力。
在其他方面，本發(fā)明提供的單克隆抗體包括來自人類抗體(例如，獲自非人類動(dòng)物的人類抗體)的一個(gè)或多個(gè)重和/或輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，其中該人類抗體能夠特異性結(jié)合CD70。在其他方面，本發(fā)明提供的單克隆抗體包括來自第一人類抗體(例如獲自非人類動(dòng)物的人類抗體)的一個(gè)或多個(gè)重和/或輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，其中該第一人類抗體能夠特異性結(jié)合CD70，并且其中來自該第一人類抗體的CDR3結(jié)構(gòu)域替換缺乏CD70結(jié)合特異性的人類抗體的CDR3結(jié)構(gòu)域，以產(chǎn)生能特異地結(jié)合CD70的第二人類抗體。在一些實(shí)施方案中，此類本發(fā)明的抗體包括來自第一人類抗體的一個(gè)或多個(gè)重和/或輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，與相應(yīng)的親代第一人類抗體相比較，(a)能與其競爭而進(jìn)行結(jié)合；(b)保留功能特性；(c)結(jié)合到相同的表位；和/或(d)具有相似的結(jié)合親和力。
具有特定種系序列的抗體 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括來自特定的種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區(qū)和/或來自特定的種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)。
例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，包括作為人類VH 3-30.3基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體特異地結(jié)合CD70。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，包括作為人類VH 3-33基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體特異地結(jié)合CD70。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，包括作為人類VH 4-61基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體特異地結(jié)合CD70。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，包括作為人類VH 3-23基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體特異地結(jié)合CD70。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，包括作為人類VK L6基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合CD70。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，包括作為人類VK L18基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合CD70。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，包括作為人類VK L15基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合CD70。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，包括作為人類VK A27基因的產(chǎn)物或衍生自該基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合CD70。
在其它另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或它的抗原結(jié)合部分，其中該抗體 (a)包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)是人類VH 3-30.3、3-33、4-61或3-23基因的產(chǎn)物或衍生自該基因(這些基因所編碼的氨基酸序列分別在SEQ ID NO61、62、63以及64中給出)； (b)包括輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)是人類基因VK L6、L18、L15或A27基因的產(chǎn)物或衍生自該基因(這些基因所編碼的氨基酸序列分別在SEQ ID NO65、66、67以及68中給出)；并且 (c)特異地結(jié)合CD70。
此類抗體也可能擁有以上詳細(xì)說明的一個(gè)或多個(gè)功能特性，例如結(jié)合人類CD70的高親和力、由表達(dá)CD70的細(xì)胞內(nèi)化、介導(dǎo)針對(duì)表達(dá)CD70的細(xì)胞的ADCC的能力、和/或當(dāng)與細(xì)胞毒素相偶聯(lián)時(shí)在體內(nèi)抑制表達(dá)CD70的腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長的能力。
