專利名稱：靶定補(bǔ)體蛋白c5的抗體的組合物和方法
靶定補(bǔ)體蛋白C5的抗體的組合物和方法發(fā)明介紹本發(fā)明涉及靶定補(bǔ)體蛋白C5的抗體和組合物及其使用方法。
背景技術(shù)：
補(bǔ)體的正常作用是在宿主防御中，補(bǔ)體是先天免疫系統(tǒng)的一部分。補(bǔ)體防御細(xì)菌感染，連接適應(yīng)性免疫和先天性免疫，并處理免疫復(fù)合物和炎癥損傷的產(chǎn)物。通過在補(bǔ)體激活過程中產(chǎn)生的生物學(xué)上有活性的產(chǎn)物完成防御功能，所述產(chǎn)物調(diào)理病原體、促進(jìn)炎癥或溶解易感性靶標(biāo)(Marzari等，Eur J Immunol 32 2773-2782(2002))。補(bǔ)體系統(tǒng)由在免疫系統(tǒng)中起作用的大約25-30種血漿蛋白質(zhì)組成。補(bǔ)體級(jí)聯(lián)由至少三條主要途徑激活。經(jīng)典途徑通常由免疫復(fù)合物激活，旁路途徑可被無保護(hù)的細(xì)胞表面激活，甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)途徑由MBL結(jié)合到細(xì)胞表面的糖類上起始 (Trendelenburg, Swiss Med Wkly 137:413-417(2007))。所有三條途徑導(dǎo)致C5轉(zhuǎn)化酶對(duì)C5的切割。該切割的結(jié)果是釋放了有效的炎癥分子Cfe片段，和起始膜攻擊復(fù)合體(MAC)的C5b。補(bǔ)體產(chǎn)物一旦釋放就不能在外源和自身靶標(biāo)之間進(jìn)行區(qū)分，并且如果不加以嚴(yán)格調(diào)節(jié)，則在與無限制補(bǔ)體激活相關(guān)的臨床情況中經(jīng)常引起無辜細(xì)胞和組織的廣泛損傷(Marzari等，2002)。C5在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)為1676個(gè)氨基酸的單個(gè)前C5肽，其由位于成熟N末端β鏈和C 末端α鏈之間的18個(gè)殘基信號(hào)序列和富含Arg的接頭序列(RPRR)組成。成熟的C5具有大約190kDa的分子量，并由二硫鍵連接的兩條多肽鏈組成(α，115kDa ； β，75kDa)。C5轉(zhuǎn)化酶在α鏈的74和75位殘基之間切割C5，釋放74個(gè)氨基酸的Cfe肽和隨后摻入到膜攻擊復(fù)合體(MAC)中的rab片段。黃斑變性是主要見于老年人的醫(yī)學(xué)狀況，在所述老年人中稱為視網(wǎng)膜黃斑區(qū)域的眼睛襯里中心遭受變薄、萎縮，并且在一些情況下，出血。這可導(dǎo)致中心視覺喪失，其使得不能看見微小細(xì)節(jié)、閱讀或識(shí)別面孔。對(duì)新脈絡(luò)膜脈管形成的發(fā)病機(jī)理還了解的不多，但認(rèn)為諸如炎癥、局部缺血和血管原性因子的局部產(chǎn)生等因素是重要的。盡管目前存在用于治療與經(jīng)典或補(bǔ)體旁路途徑相關(guān)的疾病和病征，特別是AMD的治療選擇，但仍然需要尋找產(chǎn)生有效并良好耐受治療的特異性靶標(biāo)。發(fā)明概述本發(fā)明提供分離的補(bǔ)體C5-結(jié)合分子(例如，C5-結(jié)合抗體或其抗原結(jié)合片段)、 包含此類分子的藥物組合物、制備此類分子和組合物的方法及其使用方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體具有至少IxIO7M-1UO8M-1UO9M-1UOkT1或ΙΟ、—1的親和常數(shù)(Ka)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合C5 蛋白質(zhì)，并且如通過體外溶血測(cè)定法測(cè)定以約20ρΜ到約200ρΜ的IC5tl范圍抑制補(bǔ)體旁路途徑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合C5 蛋白質(zhì)，并且與下文表1中描述的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其與下文表1中描述的抗體結(jié)合C5蛋白質(zhì)的同一表位。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)的分離的單克隆抗體。 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)的分離的人或人源化單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)的分離的嵌合抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含人重鏈恒定區(qū)和人輕鏈恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是單鏈抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是Fab片段。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是scFv。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人C5和獼猴C5的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是IgG同種型。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含構(gòu)架的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，在所述構(gòu)架中氨基酸已經(jīng)替換為來自各自人VH或VL種系序列的抗體構(gòu)架。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含與SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、17、18、19、20、21、22、33、34、 35、36、37、38、49、50、61、62、63、64、65、66、77、78、89、95、101、107、113、119、120、131、132、 133、134、135、136、145、146、147、148、149、150、159、160、161、162、163、164、173、174、175、 176、177、178、195、196、197、198、199、200、209、226、235、236、237、238、239 或 240 具有至少 90%、95%、97%、98%或至少99%序列同一性的至少一條互補(bǔ)決定(OTR)序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含與 SEQ ID NO :1、2、3、17、18、19、33、；34、35、49、61、62、63、 77、77、95、107、113、119、132、131、133、145、146、147、159、160、161、173、174、175、195、196、 197、2洸、2；35、236或237同一的至少一條重鏈CDR序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含與SEQ ID NO :4、5、6、20、21、22、36、37、38、50、64、65、 66、78、89、101、120、134、135、136、148、149、150、162、163、164、176、177、178、198、199、200、 209、238、239或MO同一的至少一條輕鏈CDR序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含選自SEQ ID NOs :1、17、33、61、131、145、159、173、195和 235 的重鏈 CDRl ；選自 SEQ ID NOs :2、18、34、49、62、77、95、107、113、119、132、146、160、 174、196、226 和 236 的重鏈 CDR2 ；和選自 SEQ ID NOs :3、19、35、63、133、147、161、175、197 和237的重鏈⑶R3。在一些實(shí)施方案中，此類抗體或其抗原結(jié)合片段還包含選自SEQ ID NOs :4、20、36、64、134、148、162、176、198 和 238 的輕鏈 CDRl ；選自 SEQ ID NOs :5、21、37、 65、135、149、163、177、199 和 239 的輕鏈 CDR2 ；和選自 SEQ ID NOs :6、22、38、50、66、78、89、 101、120、136、150、164、178、200、209 和 240 的輕鏈 CDR3。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含選自SEQ ID NOs :4、20、36、64、134、148、162、176、198和 238 的輕鏈CDRl ；選自 SEQ ID NOs :5、21、37、65、135、149、163、177、199和 239 的輕鏈CDR2 ； 和選自 SEQ ID NOs :6、22、38、50、66、78、89、101、120、136、150、164、178、200、209 和 240 的輕鏈⑶R3。