專利名稱：從satb2衍生的表位及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本披露涉及表位以及結(jié)合到其上的親和配體的領(lǐng)域。此外，本披露的一些方面涉及使用該親和配體的方法，例如用于結(jié)腸直腸癌預(yù)測。
背景技術(shù)：
癌癥癌癥是西方世界中疾病和死亡的最普通的原因之一。通常，對于癌癥的大多數(shù)形式，發(fā)病率隨著年齡而增加。隨著人類種群持續(xù)活得更長，由于一般健康狀態(tài)的增進(jìn)，癌癥將影響越來越多數(shù)量的個體。雖然在環(huán)境因素(飲食、吸煙、紫外線輻射等等)連同遺傳因素(“癌基因”如p53、APC、BRCAl、XP等的種系突變)與癌癥的發(fā)生風(fēng)險之間提供一種聯(lián)系的知識體有增加，最普通癌癥類型的病因大部分仍然是未知的。從一種細(xì)胞生物學(xué)觀點看沒有完全令人滿意的癌癥的定義，盡管事實上癌癥基本上是一種細(xì)胞疾病并且被定義為具有凈細(xì)胞生長以及抗群體行為的一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞群體。惡性轉(zhuǎn)化代表基于不可逆的遺傳改變以向一種惡性表型的轉(zhuǎn)變。雖然這還沒有正式證明，惡性轉(zhuǎn)化是被認(rèn)為是發(fā)生在一個細(xì)胞中，隨后從該細(xì)胞發(fā)展出的腫瘤開始了( “癌癥的克隆性”教義)。致癌作用是通過它產(chǎn)生癌癥的過程并且通常被認(rèn)為包括最后導(dǎo)致惡性腫瘤生長的多個事件。這種多級過程包括若干限速步驟，如突變以及還可能的次生事件的加入，其導(dǎo)致在癌前期增殖階段之后癌癥的形成。這些分級改變涉及決定細(xì)胞分裂、不合群行為、以及細(xì)胞死亡的重要調(diào)節(jié)通路的錯誤(突變)的累積。與周圍的細(xì)胞相比，這些改變的每一個可以提供一個選擇性的達(dá)爾文生長優(yōu)勢，導(dǎo)致該腫瘤細(xì)胞群的凈生長。重要的是強(qiáng)調(diào)一種惡性腫瘤不僅必需由這些轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞它們本身，而且由周圍充當(dāng)為一種支持性基質(zhì)的正常細(xì)胞組成。這種募集的癌基質(zhì)包括結(jié)締組織、血管、以及各種其他的正常細(xì)胞例如炎癥細(xì)胞，它們一致地起作用從而為這些轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞提供持續(xù)的腫瘤生長必需的信號。最常見的癌癥的形式出現(xiàn)在體細(xì)胞中并且主要是上皮細(xì)胞起源的，例如前列腺、 乳腺、結(jié)腸、泌尿道以及皮膚；隨后是從造血系起源的癌癥例如白血病和淋巴瘤、從神經(jīng)外胚層起源的癌癥例如惡性膠質(zhì)瘤、以及軟組織腫瘤例例如肉瘤。癌癥診斷和預(yù)測取自腫瘤的一種組織切片的顯微鏡評估仍然是確定一種癌癥的診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。對于顯微鏡診斷，收集來自可疑腫瘤的活組織檢查材料并且在顯微鏡下檢查。為了獲得一個確定的診斷，將該腫瘤組織在福爾馬林中固定、組織學(xué)處理、并且石蠟包埋。從該生成的石蠟塊，可以產(chǎn)生組織切片并且使用組織化學(xué)(即蘇木精-伊紅染色)染色以及免疫組織化學(xué)法二者。然后用病理學(xué)技術(shù)(包括肉眼分析以及顯微鏡分析)評估該外科標(biāo)本。這種分析通常形成用于給定一個特異性診斷的基礎(chǔ)，即進(jìn)行腫瘤類型的分類以及一種腫瘤的惡性程度的分級。根據(jù)對于各癌癥類型特異的分類方案可以將惡性腫瘤分成若干階段。用于實體瘤的最常見的分類系統(tǒng)是腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移(TNM)分期系統(tǒng)。T階段說明原發(fā)性腫瘤的局部范圍，即該腫瘤已經(jīng)侵襲并且強(qiáng)加地生長進(jìn)入周圍正常組織到什么程度，而N階段以及M 階段說明該腫瘤已經(jīng)怎樣發(fā)生轉(zhuǎn)移，N階段說明該腫瘤擴(kuò)散到淋巴結(jié)，并且M階段說明在其他遠(yuǎn)隔器官中腫瘤的生長。早期包括T0-1、NO、M0，表示具淋巴結(jié)陰性的局部性腫瘤。更晚期包括Τ1-4、ΝΟ-4、Μ0，表示具有更廣泛生長的局部性腫瘤，以及Tl-4、Nl_4、MO表示已經(jīng)轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)的腫瘤，并且Τ1-4、Ν1-4、Μ1表示具有在遠(yuǎn)隔器官中檢出的轉(zhuǎn)移的腫瘤。腫瘤的分期通常是基于檢查的若干形式，包括外科、放射學(xué)以及組織病理學(xué)分析。除了分期之外，還有一種對大多數(shù)腫瘤類型的惡性級別進(jìn)行分級的分類系統(tǒng)。該分級系統(tǒng)依賴于一種腫瘤組織樣品的形態(tài)學(xué)評估，并且以在一種給定的腫瘤中發(fā)現(xiàn)的微觀特征為基礎(chǔ)。這些分級系統(tǒng)可以是基于腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、以及非典型外觀。通常采用的分級系統(tǒng)的實例包括用于前列腺癌的Gleason分級以及用于乳腺癌的Elston-Ellis分級。準(zhǔn)確的分期以及分級對于一種正確的診斷是重要的，并且提供一種預(yù)測預(yù)后的工具。對于一種特異腫瘤的診斷和預(yù)測信息其后決定了一種對于給定的癌癥患者的適當(dāng)?shù)闹委煵呗?。除組織切片的組織化學(xué)染色之外，為了獲得關(guān)于一種腫瘤的更多信息的最通常使用的方法是免疫組織化學(xué)染色(IHC)。IHC允許使用特異性抗體檢測在組織和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。除了從組織化學(xué)染色的腫瘤組織切片評估的關(guān)于組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的信息之外，IHC在臨床診斷學(xué)中的用途允許檢測在不同的細(xì)胞群中的免疫反應(yīng)性。IHC對于支持準(zhǔn)確的診斷可以是重要的，該診斷包括一種原發(fā)性腫瘤的分期和分級連同未知起源的轉(zhuǎn)移的診斷。在當(dāng)今臨床實踐中最通常使用的抗體包括針對細(xì)胞類型“特異的”蛋白質(zhì)，例如 PSA(前列腺)、MelanA(黑色素細(xì)胞)、以及甲狀腺球蛋白(甲狀腺)的抗體，以及識別中間絲(上皮細(xì)胞、間充質(zhì)、神經(jīng)膠質(zhì))、分化群(CD)抗原(造血細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞的亞類)、以及惡性潛能的標(biāo)志物(例如Ki67 (增殖)、p53 (通常突變的腫瘤抑制基因)以及HER-2 (生長因子受體)的抗體。除了 IHC以外，用于檢測基因擴(kuò)增的原位雜交以及用于突變分析的基因測序的使用是在癌癥診斷之內(nèi)發(fā)展的技術(shù)。另外，所有轉(zhuǎn)錄物、蛋白質(zhì)、或代謝物的整體分析增加了重要的信息。然而，大多數(shù)的這些分析仍然代表基礎(chǔ)研究并且對于在臨床醫(yī)學(xué)中的使用還有待評估和標(biāo)準(zhǔn)化。來自結(jié)腸和直腸的腺癌(結(jié)腸直腸癌)結(jié)腸直腸癌，一種作為腺癌存在的惡性上皮細(xì)胞瘤，是全世界人類癌癥的最常見形式之一。來自由Parkin等人提供的GL0B0CAN 2002數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)表明每年鑒定約1百萬個新的結(jié)腸直腸癌病例(Parkin DM et al (2005)CACancer J Clin 55,74-108) 此外，全世界結(jié)腸直腸癌的發(fā)病率是所有癌癥的約9.4%，并且結(jié)腸直腸癌構(gòu)成了西方世界中死亡的第二最常見的病因。在西方世界中結(jié)腸直腸癌的五年生存率為約60%但是在東歐和印度低至30%。目前該腫瘤的早期檢測和手術(shù)切除對于成功治療是關(guān)鍵性重要的。對于局部性腫瘤，即沒有發(fā)展成轉(zhuǎn)移性疾病的腫瘤，進(jìn)行了根治性切除該腫瘤以及周圍的腸和組織的手術(shù)干預(yù)。根據(jù)Dukes分期A-D或更近的根據(jù) !分級將結(jié)腸直腸腫瘤分類成幾個階段。最小惡性的腫瘤(Dukes A和B期)通常與相對較好的結(jié)果相關(guān)，而具有轉(zhuǎn)移的高度惡性的腫瘤(Dukes C和D期)具有差的存活率。不幸的是，在檢測出之前結(jié)腸直腸癌通常已經(jīng)生長到相當(dāng)大的尺寸，并且因此轉(zhuǎn)移不是罕見的。該腫瘤典型地轉(zhuǎn)移到局部的淋巴結(jié)，但是到肝和肺的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也是常見的。癥狀取決于該腫瘤位于遠(yuǎn)處胃腸道中什么地方，并且包括腸不適(bowel distress)、腹瀉、便秘、疼痛以及貧血(繼發(fā)于來自腫瘤的出血進(jìn)入該腸中)。目前的診斷是基于患者的病史、臨床的以及內(nèi)窺鏡的檢查(直腸鏡檢查和結(jié)腸鏡檢查)，任選地隨后進(jìn)行放射學(xué)制圖以確定腫瘤生長的范圍。與內(nèi)鏡檢查相結(jié)合，從可疑的損傷進(jìn)行組織活檢。在不同的診斷中，細(xì)胞角蛋白20 (CK20)，一種在胃腸道的腺細(xì)胞中富含的中間纖維標(biāo)志物，通常用于診斷胃腸道中的原發(fā)性腫瘤，包括結(jié)腸直腸癌。該CK20標(biāo)志物不是理想的，因為若干其他的腺癌也可以對于CK20抗體是陽性的，然而不是所有的結(jié)腸直腸癌都是陽性的。預(yù)測信息主要地是從腫瘤期的分類獲得的，因為沒有公認(rèn)的可提供另外的預(yù)測數(shù)據(jù)的分級系統(tǒng)或蛋白標(biāo)志物。當(dāng)今還沒有可供使用的可以將低惡性級別以及低風(fēng)險發(fā)展成轉(zhuǎn)移性疾病的腫瘤與具有減少的存活機(jī)會的高度惡性的腫瘤區(qū)別開的標(biāo)志物。因此對于可以用于預(yù)測患者結(jié)果以及用于指導(dǎo)患者管理(包括治療性干預(yù))的分子標(biāo)志物存在著強(qiáng)烈的需要。簡要說明本披露的一些方面的一個目的是提供新的表位以及結(jié)合到其上的親和性配體。此外，一些方面的一個目的是提供在建立對患有結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者的預(yù)測有用的裝置和方法。本發(fā)明是由所附權(quán)利要求定義的。附圖簡要說明

圖1顯示了基于使用單克隆抗體5E2來診斷的患有結(jié)腸直腸的乙狀結(jié)腸癌的305 個受試者的免疫組織化學(xué)染色的總存活數(shù)分析(OS)的結(jié)果。實線表示細(xì)胞核部分
(NF >0)，并且虛線表示細(xì)胞核部分< 2% (NF = 0)。圖IA顯示了所有患者的結(jié)果。在圖 IB中，僅對患有處于Dukes C或D期中的結(jié)腸直腸癌的受試者進(jìn)行了分析。圖2顯示了基于使用單克隆抗體5E2來診斷的患有結(jié)腸直腸的乙狀結(jié)腸癌的305 個受試者的免疫組織化學(xué)染色的總存活數(shù)分析(OS)的結(jié)果。實線表示弱的、中等的或強(qiáng)的細(xì)胞核強(qiáng)度(Ni > 0)并且虛線表示無細(xì)胞核強(qiáng)度(Ni = 0)。圖2A顯示了所有患者的結(jié)果。在圖2B中，僅對患有處于Dukes C或D期中的結(jié)腸直腸癌的受試者進(jìn)行了分析。圖3顯示了基于使用單克隆抗體8F11來診斷的患有結(jié)腸直腸的乙狀結(jié)腸癌的305 個受試者的免疫組織化學(xué)染色的總存活數(shù)分析(0 的結(jié)果。實線表示細(xì)胞核部分>75% (NF = 1)，并且虛線表示細(xì)胞核部分< 75% (NF < 1)。圖3A顯示了所有患者的結(jié)果。在圖:3B中，僅對患有處于Dukes C或D期中的結(jié)腸直腸癌的受試者進(jìn)行了分析。圖4顯示了基于使用單克隆抗體8F11來診斷的患有結(jié)腸直腸的乙狀結(jié)腸癌305 個受試者的免疫組織化學(xué)染色的總存活數(shù)分析(0 的結(jié)果。實線表示強(qiáng)的細(xì)胞核強(qiáng)度(Ni =1)并且虛線表示無、弱的以及中等的細(xì)胞核強(qiáng)度(Ni < 1)。圖4A顯示了所有患者的結(jié)果。在圖4B中，僅對患有處于Dukes C或D期中的結(jié)腸直腸癌的受試者進(jìn)行了分析。圖5顯示了單克隆抗體5E2和8F11之間的交叉列表。圖6顯示了結(jié)腸直腸癌的兩個樣品的免疫組織化學(xué)染色。下面的圖像是在較高放大倍數(shù)下顯示的。圖6A顯示了使用多克隆抗體HPA001042 (HPAmsAB)的染色結(jié)果并且圖6B 顯示了多克隆抗體5E2的結(jié)果。圖7顯示了結(jié)腸直腸癌的兩個樣品的免疫組織化學(xué)染色。下面的圖像是在較高放大倍數(shù)下顯示的。圖7A顯示了使用多克隆抗體HPA001042 (HPAmsAB)的染色結(jié)果并且圖7B 顯示了多克隆抗體8F11的結(jié)果。詳細(xì)說明作為本披露的一個第一方面，提供了一種能夠選擇性地與一種表位序列相互作用的親和配體，該表位序列由47個或更少的氨基酸組成并且包括SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO 2的氨基酸序列。在本披露的背景下，“與一種表位序列選擇性地相互作用”是指選擇性地與該表位序列中所包含的氨基殘基相互作用。例如，能夠與表位序列選擇性地相互作用的一種親和配體可以能夠與由該表位序列的氨基酸殘基組成的一個片段選擇性地相互作用，這個片段可以在溶液中游離存在或被固定例如結(jié)合至一種珠粒上。還有，這種片段可以結(jié)合至報告基因基序上用于相互作用的檢測。作為另一個實例，“能夠與一種表位序列選擇性地相互作用的親和配體”可以是指該表位序列被包括在一個長的多肽中的情況，它是在該親和配體與該表位序列的氨基酸殘基而不是周圍的例如側(cè)翼的氨基酸殘基相互作用的前提下建立的。在本披露的背景下，“特異的”或“選擇性的”相互作用(例如一種親和配體與其靶標(biāo)或抗原的“特異的”或“選擇性的”相互作用)表示該相互作用是這樣使得在特異的與非特異的相互作用之間或在選擇性的與非選擇性的相互作用之間的區(qū)別變得有意義。在兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用有時是通過解離常數(shù)測量的。解離常數(shù)描述了在兩個分子之間的結(jié)合強(qiáng)度(或親和性)。典型地親和配體例如抗體與其抗原之間的解離常數(shù)是從KT7M至 IO-11M0然而，高特異性不是必須要求高親和性的。對于其對應(yīng)物具有低親和性的分子(在摩爾范圍內(nèi))已經(jīng)顯示出與具有很高親和性的分子一樣的特異性。