分別具有VH 3-30.3以及Vk L6的VH以及Vk的抗體的實(shí)例是2H5。分別具有VH3-30.3以及VK L18的VH以及VK的抗體的實(shí)例是10B4。分別具有VH 3-33以及VK L15的VH以及VK的抗體的實(shí)例是8B5和18E7。分別具有VH 4-61以及VK L6的VH以及VK的抗體的實(shí)例是69A7和69A7Y。分別具有VH 3-23以及VKA27的VH以及VK的抗體的實(shí)例是1F4。
此類抗體也可能擁有以上詳細(xì)說明的一個(gè)或多個(gè)功能特性，例如結(jié)合人類CD70的高親和力、由表達(dá)CD70的細(xì)胞內(nèi)化、結(jié)合腎細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞系、結(jié)合淋巴瘤細(xì)胞系、介導(dǎo)針對(duì)表達(dá)CD70的細(xì)胞的ADCC的能力、和/或當(dāng)與細(xì)胞毒素相偶聯(lián)時(shí)在體內(nèi)抑制表達(dá)CD70的腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長的能力。
如在此所用，如果人類抗體的可變區(qū)從使用人類種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)中獲得，則該人類抗體包含重鏈或輕鏈可變區(qū)，它是特定種系序列的“產(chǎn)物”或者“衍生于”該特定種系序列。此類系統(tǒng)包括用目的抗原對(duì)攜帶人類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫，或者用目的抗原對(duì)展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因文庫進(jìn)行篩選。是人類種系免疫球蛋白序列的“產(chǎn)物”或“衍生于”該序列的人類抗體可以通過對(duì)該人類抗體的氨基酸序列與人類種系免疫球蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較，并選擇在序列上最接近(即最大％同一性)人類抗體的序列的人類種系免疫球蛋白序列這樣進(jìn)行鑒定。是特定人類種系免疫球蛋白序列的“產(chǎn)物”或“衍生于”該序列的人類抗體，與該種系序列相比可含有不同的氨基酸，這是由于例如天然發(fā)生的體細(xì)胞突變或故意引入的定點(diǎn)突變。然而，經(jīng)選擇的人類抗體一般與由人類種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90％的同一性，并且當(dāng)與其他物種(例如，鼠類種系序列)的種系免疫球蛋白氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，包含將該人類抗體鑒定為人類抗體的氨基酸殘基。在某些情況中，人類抗體與由種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列在氨基酸序列上可具有至少95％或甚至至少96％、97％、98％，或99％的同一性。一般，與由人類種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列相比，衍生于該特定人類種系序列的人類抗體將展示不超過10個(gè)的氨基酸差異。在某些情況中，與由種系免疫球蛋白基因進(jìn)行編碼的氨基酸序列相比，該人類抗體可以展示出不超過5個(gè)，或甚至不超過4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或1個(gè)的氨基酸差異。
同源抗體 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括重鏈及輕鏈可變區(qū)，這些可變區(qū)包含與在此說明的優(yōu)選抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中該抗體保留了本發(fā)明抗CD70抗體的所希望的功能特性。
例如，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包括重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)，其中 (a)該重鏈可變區(qū)包括與選自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6以及73的氨基酸序列具有至少80％的同源性的氨基酸序列； (b)該輕鏈可變區(qū)包括與選自SEQ ID NO7、8、9、10、11、及12的氨基酸序列具有至少80％的同源性的氨基酸序列； (c)該抗體特異性與CD70相結(jié)合。
另外地或者可替代地，該抗體可具有以上討論的以下功能特性中的一個(gè)或多個(gè)，例如結(jié)合人類CD70的高親和力、由表達(dá)CD70的細(xì)胞內(nèi)化、結(jié)合腎細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞系、結(jié)合淋巴瘤細(xì)胞系、介導(dǎo)針對(duì)表達(dá)CD70的細(xì)胞的ADCC的能力、和/或當(dāng)與細(xì)胞毒素相偶聯(lián)時(shí)在體內(nèi)抑制表達(dá)CD70的腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長的能力。