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含與SEQ ID NO :7、23、39、51、67、79、96、108、114、121、137、 151、165、179、187、201、210、218、227、241、253、257、273、277 或 281 具有至少 90 %,95 97%、98%或至少99%序列同一性的重鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，此類抗體或其抗原結(jié)合片段還包含與 SEQ ID NO :8、24、40、52、68、80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、 211、219、228、242、261、265、269、285 和 289 具有至少 90%、95%、97%、98%或至少 99%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含與SEQ ID NO :8、M、40、52、68、80、90、102、122、138、152、 166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285 和 289 具有至少 90%,95%,97%, 98%或至少99%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含與SEQ ID NO :9、25、41、53、69、81、97、109、115、123、139、
153、167、181、189、203、212、220、229、243、249、254、258、274、278或 282 具有至少 90 95%、97%、98%或至少99%序列同一性的重鏈。在一些實(shí)施方案中，此類抗體還包含與SEQ ID NO :10、26、42、54、70、82、91、103、124、140、154、168、182、190、204、213、221、230、244、 251、262、266、270、286或290具有至少90%、95%、97%、98%或至少99%序列同一性的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含與SEQ ID NO :10J6、42、M、70、82、91、103、124、140、
154、168、182、190、204、213、221、230、244、251、262、266、270、286或 290 具有至少 90 %、 95%、97%、98%或至少99%序列同一性的輕鏈。本發(fā)明還包含藥物組合物，其包含本發(fā)明的一種或多種C5-結(jié)合分子(例如，C5結(jié)合抗體或其抗原結(jié)合片段)和藥學(xué)上可接受的載體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含編碼多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含與 SEQ ID NO :7、23、39、51、67、79、96、108、114、121、137、151、165、179、187、201、210、 218、227、241、253、257、273、277 或 281 具有至少 90%、95%、97%、98%或至少 99%序列同
一性的重鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含編碼多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含與 SEQ ID NO :8、24、40、52、68、80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、 228、242、261、265、269、285 和 289 具有至少 90%、95%、97%、98%或至少 99%序列同一性
的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明還提供包含此類核酸的載體和宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的宿主細(xì)胞，其包含(1)編碼本發(fā)明抗體重鏈的重組DNA區(qū)段，和( 編碼本發(fā)明抗體輕鏈的第二個(gè)重組DNA區(qū)段；其中所述DNA區(qū)段各自有效連接第一個(gè)和第二個(gè)啟動(dòng)子，并能夠在所述宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含分別編碼本發(fā)明抗體重鏈和輕鏈的重組DNA區(qū)段的分離的宿主細(xì)胞，其中所述DNA區(qū)段有效連接啟動(dòng)子，并能夠在所述宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。 在一些實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段是人單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的C5結(jié)合分子(例如C5結(jié)合抗體或其抗原結(jié)合片段) 的治療或診斷方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療年齡相關(guān)性黃斑變性的方法，其包括向需要治療的受試者施用有效量的包含本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療疾病的方法，其包括向需要治療的受試者施用有效量的包含本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物，其中所述疾病是哮喘、關(guān)節(jié)炎、 自身免疫心臟病、多發(fā)性硬化、炎性腸病、缺血-再灌注損傷、巴-西二氏綜合征、血液透析、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、紅斑狼瘡、牛皮癬、多發(fā)性硬化、移植、阿爾茨海默氏病、腎小球腎炎或 MPGNII。本發(fā)明還提供用于治療陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)的方法，其包括向需要治療的受試者施用有效量的包含本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物。本發(fā)明還提供改善與體外循環(huán)相關(guān)癥狀的方法，其包括向需要治療的受試者施用有效量的包含本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物。3. 1 定義除非另有定義，此處所用的所有技術(shù)和科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常理解的相同意思。如此處所用的術(shù)語“抗體”包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或單鏈。天然存在的“抗體”是包含通過二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白。每一重鏈包含重鏈可變區(qū)(此處縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)。所述重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域，CH1、CH2和CH3。每一輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)。所述輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL。VH和VL區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分成高變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，它們散布著稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)域。每一 VH和VL由以下面順序從氨基末端到羧基末端排列的三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一個(gè)組分(Clq)的結(jié)合。如此處所用，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”指完整抗體的一個(gè)或更多片段，其保留與給定抗原(例如C5)特異性結(jié)合的能力?？赏ㄟ^完整抗體的片段進(jìn)行抗體的抗原結(jié)合功能。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中包括的結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab片段，其為VL、VH、CL 和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；F (ab)2片段，其為包含在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的兩個(gè)Fab 片段的二價(jià)片段；由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由抗體單條臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；單結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)片段(Ward等，1989Nature 341 :544-546)，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；和分離的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶幻。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由單獨(dú)的基因編碼，但可使用重組方法， 通過人工肽接頭將它們連接，所述人工肽接頭使得它們能夠制備成單條蛋白質(zhì)鏈，其中VL 和VH區(qū)域配對(duì)形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參閱例如Bird等，1988 Science 242 423-426 ；和 Huston 等，1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :5879-5883)。此類單鏈抗體包括抗體的一個(gè)或更多“抗原結(jié)合部分”。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片段，并篩選所述片段，以與完整抗體相同的方式使用所述片段?？乖Y(jié)合部分也可摻入到單結(jié)構(gòu)域抗體、巨型抗體(maxibodies)、微型抗體(minibodies)、胞內(nèi)抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、ν-NAR和bis-scFv (參閱例如Hollinger 和 Hudson，2005，Nature Biotechnology，23，9，1126-1136)。抗體的抗原結(jié)合部分可移植到基于多肽如III型纖連蛋白0^3)的支架中(參閱美國專利號(hào)6，703，199，其描述了纖連蛋白多肽單抗體體)?？乖Y(jié)合部分可摻入到包含一對(duì)串聯(lián)Fv區(qū)段(VH-CH1-VH-CH1)的單鏈分子中， 所述串聯(lián)Fv區(qū)段與互補(bǔ)輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)(Zapata等，1995 Protein Eng. 8(10) :1057-1062 ；和美國專利號(hào) 5，641，870)。如此處所用，術(shù)語“親和力”指抗體與抗原在單個(gè)抗原位點(diǎn)上相互作用的強(qiáng)度。在每一抗原位點(diǎn)中，抗體“臂”的可變區(qū)與抗原在許多位點(diǎn)上通過弱的非共價(jià)力相互作用；相互作用越多，親和力越強(qiáng)。如此處所用，術(shù)語“親合力”指抗體-抗原復(fù)合物的總穩(wěn)定性或強(qiáng)度的信息化量度。其受三個(gè)主要因素控制抗體表位親和力；抗原與抗體兩者的效價(jià)；和相互作用部分的結(jié)構(gòu)排列。最終這些因素決定了抗體的特異性，即特定抗原結(jié)合精確抗原表位的可能性。術(shù)語“氨基酸”指天然發(fā)生的和合成的氨基酸，以及與天然發(fā)生的氨基酸以相似方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然發(fā)生的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸，以及稍后被例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸修飾的那些氨基酸。氨基酸類似物指這樣的化合物，其與天然發(fā)生的氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，即與氫結(jié)合的α碳、羧基、氨基和R基團(tuán)，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲锍。此類類似物具有修飾的R基團(tuán)(例如，正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保留了與天然發(fā)生的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同結(jié)構(gòu)的化合物，但它以與天然發(fā)生的氨基酸類似的方式起作用。如此處所用，術(shù)語“結(jié)合特異性”指各抗體結(jié)合位點(diǎn)與僅一個(gè)抗原決定簇相互作用的能力?？贵w的結(jié)合部位位于分子的Fab部分，并從重鏈和輕鏈的高變區(qū)構(gòu)建?？贵w的結(jié)合親和力是單個(gè)抗原決定簇與抗體上單個(gè)結(jié)合部位之間反應(yīng)的強(qiáng)度。其為抗原決定簇與抗體結(jié)合部位之間起作用的吸引力和排斥力的總和。兩個(gè)實(shí)體之間的特異性結(jié)合表示平衡常數(shù)(Ka)為至少IxIOl1UO8M-1UO9Mi IOkT1或IOiiM4的結(jié)合。短語與抗體的“特異性(或選擇性)結(jié)合”指決定近親抗原(例如人C5或獼猴C5)在蛋白質(zhì)和其它生物產(chǎn)品的異質(zhì)群體中的存在的結(jié)合反應(yīng)。除了上文指出的平衡常數(shù)(ΚΑ)，本發(fā)明的C5結(jié)合抗體通常還具有約ΙχΙΟΛ^ΙχΙΟΑ^ΙχΙΟΛΤ1、 IxKT5iT1或更低的解離速率常數(shù)(Kd)，并且以比其結(jié)合非特異性抗原(例如C3、C4、BSA)的親和力高至少兩倍的親和力結(jié)合C5。短語“識(shí)別抗原的抗體”和“對(duì)抗原特異的抗體”此處可與“特異性結(jié)合抗原的抗體”互換使用。術(shù)語“嵌合抗體”是這樣的抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、替換或交換，使得抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))連接不同種類或改變種類的恒定區(qū)、效應(yīng)功能和/或物種，或賦予嵌合抗體新性質(zhì)的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子、藥物等；或 (b)可變區(qū)或其部分被具有不同或改變抗原特異性的可變區(qū)改變、替換或交換。例如，可通過來自人免疫球蛋白的恒定區(qū)替換小鼠恒定區(qū)來修飾小鼠抗體。由于用人恒定區(qū)進(jìn)行替換，嵌合抗體在識(shí)別抗原中可保留其特異性，同時(shí)與最初的小鼠抗體相比，在人中具有降低的抗原性。
術(shù)語“補(bǔ)體C5蛋白質(zhì)”或“C5”可互換使用，并指不同物種中的C5蛋白質(zhì)。例如， 人C5具有如SEQ ID NO :296中闡明的序列，獼猴C5具有SEQ ID NO :297中闡明的序列 (Macaca fascicularis)(見表 1)?？蓮?Quidel (Cat. Number A403)獲得人 C5?？扇缦挛膶?shí)施例部分說明產(chǎn)生獼猴C5。術(shù)語“保守修飾的變體”應(yīng)用到氨基酸和核酸序列。對(duì)于特定核酸序列，保守修飾的變體指編碼相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸，或者其中所述核酸不編碼氨基酸序列，則指基本相同的序列。因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶均編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每一位置上(其中密碼子確定丙氨酸)，可將所述密碼子改變成任何所述相應(yīng)的密碼子，而不改變所編碼的多肽。此類核酸變異是“沉默變異”，其為保守修飾變異的一種。此處編碼多肽的每一核酸序列也描述了所述核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可修飾核酸中的每一密碼子(除了 AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密碼子)，以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，在每一所述序列中暗含了編碼多肽的核酸的每一沉默變異。對(duì)于多肽序列，“保守修飾的變體”包括對(duì)多肽序列的各替換、缺失或添加，其導(dǎo)致對(duì)氨基酸用化學(xué)上類似的氨基酸進(jìn)行替換。提供功能上類似的氨基酸的保守替換表為本領(lǐng)域所熟知。此類保守修飾變體除了并且不排斥本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同源物和等位基因。以下8組含有彼此為保守替換的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K) ；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W) ；7)絲氨酸(S)， 蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參閱例如，Creighton, Proteins (1984)) 0 在一些實(shí)施方案中，術(shù)語“保守序列修飾”用于指不顯著影響或改變含有氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征的氨基酸修飾。