在本披露的情況下，一種特異性或選擇性的相互作用是指對于在給定條件下在一種自然發(fā)生的或處理過的生物學(xué)流體的組織樣品或液體樣品中的其他蛋白質(zhì)存在下，確定包括一種特異性表位序列的蛋白的存在和/或量的一種特定的方法可使用的程度。換言之，特異性或選擇性是用于區(qū)分相關(guān)多肽序列之間的能力。在本說明書中特異性的與選擇性的有時是可互換使用的。特異性與選擇性測定還被描述于 Nilsson P et al. (2005)Proteomics 5:4327-4337。本披露的這個第一方面是基于諸位發(fā)明人已經(jīng)鑒定出某些表位(即SEQ ID NO 1 和2)并且已經(jīng)研制出結(jié)合到這些表位上的親和配體。并且，諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些結(jié)合到包含SEQ ID NO :1和/或2的氨基酸序列的蛋白上的親和配體對于建立對患有結(jié)腸直腸癌的患者的預(yù)測可能是有用的。在此顯示了在結(jié)腸直腸癌患者中包含SEQ ID N0:1和/或 2的蛋白的表達(dá)與這類患者的存活率相關(guān)。因此，例如該第一方面的親和配體可以用于建立對于患有結(jié)腸直腸癌的受試者的預(yù)測的各種分析、方法、測定或裝置中。通常在這類應(yīng)用中，更想要的是具有親和配體，這些配體對于某一表位而不是親和配體(例如多克隆抗體) 是特異性的，它們僅對全長蛋白或其較長的片段(例如抗原)是特異性的。根據(jù)該第一方面該親和配體的一個應(yīng)用的一個實例是如以下的第三方面來提供的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與具有序列SEQ ID NO 1的表位相互作用的抗體特別適合用于建立對于患有結(jié)腸直腸癌的受試者的預(yù)測。因此，在該第一方面的實施方案中，所討論的表位序列可以包括SEQ ID NO=I0 例如，諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與也結(jié)合到這類蛋白上但是對于包含SEQ ID N0:1(也參見圖 6-7)的表位序列不具有選擇性的多克隆抗體相比，根據(jù)這類實施方案的一種單克隆抗體表現(xiàn)出一種與包含包括氨基酸序列SEQ ID NO :1的蛋白的組織樣品的更強(qiáng)的并且更加顯著的免疫反應(yīng)性。通過使用兩種不同的單克隆抗體進(jìn)行表位作圖，諸位發(fā)明人已經(jīng)鑒定出兩種不同的氨基酸序列(SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4)，這兩種氨基酸序列都包括SEQ ID NO :1。因此，在該第一方面的實施方案中，所討論的表位序列可以包括SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO :4。在此顯示出用于鑒定SEQ ID NO :3的單克隆抗體是與建立對于患有結(jié)腸直腸癌的受試者的預(yù)測相關(guān)的(參見圖3和4)。因此，該第一方面的實施方案中，所討論的表位序列可以包括SEQ ID NO :3。在此顯示出具有定義長度的許多多肽片段，即所有包括SEQ ID NO :3的SEQ ID NO :31-37，與該單克隆抗體相互作用。因此，在該第一方面的實施方案中，所討論的表位序列可以包含或其組成為選自下組的氨基酸序列，該組的組成為SEQ ID N0:31-37。在此顯示出用于鑒定SEQ ID NO :4的單克隆抗體是特別地與建立對于患有結(jié)腸直腸癌的受試者的預(yù)測相關(guān)的(參見圖1和幻。因此，該第一方面的實施方案中，所討論的表位序列可以包括SEQ ID NO :4ο在此顯示出具有定義長度的許多多肽片段，即所有包含SEQ ID NO :4的SEQ ID NO :6-14，與該特別相關(guān)的單克隆抗體相互作用。因此，在該第一方面的實施方案中，所討論的表位序列可以包括或其組成為選自下組的氨基酸序列，該組的組成為SEQ ID NO :6-14.通過使用兩種不同的單克隆抗體進(jìn)行表位作圖，諸位發(fā)明人已經(jīng)鑒定出兩種不同的氨基酸序列(SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :5)，這兩種氨基酸序列都包括SEQ ID NO :2。因此，在該第一方面的實施方案中，所討論的表位序列可以包括SEQ ID NO :5。將具有定義長度的許多個多肽片段，即SEQ ID NO :52_59和78_82用于鑒定SEQ ID NO :2。因此，該第一方面的實施方案中，所討論的表位序列可以包括或其組成為選自下組的氨基酸序列，該組的組成為SEQ ID NO :52-59和78-82。包括SEQ ID NO 3的上述的片段對應(yīng)地是33、38、39、42、43、45以及47個氨基酸長度。此外，包括SEQ ID NO :4的上述片段對應(yīng)地是31、34、37、38、41、42、43、45、以及47個
氨基酸長度。因此，在該第一方面的實施方案中，所討論的表位序列可以包括45個氨基酸殘基或更少，例如43個氨基酸殘基或更少、例如42個氨基酸殘基或更少、例如41個氨基酸殘基或更少、例如39個氨基酸殘基或更少、例如38個氨基酸殘基或更少、例如37個氨基酸殘基或更少、例如34個氨基酸殘基或更少、例如33個氨基酸殘基或更少、例如31個氨基酸殘基或更少。然而，只要該表位序列包括SEQ ID NO :1或2，它就可以不必是使其能夠與該第一方面的親和配體相互作用的長度(>30個氨基酸)。因此，在該第一方面的實施方案中， 該表位序列可以包括25個氨基酸或更少、例如20個氨基酸或更少、例如17個氨基酸或更少、例如14個氨基酸或更少、例如12個氨基酸或更少。在該表位序列中，在SEQ ID NO 1 或SEQ ID NO 2側(cè)翼的氨基酸可以是例如在蛋白SATB2中它們位于側(cè)翼的那些。一旦提供了在此披露的本發(fā)明的表位信息，根據(jù)該第一方面選擇或制造一種親和配體被認(rèn)為是在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)的。盡管如此，為了說明，以下給出了可以證明有用的親和配體的實例連同用于檢測和/或定量的形式和條件的實例。因此，在該第一方面的一些實施方案中，這些親和配體可以選自下組，該組的組成為抗體及其片段及其衍生物，即基于一種免疫球蛋白支架的親和配體。例如，這些抗體可以是分離的和/或單特異性的。例如，抗體包括任何起源的單克隆和多克隆抗體，包括鼠類的、兔的、人的、以及其他的抗體，連同包括來自不同物種的序列的嵌合抗體，如部分人源化的抗體例如部分人源化的鼠抗體。通過用選擇的抗原免疫動物產(chǎn)生了多克隆抗體?？梢允褂糜蒏6hler和Milstein研制的雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)具有限定特異性的單克隆抗體(KShler G 和Milstein C(1976)Eur. J. Immunol. 6 :511-519)。在此顯示的與用于建立對于患有結(jié)腸直腸癌的受試者的預(yù)測特別相關(guān)的該親和配體是一種單克隆抗體。因此，該第一方面的實施方案中，該親和配體可以是一種單克隆抗體。在本披露的背景下，一種“單特異性抗體”是多克隆抗體的群體的一種，其依靠自身的抗原已經(jīng)親合純化，由此從其他的抗血清蛋白以及非特異性抗體分離出這類單特異性抗體。這種親和純化產(chǎn)生了與其抗原選擇性地結(jié)合的抗體。在本發(fā)明的情況下，這些多克隆抗血清是通過基于一種兩步免疫親和性的科學(xué)試驗計劃而純化的以獲得對該靶蛋白選擇性的單特異性抗體。使用固化標(biāo)簽蛋白作為捕獲劑，在一個初次消耗步驟中將定向針對抗原片段的屬類親和標(biāo)簽的抗體去除。繼該第一消耗步驟之后，將該血清荷載到第二親和柱(具有該抗原作為捕獲劑)上，以便富集對于該抗原特異性的抗體(還參見Nilsson P et al. (2005) Proteomics 5:4327-4337)。抗體片段以及衍生物包括Fab片段，這些Fab片段包括一個完整的免疫球蛋白的重鏈的第一恒定域(CHl)、輕鏈的恒定域(CL)、重鏈的可變域(VH)、以及輕鏈的可變域 (VL) ；Fv片段，這些Fv片段包括這兩個可變抗體結(jié)構(gòu)域VH和VL (Skerra A and Pluckthun A(1988) Science 240:1038-1041)；單鏈Fv片段(scFv)，這些單鏈Fv片段包括由一種柔性連接肽連接在一起的兩個VH和VL結(jié)構(gòu)域(Bird RE and Walker Bff (1991) Trends Biotechnol. 9 :132-137) ；Bence Jones 二聚體(Stevens FJ et al. (1991)Biochemistry 30 :6803-6805)；路馬它科動物重鏈二聚體(Hamers-Casterman C et al. (1993) Nature 363 446-448)以及單鏈可變域(Cai X and Garen A(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 93 6280-6285 ；Masat L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. ki. U. S. A. 91 :893-896)，以及單域支架，像例如來自護(hù)士鯊(nurse shark)的新抗原受體(New Antigen Receptor, NAR) (Dooley H et al. (2003)Mol. Immunol. 40 :25-33)以及基于一種可變重鏈結(jié)構(gòu)域的微型抗 # (minibody)(Skerra A and Pluckthun A (1988)Science 240 :1038-1041)。多克隆和單克隆抗體連同它們的片段和衍生物，代表了在要求選擇性生物分子識別的應(yīng)用中親和配體的傳統(tǒng)選擇，如在根據(jù)以下方法方面的靶蛋白的檢測和/或定量中。 然而，在本領(lǐng)域中的那些普通技術(shù)人員知道由于選擇性結(jié)合配體的高流通量產(chǎn)生以及低成本生產(chǎn)系統(tǒng)的要求增加，已經(jīng)在近十年期間研發(fā)了新的生物分子多樣性技術(shù)。這已經(jīng)能夠使免疫球蛋白連同非免疫球蛋白(已經(jīng)證明作為結(jié)合配體在生物分子識別應(yīng)用中同樣有用，并且可以代替或與免疫球蛋白一起使用)二者起源的新類型的親和配體的產(chǎn)生。根據(jù)該第一方面需要用于親和配體選擇的生物分子多樣性可以通過多種可能的支架分子之一的組合工程而產(chǎn)生，并且然后使用一種適當(dāng)?shù)倪x擇平臺來選擇這些親和配體。該支架分子可以是免疫球蛋白起源的(Bradbury AR和Marks JD (2004) J. Immunol. Meths.四0 :29-49)，非免疫球蛋白起源的(Nygren P A和 Skerra A(2004) J. Immunol. Meths.四0 :3-28)，或一種寡核苷酸起源的(Gold L et al. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64 763-797)。在新穎的結(jié)合蛋白的研制中已經(jīng)將許多非免疫球蛋白蛋白支架用作支持結(jié)構(gòu)。對于生成根據(jù)該第一方面的親和配體有用的這類結(jié)構(gòu)的非限制性實例是葡萄球菌蛋白A和其結(jié)構(gòu)域以及這些結(jié)構(gòu)域的衍生物，比如蛋白Z(Nord K et al. (1997)Nat. Biotechnol. 15 :772-777)；脂質(zhì)運載蛋白(Beste G et al. (1999)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 96 :1898-1903)；錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Binz HK et al. (2003) J. Mol. Biol. 332 489-503)；纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD) (Smith GP et al. (1998) J. Mol. Biol. 277 :317-332 ； Lehtio J et al. (2000)Proteins 41:316-322) ； γ 晶型(Fiedler U and Rudolph R, W001/04144)；綠色熒光蛋白(GFP) (Peelle B et al. (2001)Chem. Biol. 8 :521-534)； 人細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原 4(CTLA-4) (Hufton SE et al. (2000)FEBS Lett. 475 225-231 ；Irving RA et al. (2001) J. Immunol. Meth. 248 :31-45)；蛋白酶抑制劑，如 Knottin 蛋白(Wentzel A et al. (2001) J. Bacteriol. 183 :7273-7284 ；Baggio R et al. (2002) J. Mol. Recognit. 15 :126-134)以及 Kunitz 結(jié)構(gòu)域(Roberts BL et al. (1992) Gene 121 9-15 ；Dennis MS and Lazarus RA(1994)J. Biol. Chem. 269 :22137-22144)； PDZ 結(jié)構(gòu)域(Schneider S et al. (1999)Nat. Biotechnol. 17 :170-175)；肽適體，如硫氧還蛋白(Lu Z et al. (1995)Biotechnology 13 :366-372 ；Klevenz B et al. (2002)Cell. Mol. Life Sci. 59 :1993-1998)；葡萄球菌核酸酶(Norman TC et al. (1999) Science285 591-595)；淀粉酶抑肽(McConell SJ and Hoess RH(1995)J. Mol. Biol. 250 :460-479 ； Li R et al. (2003) Protein Eng. 16 :65-72)；基于纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域的三連接素 (trinectin) (Koide A et al. (1998)J. Mol. Biol. 284 :1141-1151 ；Xu L et al. (2002) Chem. Biol. 9 :933-942)；以及鋅指結(jié)構(gòu)(Bianchi E et al. (1995) J. Mol. Biol. 247 154-160 ；Klug A(1999)J.Mol. Biol. 293 :215-218 ；Segal DJ et al. (2003)Biochemistry 42 :2137-2148)。以上提到的非免疫球蛋白支架的實例包括呈現(xiàn)有用于新穎的結(jié)合特異性的產(chǎn)生的一種單隨機(jī)化環(huán)(single randomized loop)的支架蛋白；具有一種剛性次級結(jié)構(gòu)的蛋白支架，其中從該蛋白表面突出的側(cè)鏈被隨機(jī)化以用于新穎的結(jié)合特異性的產(chǎn)生； 以及展示有用于新穎的結(jié)合特異性的產(chǎn)生的一種非鄰接高可變環(huán)區(qū)域(non-contiguous hyper-variable loop region)白勺支架。除了非免疫球蛋白之外，寡核苷酸也可以用作根據(jù)該第一方面的親和配體。單鏈核酸被稱為適體或假目標(biāo)(decoys)，折疊成輪廓分明的三維結(jié)構(gòu)并且以高親合性和特異性結(jié)合至它們的靴標(biāo)。(Ellington AD 和 kostak Jff (1990)Nature 346 :818-822 ；Brody EN 和 Gold L (2000) J. Biotechnol. 74 5-13 ；Mayer G 和 Jenne A(2004)BioDrugs 18: 351-359)。這些寡聚核苷酸配體可以是RNA或DNA，并且可以結(jié)合至寬范圍的靶分子類別。