在不同的實(shí)施方案中，該抗體可以是例如人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
在其他實(shí)施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以與以上給出的序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。具有與以上給出的序列的VH以及VK區(qū)有高度同源性(即，80％或更高)的VH與VL區(qū)的抗體可以通過以下方式來獲得對(duì)編碼SEQ ID NO1-12和73的核酸分子進(jìn)行誘變(例如，定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變)，然后用此處說明的功能測定法檢測所編碼、被改變的抗體的保留的功能(即以上所給出的功能)。
如在此所使用，兩個(gè)氨基酸序列之間的百分比同源性等同于兩個(gè)序列之間的百分比同一性。在這兩個(gè)序列之間的百分比同一性是在考慮空位數(shù)目、以及每個(gè)空位長度的情況下，這些序列共有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，％同源性＝相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)目×100)，需要引入這些空位以用于兩條序列的最佳比對(duì)。正如在以下的非限制性實(shí)施例中說明的，使用數(shù)學(xué)算法可以完成兩條序列之間的序列比較以及百分比同一性的確定。
可以使用已經(jīng)整合在ALIGN程序中(2.0版本)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，411-17(1988))的算法，使用PAM120權(quán)重殘基表，空位長度罰分為12以及空位罰分為4，確定兩個(gè)氨基酸序列的百分比同一性。此外，兩個(gè)氨基酸序列的百分比同一性可以使用已經(jīng)整合到GCG軟件包中的GAP程序(可在www.gcg.com上獲得)里的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48444-453(1970))的算法，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，以及空位權(quán)重16、14、12、10、8、6或4以及長度權(quán)重1、2、3、4、5或6來確定。
另外地或者可替代地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步作為“查詢序列”而使用，對(duì)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，例如鑒定相關(guān)序列。使用Altschul，等人(1990)J.Mol.Biol.215403-10的XBLAST程序(版本2.0)可以進(jìn)行此類檢索。用XBLAST程序，記分＝50，字長＝3進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)檢索，以獲得與本發(fā)明抗體分子同源的氨基酸序列。為獲得用于比較目的的空位比對(duì)，如在Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402中說明的可使用Gapped BLAST。當(dāng)使用BLAST及Gapped BLAST程序時(shí)，對(duì)應(yīng)的程序(如XBLAST及NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)是有用的。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守性修飾的抗體 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的重鏈可變區(qū)以及含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中這些CDR序列中的一個(gè)或多個(gè)序列包括基于已知抗CD70抗體或它們保守性修飾的特定氨基酸序列，并且其中這些抗體保留了本發(fā)明抗CD70抗體的所希望的功能特性。本領(lǐng)域所理解的是可以進(jìn)行某些保守性序列修飾，這些保守性序列修飾并不去除抗原結(jié)合。參見，例如，Brummell等人(1993)Biochem 321180-8(說明了在對(duì)沙門氏菌特異的抗體CDR3重鏈結(jié)構(gòu)域的突變分析)；de Wildt等人(1997)Prot.Eng.10835-41(說明了抗UA1抗體的突變研究)；Komissarov等人(1997)J.Biol.Chem.27226864-26870(顯示了在HCDR3中間的突變導(dǎo)致親和力的消除或減低)；Hall等人(1992)J.Immunol.1491605-12(說明在CDR3區(qū)中的單一氨基酸改變消除了結(jié)合活性)；Kelley和O’Connell(1993)Biochem.326862-35(說明了酪氨酸殘基在抗原結(jié)合中的作用)；Adib-Conquy等人(1998)Int.Immunol.10341-6(說明了疏水性在結(jié)合中的作用)以及Beers等人(2000)Clin.Can.Res.62835-43(說明了HCDR3氨基酸突變體)。