術(shù)語“交叉-阻斷”、“交叉-阻斷的”在此處可互換使用，表示抗體或其它結(jié)合劑在標(biāo)準(zhǔn)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定中干擾其它抗體或結(jié)合劑與C5結(jié)合的能力?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定法來測(cè)定抗體或其它結(jié)合劑能夠干擾另一抗體或結(jié)合分子與C5結(jié)合的能力或程度，并因此是否可以被稱為本發(fā)明的交叉阻斷。一種合適的測(cè)定法包括使用Biacore技術(shù)(例如通過使用BIAcore 3000儀器(Biacore，Uppsala, Sweden))，其可以使用表面等離振子共振技術(shù)測(cè)量相互作用的程度。用于測(cè)量交叉阻斷的另一測(cè)定法使用基于ELISA的方法。術(shù)語“表位”表示能夠特異性結(jié)合抗體的蛋白質(zhì)決定簇。表位一般由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)，如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，并一般具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及比電荷特征。 構(gòu)象和非構(gòu)象表位可以區(qū)分開，因?yàn)樵谧冃匀軇┑拇嬖谙率ヅc前者的結(jié)合，而不失去與后者的結(jié)合。如此處所用，術(shù)語IgG抗體的“高親和力”指對(duì)靶抗原具有10_%或更低、10、或更低、10_1(IM、或10_"M或更低的KD的抗體。然而，“高親和力”結(jié)合對(duì)于其它抗體同種型可以發(fā)生變化。例如，對(duì)于IgM同種型的“高親和力”結(jié)合指具有10_7M或更低，或或更低的KD的抗體。如此處所用，術(shù)語“人抗體”旨在包括具有可變區(qū)的抗體，在所述可變區(qū)中構(gòu)架和CDR區(qū)均來自人來源的序列。此外，如果抗體含有恒定區(qū)，所述恒定區(qū)也來自此類人序列，例如人種系序列，或突變形式的人種系序列。本發(fā)明的人抗體可包括不由人序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。術(shù)語“人單克隆抗體”指具有可變區(qū)的顯示單一結(jié)合特異性的抗體，在所述可變區(qū)中構(gòu)架和CDR區(qū)均來自人序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，所述雜交瘤包括從轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的B細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物具有融合到無限增殖細(xì)胞中的包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組?！叭嗽椿笨贵w是保留非人抗體的反應(yīng)性，而在人中具有更低免疫原性的抗體。 例如這可通過保留非人⑶R區(qū)并用它們的人類對(duì)應(yīng)物替換抗體剩余部分(即，恒定區(qū)以及可變區(qū)的構(gòu)架部分)來實(shí)現(xiàn)。參閱例如，Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA,81 6851-6855，1984 ；Morrison 禾口 Oi，Adv. Immunol. ,44 :65-92,1988 ；Verhoeyen 等，Science, 239 :1534-1536,1988 ；Padlan, Molec. Immun. ,28 :489-498,1991 ；禾口 Padlan，Molec. Immun. ,31 =169-217,1994。人工程化技術(shù)的其它實(shí)例包括，但不限于在US 5，766，886中公開的Xoma技術(shù)。在兩條或更多核酸或多肽序列的上下文中，術(shù)語“相同的”或百分比“同一性”指相同的兩條或更多序列或子序列。當(dāng)使用以下的序列比較算法或通過手工比對(duì)和視覺檢查測(cè)定，比較并比對(duì)在比較窗內(nèi)或指定區(qū)域內(nèi)用于最大對(duì)應(yīng)時(shí)，如果兩條序列具有特定百分比(即，在特定區(qū)域上或當(dāng)不指定時(shí)，在全長(zhǎng)序列上60 %同一性，任選地65%、70 %、75%、 80 %、85 %、90 %、95 %或99 %同一性)的相同氨基酸殘基或核苷酸，那么兩條序列“基本相同”。任選地，同一性存在于長(zhǎng)度至少約50個(gè)核苷酸(或10個(gè)氨基酸)的區(qū)域，或更優(yōu)選地在長(zhǎng)度至少100到500或1000或更多核苷酸(或20、50、200或更多氨基酸)的區(qū)域。對(duì)于序列比較，通常一條序列作為參考序列，測(cè)試序列與其進(jìn)行比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，如果需要，指定子序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)?？墒褂媚J(rèn)程序參數(shù)，或可指定可選參數(shù)。所述序列比較算法然后基于程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的百分比序列同一性。如此處所用，“比較窗口”包括參考選自20到600、一般約50到約200，更一般約100到約150的任何一定數(shù)量相鄰位置的區(qū)段，其中可在兩條序列進(jìn)行最佳比對(duì)后將序列與相同數(shù)量相鄰位置的參考序列進(jìn)行比較。用于比較的序列比對(duì)方法為本領(lǐng)域所熟知。例如通過Smith和Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2 :482c的局部同源性算法，通過 Needleman 和 Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443,1970 的同源性比對(duì)算法，通過搜索 Pearson 和 Lipman，Proc. Nat，1. Acad. Sci. USA 85 :2444，1988的相似性方法，通過這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)現(xiàn)(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.，Madison, WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通過手工比對(duì)和視覺檢查(參閱，例如 Brent 等，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou編輯，2003))進(jìn)行序列最佳比對(duì)用于比較。適合于測(cè)定百分比序列同一性和序列相似性的算法的兩個(gè)實(shí)例是BLAST和BLAST 2. 0 算法，其分別描述于 Altschul 等，Nuc. Acids Res. 25 :3389-3402,1977 ；和 Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 :403_410，1990 中。用于進(jìn)行 BLAST 分析的軟件通過 National Center for Biotechnology ^formation公開獲得。該算法包括首先通過鑒定查詢序列中長(zhǎng)度為W的短字來鑒定高得分序列對(duì)(HSR)，當(dāng)在數(shù)據(jù)庫序列中用相同長(zhǎng)度的字比對(duì)時(shí)，所述短字匹配或滿足某一正值閾值得分Τ。T稱為鄰近字得分閾值(Altschul等，上文)。這些初始鄰近字命中作為起始搜索的種子，以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長(zhǎng)HSI^s。只要可增加累積比對(duì)得分，則沿每一序列的兩個(gè)方向延伸字命中。對(duì)于核苷酸序列，使用參數(shù)M(對(duì)一對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)賞得分 ’總〉0)和N(對(duì)錯(cuò)配殘基的罰分；總< 0)計(jì)算累積得分。對(duì)于氨基酸序列，使用得分矩陣來計(jì)算累積得分。當(dāng)所述累積比對(duì)得分從其最高達(dá)到值跌落X量；因一個(gè)或更多負(fù)得分殘基比對(duì)累積，所述累積比對(duì)得分到達(dá)零或以下；或到達(dá)任何一條序列的末端時(shí)， 停止字命中在每一方向上的延伸。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對(duì)的靈敏度和速度。 BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)使用默認(rèn)字長(zhǎng)(W) 11、期望值(E) 10、M = 5、N = -4和兩條鏈的比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用默認(rèn)字長(zhǎng)3，和期望值(E) 10和BL0SUM62 得分矩陣(參閱 Henikoff 和 Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915,1989)比對(duì) (B) 50、期望值(E) 10、M= 5、N = -4和兩條鏈的比較。BLAST算法也進(jìn)行兩條序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參閱例如，Karlin和 Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-5787,1993)。BLAST 算法提供的一種相似性測(cè)量是最小總和概率(P(N))，其提供兩條核苷酸或氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹配的概率的指示。例如，如果測(cè)試核酸與參考核酸的比較中最小總和概率低于約0. 2，更優(yōu)選低于約 0. 01，并最優(yōu)選低于約0. 001，那么認(rèn)為核酸與參考序列相似。也可使用已經(jīng)整合至Ij ALIGN算法(版本2. 0)的E. Meyers和W. Miller (Comput. Appl.Biosci.，4 :11-17,1988)的算法，使用PAMl20加權(quán)殘基表，空位長(zhǎng)度罰分12和空位罰分4測(cè)定兩條氨基酸序列之間的百分比同一性。此外，可使用已經(jīng)整合到GCG軟件包(可在 www. RCR. com 上獲得)中的 GAP 程序的 Needleman 和 1Wunsch (J. Mol,Biol. 48 :444-453, 1970)算法，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，以及空位加權(quán)16、14、12、10、8、6或4和長(zhǎng)度加權(quán)1、2、3、4、5或6來測(cè)定兩條氨基酸序列之間的百分比同一性。除了上文指出的序列同一性的百分比，兩條核酸序列或多肽基本相同的另一指示是第一條核酸編碼的多肽與針對(duì)第二條核酸編碼的多肽產(chǎn)生的抗體免疫交叉反應(yīng)，如下文描述。因此，多肽通常與第二條多肽基本相同，例如，其中兩條肽僅因保守替換而不同。兩條核酸序列基本相同的另一指示是兩個(gè)分子或其互補(bǔ)序列在嚴(yán)格條件下彼此雜交，如下文描述。兩條核酸序列基本相同的又一指示是可使用相同的引物來擴(kuò)增所述序列。術(shù)語“分離的抗體”指抗體，其基本不含具有不同抗原特異性的其它抗體(例如， 特異性結(jié)合C5的分離的抗體基本不含特異性結(jié)合除C5外的抗原的抗體)。然而，特異性結(jié)合C5的分離的抗體可對(duì)其它抗原具有交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可基本不含其它細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)品。術(shù)語“同種型”指重鏈恒定區(qū)基因提供的抗體種類(例如，IgM、IgE、IgG如IgGl 或IgG4)。同種型也包括這些種類中一種的修飾形式，其中已經(jīng)進(jìn)行修飾以改變Fc功能，例如來增強(qiáng)或減弱效應(yīng)功能或與Fc受體的結(jié)合。如此處所用，術(shù)語“Kassoc”或“Ka”旨在指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率， 而如此處所用，術(shù)語“Kdis”或“Kd”旨在指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如此處所用，術(shù)語“K/旨在指解離常數(shù)，其獲得于Kd與Ka的比值(即Kd/Ka)并表達(dá)為摩爾濃度 (M)?？墒褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法測(cè)定抗體的Kd值。用于測(cè)定抗體Kd的方法是通過使用表面等離振子共振，或使用生物傳感器系統(tǒng)如Biaeere 系統(tǒng)。如此處所用，術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指單個(gè)分子組合物的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物對(duì)特定表位顯示單一結(jié)合特異性和親和力。術(shù)語“核酸”此處與術(shù)語“多核苷酸”可互換使用，并指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述術(shù)語包括含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或鍵的核酸，其為合成的、天然發(fā)生的和非天然發(fā)生的，其與參考核酸具有相似的結(jié)合性質(zhì)，并且其以與參考核苷酸相似的方式進(jìn)行代謝。此類類似物的實(shí)例包括，但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。除非另有指出，特定核酸序列也暗中包括其保守修飾的變體(例如簡(jiǎn)并密碼子替換)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。尤其是，如下文詳細(xì)描述，可通過產(chǎn)生這樣的序列完成簡(jiǎn)并密碼子替換，其中用混和堿基和/或脫氧肌苷殘基替換一個(gè)或更多所選(或全部) 密碼子的第三個(gè)位置(Batzer 等，Nucleic Acid Res. 19 :5081,1991 ；Ohtsuka 等，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608,1985 ；禾口 Rossolini 等，Mol. Cell. Probes 8 :91-98,1994)。術(shù)語“有效連接”指兩個(gè)和更多多核苷酸(例如DNA)區(qū)段的功能關(guān)系。通常，其指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與轉(zhuǎn)錄序列之間的功能關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列刺激或調(diào)節(jié)編碼序列在適當(dāng)宿主細(xì)胞或其它表達(dá)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄，那么該啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列有效連接編碼序列。一般地，有效連接轉(zhuǎn)錄序列的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與轉(zhuǎn)錄序列在物理空間上鄰近，即它們是順式作用。然而，一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，如增強(qiáng)子不需要與編碼序列(增強(qiáng)子增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄)在物理空間上鄰近或位于其附近。如此處所用，術(shù)語“優(yōu)化的”表示已經(jīng)使用生產(chǎn)細(xì)胞或生物，一般是真核細(xì)胞，例如畢赤酵母細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或人細(xì)胞中優(yōu)選的密碼子改變核苷酸序列，以編碼氨基酸序列。將優(yōu)化的核苷酸序列改造以完全或最大可能地保留起始核苷酸序列(其也稱為“親本”序列)最初編碼的氨基酸序列。已經(jīng)改造了此處的優(yōu)化序列以具有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中優(yōu)選的密碼子。然而，此處也考慮其它真核細(xì)胞或原核細(xì)胞中這些序列的優(yōu)化表達(dá)。 優(yōu)化的核苷酸序列編碼的氨基酸序列也稱為優(yōu)化的。術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”此處互換使用來指氨基酸殘基的聚合物。所述術(shù)語應(yīng)用到氨基酸聚合物，其中一個(gè)或更多氨基酸殘基是相應(yīng)天然發(fā)生氨基酸的人工化學(xué)模擬物， 還應(yīng)用到天然發(fā)生的氨基酸聚合物和非天然發(fā)生的氨基酸聚合物。除非另有指出，特定的多肽序列也暗中包括其保守修飾的變體。如此處所用，術(shù)語“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，如從對(duì)人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動(dòng)物(例如小鼠)或從中制備的雜交瘤中分離的抗體、從經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞，例如從轉(zhuǎn)染瘤中分離的抗體、從重組、組合人抗體庫文中分離的抗體，和通過任何其它手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，所述手段包括將全部或部分人免疫球蛋白基因、序列剪切成其它DNA序列。