為了從任何上述支架結(jié)構(gòu)的變體的集合體(pool)選擇根據(jù)該第一方面的親和配體，許多選擇平臺可用于分離一種特異的新穎的配體(針對選擇的一種靶蛋白)。選擇平臺包括但不局限于噬菌體展示(Smith GP(1985)Science228 1315-1317)、核糖體展示(Hanes J and Pluckthun A (1997) Proc. Natl. Acad. ki. U. S. A. 94 :4937-4942)、酵母雙雜交系統(tǒng)(Fields S and Song 0(1989)Nature 340 :245-246)、酵母展示(Gai SA and Wittrup KD (2007) Curr Opin Struct Biol 17 :467-473)、mRNA 展示(Roberts Rff and Szostak Jff (1997)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94 :12297-12302)、細(xì)菌展示(Daugherty PS(2007)Curr Opin Struct Biol 17 :474-480, Kronqvist N et al. (2008)Protein Eng Des Sel 1-9,Harvey BR et al. (2004)PNAS 101(25) :913-9198)、微珠粒展示(Nord 0 et al. (2003) J Biotechnol 106 :1-13、W001/05808)、SELEX (System Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) (Tuerk C and Gold L (1990) Science 249 :505-510)、以及蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)測定(PCA) (Remy I and Michnick Sff (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 5394-5399)。因此，在第一方面的實施方案中，該親和配體可以是源自任何以上所列出的蛋白支架或一種寡核苷酸分子的一種非免疫球蛋白親和配體?？梢詫⒃撚H和配體標(biāo)記用于不同的分析、測定、方法以及裝置中。下面與該第三和第四方面相結(jié)合討論根據(jù)該第一方面的標(biāo)記的親和配體的實施方案。根據(jù)該第一方面的配體可以用于體內(nèi)診斷，如體內(nèi)成像。諸位發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識到在乙狀結(jié)腸中靶蛋白的表達(dá)是與建立用于結(jié)腸直腸癌的預(yù)測特別相關(guān)的。因此，該親和配體可以是體內(nèi)地用于檢測靶蛋白的表達(dá)(參見以下定義)。因此，在該第一方面的一個實施方案中，該親和配體可以用于一個用于檢測靶蛋白(參見以下定義)的表達(dá)的體內(nèi)方法中，例如用于建立對于患有結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者的預(yù)測。在這些體內(nèi)實施方案中，例如可以標(biāo)記該親和配體以使之能夠成像，即用一種可檢出的標(biāo)記物如一種放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記。用于標(biāo)記親和配體的適當(dāng)標(biāo)記物(如抗體) 對于技術(shù)人員是熟知的。因此，用于建立對于患有一種結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者的預(yù)測的體內(nèi)方法例如可以揭示在體內(nèi)腫瘤中的靶蛋白的表達(dá)，進(jìn)而可以形成一種治療決定的 ■石出。在此還顯示了，根據(jù)該第一方面的親和配體可以具有與建立對于患有結(jié)腸直腸癌的受試者的預(yù)測相關(guān)的不同的應(yīng)用。因此，作為本披露的一個第二方面，在此提供了作為一種預(yù)測試劑的一種根據(jù)該第一方面的親和配體的用途。在本披露的背景下，“預(yù)測試劑”是指一種試劑，該試劑具有至少一種特性，該特性在建立一個預(yù)測中是有價值的。例如，該“預(yù)測試劑”可以能夠選擇性地與一種預(yù)測標(biāo)志物 (如一種標(biāo)志物蛋白)相互作用。另外，在本披露的背景下，一種“預(yù)測標(biāo)志物”是指某一種物質(zhì)，該物質(zhì)的存在在一個預(yù)測的建立中是有價值的。例如，該預(yù)測標(biāo)志物可以是一種如下定義的靶蛋白。在該第二方面的實施方案中，該用途可以是用于建立一個對于患有癌癥例如結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者的預(yù)測。
作為本披露的一個第三方面，在此提供了一種用于確定對于患有結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者的預(yù)測是否比參比預(yù)測更差或相等的方法，該方法包括以下步驟a)提供一個早期從所述受試者獲得的樣品；b)使用一種根據(jù)該第一方面的親和配體對在所述樣品的至少一部分中存在的靶蛋白的量進(jìn)行評估，并且確定對應(yīng)于所述評估的量的樣品值；c)將步驟b)中得到的所述樣品值與一個與所述參比預(yù)測相關(guān)的參比值進(jìn)行比較；并且如果所述樣品值低于或等于所述參比值，d)得出以下結(jié)論，即所述的用于所述受試者的預(yù)測比所述參比預(yù)測更差或相等。在本披露的方面一至七的背景下，“靶蛋白”是指包括氨基酸序列SEQ ID NO 1和 /或SEQ ID NO :2的蛋白。SATBl蛋白和SATB2蛋白是包括氨基酸序列SEQ ID N0:1和/ 或SEQ ID NO: 2的蛋白的實例。在一個實施方案中，該靶蛋白可以是SATB2，它包括SEQ ID NO :1。根據(jù)該第三方面的一個第一構(gòu)型，在此提供了一種用于確定對于患有結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者的預(yù)測的方法，該方法包括以下步驟a)提供早期從所述受試者獲得的樣品；b)使用一種根據(jù)該第一方面的親和配體對在所述樣品的至少一部分中存在的靶蛋白的量進(jìn)行評估，并且確定對應(yīng)于所述評估的量的樣品值；c)步驟b)中得到的所述樣品值與一個與一種參比預(yù)測相關(guān)的參比值進(jìn)行比較； 并且如果所述樣品值低于或等于所述參比值，d)得出以下結(jié)論，即所述的用于所述受試者的預(yù)測比所述參比預(yù)測更差或相等。在多個實施方案中，上述方法的任何一個可以包括另外的步驟如果該樣品值高于該參比值，e)得出以下結(jié)論，即對于該受試者的預(yù)測比該參比預(yù)測更好。根據(jù)該第三方面的一個第二構(gòu)型，提供了一種用于確定一種對于患有結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者的預(yù)測是否比參比預(yù)測更差或相等、或它是否比所述參比預(yù)測更好的方法，所述方法包括以下步驟a)提供一種早期從所述受試者獲得的樣品；b)用一種根據(jù)該第一方面的親和配體對所述樣品的至少一部分中存在的靶蛋白的量進(jìn)行評估，并且確定對應(yīng)于所述評估的量的樣品值；c)將在步驟b)中得到的所述樣品值與一個參比預(yù)測相關(guān)的參比值進(jìn)行比較；并且，如果所述樣品值等于或小于所述參比值，dl)得出以下結(jié)論，即用于所述受試者的預(yù)測等于或差于所述參比預(yù)測，或者如果所述樣品值高于所述參比值，d2)得出以下結(jié)論，即用于所述受試者的預(yù)測好于所述參比預(yù)測。然而由同樣的概念的密切相關(guān)和覆蓋，該第三方面的該第二構(gòu)型的dl)和d2)提供了兩個可替代的結(jié)論選項。因此，該第三方面的第二構(gòu)型的方法可以回答用于所述受試者的預(yù)測是否等于或差于所述參比預(yù)測的問題或用于所述受試者的預(yù)測是否好于所述參比預(yù)測的問題。然而，該第三方面的第二構(gòu)型的方法還可以(但不是必需的)包括步驟dl) 連同其所附的條件(“如果短語”)以及步驟d2)連同其所附的條件(“如果短語”)二者。
因此，該第三方面限于根據(jù)該第一方面的親和配體的用途，即限于本披露的表位的識別。例如，該第三方面可以提供一種用于鑒定結(jié)腸直腸癌的侵襲形式的工具，并且進(jìn)而，結(jié)直腸癌的侵襲形式的早期鑒定是極其重要的，因為它有助于醫(yī)生選擇適當(dāng)?shù)闹委煵呗?。而且，通過在早期階段鑒定出較少侵襲的形式，可以避免過度治療。在本披露中，對應(yīng)于不同的預(yù)測呈現(xiàn)出的不同的蛋白表達(dá)值(樣品值)。典型地， 相比于高樣品值，低樣品值是與較差的預(yù)測相關(guān)的。在以上方法中，樣品值是與一個參比值比較的，并且如果該樣品值等于或低于該參比值，可以得出結(jié)論，即對于該受試者的預(yù)測等于或差于與該參比值相關(guān)的參比預(yù)測。因此，以上方法可以適合于一個參比值。在這樣的情況下，從一個給出的在某些情況下被認(rèn)為是相關(guān)的樣品值開始，可以選擇一個等于或高于該給出的樣品值的參比值。隨后，可以確立一個與該參比值相關(guān)的參比預(yù)測。通過本披露的指導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道如何建立一個相應(yīng)于一個給出的參比值的參比預(yù)測。例如，如以下部分4的實例中所述可以在一組癌癥患者中檢查蛋白表達(dá)值與存活數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，并且在此所描述的步驟可以適合于一個給出的參比值。然后，可以選擇對應(yīng)于該給出的參比值的預(yù)測作為參比預(yù)測。并且，以上方法可以適合于一個給出的參比預(yù)測。在這樣的情況下，從一個給出的在某些情況下被認(rèn)為是例如與選擇適當(dāng)?shù)闹委熛嚓P(guān)的參比預(yù)測開始，可以建立一個相應(yīng)的參比值。通過本披露的指導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道如何建立一個對應(yīng)于一個給出的參比預(yù)測的參比值。例如，如以下部分4的實例中所述可以在一組癌癥患者中檢查樣品值與存活數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，但是在此所描述的步驟適合于建立對應(yīng)于一個給出的參比預(yù)測的參比值。例如，可以測試不同的參比值直到發(fā)現(xiàn)與該給出的參比預(yù)測相關(guān)的一個。普通技術(shù)人員可以進(jìn)行這樣的測試而沒有過多的負(fù)擔(dān)，例如因為本披露提出了可以減少所要求的測試的量的適合的起始值。因此，以上方面的方法的實施方案中，該參比預(yù)測可以是基于一個以前建立的預(yù)測的，例如通過檢查相同的受試者或受試者的群體而獲得的。并且，該參比預(yù)測可以適合于一般群體中的背景風(fēng)險、一個統(tǒng)計預(yù)測/風(fēng)險或一個基于該受試者的檢查的假設(shè)。這樣的檢查可以將受試者的年齡、一般情況、性別、種族、和/或健康狀況以及病史考慮進(jìn)去，例如癌癥病史或結(jié)腸直腸癌的狀況。例如，一個醫(yī)生可以使該參比預(yù)測適合于該受試者的癌癥病史、該腫瘤的階段、該腫瘤的形態(tài)、該腫瘤的位置、轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)和擴(kuò)散和/或另外的癌癥特征。根據(jù)該第三方面的一個第三構(gòu)型，在此提供了一種用于建立一種對于患有結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者的預(yù)測的方法a)提供一種來自該受試者的樣品；b)使用一種根據(jù)該第一方面的親和配體對所述樣品的至少一部分中存在的靶蛋白的量進(jìn)行評估，并且確定對應(yīng)于所述評估的量的一個樣品值；c)使步驟b)的樣品值與對于該受試者的預(yù)測相關(guān)聯(lián)。在本披露的背景下，“建立一個預(yù)測”是指建立一個特異性的預(yù)測或一個預(yù)測間隔。在以上方法的一個實施方案中，該樣品可以是一種較早獲得的樣品。步驟c)的相關(guān)是指使存活數(shù)據(jù)與獲得的樣品值相關(guān)聯(lián)以建立一個對于該受試者的預(yù)測的任何途徑。根據(jù)該第一方面，已鑒定的該親和配體的結(jié)合活性與結(jié)腸直腸癌預(yù)測之間的相關(guān)性還可以形成用于治療決定的基礎(chǔ)。例如，基于這樣一個相關(guān)性的方法可以表明一個在其他情況下可能不會被考慮的治療方案。因此，根據(jù)本披露的一個第四方面，在此提供了一種對其有需要的受試者的治療的方法，其中該受試者患有一種結(jié)腸直腸癌，該方法包括以下這些步驟a)提供一種來自所述受試者的樣品；b)使用一種根據(jù)該第一方面的親和配體對所述樣品的至少一部分中存在的靶蛋白的量進(jìn)行評估，并且確定一個對應(yīng)于所述評估的量的樣品值；c)將在步驟b)中獲得的所述樣品值與一個參比值進(jìn)行比較；并且，如果所述樣品值低于或等于所述參比值，d)則用一種輔助結(jié)腸直腸癌治療方案來治療所述受試者。在該第二方面的一個實施方案中，該方法可以包括另外的步驟并且如果所述樣品值高于所述參比值，e)則避免用輔助結(jié)腸直腸癌治療方案來治療所述受試者。在該第四方面的一個實施方案中，步驟C)的參比值可以是與一個參比預(yù)測相關(guān)的，并且步驟d)的所述結(jié)腸直腸癌治療方案可以適合于一個差于或等于該參比預(yù)測的預(yù)測。在這樣一個實施方案中，該方法可以包括另外的步驟e)并且如果所述樣品值高于所述參比值，則用一種適合于一個好于該參比預(yù)測的預(yù)測的治療方案來治療所述受試者。例如，該第二方面的治療方案可以是選自化學(xué)療法、新輔助療法或它們的組合。因此，該治療方案可以是新輔助療法。這樣的新輔助療法可以包括僅有放射療法或放射療法與化學(xué)療法相結(jié)合。通常，當(dāng)決定對于患有結(jié)腸直腸癌的患者的一個適合的治療策略時，負(fù)責(zé)治療的醫(yī)生可以將幾個參數(shù)考慮在內(nèi)，例如免疫組織化學(xué)評估的結(jié)果、患者的年齡、一般情況、腫瘤期、血管浸潤以及分化的等級。