因此，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包括含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的重鏈可變區(qū)以及含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中 (a)重鏈可變區(qū)CDR3序列包括選自氨基酸序列SEQ ID NO25、26、27、28、29、30以及75，以及它們的保守性修飾的氨基酸序列； (b)輕鏈可變區(qū)CDR3序列包括選自氨基酸序列SEQ ID NO43、44、45、46、47以及48，以及它們的保守性修飾的氨基酸序列； (c)抗體與CD70特異性結(jié)合。
另外地或者可替代地，該抗體可擁有以上說明的以下功能特性中的一個(gè)或多個(gè)，例如結(jié)合人類CD70的高親和力、被表達(dá)CD70的細(xì)胞內(nèi)化、結(jié)合腎細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞系、結(jié)合淋巴瘤細(xì)胞系、介導(dǎo)針對(duì)表達(dá)CD70的細(xì)胞的ADCC的能力、和/或當(dāng)與細(xì)胞毒素相偶聯(lián)時(shí)在體內(nèi)抑制表達(dá)CD70的腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長的能力。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR2序列包括選自氨基酸序列SEQ ID NO19、20、21、22、23以及24，以及它們的保守性修飾的氨基酸序列；并且輕鏈可變區(qū)CDR2序列包括選自氨基酸序列SEQ ID NO37、38、39、40、41、以及42，以及它們的保守性修飾的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR1序列包括選自氨基酸序列SEQ ID NO13、14、15、16、17以及18，以及它們的保守性修飾的氨基酸序列；并且輕鏈可變區(qū)CDR1序列包括選自氨基酸序列SEQ ID NO31、32、33、34、35以及36，以及它們的保守性修飾的氨基酸序列。
在不同的實(shí)施方案中，該抗體可以是例如人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
如在此所使用，術(shù)語“保守性序列修飾”旨在表示不顯著影響或改變包含該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特性的氨基酸修飾。此類保守性修飾包括氨基酸的置換、插入以及缺失。通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變以及PCR介導(dǎo)的誘變，可將這些修飾引入本發(fā)明的抗體中。保守性氨基酸置換是以下這些置換，其中氨基酸殘基由具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。本領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)，以及具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，本發(fā)明抗體的CDR區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以由來自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基所替換，并且使用在此說明的功能測定可以針對(duì)保留的功能(即，在以上給出的功能)測試被改變的抗體。
與本發(fā)明的抗-CD70抗體結(jié)合相同表位的抗體 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗體，其結(jié)合本發(fā)明任何CD70單克隆抗體所識(shí)別的人類CD70上的表位(即，有能力與本發(fā)明單克隆抗體中的任何抗體進(jìn)行交叉競爭而結(jié)合CD70的抗體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于交叉競爭研究的參照抗體可以是單克隆抗體2H5(具有分別示于SEQ ID NO1和7的VH和VL序列)或單克隆抗體10B4(具有分別示于SEQ ID NO2和8的VH和VL序列)或單克隆抗體8B5(具有分別示于SEQ ID NO3和9的VH和VL序列)或單克隆抗體18E7(具有分別示于SEQ ID NO4和10的VH和VL序列)或單克隆抗體69A7(具有分別示于SEQ ID NO5和11的VH和VL序列)或單克隆抗體69A7Y(具有分別示于SEQ ID NO73和11的VH和VL序列)或單克隆抗體1F4(具有分別示于SEQ ID NO6和12的VH和VL序列)。