此類重組人抗體具有可變區(qū)，其中構(gòu)架和CDR區(qū)均來自人種系免疫球蛋白序列。然而在某些實(shí)施方案中，此類重組人抗體可進(jìn)行體外誘變(或者，當(dāng)使用人Ig序列轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物時(shí)，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是當(dāng)來自并與人種系VH和VL序列相關(guān)時(shí)可能在體內(nèi)人抗體種系所有組成成分中不天然存在的序列。術(shù)語“重組宿主細(xì)胞”(或簡(jiǎn)單地“宿主細(xì)胞”)指已經(jīng)向其中引入重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)理解此類術(shù)語不僅旨在指特定受試者細(xì)胞，還指此細(xì)胞的后代。因?yàn)槟承┬揎椏赡芤蛲蛔兓颦h(huán)境影響而在后代中出現(xiàn)，所以該后代實(shí)際上可能與親本細(xì)胞不相同，但仍然包括在此處所用術(shù)語“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。術(shù)語“受試者”包括人和非人動(dòng)物。非人動(dòng)物包括所有的脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類、羊、狗、奶牛、雞、兩棲動(dòng)物和爬行動(dòng)物。除了指出時(shí)，術(shù)語“患者”或“受試者”此處可互換使用。術(shù)語“治療”包括施用組合物或抗體，以防止或延遲癥狀、并發(fā)癥或疾病(例如 AMD)的生物化學(xué)指征的開始，緩解癥狀或阻止或抑制疾病、狀況或病征的進(jìn)一步發(fā)展。治療可以是預(yù)防性的(以防止或延遲疾病開始，或防止其臨床或亞臨床癥狀的表現(xiàn))或在疾病表現(xiàn)后治療性抑制或緩解癥狀。術(shù)語“載體”旨在指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)已經(jīng)連接另一多核苷酸的多核苷酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！?，其指已經(jīng)連接額外DNA片段的環(huán)形雙鏈DNA環(huán)。另一類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA區(qū)段可連接到病毒基因組內(nèi)。某些載體能夠在其中引入載體的宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和游離型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非游離型哺乳動(dòng)物載體)可在引入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì)胞的基因組中，并由此與所述宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)它們有效連接的基因的表達(dá)。此類載體此處稱為“重組表達(dá)載體”(或簡(jiǎn)單地，“表達(dá)載體”)。一般而言，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體經(jīng)常是質(zhì)粒的形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常用形式。然而，本發(fā)明旨在包括此類其它形式的表達(dá)載體，如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，其起等同的功能。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示所選抗體與其最相近的人種系序列的可變區(qū)比對(duì)。圖2顯示溶血測(cè)定，其中將人C5滴定到人C5耗盡的血清中來測(cè)定C5活性。圖3顯示獼猴血清滴定到人C5耗盡的血清中來測(cè)定最佳獼猴C5濃度，用于旁路途徑溶血測(cè)定。圖4顯示使用20%人血清的經(jīng)典途徑溶血測(cè)定的實(shí)例。圖5顯示旁路途徑溶血測(cè)定的實(shí)例，使用添加到人C5耗盡的血清中的IOOpM純化人C5。圖6顯示使用0. 025%獼猴血清添加到人C5耗盡的血清中的旁路途徑溶血測(cè)定的實(shí)例。圖7顯示使用成熟Fabs與其各自親本比較的經(jīng)典途徑溶血測(cè)定(20%人血清)的實(shí)例。圖8顯示使用成熟Fabs的經(jīng)典途徑溶血測(cè)定(5%獼猴血清)的實(shí)例。圖9顯示使用IOOpM人C5添加到20%人C5耗盡的血清中的旁路途徑溶血測(cè)定中親和力成熟的Fab的表征。圖10顯示使用20%人血清的旁路途徑溶血測(cè)定中親和力成熟的Fab的表征。圖11顯示使用IOOpM獼猴C5添加到20%人C5耗盡的血清中的旁路途徑溶血測(cè)定中親和力成熟的Fab的表征。圖12顯示使用20%人血清的經(jīng)典途徑溶血測(cè)定中種系IgGs的表征。
圖13顯示使用5%獼猴血清的經(jīng)典途徑溶血測(cè)定中種系IgGs的表征。圖14顯示使用IOOpM人C5的旁路途徑溶血測(cè)定中種系IgGs的表征。圖15顯示使用20%人血清的旁路途徑溶血測(cè)定和Cfe產(chǎn)生ELISA中最終種系 IgGs的表征。圖16顯示使用來自20%人血清溶血測(cè)定的上清液的C5a ELISA中親和力成熟的 Fab的表征。圖17顯示人C3、C4、C5和獼猴C5測(cè)試抗體7091及其衍生物上的特異性溶液 ELISA。圖18顯示使用Fabs的血清穩(wěn)定性測(cè)定(在存在50%血清的情況下結(jié)合人C5)。圖19顯示一些親和力提高的Fabs的表位結(jié)合。圖20顯示抗體結(jié)合小鼠-人嵌合C5或人C5的ELISA，來確定α鏈相對(duì)于β鏈結(jié)合子。通過5G1. 1呈遞C5，來測(cè)定與5G1. 1的競(jìng)爭(zhēng)。圖21顯示用于測(cè)試具有5G1. 1捕獲的α鏈相對(duì)于β鏈結(jié)合子的ELISA。圖22顯示用于測(cè)試α鏈相對(duì)于β鏈結(jié)合子的溶血測(cè)定的結(jié)果。圖23顯示37°C下(0、30、60和90分鐘)親本Fabs的嗜熱菌蛋白酶蛋白酶解。圖24顯示55°C下(0、30、60和90分鐘)親本Fabs的嗜熱菌蛋白酶蛋白酶解。圖25顯示37°C下成熟Fabs的嗜熱菌蛋白酶敏感性。圖26顯示55°C下成熟Fabs的嗜熱菌蛋白酶敏感性。圖27顯示MAC沉積測(cè)定中可變途徑的Fab抑制的實(shí)例。發(fā)明詳述本發(fā)明提供特異性結(jié)合補(bǔ)體C5蛋白質(zhì)(例如，人C5，獼猴C5)的抗體、藥物組合物、產(chǎn)生方法和使用此類抗體和組合物的方法。5.1C5 抗體本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5(例如，人C5，獼猴C5)的抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人和獼猴C5的抗體。本發(fā)明的抗體包括，但不限于如實(shí)施例中所述分離的人單克隆抗體(參閱下文第6部分)。本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)(例如，人和/或獼猴C5)的抗體，所述抗體包含具有 SEQ ID NO :7、23、39、51、67、79、96、108、114、121、137、151、165、179、187、201、210、 218、227、M1、253、257、273、277或281的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)(例如，人和/或獼猴C5)的抗體，所述抗體包含具有下文表1中列出的任何一個(gè)VH CDRs的氨基酸序列的VH CDR0具體而言，本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)(例如，人和/或獼猴C5)的抗體，所述抗體包含(或者，組成為)具有下文表1中列出的任何一個(gè)VH⑶Rs的氨基酸序列的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多VH⑶Rs。本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)(例如，人和/或獼猴C5)的抗體，所述抗體包含具有 SEQ ID NO :8、24、40、52、68、80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、 228,242,261,265,269,285或觀9的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供特異性結(jié)合 C5蛋白質(zhì)(例如，人和/或獼猴C5)的抗體，所述抗體包含具有下文表1中列出的任何一個(gè)VL CDRs的氨基酸序列的VL CDR0具體而言，本發(fā)明提供特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)(例如， 人和/或獼猴⑶)的抗體，所述抗體包含(或者，組成為)具有下文表1中列出的任何一個(gè)VL⑶Rs的氨基酸序列的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多VL⑶Rs。本發(fā)明的其它抗體包括已經(jīng)突變的氨基酸，其在CDR區(qū)中仍然與表1所述序列中描述的⑶R區(qū)具有至少百分之60、70、80、90或95的同一性。在一些實(shí)施方案中，其包括突變氨基酸序列，其中當(dāng)與表1所述序列中描述的⑶R區(qū)比較時(shí)⑶R區(qū)中不超過1、2、3、4或 5個(gè)氨基酸已經(jīng)發(fā)生突變。本發(fā)明還提供編碼特異性結(jié)合C5蛋白質(zhì)(例如，人和/或獼猴C5)的抗體的VH、 VL、全長(zhǎng)重鏈和全長(zhǎng)輕鏈的核酸序列。可優(yōu)化此類核酸序列用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá) (例如，表 1 顯示了抗體 8109、8110、8111、8113、8114、8112、8125、8126、8127、8128、8129、 8130,8131,8132和8091的重鏈和輕鏈的優(yōu)化核酸序列)。表1.本發(fā)明c5抗體與c5蛋白質(zhì)的實(shí)例