為了在這樣的決定中被指導(dǎo)，醫(yī)生可以根據(jù)任何以上給出的這些方法方面的一個實施方案來進(jìn)行一個測試，或者命令進(jìn)行一個測試。在本披露的背景下，“預(yù)測”是指一種疾病的病程或結(jié)果以及它的治療或指遭受該疾病的受試者的存活的預(yù)測。例如，預(yù)測可以是指確定來自一種疾病的存活或恢復(fù)的可能性，以及指所期望的一位受試者的存活時間的預(yù)測。它還可能是疾病復(fù)發(fā)的可能性，例如局部的、區(qū)域的或遠(yuǎn)處的事件。此外，預(yù)測可以包括確定在未來的一個時間段期間(例如，三年、五年、十年、十五年或任何其他時間段)一位患者的存活的可能性。因此，對于一位受試者的預(yù)測可以是例如一個存活的概率，例如“總存活率”，它被認(rèn)為是一個存活的量度。在涉及一個預(yù)測以及參比預(yù)測的以上方法中，這兩種預(yù)測是相同類型的預(yù)測。作為一個實例，如果該參比預(yù)測是一種總存活率的參比概率，之后的結(jié)論將是對于該受試者的總存活率的概率，它將與該總存活率的參比概率相關(guān)。因此，在該第三方面(并且如果可應(yīng)用的話該第四方面)的方法的實施方案中，該預(yù)測可以是存活的概率，它要求對于該受試者的預(yù)測是存活的概率并且該參比預(yù)測是一種存活的概率。例如，存活的概率可以是一個五年存活、十年存活或15年存活的概率。此外，在本披露的背景下，“患有一種結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者”是指患有一種原發(fā)性或繼發(fā)性結(jié)腸直腸腫瘤的哺乳動物受試者或已經(jīng)從結(jié)腸和/或直腸中去除腫瘤的哺乳動物受試者，其中該腫瘤的去除是指通過任何適當(dāng)類型的手術(shù)或治療殺死或去除該腫瘤。例如，在其中已經(jīng)將該受試者的腫瘤去除的情況下，該腫瘤可能在少于五年之前，例如少于一年或六個月之前已經(jīng)被去除。在本披露的方法和用途方面中，“患有一種結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者”還包括其中該哺乳動物受試者在進(jìn)行該用途或方法的時候被懷疑患有一種結(jié)腸直腸癌并且隨后確定了該結(jié)腸直腸癌的診斷的情形。在本披露的這些方法方面的背景下，“較早獲得”是指在進(jìn)行該方法之前獲得。因此，如果在一種方法中提供了較早從一個受試者獲得的一種樣品，該方法不涉及從該受試者中獲得該樣品，即該樣品是在與該方法分離的一個步驟中從該受試者在先獲得的。因此，本披露的所有方法和用途可以完全在體外進(jìn)行。本披露的以上方法方面的步驟b)涉及對該樣品的至少一部分中存在的蛋白的量進(jìn)行評估并且確定與該量對應(yīng)的一個樣品值。該“樣品的至少一部分”是指用于建立該預(yù)測或得出關(guān)于適當(dāng)?shù)闹委煹慕Y(jié)論的樣品的一個相關(guān)部分或多個相關(guān)部分。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解當(dāng)提出進(jìn)行該方法的情況下哪個或哪些部分是相關(guān)的。例如，如果該樣品包括腫瘤和非腫瘤細(xì)胞，該技術(shù)人員可以僅僅考慮這些腫瘤細(xì)胞，并且僅僅考慮該樣品的這些腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核。此外，在步驟b)中評估了一個量，并且確定了與該量對應(yīng)的一個樣品值。因此，用于獲得該樣品值不要求精確地測量該蛋白的量。例如，可以通過目測一種染色的組織樣品來評估該蛋白的量，并且然后可以將該樣品值進(jìn)行分類為高或低(例如基于該評估的量)。 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員了解如何進(jìn)行這類評估和測定。并且關(guān)于根據(jù)上述方面的這些方法的步驟b)，該蛋白的量的增加典型地導(dǎo)致了樣品值的增加。然而，在一些實施方案中，該評估的量可以與任何一個預(yù)設(shè)的離散樣品值的數(shù)量對應(yīng)。在這類實施方案中，第一個量和第二個增加的量可以與該同樣的樣品值對應(yīng)。無論如何，在根據(jù)以上方面的方法的情況下，該蛋白的量的增加將不會導(dǎo)致該樣品值的減少。雖然不便，但在一個等效的方式中，如果在步驟C)與d)之間的條件是“如果該樣品量高于或等于該參比值”，則該評估的量可能與樣品值逆相關(guān)。仍然進(jìn)一步在本披露的背景下，該“參比值”是指一個預(yù)定值，該值是與作出關(guān)于對于該受試者的預(yù)測或其治療的決定或結(jié)論相關(guān)的。并且，在本披露的背景下，參比預(yù)測與參比值“相關(guān)聯(lián)”是指基于經(jīng)驗數(shù)據(jù)和/或臨床相關(guān)的假設(shè)將該參比值指定到該參比預(yù)測上。參見例如該第三方面的方法的步驟c) 以及該第四方面的某些實施方案。該參比值不是必須被指定到直接從一組顯示該參比值的受試者的預(yù)測數(shù)據(jù)得到的一個參比預(yù)測上的。例如該參比預(yù)測可以對應(yīng)于顯示該參比值或更低的受試者的預(yù)測。即，如果在從0至3的尺度上該參比值是1，則該參比預(yù)測可以是這些顯示值0或1的受試者的預(yù)測。因此，該參比預(yù)測還可以適合于可獲得的數(shù)據(jù)的性質(zhì)。如以上進(jìn)一步所討論的，該參比預(yù)測還可以適合于其他參數(shù)。可以將不同的條件用于步驟b)中的評估以獲得所述樣品值。在第三和第四方面的方法的實施方案中，步驟b)可以包括在能夠使所述親和配體結(jié)合到所述樣品中的蛋白上的條件下將所述親和配體施用于所述樣品，并且所述評估的量是通過對所述親和配體的量進(jìn)行評估而得到的，所述親和配體是與所述樣品的所述至少一部分相關(guān)聯(lián)的。
在此，“相關(guān)聯(lián)”是指該親和配體與在該樣品中的多個組分例如蛋白之間特異性的和/或選擇性的相互作用。在第三和第四方面的方法的實施方案中，步驟b)可以包括以下步驟bl)在所述條件下將所述親和配體施用于所述樣品，所述條件使所述親和配體能夠結(jié)合到所述樣品中的蛋白上；b2)從所述樣品中去除未結(jié)合的親和配體；并且b3)對保持與所述樣品的所述至少一部分相結(jié)合的親和配體的量進(jìn)行評估，從而得到所述評估的量。在此，“保持與該樣品相結(jié)合的親和配體”是指在步驟W)中沒有去除的親和配體， 例如結(jié)合到該樣品上的親和配體。該結(jié)合可以是例如在樣品中存在的抗原與抗體之間的特異性的和/或選擇性的相互作用。此外，在這類實施方案中，步驟W)可以例如用洗滌緩沖劑來進(jìn)行洗滌。洗滌緩沖劑的實例對于普通技術(shù)人員是熟知的。并且，在這類實施方案中的樣品可以是組織樣品，并且在這種情況下，步驟bl)-b3)反映了一個染色步驟。例如，洗滌是這樣一個步驟，即在本領(lǐng)域中是標(biāo)準(zhǔn)的操作。在第三和第四方面的方法的一些實施方案中，該親和配體可以是可檢出的和/或可定量的。這種親和配體的檢測和/或定量可以按技術(shù)人員已知的用于在基于生物學(xué)相互作用的測定中的結(jié)合試劑的檢測和/或定量的任何方式來完成。如以上所說明的任何親和配體可以用于定性或定量檢測靶蛋白的存在。這些“第一”親和配體可以用不同的標(biāo)志物將它們自身標(biāo)記或可以進(jìn)而由第二標(biāo)記的親和配體檢出，以允許檢測、可視化和/或定量。 這可以使用許多標(biāo)記的任何一種或多種來完成，這些標(biāo)記可以使用技術(shù)人員已知的許多技術(shù)的任何一種或多種(而不像涉及任何過度實驗的那樣)而被結(jié)合至能夠與靶蛋白相互作用的親和配體或結(jié)合至任何第二親和配體?？梢越Y(jié)合到第一和/或第二親和配體上的標(biāo)記的非限制性實例包括熒光染料類或金屬類(例如，熒光素、玫瑰精、藻紅蛋白、熒光胺)、發(fā)光染料類(例如，視紫紅質(zhì))、化學(xué)發(fā)光化合物類(例如，魯米諾、咪唑)以及生物發(fā)光蛋白類(例如，螢光素、螢光素酶)、半抗原類(例如，生物素)。多種其他有用的熒光劑和生色團(tuán)被描述于Mryer L (1968) Science 162 :526-533 以及 Brand L and Gohlke JR(1972) Annu. Rev. Biochem. 41 :843-868 中。還可以用酶類(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-內(nèi)酰胺酶)、放射性同位素類(例如， 力、14(、3牛、％或1251)以及顆粒(例如，金)來標(biāo)記親和配體。在本披露的情形下，“顆?！笔侵高m合用于標(biāo)記分子的顆粒，如金屬顆粒。此外，還可以用熒光半導(dǎo)體納米晶體(量子點) 來標(biāo)記這些親和配體。量子點具有優(yōu)越的量子產(chǎn)率并且相比于有機(jī)熒光團(tuán)是更耐光的，并且因此更容易被檢出(Chan et al. (2002)Curr Opi Biotech. 13 :40-46)?？梢允褂貌煌幕瘜W(xué)作用(例如胺反應(yīng)或硫醇反應(yīng))將這些不同類型的標(biāo)記物結(jié)合至一種親和配體。然而，除了胺和硫醇外，可以使用其他的反應(yīng)基團(tuán)，例如醛、羧酸以及谷氨酰胺?？梢詫⒈九兜姆椒ǚ矫媸褂迷谌魏稳舾梢阎男问胶脱b置中，其中一種非限制性的選擇在以下論述。在基于組織學(xué)的一種裝置中，結(jié)合到靶蛋白上的一種標(biāo)記的親和配體的檢測、定位、和/或定量可以包括可視化技術(shù)，如光學(xué)顯微術(shù)或免疫熒光顯微術(shù)。其他的方法可以包括經(jīng)由流式細(xì)胞術(shù)或發(fā)光測定法的檢測。
可以將一種生物樣品，如一種腫瘤組織樣品(活組織檢查)例如來自已經(jīng)從受試者移出的結(jié)腸直腸組織用于靶蛋白的檢測和/或定量。該生物樣品(如該活組織檢查)可以是一種較早獲得的樣品。如果在一種方法中使用一種較早獲得的樣品，該方法的步驟沒有在人或動物體上實踐?？梢詫⒂H和配體應(yīng)用到該生物樣品用于靶蛋白的檢測和/或定量。這個步驟不僅使得能夠檢測靶蛋白，而且可以另外顯示其表達(dá)的相對水平以及分布。在親和配體上的標(biāo)記的可視化的方法可以包括但不局限于熒光測定、發(fā)光測定和 /或酶的技術(shù)。通過將熒光標(biāo)記暴露于一種特定波長的光下而將熒光檢測和/或定量，并且其后在一個特定波長區(qū)域中檢測和/或定量發(fā)射的光?？梢酝ㄟ^在一種化學(xué)反應(yīng)期間發(fā)生的熒光而檢測和/或定量一種熒光標(biāo)記的親和配體的存在。一種酶促反應(yīng)的檢測是由于在樣品中起于化學(xué)反應(yīng)的一種色移。在本領(lǐng)域中的那些普通技術(shù)人員知道可以改進(jìn)許多種不同的科學(xué)試驗計劃以便用于適當(dāng)?shù)臋z測和/或定量。在第三和第四方面的這些方法的實施方案中，一種生物樣品可以被固化到一種固相支持物或載體上，如硝酸纖維素或任何其他的能夠固化存在于施用于它的生物樣品中的靶蛋白的固體支持基質(zhì)。在本發(fā)明中有用的一些眾所周知的固態(tài)支持材料包括玻璃、碳水化合物(例如kpharose)、尼龍、塑料、羊毛、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、右旋糖酐、淀粉酶、 薄膜、樹脂、纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、氧化鋁、輝長巖、以及磁鐵礦。在該生物樣品固定之后，可以施用根據(jù)該第一方面的第一親和配體，例如在本披露的部分4或5的實例中的描述。如果該第一親和配體沒有完全地被標(biāo)記，可以用在本領(lǐng)域中已知的一種或多種適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌該支持基質(zhì)，隨后暴露于一種第二標(biāo)記的親和配體，并且再一次用緩沖液洗滌以除去未結(jié)合的親和配體。其后，可以用常規(guī)的方法將選擇性親和配體檢測和/或定量。對于一種親和配體的結(jié)合性質(zhì)可能在一個固態(tài)支持物與另一個之間不同，但那些在本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)實驗確定對于每一測定有效的和最佳的測定條件。因此，在第三和第四方面的方法的實施方案中，可以使用能夠識別該可定量的親和配體的一種第二親和配體來檢測bl)中所施用的親和配體(第一親和配體)。b3)的定量因此可以借助于一種第二親和配體(具有對于該第一親和配體的親合性)來進(jìn)行。作為一個實例，該第二親和配體可以是一種抗體或它的一種片段或一種衍生物。作為一個實例，用于該靶蛋白的檢測和/或定量的一個可用的方法是通過將根據(jù)該第一方面的親和配體連接到一種酶，然后可以在一種酶免疫測定(如一種EIA或ELISA) 中檢測和/或定量。很好地建立了這類技術(shù)，并且它們的實現(xiàn)對于技術(shù)人員不存在任何過度的困難。在這類方法中，使該生物樣品與一種固體材料接觸或與一種結(jié)合到該親和配體上的一種固體材料接觸，然后用一種酶標(biāo)記的第二親和配體進(jìn)行檢測和/或定量。此后，加入一種適當(dāng)?shù)牡孜铮诰哂羞@種酶性標(biāo)記的適當(dāng)?shù)木彌_液中反應(yīng)以產(chǎn)生一種化學(xué)部分，例如使用一種分光光度計、熒光計、光度計或通過直觀的方式進(jìn)行檢測和/或定量。如上所述，可以用放射性同位素標(biāo)記第一和任何第二親和配體以使其能夠檢測和 /或定量。在本披露中適當(dāng)?shù)姆派湫詷?biāo)記的非限制性的實例是3H、14C、32P、35S或1251。該標(biāo)記的親和配體的比活性取決于該放射性標(biāo)記的半衰期、同位素純度、以及該標(biāo)記如何已經(jīng)結(jié)合進(jìn)入該親和配體中。優(yōu)選地使用眾所周知的技術(shù)將親和配體標(biāo)記(Wensel TG和Meares CF (1983) in :Radioimmunoimaging 禾口 Radioimmunotherapy (Burchiel Sff and Rhodes BA eds.)Elsevier,New York，pp 185-196)。因此一種放射性標(biāo)記的親和配體可用于通過在體內(nèi)或體外檢測放射性來可視化靶蛋白。放射性核掃描，如用Y照相機(jī)、磁共振波譜學(xué)或發(fā)射斷層術(shù)功能用于體內(nèi)以及體外檢測，同時還在體外使用Υ/β計數(shù)器、閃爍計數(shù)器、以及放射線照相術(shù)。在第三和第四方面的方法的實施方案中，該受試者可以患有處于不同形式和/或階段的結(jié)腸直腸癌。在這些方面的一些實施方案中，所討論的結(jié)腸直腸癌是一種淋巴結(jié)陰性結(jié)腸直腸癌，即沒有發(fā)展成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移期的結(jié)腸直腸癌。在其他類似的實施方案中，所討論的結(jié)腸直腸癌的特征是處于或者Dukes A期亦或B期。