此類交叉競爭抗體可以在標(biāo)準(zhǔn)的CD70結(jié)合測定中基于它們與2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4進(jìn)行交叉競爭的能力而被鑒別?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)ELISA測定，其中將重組的人類CD70蛋白固定在板上，這些抗體中的一種用熒光進(jìn)行標(biāo)記，并且評(píng)價(jià)了未標(biāo)記抗體進(jìn)行競爭脫去標(biāo)記的抗體的結(jié)合的能力。另外地或可替代地，BIAcore分析也可以用于評(píng)價(jià)抗體的交叉競爭的能力。例如，使用BIAcore的表位結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明了2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4抗體結(jié)合CD70上不同的表位。測試抗體抑制例如2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4結(jié)合人類CD70的能力證明該測試抗體能與2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4競爭與人類CD70的結(jié)合，并且因此結(jié)合至由2H5(具有分別示于SEQ ID NO1和7的VH和VL序列)或10B4(具有分別示于SEQ ID NO2和8的VH和VL序列)或8B5(具有分別示于SEQ ID NO3和9的VH和VL序列)或18E7(具有分別示于SEQ ID NO4和10的VH和VL序列)或69A7(具有分別示于SEQ ID NO5和11的VH和VL序列)或69A7Y(具有分別示于SEQ ID NO73和11的VH和VL序列)或1F4(具有分別示于SEQ ID NO6和12的VH和VL序列)所識(shí)別的人類CD70的相同表位上。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合至由2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4所識(shí)別的人類CD70上的相同表位的抗體是人類單克隆抗體。正如在實(shí)施例中所說明的，可以對(duì)此類人類單克隆抗體進(jìn)行制備并分離。
經(jīng)改造的并且經(jīng)修飾的抗體 通過以下方式可以進(jìn)一步制備本發(fā)明的抗體可以使用具有一個(gè)或多個(gè)本文公開的VH和/或VL序列的抗體作為起始材料，以改造為經(jīng)修飾的抗體，這種經(jīng)修飾的抗體與起始抗體相比可能具有經(jīng)改變的特性。通過在一個(gè)或兩個(gè)可變區(qū)(即VH和/或VL)中，例如在一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)和/或在一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)內(nèi)中修飾一個(gè)或多個(gè)殘基，可以對(duì)抗體進(jìn)行改造。另外地或可替代地，通過修飾恒定區(qū)中的殘基，例如改變?cè)摽贵w的效應(yīng)物功能，能夠?qū)贵w進(jìn)行改造。
在某些實(shí)施方案中，可以使用CDR移植以對(duì)抗體的可變區(qū)進(jìn)行改造?？贵w和靶抗原主要通過位于六個(gè)重鏈及輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基進(jìn)行相互作用。由于這一原因，在各個(gè)抗體之間的CDR的氨基酸序列比在CDR之外的序列更具有多樣性。因?yàn)镃DR序列負(fù)責(zé)大部分抗體-抗原相互作用，所以通過構(gòu)建包括來自被移植至框架序列(來自具有不同特性的不同抗體)上的特異天然發(fā)生抗體的CDR序列的表達(dá)載體，表達(dá)模擬特異天然發(fā)生抗體的特性的重組抗體是可能的(參見，例如Riechmann，L.等人(1998)Nature 332323-327；Jones，P.等人(1986)Nature321522-525；Queen，C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.8610029-10033；Winter的美國專利號(hào)5,225,539，以及Queen等人的美國專利號(hào)5,530,101；5,585,089；5,693,762及6,180,370)。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，該單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分包括含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的重鏈可變區(qū)，該CDR1、CDR2以及CDR3序列包括分別選自SEQID NO13、14、15、16、17和18，SEQ ID NO19、20、21、22、23和24，以及SEQ ID NO25、26、27、28、29、75和30的氨基酸序列；以及含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，該CDR1、CDR2以及CDR3序列包括分別選自SEQ ID NO31、32、33、34、35和36，SEQ ID NO37、38、39、40、41和42，以及SEQ ID NO43、44、45、46、47和48的氨基酸序列。因此，此類抗體含有單克隆抗體2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4的VH和VLCDR序列，但是可包含與這些抗體不同的框架序列。