抗體8109序列標(biāo)識(shí)符(seq id no:)或注釋/細(xì)節(jié)cdrhl1: syaiscdrh22: gigpffgtanyaqkfqgcdrh33:dtpyfdycdrll4:sgdsipnyyvycdrl25: ddsnrpscdrl36:qsfdsslnaevvh7:evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmggigpffgtany aqkfqgr vtitades tstaymelsslrsedtavyycardtpyfdywgqgtlvtvssvl8:Syettqpt ,svsvAT ,Gqtarttcsgdsipnyyvywyqqkpgqapvi ,viyddsnrpsgiprrfsgsnsgnt Ατι ,tisraq agdead yycqsfdsslnaevfgggtkltvl重鏈9:evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmggigpffgtanyaqkfqgrvtitades tstaymelsslrsedtavyycardtpyfdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyrpep vtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpa peaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeq ynstyr vvsvlt vlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesn gqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk輕鏈10:syeltqplsvsvalgqtaritcsgdsipnyyvywyqqkpgqapvlviyddsnrpsgiperfsgsnsgntatltisra qagdead yycqsfdsslnaevfgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypga vtv awkads spvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektv aptecs編碼seq id no:7 的 pn11:GAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGC AAAGC CTCCGGAGGCACTTTTTCTTCTTATGCCATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGG CGGTATCGGTCCGTTTTTTGGCACTGCGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGC GGATG AAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCG TGATACTCCTTATTTTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA編碼SEQ ID NO:8 的 PN12:tcctatgaactcacacagcccctgagcgtgagcgtggccctgggccagaccgcccggatcacctgctccggc GACAGCATCCCCAACTACTACGTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCGTGCTGGTGATCTACGA CGACAGC AACCGGCCCAGCGGCATCCCCGAGCGGTTC.AGC GGCAGC AACAGCGGCAACACCGC.CACCCTGACC ATTTCCAGAGCACAGGCAGGCGACGAGGCCGACTACTACTGCCAGAGCTTCGACAGCAGCCTGAACGCCGAGG TGTTCGGCGGAGGGACCAAGTTAACCGTCCTA編碼SEQ ID no:9 的 pn13:gaggtgcaattggttcagtctggcgcggaagtgaaaaaaccgggcagcagcgtgaaagtgagctgc aaagc CTCCGGAGGCACTTTTTCTTCTTATGCCATTTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGG CGGTATCGGTCCGTTTTTTGGCACTGCGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCGGATG aaagcaccagcaccgcgtatatoa~actaaxicagcct<^ctagcgaagatacg<^。ctm’ar· TGATACTCCTTATTTTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCAGCCTCCACCAAGGGTCCATC GGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTA catctgc aacgtgaatcacaagcccagc aacacc aaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaa
權(quán)利要求
1.特異性結(jié)合補(bǔ)體C5蛋白質(zhì)的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體具有至少 IxIO7M-1UO8M-1UO9M-1UOiqM-1 或 ΙΟ、—1 的親和常數(shù)(Ka)。
2.權(quán)利要求1的抗體，其如通過體外溶血測(cè)定法所測(cè)定以20-200ρΜ的IC5tl抑制補(bǔ)體旁路。
3.抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合補(bǔ)體C5蛋白質(zhì)，并與表1中描述的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)。
4.抗體或其抗原結(jié)合片段，其與表1中描述的抗體結(jié)合相同的表位。
5.權(quán)利要求1、3或4的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
6.權(quán)利要求5的抗體，其中所述抗體是人或人源化抗體。
7.權(quán)利要求5的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體。
8.權(quán)利要求5的抗體，其中所述抗體包含人重鏈恒定區(qū)和人輕鏈恒定區(qū)。
9.權(quán)利要求5的抗體，其中所述抗體是單鏈抗體。
10.權(quán)利要求5的抗體，其中所述抗體是Fab片段。
11.權(quán)利要求5的抗體，其中所述抗體是scFv。
12.權(quán)利要求5的抗體，其結(jié)合人C5和獼猴C5。
13.權(quán)利要求5的抗體，其是IgG同種型。
14.權(quán)利要求5的抗體，其中所述抗體包含構(gòu)架，其中氨基酸已經(jīng)替換成來自各自人VH 或VL種系序列的抗體構(gòu)架。
15.分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，其包含與SEQID N0:l、2、3、4、5、6、17、 18、19、20、21、22、33、34、35、36、37、38、49、50、61、62、·63、64、65、66、77、78、89、95、101、107、 113、119、120、131、132、133、134、135、136、145、146、147、148、149、150、159、160、161、162、 163、·164、173、174、175、176、177、178、195、196、197、198、199、200、209、226、235、236、237、 238、239或240具有至少95%序列同一性的至少一個(gè)互補(bǔ)決定(OTR)序列，其中所述抗體結(jié)合人C5蛋白質(zhì)。