在又另外的實施方案中，所討論的結(jié)腸直腸癌是結(jié)腸直腸腺瘤或結(jié)腸直腸癌瘤。在這些實施方案中，確定該受試者顯示出低的靶蛋白表達(dá)對于預(yù)測該疾病的未來進(jìn)展可能是很有價值的，并且因此形成了用于關(guān)于未來疾病管理的一個信息決定的基礎(chǔ)。在一組罹患這類相對早期的疾病的受試者中，具有低的靶蛋白表達(dá)的受試者可能處于相對高的發(fā)展一種更具侵襲性的疾病的風(fēng)險。在患有淋巴結(jié)陰性結(jié)腸直腸癌或Dukes A期或B期結(jié)腸直腸癌的受試者中，低的靶蛋白表達(dá)因此可以表明這些受試者應(yīng)該被更密切地監(jiān)測和/或與未顯示低的靶蛋白表達(dá)的受試者進(jìn)行不同的治療。由于通過使用根據(jù)該第一方面的親和配體的該方法給出了另外的預(yù)測信息，因此根據(jù)本發(fā)明的這些方法對于這類受試者提供了經(jīng)一定時間段的更大存活機(jī)會和/或更長的存活時間的可能性?；加蠨ukes A期結(jié)腸直腸癌的受試者典型地未用輔助性化學(xué)療法進(jìn)行治療。然而，通過本披露的傳授內(nèi)容的指導(dǎo)，醫(yī)生可以決定對這樣的具有低的或沒有靶蛋白表達(dá)的受試者給予這樣一種輔助性化學(xué)療法。因此，在第三和第四方面的方法的實施方案中，該結(jié)腸直腸癌處于DukesA期。在一個可替代的或補(bǔ)充的實施方案中，所述結(jié)腸直腸癌處于根據(jù)上述 M分期系統(tǒng)的Τ1-2、 NO以及MO期。此外，如在此所示，該靶蛋白表達(dá)分析是與建立一個對于患有處于DukesC或D期的結(jié)腸直腸癌的受試者的預(yù)測相關(guān)的(參見圖1Β、2Β、;3Β以及4Β)。經(jīng)常用具有嚴(yán)重副作用的方案治療患有處于這樣的晚期的結(jié)腸直腸癌的受試者。作為一個實例，如果這類受試者被診斷為具有相對高的靶蛋白的表達(dá)，則他們可以被給予具有較少或較低嚴(yán)重副作用的較小廣泛性的治療。在第三和第四方面的方法的實施方案中，該樣品可以是一種體液樣品。例如，該體液樣品可以是選自下組，該組的組成為血液、血漿、血清、腦脊液、尿液、精液以及滲出物。 可替代地，該樣品可以是一種細(xì)胞學(xué)樣品或一種糞便樣品。在第三和第四方面的方法的另外的實施方案中，該樣品可以是一種組織樣品，例如一種結(jié)腸直腸組織樣品，例如一種從結(jié)腸或直腸中得到的樣品。例如，該組織樣品可以是從乙狀結(jié)腸中得到的。諸位發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識到在結(jié)腸/直腸的這個部分中的靶蛋白表達(dá)對于建立用于結(jié)腸直腸癌的預(yù)測是特別相關(guān)的。在本領(lǐng)域中，乙狀結(jié)腸有時也被稱為盆部結(jié)腸或乙狀彎曲(sigmoid flexture)。在第三和第四方面的方法的補(bǔ)充實施方案中，該樣品可以是一種腫瘤組織樣品。在第三和第四方面的方法的實施方案中，該樣品可以包括來自所述受試者的腺細(xì)胞。因此，除了組織樣品，例如糞便樣品或血液樣品還可以包括可以通過使用根據(jù)該第一方面的親和配體來評估表達(dá)靶蛋白的這類細(xì)胞。諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靶蛋白被表達(dá)于相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞核中。因此，在樣品中靶蛋白表達(dá)的評估可以限于存在于該樣品(例如來自手術(shù)去除結(jié)腸直腸癌的一個較早獲得的腫瘤組織活檢材料或標(biāo)本)中的腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞核表達(dá)的分析。作為一個實例，上述方法的步驟b)的評估可以被限于對所述樣品的腫瘤細(xì)胞(例如起源于上皮細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞， 例如腺細(xì)胞)的細(xì)胞核中的靶蛋白的量進(jìn)行評估。當(dāng)該評估限于細(xì)胞核時，僅有例如該親和配體與細(xì)胞核的相互作用的特征被考慮在該評估中。這類評估例如可以是一種免疫組織化學(xué)染色。此外，諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靶蛋白的細(xì)胞核表達(dá)可以與預(yù)測相關(guān)。一個比該參比值高的靶蛋白的樣品值或一個獲得這樣的樣品值的受試者，有時在此稱為“靶蛋白高的”。此外，一個比該參比值低的或與之相等的靶蛋白的樣品值或一個獲得這樣的樣品值的受試者，有時在此稱為“靶蛋白低的”。在本披露的背景下，術(shù)語“樣品值”以及“參比值”應(yīng)當(dāng)被廣義地解釋。為了獲得這些值的靶蛋白的定量可以通過自動裝置、通過一個基于樣品的視覺或顯微檢查的評分系統(tǒng)、或通過它們的組合而完成，只要使用了根據(jù)該第一方面的抗體。然而，對于一位技術(shù)人員如組織病理學(xué)領(lǐng)域的一位技術(shù)人員還可能的是，僅僅通過例如使用所討論的親和配體檢查已經(jīng)染色的用于靶蛋白表達(dá)的組織切片就確定該樣品值和參比值。比該參比值高的該樣品值的測定可以因此對應(yīng)于在視覺或顯微檢查上的測定(一種樣品組織切片比在一個參比組織切片的情況下染色更致密和/或展示了一個更大的染色細(xì)胞的部分)。還可以將該樣品值與由一篇文字引用給出的一個參比值(如以文字描述的一個參比值)進(jìn)行比較。因此，該樣品和/或參比值可以被認(rèn)為是普通技術(shù)人員根據(jù)檢查和比較而確定的精神值(mental value)。例如，該技術(shù)人員可以將一個樣品分類為靶蛋白高或低，其中如果該樣品含有比一個先前檢查的參比樣品更多的靶蛋白，則被分類為高；如果該樣品含有比一個先前檢查的參比樣品少或與之幾乎相等的靶蛋白，則被分類為低?？梢酝ㄟ^用包括根據(jù)該第一方面的抗體的一種染色液進(jìn)行染色該樣品(并且，如果有必要，一個參比樣品)來輔助這樣的評估。可以以各種方式提供被發(fā)現(xiàn)與對于患有結(jié)腸直腸癌的受試者的預(yù)測的規(guī)定或?qū)τ谧鞒鲫P(guān)于這類受試者的治療決定有關(guān)的、以用于與來自該受試者的樣品值進(jìn)行比較的一個參比值。用本披露的這些傳授內(nèi)容的知識，技術(shù)人員可以在無需不適當(dāng)?shù)呢?fù)擔(dān)下提供用于進(jìn)行第三和第四方面的這些方法的相關(guān)參比值。進(jìn)行第三和第四方面的這些方法的人員例如可以使該參比值適合于所希望的預(yù)測信息。例如，該參比值可以適合于產(chǎn)生顯著的預(yù)測信息，例如在高存活率曲線與低存活率曲線之間的最大間距(參見這些圖)?？商娲?，該參比值可以適合于鑒定一組具有預(yù)定預(yù)測的受試者，例如具有五年總存活低于預(yù)定百分比的概率的該組受試者。在第三和第四方面的這些方法的實施方案中，該參比值可以對應(yīng)于在一種健康組織(如該方法的受試者的健康乳房組織或基質(zhì)組織)中的靶蛋白表達(dá)的量。作為另一個實例，該參比值可以按照在來自另一個可比較的受試者的正常組織的一種標(biāo)準(zhǔn)樣品中測量的靶蛋白表達(dá)的量而提供。作為另一個實例，該參比值可以按照在一種包括腫瘤細(xì)胞的參比樣品如一種包括腫瘤組織(例如結(jié)腸直腸癌組織)的參比樣品中測量的靶蛋白表達(dá)的量而提供?？蓛?yōu)選地，該參比樣品的靶蛋白表達(dá)的量是先前確定的。因此，該參比值可以按照在包括表達(dá)一種預(yù)定量的靶蛋白的細(xì)胞的參比樣品中測量的靶蛋白的量而提供。此外，該參比值例如可以按照在一種包括表達(dá)一個預(yù)定或控制量的靶蛋白的細(xì)胞系(如癌細(xì)胞系)的參比樣品中測量的靶蛋白表達(dá)的量而提供。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解如何提供這類細(xì)胞系，例如按照Rhodes等披露的Q006)The biomedical scientist, ρ 515-520的指導(dǎo)。因此，在第三和第四方面的這些方法的實施方案中，該參比值可以是與在一個參比樣品中靶蛋白表達(dá)的量相對應(yīng)的一個預(yù)定值。然而，如以下進(jìn)一步論述的，在這個參比樣品中靶蛋白的量不必直接與該參比值相對應(yīng)。該參比樣品還可以提供靶蛋白的量，這個量有助于一個進(jìn)行該方法的人員評定不同的參比值。例如，該一種或多種參比樣品可以有助于通過提供一個“陽性”(高的)和/ 或一個“陰性”(低的)值來創(chuàng)造該參比值的一個精神圖像(mental image) 0諸位發(fā)明人在此顯示患有結(jié)腸直腸癌并且具有基本上沒有靶蛋白表達(dá)的受試者實質(zhì)上具有相對差的預(yù)測(參見例如圖1)。因此，在第三和第四方面的這些方法的實施方案中，步驟b)的樣品值可以是1(對應(yīng)于在該樣品中可檢出的靶蛋白)或0(對應(yīng)于在該樣品中沒有可檢出的靶蛋白)。因此，在這類實施方案中，該樣品的評估是數(shù)字的靶蛋白被認(rèn)為是或者存在或者缺乏的。在本披露的背景下，“沒有可檢出的靶蛋白”是指靶蛋白的量是如此低以至于在正常的操作情況期間它通過一個人或一個器具進(jìn)行根據(jù)第三和第四方面的任一項的方法是不可檢出的。該“正常的操作情況”是指本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會發(fā)現(xiàn)的適合用于進(jìn)行本發(fā)明的實驗室方法和技術(shù)。因此，第三和第四方面的方法的實施方案中，步驟C)的參比值可以是0。并且隨后的是，在第三和第四方面的方法的另外的實施方案中，步驟c)的參比值可以對應(yīng)于一個不具有可檢出的靶蛋白的參比樣品。這意味著該參比值可以通過分析缺少靶蛋白的參比樣品而獲得。對于在一個樣品(如從該受試者較早獲得的樣品或參比樣品)中的靶蛋白表達(dá)的定量的一個替代方案，是確定在顯示出靶蛋白表達(dá)超過某一水平的樣品中的細(xì)胞的部分。 該部分例如可以是一種“細(xì)胞部分”，其中整個細(xì)胞的靶蛋白表達(dá)被考慮；一種“細(xì)胞質(zhì)部分”，其中僅僅這些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的靶蛋白表達(dá)被考慮；或一種“核部分”，其中僅僅這些細(xì)胞的細(xì)胞核的靶蛋白表達(dá)被考慮。例如可以將該細(xì)胞核部分分類為< 2%、2%至25%、> 25%至75%、或>75%的有關(guān)細(xì)胞群體的免疫反應(yīng)細(xì)胞?？商娲?，或作為一個補(bǔ)充，該細(xì)胞核部分可以被分類為彡10%或> 10% -100%，或者為彡1%或> -100%。該“細(xì)胞核部分”對應(yīng)于在細(xì)胞核中顯示出陽性染色的樣品中的相關(guān)細(xì)胞的百分比，其中一種在細(xì)胞核中的中等的或顯著而強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)性被認(rèn)為是陽性的，并且在細(xì)胞核中沒有或微弱的免疫反應(yīng)性被認(rèn)為是陰性的。病理學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員了解在當(dāng)進(jìn)行該方法時存在的條件下哪些細(xì)胞是有關(guān)的，并且可以基于他的常識和本披露的傳授內(nèi)容而確定一種細(xì)胞核部分。這些有關(guān)的細(xì)胞可以是，例如腫瘤細(xì)胞。此外，技術(shù)人員了解如何采用該“細(xì)胞部分”或該“細(xì)胞質(zhì)部分”進(jìn)行對應(yīng)的測量。對于在一個樣品(如從該受試者較早獲得的樣品或參比樣品)中的靶蛋白表達(dá)的定量的另一個替代方案，是確定該樣品的總的染色強(qiáng)度。該強(qiáng)度例如可以是一種“細(xì)胞強(qiáng)度”，其中整個細(xì)胞的靶蛋白表達(dá)被考慮；一種“細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)度”，其中僅僅這些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的靶蛋白表達(dá)被考慮，或一種“細(xì)胞核強(qiáng)度”，其中僅僅這些細(xì)胞的細(xì)胞核的靶蛋白表達(dá)被考慮。細(xì)胞核強(qiáng)度是依照臨床組織病理學(xué)診斷上使用的標(biāo)準(zhǔn)而被主觀評估的。一種細(xì)胞核強(qiáng)度測定的結(jié)果可以被分類為無=在該樣品的相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞核中沒有總體免疫反應(yīng)性，弱=在該樣品的相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞核中微弱的總體免疫反應(yīng)性，中等=在該樣品的相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞核中的中等的總體免疫反應(yīng)性，或強(qiáng)=在該樣品的相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞核中顯著而強(qiáng)烈的總體免疫反應(yīng)性。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員了解在當(dāng)進(jìn)行該方法時存在的條件下哪些細(xì)胞是有關(guān)的，并且可以基于他的常識和本披露的傳授內(nèi)容而確定一種細(xì)胞核強(qiáng)度。這些有關(guān)的細(xì)胞可以是，例如腫瘤細(xì)胞。此外，技術(shù)人員了解如何采用該“細(xì)胞強(qiáng)度”或該“細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)度”進(jìn)行對應(yīng)的測量。諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靶蛋白的細(xì)胞核表達(dá)與建立一種預(yù)測是特別相關(guān)的。因此， 在第三和第四方面的這些方法的實施方案中，該參比值可以是一種細(xì)胞核部分、一種細(xì)胞核強(qiáng)度或它們的一種組合。因此，該樣品值可以是一種細(xì)胞核部分、一種細(xì)胞核強(qiáng)度或它們的一種組合。優(yōu)選地，該樣品值以及該參比值二者都是相同類型的值。因此，在第三和第四方面的這些方法的實施方案中，該樣品值以及該參比值可以各自是一種細(xì)胞核部分、一種細(xì)胞核強(qiáng)度或它們的一種組合。在第三和第四方面的方法的實施方案中，用于在步驟d)中的結(jié)論的標(biāo)準(zhǔn)可以是用于靶蛋白陽性細(xì)胞的細(xì)胞核部分的樣品值，即低于或等于一個參比值的“細(xì)胞核部分”， 該參比值是90%、例如低于或等于80%、例如低于或等于70%、例如低于或等于60%、例如低于或等于50%、例如低于或等于40%、例如低于或等于35%、例如低于或等于30%、例如低于或等于25%、例如低于或等于20%、例如低于或等于15%、例如低于或等于10%、例如低于或等于5%、例如低于或等于2%、例如低于或等于1<%、例如等于0%。