此類框架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫或已公開的文獻(xiàn)獲得。例如，針對(duì)人類重鏈及輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在“Vbase”人類種系序列數(shù)據(jù)庫中找到(在互聯(lián)網(wǎng)在http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上獲得)，連同在以下獻(xiàn)中找到Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛(wèi)生和人類服務(wù)部，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson，I.M.，等人(1992)“The Repertoire of Human Germline VH SequencesReveals about Fifty Groups of VH Segments with Different HypervariableLoops”J.Mol.Biol.227776-798；以及Cox，J.P.L.等人(1994)“ADirectory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in theirUsage”Eur.J.Immunol.24827-836；這些文獻(xiàn)中每一篇的內(nèi)容均明確地通過引用結(jié)合于此作為參考。作為另一個(gè)實(shí)例，針對(duì)人類重鏈及輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在Genbank數(shù)據(jù)庫中找到。例如，在HCo7HuMAb小鼠中發(fā)現(xiàn)的以下重鏈種系序列在所附的Genbank登錄號(hào)中可獲得1-69(NG_0010109、NT_024637、以及BC070333)、3-33(NG_0010109以及NT_024637)、以及3-7(NG_0010109以及NT_024637)。作為另一個(gè)實(shí)例，在HCo12HuMAb小鼠中發(fā)現(xiàn)的以下重鏈種系序列在所附的Genbank登錄號(hào)中可獲得1-69(NG_0010109、NT_024637、以及BC070333)、5-51(NG_0010109以及NT_024637)、4-34(NG_0010109以及NT_024637)、3-30.3(CAJ556644)、以及3-23(AJ406678)。然而人類重鏈和輕鏈種系序列的另一個(gè)來源為人類免疫球蛋白基因數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫可獲自IMGT(http://imgt.cines.fr)。
使用序列相似性檢索方法之一的稱為Gapped BLAST方法(Altschul等人(1997)Nucleic Acids Research 253389-3402)將抗體蛋白質(zhì)序列和已編制的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是熟知的。BLAST是一種啟發(fā)式算法，因?yàn)榭贵w序列與數(shù)據(jù)庫序列之間統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性比對(duì)可能包含比對(duì)字符的高得分片段對(duì)(HSP)。通過擴(kuò)展或修正不能改善片段對(duì)分?jǐn)?shù)的片段對(duì)被稱為命中項(xiàng)(hit)。簡言之，翻譯VBASE來源的核苷酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)，并且保留在FR1至FR3框架區(qū)之間的區(qū)(包括FR1至FR3框架區(qū))。這些數(shù)據(jù)庫序列具有的平均長度為98個(gè)殘基。去除重復(fù)序列(它們是蛋白質(zhì)全長上的精確匹配)。用于蛋白質(zhì)的BLAST檢索使用程序blastp，其使用默認(rèn)的、除了低復(fù)雜性過濾(它已被關(guān)閉)以外的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，以及置換矩陣BLOSUM62，針對(duì)實(shí)現(xiàn)序列相配的前5個(gè)命中項(xiàng)的過濾。按全部六個(gè)讀碼框翻譯核苷酸序列，并且認(rèn)為在數(shù)據(jù)庫序列的匹配片段中不具有終止密碼子的讀碼框是潛在的命中項(xiàng)。進(jìn)而使用BLAST程序tblastx對(duì)此結(jié)論進(jìn)行確認(rèn)，該程序以全部六個(gè)讀碼框翻譯抗體序列，并且將這些翻譯與以全部六個(gè)讀碼框動(dòng)態(tài)翻譯的VBASE核苷序列進(jìn)行比較?？梢匀缫陨险f明使用類似于VBASE的方法對(duì)其他人類種系序列數(shù)據(jù)庫(例如可從IMGT(http://imgt.cines.fr)獲得的數(shù)據(jù)庫)進(jìn)行檢索。