16.分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，其包含與SEQID N0:l、2、3、17、18、19、33、 34、35、49、61、62、63、77、77、95、107、113、119、132、·131、133、145、146、147、159、160、161、 173、174、175、195、196、197、226、235、236或237相同的至少一個(gè)重鏈CDR序列，其中所述抗體結(jié)合人C5蛋白質(zhì)。
17.分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，其包含與SEQID NO :4、5、6、20、21、22、36、 37、38、50、64、65、66、78、89、101、120、134、135、136、·148、149、150、162、163、164、176、177、 178、198、199、200、209、238、239或240相同的至少一個(gè)輕鏈CDR序列，其中所述抗體結(jié)合人 C5蛋白質(zhì)。
18.分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，其包含選自SEQID N0:l、17、33、61、131、 145、159、173、195 和 235 的重鏈 CDRl ；選自 SEQID NO :2、18、·34、49、62、77、95、107、113、 119、132、146、160、174、196、226 和 236 的重鏈 CDR2 ；和選自 SEQ ID NO :3、19、35、63、133、·147、161、175、197和237的重鏈CDR3，其中所述抗體結(jié)合人C5蛋白質(zhì)。
19.分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，其包含選自SEQID N0:4、20、36、64、134、·148、162、176、198和 238 的輕鏈 CDRl ；選自 SEQ ID NO :5、21、37、65、135、149、163、177、199 和239 的輕鏈CDR2 ；和選自 SEQ ID NO :6、22、38、50、·66、78、89、101、120、136、150、164、178、·200,209和240的輕鏈⑶R3，其中所述抗體結(jié)合人C5蛋白質(zhì)。
20.權(quán)利要求18的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其還包含選自SEQIDN0:4、20、36、64、 134、148、162、176、198和238 的輕鏈CDRl ；選自 SEQ ID NO :5、21、37、65、135、149、163、177、 199 和 239 的輕鏈 CDR2 ；和選自 SEQ ID NO :6、22、38、50、66、78、89、101、120、136、150、164、 178、200、209 和 240 的輕鏈 CDR3。
21.分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，其包含與SEQID N0:7、23、39、51、67、79、96、108、114、121、137、151、165、179、187、201、210、218、227、241、253、257、273、277或 281 具有至少95%序列同一性的重鏈可變區(qū)，其中所述抗體結(jié)合人C5蛋白質(zhì)。
22.分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，其包含與SEQID N0:8、24、40、52、68、80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285和 289 具有至少95%序列同一性的輕鏈可變區(qū)，其中所述抗體結(jié)合人C5蛋白質(zhì)。
23.權(quán)利要求21的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其還包含與SEQID NO :8、對(duì)、40、52、68、 80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285 和 289 具有至少95%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
24.分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，其包含與SEQID NO :9、25、41、53、69、81、97、109、115、123、139、153、167、181、189、203、212、220、229、243、249、254、258、274、278或 282具有至少95%序列同一性的重鏈，其中所述抗體結(jié)合人C5蛋白質(zhì)。
25.分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，其包含與SEQID NO :10,26,42,54,70,82,91、103、124、140、154、168、182、190、204、213、221、230、244、251、262、266、270、286或 290 具有至少95%序列同一性的輕鏈，其中所述抗體結(jié)合人C5蛋白質(zhì)。
26.權(quán)利要求M的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其還包含與SEQID NO :10,26,42,54,70, 82、91、103、124、140、154、168、182、190、204、213、221、230、244、251、262、266、270、286 或 290具有至少95%序列同一性的輕鏈。
27.藥物組合物，其包含選自權(quán)利要求116的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
28.包含編碼多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含與SEQID N0:7、23、39、51、67、79、96、108、114、121、137、151、165、179、187、201、210、218、227、241、253、257、273、277或 281具有至少95%序列同一性的重鏈可變區(qū)。
29.包含編碼多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含與SEQID NO :8、24、40、52、68、80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285和 289 具有至少95%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
30.載體，其包含權(quán)利要求28或四的核酸。
31.分離的宿主細(xì)胞，其包含(1)編碼權(quán)利要求18的抗體重鏈的重組DNA區(qū)段，和(2) 編碼所述抗體的輕鏈的第二個(gè)重組DNA區(qū)段；其中所述DNA區(qū)段有效連接啟動(dòng)子，并能夠在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)。
32.權(quán)利要求31的宿主細(xì)胞，其中所述抗體是人單克隆抗體。
33.權(quán)利要求31的宿主細(xì)胞，其為非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
34.治療年齡相關(guān)性黃斑變性的方法，其包括向需要該治療的受試者施用有效量的包含選自權(quán)利要求1-26的抗體的組合物。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述受試者是人。
36.治療疾病的方法，其包括向需要該治療的受試者施用有效量的包含選自權(quán)利要求 1-26的抗體的組合物，其中所述疾病是哮喘、關(guān)節(jié)炎、自身免疫心臟病、多發(fā)性硬化、炎性腸病、缺血-再灌注損傷、巴-西綜合征、血液透析、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、紅斑狼瘡、牛皮癬、多發(fā)性硬化、移植、阿爾茨海默氏病、腎小球腎炎或MPGN II。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述疾病是腎小球腎炎。
38.治療陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)的方法，其包括向需要該治療的受試者施用有效量的包含選自權(quán)利要求1-26的抗體的組合物。
39.改善與體外循環(huán)相關(guān)癥狀的方法，其包括向需要其的受試者施用有效量的包含權(quán)利要求146的抗體的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及靶定補(bǔ)體蛋白質(zhì)C5的抗體，和組合物及其使用方法。
文檔編號(hào)C07K16/18GK102170906SQ200980138903
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日
發(fā)明者A·埃博斯, B·C·吉爾德, B·迪芬巴赫-施特賴貝爾, I·斯普勞斯基, M·羅古斯卡, Y-I·金 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司