在以上方面的方法的可替代的或補(bǔ)充的實施方案中，步驟C)的參比值是一個 90%或更低的細(xì)胞核部分、例如80%或更低、例如70%或更低、例如60%或更低、例如50% 或更低、例如40%或更低、例如35%或更低、例如30%或更低、例如25%或更低、例如20% 或更低、例如15%或更低、例如10%或更低、例如5%或更低、例如2%或更低、例如或更低、例如0%。此外，在第三和第四方面的這些方法的實施方案中，用于步驟d)中的結(jié)論的標(biāo)準(zhǔn)可以是一個樣品的用于染色強(qiáng)度的樣品值，即細(xì)胞核強(qiáng)度，該強(qiáng)度低于或等于一種中等的細(xì)胞核強(qiáng)度，例如低于或等于一種弱的細(xì)胞核強(qiáng)度，例如無細(xì)胞核強(qiáng)度。在第三和第四方面的這些方法的可替代的或補(bǔ)充的實施方案中，步驟C)的參比值可以是靶蛋白表達(dá)的中等或更低的細(xì)胞核強(qiáng)度，如靶蛋白表達(dá)的一種弱的或更低的細(xì)胞核強(qiáng)度，如一種無靶蛋白表達(dá)的細(xì)胞核強(qiáng)度。此外，在第三和第四方面的這些方法的實施方案中，該參比值可以由兩個值組成， 其中用于在步驟d)中的結(jié)論的標(biāo)準(zhǔn)是一個比這兩個值的任何一個高的樣品值。可替代地，在第三和第四方面的這些方法的實施方案中，該參比值可以是一種部分值與一種強(qiáng)度值(如一種細(xì)胞核部分值與一種細(xì)胞核強(qiáng)度值)的組合。此外，在第三和第四方面的這些方法的實施方案中，該參比值可以是一種細(xì)胞核部分值與一種細(xì)胞核強(qiáng)度值的函數(shù)。例如，這樣一種函數(shù)可以是一種染色評分。如在實例、 部分3、以及以下表1中所說明計算該“染色評分”。例如，該參比值可以是一個0、1或2的染色評分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)識到為強(qiáng)度值或部分值的其他參比值也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。同樣，本領(lǐng)域的一名普通技術(shù)人員認(rèn)識到多個部分和強(qiáng)度的其他組合也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，該參比值可以包括兩個以及可能更多個標(biāo)準(zhǔn)。通常，作為該參比值的一種細(xì)胞核強(qiáng)度值和/或一種細(xì)胞核部分值可以取決于染色步驟，例如取決于根據(jù)該第一發(fā)明所施用的抗體的性質(zhì)以及取決于染色試劑。通過本披露的指導(dǎo)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員例如一位病理學(xué)家，了解如何進(jìn)行產(chǎn)生一種部分(如一種細(xì)胞的、細(xì)胞質(zhì)的或細(xì)胞核的部分)或一種強(qiáng)度(如一種細(xì)胞的、細(xì)胞質(zhì)的或細(xì)胞核的強(qiáng)度)的評估。例如，技術(shù)人員可以使用一個包括預(yù)定量的靶蛋白的參比樣品用于建立一定的部分或強(qiáng)度的外觀。然而，一個參比樣品可能不僅用于提供實際參比值，而且還被用于提供一種樣品 (具有比對應(yīng)于該參比值的量更高的靶蛋白的量)的一個實例。作為一個實例，在組織化學(xué)染色中(如在免疫組織化學(xué)染色中)，技術(shù)人員可以使用一個參比樣品用于建立具有高量的靶蛋白的一種染色樣品的外觀，例如一個陽性參比。隨后，技術(shù)人員可以評定具有較低量的靶蛋白的樣品的外觀，如具有與該參比值對應(yīng)的靶蛋白的量的一種樣品的外觀。換言之， 技術(shù)人員可以使用一個參比樣品以創(chuàng)造對應(yīng)于靶蛋白的量(低于該參比樣品)的一個參比值的精神圖像?？商娲鼗蜃鳛橐环N補(bǔ)充，在這樣的評定中，技術(shù)人員可以使用具有一個低量的靶蛋白或?qū)嵸|(zhì)上沒有靶蛋白的另一個參比樣品，用于建立這種樣品的外觀，例如作為一種“陰性參比”。例如，如果使用10%細(xì)胞核部分的參比值，可以將不具有可檢出的靶蛋白并且因此對應(yīng)于一個細(xì)胞核部分為0(低于該參比值)的一個第一參比樣品與具有對應(yīng)于細(xì)胞核部分為75%或更高(高于該參比值)的靶蛋白的量的一個第二參比樣品一起使用。因此，在評估中，技術(shù)人員可以使用一個參比樣品用于建立具有高量的靶蛋白的一種樣品的外觀。這類參比樣品可以是一種樣品，其包括表達(dá)一種高量的靶蛋白的組織，如包括結(jié)腸直腸腫瘤組織(具有一種預(yù)先建立的靶蛋白的高表達(dá))的一種樣品。因此，該參比樣品可以提供一種具有強(qiáng)的細(xì)胞核強(qiáng)度(Ni)的一個實例。用一種具有強(qiáng)的NI樣品的外觀的知識，然后技術(shù)人員可以將樣品分成其他NI類別，例如上述的無、弱、中等、以及強(qiáng)?？梢酝ㄟ^缺乏可檢出的靶蛋白的一個參比樣品(陰性參比)，即提供一種無細(xì)胞核強(qiáng)度的一個參比樣品而進(jìn)一步輔助這種區(qū)分。此外，該參比樣品可以提供具有75%或更高的一種細(xì)胞核部分(NF)的樣品的一個實例。用一種具有超過75%陽性細(xì)胞的樣品的外觀的知識，技術(shù)人員然后可以評估例如具有一個更低百分比的陽性細(xì)胞的其他樣品的細(xì)胞核部分?？梢酝ㄟ^實質(zhì)上缺乏靶蛋白(陰性參比)、即提供一個低的NF(例如 <2%)的參比樣品或0的NF的參比樣品來進(jìn)一步幫助區(qū)分。如上述，表達(dá)一種控制量的靶蛋白的細(xì)胞系可以用作該參比，尤其是用作一種陽性參比。如上所討論，第三和第四方面的這些方法可以適合于一個選擇的參比值，例如以上提出的這些參比值之一，并且在這種情況下該參比預(yù)測可以是該選擇的參比值的一個結(jié)果。作為一個非限制性實例，如果使用一個<2% (NF < 2% )的細(xì)胞核部分作為參比值， 可以從圖IA(分析的總存活率，處于所有階段的腫瘤)中通過研究“低的”曲線(虛線)得到一個相關(guān)的參比預(yù)測。在來自診斷的給出的時間點，可以從該圖中讀出對應(yīng)于該“低的” 曲線的累積存活率，例如5年(60個月)后25%，這導(dǎo)致了一個參比預(yù)測是25%的五年總存活概率。因此，具有等于該參比值NF <2%的樣品值的受試者具有25%的五年總存活概率。然而，上述參比預(yù)測僅僅是作為說明性的實例而提供，并且普通技術(shù)人員知道根據(jù)以上方面的這些方法的有用性不限于任何特定的參比預(yù)測或預(yù)測量度。作為本披露的一個第五方面，在此提供了一種用于進(jìn)行根據(jù)第三或第四方面的實施方案的方法的試劑盒，該試劑盒包括a) 一種根據(jù)該第五方面的親和配體；以及b)用于對所述親和配體的量進(jìn)行定量所必需的試劑。根據(jù)第六方面的試劑盒的不同的組分可以結(jié)合以上本披露的這些方法方面的說明而選擇并且限定。因此，例如這些試劑可以包括如上述的一種第二親和配體。此外，該試劑盒可以包括用于提供該參比值的一個或多個參比樣品。術(shù)語“用于提供該參比值的參比樣品”在本披露的情況下應(yīng)當(dāng)被寬泛地解釋。該參比樣品可以包括實際上與該參比值對應(yīng)的量的靶蛋白，但是它也可以包括與高于該參比值的一個值對應(yīng)的一個量的靶蛋白。在后者情況下，該“高”值可以被一個進(jìn)行該方法的人員用作一個上參比(陽性參比)用于評定例如低于該“高”值的一個參比值的外觀。免疫組織化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員了解如何做這樣一種評定。此外，作為一種可替代的或一種補(bǔ)充的實例，該技術(shù)人員可以使用包括一個低量的靶蛋白的另一個參比樣品例如作為一個陰性參比用于提供在這樣一種評估中的一個“低” 值，。結(jié)合這些方法方面在以上進(jìn)一步論述了這種情況。在試劑盒方面的實施方案中，該參比樣品可以是一種組織樣品，如適合于用眼或顯微鏡評估的一種組織樣品。作為一個實例， 該組織參比樣品可以被固定在石蠟或在緩沖福爾馬林中和/或組織處理為裝在顯微載玻片上的ym薄切片。該組織參比樣品可以進(jìn)一步適應(yīng)于用親和配體(如根據(jù)該第一方面的親和配體)染色。因此，根據(jù)本披露的試劑盒包括根據(jù)該第一方面的一種親和配體，連同其他的有助于定量該親和配體(在它已經(jīng)特異性和/或選擇性地結(jié)合到該靶蛋白之后)的工具。例如，該試劑盒可以包含一種第二親和配體，用于檢測和/或定量一種由該靶蛋白與所討論的親和配體形成的絡(luò)合物。該試劑盒還可以包含除了親和配體以外的不同的助劑物質(zhì)，以使該試劑盒能夠容易并且有效地使用。助劑物質(zhì)的實例包括用于進(jìn)行溶解或復(fù)原該試劑盒的凍干蛋白組分的溶劑、洗滌緩沖液、用于對酶活性進(jìn)行測量(在一種酶被用作一種標(biāo)記物的情況下)的底物、在使用石蠟或福爾馬林固定組織樣品的情況下為提高對抗原的可接近性的靶標(biāo)恢復(fù)溶液、以及在免疫測定試劑盒中通常使用的物質(zhì)如反應(yīng)阻止劑，例如為降低背景染色的內(nèi)源性酶封閉溶液和/或為增加染色對比的復(fù)染溶液。作為本發(fā)明的一個第六方面，在此提供了一種分離的多肽，該多肽由47個或更少的酸殘基組成并且包括SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的氨基酸序列。本披露的這個第六方面是基于但不限于諸位發(fā)明人認(rèn)識到某些表位例如對于檢測在不同的背景中的該靶蛋白的表達(dá)是特別感興趣的，并且認(rèn)識到可以將包括這些表位的片段用于診斷或預(yù)測工具的生產(chǎn)、選擇或純化。以上與該第一方面相結(jié)合討論了下面描述的該第六方面的不同的實施方案。
該第六方面的實施方案中，該多肽可以包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列。此外，在這類實施方案中，該多肽可以包括氨基酸序列SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO :4。又另外地，在其中該多肽包括序列SEQ ID NO :3的這些實施方案中，該多肽可以包括或其組成為選自下組的一種氨基酸序列，該組的組成為SEQ ID N0:31-37。并且在其中該多肽包括序列 SEQ ID NO :4的實施方案中，該多肽以包括或其組成為選自下組的一種氨基酸序列，該組的組成為:SEQ ID NO :6-14。并且，該第六方面的實施方案中，該多肽可以包括SEQ ID NO :5的氨基酸序列。在這類實施方案中，該多肽可以包括或其組成為選自下組的一種氨基酸序列，該組的組成為 SEQ ID NO 52-59 以及 78-82。在該第六方面的實施方案中，該多肽可以由45個或更少的氨基酸殘基、例如43個或更少的氨基酸殘基、例如42個或更少的氨基酸殘基、例如41個或更少的氨基酸殘基、例如39個或更少的氨基酸殘基、例如38個或更少的氨基酸殘基、例如37個或更少的氨基酸殘基、例如34個或更少的氨基酸殘基、例如33個或更少的氨基酸殘基、例如31個或更少的
氨基酸殘基組成。此外，在該第六方面的多個實施方案中，該多肽可以由25個或更少的氨基酸殘基、例如20個或更少的氨基酸殘基、例如17個或更少的氨基酸殘基、例如14個或更少的氨
基酸殘基組成。例如，可以將該第六方面的多肽用于免疫中，例如用于單克隆或多克隆抗體的制備中。因此，在該第六方面的多個實施方案中，可以將該多肽在免疫中用作抗原，例如用于單克隆或多克隆抗體的制備中。因此，作為本披露的一個第七方面，在此提供了例如在免疫中根據(jù)該第六方面的多肽作為抗原的用途。例如，該免疫可以是非人類的動物的免疫。類似地，在此提供了根據(jù)該第六方面的一種多肽在抗體(例如單克隆或多克隆抗體)的制備中的用途。此外，在此提供了根據(jù)該第六方面的一種多肽在一種親和配體的選擇或純化中的用途。像例如可以將親和配體用于建立對于患有結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者的預(yù)測或另一種類型的預(yù)測方法。例如，這樣的用途可以包括在一種固相支持物(其上已經(jīng)固定該多肽)上的親和純化。例如可以將該固相支持物安排在一個柱中。此外，該用途可以包括使用一種固相支持物(其上已經(jīng)固定該多肽)對具有根據(jù)該第三方面的一種多肽的特異性的親和配體進(jìn)行選擇。這樣的固相支持物可以是96孔板、磁珠、瓊脂糖珠?；颦傊悄z珠粒。此外，該用途可以包括在一種可溶基質(zhì)(例如使用一種葡聚糖基質(zhì))上的親和配體的分析，或在一種表面等離子共振儀(如一種Biacore 儀)中的用途，該分析例如可以包括監(jiān)測該固定的多肽與許多潛在的親和配體的親合性。作為本披露的一個第八方面，在此提供了一種能夠選擇性地與一種表位序列相互作用的親和配體，該表位序列有26個或更少的氨基酸組成并且包括SEQ ID NO 87,SEQ ID NO 105和/或SEQ ID NO :106的氨基酸序列。本披露的這個第八方面是基于諸位發(fā)明人已經(jīng)鑒定針對SATB2抗原(SEQ ID NO 111)所產(chǎn)生的多克隆抗體與其相互作用的某些表位(即，SEQ ID NO 87,SEQ ID NO :105和 /或SEQ ID NO :106)。例如可以將這些與這類表位相互作用的親和配體用于建立對于患有結(jié)腸直腸癌的受試者的預(yù)測的各種分析、方法、測定或裝置中。通常，在這類應(yīng)用中，更希望的是具有多種親和配體，這些配體對于某一表位而不是親和配體(例如多克隆抗體)是特異性的，它們僅對全長蛋白或其較長的片段(例如抗原)是特異性的。此外，該全長SATB2 蛋白及其抗原片段(SEQ ID NO 111)包括SATBl蛋白和SATB2蛋白共有的幾個序列部分。 在一些情況下，例如當(dāng)它們都被表達(dá)時，在這兩種蛋白之間進(jìn)行區(qū)分可能是所希望的。SEQ ID NO 87,SEQ ID NO :105和/或SEQ ID NO 106對于SATB2都是唯一的，并且因此能夠與這些中的任何一個選擇性地相互作用的親和配體可以滿足這樣的需要。具有定義長度的許多個多肽片段(S卩，SEQ ID NO :88-91)被用于鑒定SEQ ID NO 87。因此，在該第八方面的多個實施方案中，所討論的表位序列可以包括或其組成為選自下組的一個氨基酸序列，該組的組成為SEQ ID N0:88-91。此外，具有定義長度的許多個其他的多肽片段(即SEQ ID NO :108-110)被用于鑒定SEQ ID N0:105。因此，在該第八方面的多個實施方案中，所討論的表位序列可以包括或其組成為選自下組的一個氨基酸序列，該組的組成為SEQ ID N0:108-110。上述的片段對應(yīng)地是25、26、22、24以及14個氨基酸長度。因此，在該第八方面的多個實施方案中，所討論的表位序列可以由25個或更少的氨基酸殘基、例如M個或更少的氨基酸殘基、例如22個或更少的氨基酸殘基、例如14個或更少的氨基酸殘基組成。在根據(jù)該第八方面的表位序列中，在SEQ ID NO :87、SEQ ID NO :105或SEQ ID NO: 106側(cè)翼的氨基酸例如可以是在蛋白SATB2中它們位于側(cè)翼的那些。加以必要的變通，將根據(jù)該第一方面的親和配體的不同實施方案(例如它們的類型以及制造)應(yīng)用于該第八方面的親和配體。該第二方面的用途也這樣做。因此，根據(jù)該第八方面的親和配體的用途構(gòu)成本披露的一個第九方面。此外，可以將根據(jù)第八方面的這些親和配體用于對應(yīng)于該第三方面的方法中。因此，作為本披露的一個第十方面，在此提供了一種用于確定一個對于患有結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者的預(yù)測是否差于或等于一種參比預(yù)測的方法，該方法包括以下步驟a)提供一種較早從所述受試者獲得的樣品；b)使用一種根據(jù)該第八方面的親和配體對所述樣品的至少一部分中存在的 SATB2蛋白的量進(jìn)行評估，并且確定一個對應(yīng)于所述評估的量的樣品值；c)將步驟b)中得到的所述樣品值與一個與所述參比預(yù)測相關(guān)的參比值進(jìn)行比較；并且如果所述樣品值低于或等于所述參比值，d)則得出結(jié)論，即用于所述受試者的所述預(yù)測差于或等于所述參比預(yù)測。因此，在該第十方面中的SATB2蛋白對應(yīng)于在該第三方面中的靶蛋白。并且，可以將根據(jù)第八方面的這些親和配體用于對應(yīng)于該第四方面的方法中。因此，作為本披露的一個第十一面，在此提供了一種治療對其有需要的受試者的方法，其中所述受試者患有一種結(jié)腸直腸癌，該方法包括以下這些步驟a)提供一種來自所述受試者的樣品；b)使用一種根據(jù)該第八方面的親和配體對所述樣品的至少一部分中存在的 SATB2蛋白的量進(jìn)行評估，并且確定一個相應(yīng)于所述評估的量的樣品值；