同一性是抗體序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫之間在序列的全長上的精確的氨基酸匹配。這些陽性項(xiàng)(同一性+取代匹配)不是完全相同的，而是由BLOSUM62取代矩陣所引導(dǎo)的氨基酸取代。如果抗體序列以相同的同一性匹配數(shù)據(jù)庫序列中的兩條序列，則具有最大陽性的命中項(xiàng)將被判定為匹配的序列命中項(xiàng)。
可用于本發(fā)明抗體的優(yōu)選框架序列是與所選擇的本發(fā)明抗體所用框架序列在結(jié)構(gòu)上類似的那些框架序列，例如類似于本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體所使用的以下框架序列VH 3-30.3框架序列(SEQ ID NO61)和/或VH 3-33框架序列(SEQ ID NO62)和/或VH 4-61框架序列(SEQ ID NO63)和/或VH 3-23框架序列(SEQ ID NO64)和/或VKL6框架序列(SEQ IDNO65)和/或VK L18框架序列(SEQ ID NO66)和/或VK L15框架序列(SEQ ID NO67)和/或VK A27框架序列(SEQ ID NO68)。
VH CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及VK CDR1、CDR2以及CDR3序列可以被移植至這樣的框架結(jié)構(gòu)區(qū)上，其具有與從中衍生出該框架序列的種系免疫球蛋白基因中所發(fā)現(xiàn)的序列相同的序列，或者這些CDR序列可以被移植至與種系序列相比含有一個(gè)或多個(gè)突變的框架結(jié)構(gòu)區(qū)上。例如，已發(fā)現(xiàn)在某些情況下在框架區(qū)內(nèi)對(duì)殘基進(jìn)行突變可能是有益的，以保持或增強(qiáng)該抗體的抗原結(jié)合能力(參見，例如Queen等人的美國專利號(hào)5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370)。
另一種類型的可變區(qū)修飾是在VH和/或VK CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)中對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行突變，由此改善目的抗體的一種或多種結(jié)合特性(例如親和力)?？梢赃M(jìn)行定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變來引入一種或多種突變，并且對(duì)抗體的結(jié)合或其他目的功能特性的影響可以通過在此說明的以及在實(shí)施例中提供的體內(nèi)或體外測定進(jìn)行評(píng)估。優(yōu)選引入保守性修飾(如以上所討論)。這些突變可以是氨基酸置換、插入或缺失，但優(yōu)選是置換。此外，一般在CDR區(qū)中改變不超過一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)殘基。
因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的抗CD70單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包括重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包括(a)VH CDR1區(qū)，包括選自SEQ ID NO13、14、15、16、17和18的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO13、14、15、16、17和18相比具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列。(b)VH CDR2區(qū)，包括選自SEQ ID NO19、20、21、22、23和24的氨基酸序列，或者與SEQ IDNO19、20、21、22、23和24相比具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3區(qū)，包括選自SEQ IDNO25、26、27、28、29、75和30的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO25、26、27、28、29、75和30相比具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VK CDR1區(qū)，包括選自SEQ IDNO31、32、33、34、35和36的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO31、32、33、34、35和36相比具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VK CDR2區(qū)，包括選自SEQ ID NO37、38、39、40、41和42的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO37、38、39、40、41和42相比具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；以及(f)VK CDR3區(qū)，包括選自SEQ ID NO43、44、45、46、47和48的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO43、44、45、46、47和48相比具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列。