c)將步驟b)中得到的所述樣品值與一個與所述參比預(yù)測相關(guān)的參比值進(jìn)行比較；并且如果所述樣品值低于或等于所述參比值，d)則用一種輔助結(jié)腸直腸癌治療方案來治療所述受試者。加以必要的變通，將該第三和第四方面的不同的構(gòu)型以及實施方案對應(yīng)地應(yīng)用于該第十和第十一方面。作為本披露的一個第十二方面，在此提供了一種用于進(jìn)行根據(jù)第十或第十一方面的實施方案的方法的試劑盒，該試劑盒包括a)根據(jù)該第八方面的親和配體；以及b)用于對所述親和配體的量進(jìn)行定量所必需的試劑。加以必要的變通，將該第五方面的不同實施方案應(yīng)用于該第十二方面。作為本披露的一個第十三方面，在此提供了一種多肽，該多肽包括沈個或更少的氨基酸并且包括SEQ ID NO :87、SEQ ID NO :105和/或SEQ ID NO :106的氨基酸序列。如上述，具有定義長度的許多個多肽片段(S卩，SEQ ID NO :88-91)被用于鑒定SEQ ID NO :87。因此，在該第十三方面的多個實施方案中，所討論的多肽可以包括或其組成為選自下組的一個氨基酸序列，該組的組成為SEQ ID N0:88-91。并且如上述，具有定義長度的多個其他多肽片段(即SEQ ID NO :108-110)被用于鑒定SEQ ID N0:105。因此，在該第十三方面的多個實施方案中，所討論的多肽可以包括或其組成為選自下組的氨基酸序列，該組的組成為SEQ ID N0:108-110。最后，也如上討論，上述片段對應(yīng)地是25、26、22、24以及14個氨基酸長度。因此，在該第十三方面的多個實施方案中，所討論的多肽由25個或更少的氨基酸殘基、例如M個或更少的氨基酸殘基、例如22個或更少的氨基酸殘基、例如14個或更少的氨基酸殘基組成。在根據(jù)該第十三方面的多肽中，在SEQ ID NO 87,SEQ ID NO :105或SEQ ID NO 106側(cè)翼的氨基酸可以是例如在蛋白SATB2中在它們側(cè)翼上的那些。作為本披露的一個第十四方面，提供了根據(jù)該第十三方面的多肽的用途。加以必要的變通，將該第七方面的不同實施方案應(yīng)用于該第十四方面。鍾1)抗原的生成a.材料和方法用人基因組序列作為模板使用生物信息學(xué)工具來設(shè)計由EnsEMBL Gene ID ENSG00000119042編碼的靴蛋白的一種適當(dāng)?shù)钠?Lindskog M et al. (2005) Biotechniques 38 :723-727, EnsEMBL, www. ensembl. org)。設(shè)計了對應(yīng)于蛋白 SATB2 (EnsEMBL 登陸號 ENSP00000260926)的氨基酸 377-499 (SEQ ID NO :111)的一個由 123個氨基酸組成的片段。通過一個具有Platinum Taqanvitrogen)和作為模板的人類總 RNA 集合板(人類總 RNA 板 IV，BD Biosciences Clontech)的 Superscript One-Step RT-PCR擴(kuò)增試劑盒分離一個對該靶蛋白進(jìn)行編碼的多核苷酸，該多核苷酸包含長SATB2基因轉(zhuǎn)錄本(EnsEMBL登錄號ENST00000260926)的核苷酸1542-1910。通過PCR擴(kuò)增引物將側(cè)翼限制酶切位點NotI和AscI引入該片段中以允許框內(nèi)克隆進(jìn)入表達(dá)載體中(正向引物GTGTCCCAAGCTGTCTTTG，反向引物CTTGGCCCTTTTCATCTCC)。如上述對下游引物進(jìn)行生物素?；栽试S進(jìn)行固相克隆，并且將該生成的生物素?；?PCR 產(chǎn)物固定在 Dynabeads ]\C80 鏈霉親和素上((Dynal Biotech, Oslo, Norway) (Larsson M et al (2000) J. Biotechnol. 80 143-157))。通過Notl-Ascl 消化(New England Biolabs)來從該固體支撐物上釋放該片段，將該片段與一個雙親和標(biāo)記物一起連接到框內(nèi)pAffdc載體(Larsson M et al，如上)中，該雙親和標(biāo)記物包括一個用于固定化金屬離子層析(IMAC)純化的六組氨酸標(biāo)簽以及一個來自鏈球菌G蛋白的免疫增強(qiáng)白蛋白結(jié)合蛋白(ABP) ( Sjolander A et a/(1997) J. Immunol. Methods 201 :115-123 ； SaShl S et a/(1999)Encyclopedia of Bioprocess Technology :Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation(Fleckinger MC and Drew Sff,eds)John Wiley and Sons Inc. ,New York, PP 49-63)，并且轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)細(xì)胞(Novagen)中。根據(jù)制造商的建議，使用 iTempliPhiDNA 測序擴(kuò)增試劑盒(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)，通過質(zhì)粒 DNA 擴(kuò)增的染料終止循環(huán)測序驗證這些克隆的序列。通過在相同培養(yǎng)基中加入Iml —種過夜培養(yǎng)物，將包含有該表達(dá)載體的 BL21(DE3)細(xì)胞接種在IOOml 30g/l大豆胰蛋白酶肉湯(Merck KGaA)中，該大豆胰蛋白酶肉湯補(bǔ)充有5g/l的酵母提取物(Merck KGaA)以及50mg/l的卡那霉素(Sigma-Aldhch, St-Louis)。在37°C以及150rpm下將該細(xì)胞培養(yǎng)物在一個1公升的搖瓶中進(jìn)行孵育直到在 600nm下的光密度達(dá)到0. 5-1. 5。然后通過添加異丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷(Apollo Scientific)至一個ImM的終濃度誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并且在25°C和150rpm下繼續(xù)孵育過夜。 通過在MOOg離心收獲細(xì)胞，并且將片狀沉淀物再懸浮在5ml的溶解緩沖液中(7M鹽酸胍、 47mM Na2HPO4,2. 65mM NaH2PO4UOniM Tris-HClUOOmM NaCl、20mM β _巰基乙醇；ρΗ = 8. 0), 并且在37°C和150rpm下孵育2小時。在35300g下離心以后，收集包含變性并且溶解的基因產(chǎn)物的上清液。使用一個自動化蛋白純化步驟(SteenJ et al. (2006)Protein Expr. Purif. 46 173-178)在一種ASPEC XL4 (Gilson)上，通過在具有Iml的Talon 金屬(Co2+)親合樹脂的柱子(BD Biosciences Clontech)上進(jìn)行固定化金屬離子親和層析(IMAC)純化Hk6標(biāo)簽的融合蛋白。在載入該澄清的細(xì)胞溶解產(chǎn)物之前，用20ml變性洗滌緩沖液(6M鹽酸胍、 46. 6mM Na2HPO4,3. 4mMNaH2P04,300mM NaCl.pH 8.0-8. 2)將該樹脂平衡。其后,將該樹脂在 2. 5ml 洗脫緩沖液(6M 脲、50mM NaH2PO4UOOmM NaCl、30mM 乙酸、70mM 乙酸 Na，pH 5. 0)洗滌之前用不少于31. 5ml的洗滌緩沖液洗滌。將洗脫的物質(zhì)分餾成500、700和1300毫升的三個集合。該700毫升餾分，在此稱為抗原餾分，并且該收集的500和1300毫升餾分存儲以備以后使用。將該抗原餾分用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS；1. 9mM NaH2PO4,8. ImMNa2HPO4U54mM NaCl) 稀釋到IM脲的終濃度，隨后使用具有7500Da截留分子量的Vivapore 10/20ml濃縮器通過一個濃縮步驟以增加該蛋白質(zhì)的濃度(Vivascience AG)。根據(jù)制造商的推薦使用一種具有牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的一種雙金雞寧酸(BCA)微測定科學(xué)試驗計劃(Pierce)測定該蛋白質(zhì)的濃度。使用蛋白50或200測定法(Agilent Technologies)在一臺Bioanalyzer儀器上分析該蛋白質(zhì)的質(zhì)量。b 結(jié)果使用對于該蛋白片段特異的引物，通過RT-PCR從一個人RNA池成功分離了一種對應(yīng)于該SATB2基因的長轉(zhuǎn)錄物的核苷酸1542至1910并且編碼一種肽(SEQ ID NO :111)的基因片段，該肽由該SATB2蛋白的377至499位氨基酸組成。然而，與來自EnsEMBL的 ENSG00000119042的序列相比較，在該序列中存在一個單一的沉默核苷酸突變。將該靶蛋白的123氨基酸片段(SEQ ID NO :111)設(shè)計成缺乏跨膜區(qū)域以確保在大腸桿菌中有效表達(dá)， 并且缺乏任何信號肽，因為那些在成熟蛋白中被裂開。此外，該蛋白片段被設(shè)計為具有適合的尺寸以允許構(gòu)象表位的形成并且還允許在細(xì)菌系統(tǒng)中有效地克隆和表達(dá)。將編碼該正確的氨基酸序列的一個克隆進(jìn)行鑒定，并且在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)生這種正確大小的一種單一蛋白質(zhì)，并且隨后使用固定化金屬離子層析進(jìn)行純化。將該抗原餾分稀釋到為IM脲的終濃度之后，測定該蛋白片段的濃度為7，％ig/ml，并且根據(jù)純化分析為 98% 純。2)單克隆抗體的生成。a)材料和方法將如部分1的實例中得到的純化的片段(SEQ ID NO :111)用作用于生產(chǎn)單克隆抗體的抗原。將抗原送到Abka Biotechnology Ldt (中國北京)并且簡言之，將該抗原以三周的間隔皮下注入BALB/c小鼠周齡，雌性)體內(nèi)。將該抗原與弗氏完全佐劑混合用于第一次注射，并且與弗氏不完全佐劑混合用于隨后的注射。在融合之前三天，靜脈內(nèi)用抗原最后激發(fā)(challenged)該小鼠。通過將小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞系進(jìn)行融合來產(chǎn)生雜交瘤。使用ELISA通過篩選幾種細(xì)胞系，鑒定出分泌對該抗原(SEQ ID NO :111)特異的抗體的細(xì)胞，并且將這些細(xì)胞遞送到Atlas Antibodies AB用于進(jìn)一步表征。選擇在 ELISA、蛋白質(zhì)印跡(WB)以及免疫組織化學(xué)(IHC)中顯示陽性結(jié)果的細(xì)胞系用于亞克隆，這是由 AbSea Biotechnology Ldt 完成的。此外，將該單克隆抗體的免疫組織化學(xué)染色模式與內(nèi)部的多克隆抗SATB2抗體 (HPA001042，Atlas Antibodies AB，瑞典；使用抗原 SEQ ID NO :111 來產(chǎn)生)進(jìn)行比較。這種抗體有時在此稱為“ΗΡΑ多克隆抗體”或“ΗΡΑ msAb”。b)結(jié)果通過ELISA(在Abka)來篩選細(xì)胞系以鑒定出生產(chǎn)識別該抗原(SEQ ID NO :111) 而不是該親和標(biāo)簽His-ABP的單克隆抗體(mAbs)的細(xì)胞系。在ELISA中十三個細(xì)胞系顯示出與該抗原SEQ ID NO :111特異性結(jié)合，并且選擇用于進(jìn)一步的測試。對于所選擇的十三個克隆的每一個，收集150微升至300微升的上清液，加入疊氮化物，并且將這些上清液在濕冰上遞送到Atlas AntibodiesAB0當(dāng)?shù)诌_(dá)時根據(jù)AbSea的技術(shù)說明書將這些上清液存儲在+4°C下。對這些細(xì)胞系的進(jìn)一步測試導(dǎo)致鑒定出四個細(xì)胞系(克隆)C3B10、8F11、2B11 以及5E2)，它們在蛋白質(zhì)印跡和IHC兩者分析中給出陽性結(jié)果。對這四個克隆進(jìn)行選擇用于亞克隆和擴(kuò)增,這是由Abka Biotechnology Ldt.來完成的。使用多克隆抗體HPA001042以及單克隆抗體5E2和8F11進(jìn)行的結(jié)腸直腸癌免疫組織化學(xué)染色顯示了用于這些測試抗體的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核染色。與該多克隆抗體 ΗΡΑ001042相比較，單克隆抗體5E2和8F11產(chǎn)生了更顯著的和更強(qiáng)的圖案(圖6和7)。因此，與多克隆抗體HPA001042相比較，至少在某些方面，5E2和8F11更適合用于免疫組織化學(xué)。3)使用細(xì)菌展示進(jìn)行表位作圖a)將文庫亞克隆到該葡萄球菌的展示載體中。將大腸桿菌株RRlAM15(RUther，U.pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts. Nucleic. Acids Res. 10,57655772(1982))用作用于質(zhì)粒構(gòu)建的宿主株。通過將一種含有一個新的限制酶切位點(RiieI)的基因片段連接到先前描述的葡萄球菌載體pSCXm而創(chuàng)建一禾中新的葡萄球菌載體pSCEMl (Wernerus,H. and StShl, S. Vector engineering to improve a staphylococcal surface display system. FEMS Microbiol Lett 212,47-54 (2002)),用 BamHI 和 Sail (New England Biolabs, Beverly, MA)將其消化。