本發(fā)明改造的抗體包括其中在VH和/或VK內(nèi)已經(jīng)對(duì)框架殘基進(jìn)行了修飾的抗體，如改善了抗體的特性。一般對(duì)此類框架進(jìn)行修飾以降低抗體的免疫原性。例如，一個(gè)方法是將一個(gè)或多個(gè)框架殘基“回復(fù)突變”成為相應(yīng)的種系序列的殘基。更確切地說，已經(jīng)經(jīng)歷了體細(xì)胞突變的抗體可能包含與從中衍生出該抗體的種系序列不同的框架殘基。此類殘基可以通過將該抗體框架序列與從中衍生出該抗體的種系序列進(jìn)行比較而被鑒定。本發(fā)明也旨在涵蓋此類“回復(fù)突變”的抗體。例如，對(duì)于10B4，VH(位于FR1)的#2氨基酸是異亮氨酸而該在相應(yīng)的VH 3-30.3種系序列中此殘基是纈氨酸。為了將框架區(qū)序列返回至它們的種系序列，通過例如定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變，可以將體細(xì)胞突變“回復(fù)突變”為種系序列(例如，可以將10B4的VH中FR1的2號(hào)殘基從異亮氨酸回復(fù)突變?yōu)槔i氨酸)。
作為另一個(gè)實(shí)例，對(duì)于10B4而言，VH的氨基酸殘基#30(在FR1內(nèi))為甘氨酸，而在VH 3-30.3種系序列中相應(yīng)的這一殘基為絲氨酸。為了使該框架區(qū)序列返回到它們的種系構(gòu)型，例如，10B4的VH的FR1的殘基30可從甘氨酸“回復(fù)突變”到絲氨酸。
作為另一個(gè)實(shí)例，對(duì)于8B5而言，VH的氨基酸殘基#24(在FR1內(nèi))為蘇氨酸，而在VH 3-33種系序列中相應(yīng)的這一殘基為丙氨酸。為了使該框架區(qū)序列返回到它們的種系構(gòu)型，例如，8B5的VH的FR1的殘基24可從蘇氨酸“回復(fù)突變”到丙氨酸。
作為另一個(gè)實(shí)例，對(duì)于8B5而言，VH的氨基酸殘基#77(在FR3內(nèi))為賴氨酸，而在VH 3-33種系序列中相應(yīng)的這一殘基為天冬酰胺。為了使該框架區(qū)序列返回到它們的種系構(gòu)型，例如，8B5的VH的FR3的殘基11可從賴氨酸“回復(fù)突變”到天冬酰胺。
作為另一個(gè)實(shí)例，對(duì)于8B5而言，VH的氨基酸殘基#80(在FR3內(nèi))是絲氨酸，而在相應(yīng)的VH 3-33種系序列中這一殘基是酪氨酸。為了使該框架區(qū)序列返回到它們的種系構(gòu)型，例如，8B5的VH的FR3的殘基14可從絲氨酸“回復(fù)突變”到酪氨酸。
作為另一個(gè)例子，對(duì)于69A7而言，VH的氨基酸殘基#50(FR2內(nèi))是亮氨酸，而在VH 4-61種系序列中相應(yīng)的這一殘基是異亮氨酸。為了使該框架區(qū)序列返回到它們的種系構(gòu)型，例如，69A7的VH的FR2的殘基13可從亮氨酸“回復(fù)突變”到異亮氨酸。
作為另一個(gè)實(shí)例，對(duì)于69A7而言，VH的氨基酸殘基#85(在FR3內(nèi))為精氨酸，而在VH 4-61種系序列中相應(yīng)的這一殘基為絲氨酸。為了使該框架結(jié)構(gòu)區(qū)序列返回到它們的種系構(gòu)型，例如，69A7的VH的FR3的殘基18可從精氨酸“回復(fù)突變”到絲氨酸。
作為另一個(gè)實(shí)例，對(duì)于69A7而言，VH的氨基酸殘基#89(在FR3內(nèi))為蘇氨酸，而在VH 4-61種系序列中相應(yīng)的這一殘基為丙氨酸。為了使該框架區(qū)序列返回到它們的種系構(gòu)型，例如，69A7的VH的FR3的殘基22可從蘇氨酸“回復(fù)突變”到丙氨酸。
作為另一個(gè)實(shí)例，對(duì)于10B4而言，VL的氨基酸殘基#46(在FR2內(nèi))為苯丙氨酸，而在VLL18種系序列中相應(yīng)的這一殘基為亮氨酸。為了使該框架區(qū)序列返回到它們的種系構(gòu)型，例如，10B4的VL的FR2的殘基12可從苯丙氨酸“回復(fù)突變”到亮氨酸。
作為另一個(gè)實(shí)例，對(duì)于69A7而言，VL的氨基酸殘基#49(在FR2內(nèi))為苯丙氨酸，而在VLL6種系序列中相應(yīng)的這一殘基為酪氨酸。為了使該框架區(qū)序列返回到它們的種系構(gòu)型，例如，69A7的VL的FR2的殘基15可從苯丙氨酸“回復(fù)突變”到酪氨酸。
另一種類型的框架修飾涉及在框架區(qū)內(nèi)或甚至在一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)的對(duì)一個(gè)或多個(gè)殘基進(jìn)行突變，以除去T細(xì)胞表位，由此降低抗體的潛在的免疫原性。這一方法也稱為“去免疫化”，并且在Carr等人的美國專利
發(fā)明者M·A·科恰, J·A·科雷特, D·J·金, C·帕恩, J·卡爾達(dá)雷利, M·亞馬納卡, K·A·亨寧 申請(qǐng)人:梅達(dá)雷克斯公司