用于擴(kuò)增 SATB2 片段基因的模板是由Anja Persson (皇家技術(shù)學(xué)院，斯德哥爾摩；瑞典)惠贈的。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增該基因片段(9. 6ml，合并的)并且在冰上的50ml i^lcon管中使用一種微尖 (microtip)進(jìn)行超聲處理60分鐘(21 %幅值，持續(xù)超聲處理)以便產(chǎn)生隨機(jī)片段。隨后使用 Centhcon Plus 20柱(CO IOkDa ;Millipore，Billerica，MA)通過超濾將樣品進(jìn)行濃縮。 根據(jù)供應(yīng)商的推薦，通過加入jM DNA聚合酶以及T4多核苷酸激酶(New England Biolabs) 使?jié)饪s的片段末端鈍化并且磷酸化。此后，使用jM DNA連接酶anvitroger^CarlskicbCA) 使這些末端鈍化的片段連接進(jìn)入該葡萄球菌展示載體pSCEMl，用RiieI消化(New England Biolabs)。 Mf 該文庫轉(zhuǎn)化至Ij 電轉(zhuǎn)化感受態(tài) S. carnosus TM300 ( Gotz, F. Staphylococcus carnosus :a new host organism for gene cloning and protein production. Soc. Appl. Bacteriol. Symp. Ser. 19，49S-53S (1990))，如先前的描述(Lofblom, J. , Kronqvist, N. , Uhlen, Μ. , Stahl, S. &ffernerus, H. Optimization of electroporation-mediated transformation !Staphylococcus carnosus as model organism. J Appl Microbiol 102, 736-747 (2007))，并且在15%的甘油中于_80°C下儲存。b)細(xì)胞標(biāo)記以及熒光激活細(xì)胞分選(FACS)將等分部分的Sc:SATB2_lib (至少十倍于該文庫大小)接種到具有20 μ g/ml氯霉素的IOOml TSB+Y (大豆胰蛋白酶肉湯+酵母提取物)并且在37°C以及150rpm下生長過夜。16 小時后，用具有 0. 1 % Pluronic ； F108NF 表面活性劑(PBSP ；BASF Corporation, Mount Olive,NJ)的Iml的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH 7.4)洗滌IO7個細(xì)胞。通過離心作用 (3500xg，4°C，6分鐘)使這些細(xì)胞沉淀，并且重懸于含有抗體(即用于表位作圖的抗體，典型地在濃度IOOnM左右)的100 μ 1 PBSP中，并且在室溫下孵育并輕柔混合1小時以達(dá)到平衡結(jié)合。此后，用Iml的冰冷PBSP洗滌細(xì)胞，隨后在黑暗中的冰上在Iml PBSP (含有4 μ g/ ml 的 Alexa Fluor · 488 (Invitrogen)羊抗兔 IgG 或 4 μ g/ml 的 AlexaFluor488 羊抗鼠 IgG(Invitrogen)以及 225nM 的 Alexa Fluor647HAS 結(jié)合物 Qnvitrogen))中孵育 1 小時。在Iml冰冷PBSP中的最終洗滌步驟之后，在分選之前將這些細(xì)胞重懸在300 μ 1冰冷的 PBSP 中。使用 FACSVantage SE (BD Biosciences, San Jose, CA)流式細(xì)胞儀將這些細(xì)胞分選。將這些細(xì)胞直接分選進(jìn)入0. 5ml的B2培養(yǎng)基(Lofblom, J. ,Kronqvist, N. , Uhlen,M.， Stahl, S. &ffernerus, H. Optimization of electroporation-mediated transformation Staphylococcus carnosus as model organism. J Appl Microbiol 102,736-747(2007)) 并且涂布在含有10 μ g/ml的氯霉素的血瓊脂基質(zhì)(Merck)板上，并且在37°C下孵育M小時。在最后一輪中，將細(xì)胞分選進(jìn)入在96孔板的單獨的孔(含有半固體培養(yǎng)基)中以形成集落。c) DNA測序以及BLAST比對將每一集落的部分轉(zhuǎn)移到在96孔板中的兩個分離的孔用于PCR。使用兩個不同的引物對通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增該葡萄球菌展示載體的插入片段區(qū)域，產(chǎn)生兩種分別在正向端和在反向端含有一種生物素分子的PCR產(chǎn)物。通過在包被鏈親和素的順磁珠粒 (Dynabeads M-270 ；Dynal Biotech,Oslo,Norway)上固定的生物素酰化的PCR產(chǎn)物的NaOH 鏈分離來生成單鏈DNA。焦磷酸測序引物的鏈分離和退火是使用Magnatrix 1200移液機(jī)器人(Magnetic Biosolutions AB, Stockholm, Sweden)根據(jù)生產(chǎn)廠家的技術(shù)說明書來完成的。根據(jù)制造商的說明使用一臺PSQ 96HS儀器(Biotage AB, Uppsala, Sweden)在每一插入片段兩端進(jìn)行10個循環(huán)焦磷酸測序。補(bǔ)充的軟件是用Perl寫成的用于自動分析焦磷酸測序輸出文件，包括確定閱讀框以及與該抗原進(jìn)行BLAST比對。d)結(jié)果如上述建立了一個SATB2肽文庫并且轉(zhuǎn)化產(chǎn)生約60，000個單獨的克隆，導(dǎo)致在該葡萄球菌的表面上展示約2，40(K4%)個不同的功能性抗原衍生片段。使用以前通過用抗原SEQ ID NO :111免疫生產(chǎn)的一群多克隆抗體(該多克隆抗體HPA001042)以及四個單克隆抗體(3B10、8F11、2B11以及5E》進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)分選，所有這些多克隆抗體都從相同的抗原(SEQ ID NO 111)產(chǎn)生。在成功地富集抗體結(jié)合細(xì)胞后在第二輪分選中將陽性細(xì)胞分離出來。對于該多克隆抗體，使用兩個分離的門來收集具有微小差異的抗體結(jié)合特性的細(xì)胞群，其中每一個單克隆抗體使用一個門。對所收集的來自各基于抗體分選的克隆進(jìn)行的測序顯示了對于該多克隆抗體的五個不同的表位，而所有單克隆抗體的結(jié)合模式證實為單一的結(jié)合表位。發(fā)現(xiàn)已鑒定出的單克隆抗體的共有序列表位(SEQ ID:1和2)與兩個所鑒定的對于多克隆抗體HPA001042 (序列未包括)的表位是重疊的。這兩個表位被表示為表位 1 (SEQ ID NO 1)和 2 (SEQ ID NO 2)。基于使用單克隆抗體8F11和5E2所得到的測序信息，諸位發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用于表位 KSEQ ID NO :1，QNFLNLPE)的共有序列。8F11的作圖顯示16個氨基酸長度的表位(SEQ ID NO :3，LRAMQNFLNLPEVERD)，這由 SEQ ID NO :31-51 所支持。換言之，發(fā)現(xiàn)了片段 SEQ ID N0: 31-51與8F11相互作用并且鑒定出了 SEQ ID NO 3的共有序列。對于單克隆抗體5E2，作圖顯示了 13個氨基酸長度的表位(SEQ ID NO :4，QNFLNLPEVERDI)，這由SEQ ID NO 6-30 所支持。換言之，發(fā)現(xiàn)了片段SEQ ID NO :6-30與5E2相互作用并且鑒定出了 SEQ ID NO 4 的共有序列。此外，諸位發(fā)明人基于使用單克隆抗體:3B10和2B11獲得的測序信息發(fā)現(xiàn)了對于表位2的共有序列(SEQ ID NO 2, GLLSEILRK)。！3B10的作圖顯示了 10個氨基酸長度的表位(SEQ ID NO 5, QGLLSEILRKE)，這由 SEQ ID NO :78-86 所支持。對于單克隆抗體 2B11， 作圖顯示了 9個氨基酸長度的表位(SEQ ID NO 2, GLLSEILRK)，這由SEQ ID NO :52-77所支持。并且，諸位發(fā)明人已經(jīng)使用多克隆抗體HPA001042鑒定出三個另外的表位，即表位 3(SEQ ID NO :87)、表位 4(SEQ ID NO :105)以及表位 5(SEQ ID NO :106)。諸位發(fā)明人使用作圖鑒定出該12個氨基酸的表位3(KTSTPTTDLPIK)，并且該表位是一個基于來自SEQ ID NO :88-104的測序信息的共有序列。同樣地，諸位發(fā)明人通過作圖鑒定出該12個氨基酸的表位5，并且該表位是一個基于來自SEQ ID NO :107-110的測序信息的共有序列。此外諸位發(fā)明人使用作圖還鑒定出該對個氨基酸的表位4(VSSASSS PSSS RTPQAKTSTPTTD)。4)結(jié)腸癌TMA (乙狀結(jié)腸隊列)
a)材料和方法從瑞典馬爾默大學(xué)醫(yī)院的病理系收集在1993年與2003年之間的對乙狀結(jié)腸癌進(jìn)行手術(shù)治療的305個患者(148名女性以及157名男性)的歸檔的福爾馬林固定的石蠟包埋的組織。患者的中位年齡是74歲(39-97歲)。49位的腫瘤是在Dukes A期，127位是在 Dukes B期，89位是在Dukes C期，并且46位是在Dukes D期。對于所有患者關(guān)于死亡日期的信息是從地區(qū)的死亡原因登記冊得到的。從地方倫理委員會得到倫理許可。所有305個病例在用蘇木精和伊紅染色的載玻片上進(jìn)行了組織病理學(xué)再評估。然后通過對每個病例從代表乙狀結(jié)腸癌的區(qū)域取樣hi. Omm核心構(gòu)建了 TMA: S。如先前的說明進(jìn)行自動免疫組織化學(xué)(Kampf C et al. (2004)Clin. Proteomics 1J85-300)。簡要地，在60°C下將這些載玻片孵育45分鐘，在二甲苯中脫石蠟0x15分鐘)，并且在梯度醇中水合。為了抗原恢復(fù)，將載玻片浸于TRS(靶標(biāo)恢復(fù)溶液，pH 6.0， Dako, Copenhagen, Denmark) Φ^ 一ft Decloaking chamber (Biocare Medical)中在125°C下煮沸4分鐘。將載玻片放置于該Autostainer (Dako)中并且開始用H2O2 (Dako) 封閉內(nèi)源性過氧化物酶。在室溫下將這些載玻片與如在實例部分2中獲得的第一抗體5E2 和8F11孵育30分鐘，隨后用結(jié)合Envision通的羊抗兔過氧化物酶在室溫下孵育30分鐘。 在所有步驟之間，將載玻片在洗滌緩沖液(Dako)中漂洗。最后，用二氨基聯(lián)苯胺(Dako)作為色原體并且用Harris蘇木精(Sigma-Aldrich)進(jìn)行復(fù)染。用Pertex (Histolab)裝上這些載玻片。在顯微鏡下對所有免疫組織化學(xué)染色的組織的樣品進(jìn)行人工評估，并且由認(rèn)證的病理學(xué)家進(jìn)行評注。使用簡化的方案對每個樣品就其IHC結(jié)果的分類進(jìn)行評注。對每一組織就其代表性和免疫反應(yīng)性進(jìn)行檢查。對腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)兩者都進(jìn)行評注。基本的評注參數(shù)包括i)亞細(xì)胞定位(細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)/膜)，ii)染色強(qiáng)度(Si)，以及iii)染色細(xì)胞的部分(FSC)的評估。根據(jù)臨床上組織病理學(xué)診斷使用的標(biāo)準(zhǔn)主觀地評估染色強(qiáng)度，并且將結(jié)果分類為無=無免疫反應(yīng)性，弱=微弱的免疫反應(yīng)性，中等=中等免疫反應(yīng)性，或強(qiáng)=顯著而強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)性。普通技術(shù)人員會認(rèn)識到這個步驟與一種Allred評分的計算是相似的，參見例如 Allred et al (1998) Mod Pathol 11(2),1550為了統(tǒng)計分析，對細(xì)胞核部分(NF)和細(xì)胞核強(qiáng)度(Ni)的水平進(jìn)行了評估。NF和 NI兩者都是根據(jù)在臨床組織病理學(xué)診斷中所使用的標(biāo)準(zhǔn)來主觀評估的該“細(xì)胞核部分” 對應(yīng)于在細(xì)胞核中顯示出陽性染色的樣品中的腫瘤細(xì)胞的百分比，其中一種在細(xì)胞核中的中等的或顯著而強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)性被認(rèn)為是陽性的，并且在細(xì)胞核中沒有或微弱的免疫反應(yīng)性被認(rèn)為是陰性的?！凹?xì)胞核強(qiáng)度”對應(yīng)于該樣品的總?cè)旧珡?qiáng)度。然而，僅將這些細(xì)胞的細(xì)胞核的表達(dá)考慮在內(nèi)。一種細(xì)胞核強(qiáng)度測定的結(jié)果被分類為無=在該樣品的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中沒有總體免疫反應(yīng)性，弱=在該樣品的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中微弱的總體免疫反應(yīng)性，中等=在該樣品的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中的中等的總體免疫反應(yīng)性，或強(qiáng)=在該樣品的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中顯著而強(qiáng)烈的總體免疫反應(yīng)性?；趯τ趩为毜膶拥拇婊钰厔?，構(gòu)建了一種用于進(jìn)一步統(tǒng)計分析的二分變數(shù)(dichotomized variable) 0對于使用該5E2抗體的分析，高的細(xì)胞核部分(NF > 0)被定義為2%至100%的細(xì)胞的部分被染色并且低的細(xì)胞核部分(NF = 0)被定義為< 2%的細(xì)胞的部分被染色。此外，弱、中等以及強(qiáng)細(xì)胞核強(qiáng)度(Ni > 0)被定義為高蛋白表達(dá)水平，并且無細(xì)胞核強(qiáng)度(Ni = 0)被定義為低蛋白表達(dá)水平。該8F11抗體被更強(qiáng)地染色并且因此高的細(xì)胞核部分(NF= 1)被定義為>75%的細(xì)胞的部分被染色并且低的細(xì)胞核部分(NF < 1)被定義為0%至75%的細(xì)胞的部分被染色。此外，強(qiáng)的細(xì)胞核強(qiáng)度(Ni = 1)被定義為高蛋白表達(dá)并且無、弱以及中等的細(xì)胞核強(qiáng)度(Ni < 1)被定義為低蛋白表達(dá)。將樣品的上述分類用于根據(jù)卡普蘭-邁耶方法的總存活率(OS)分析，并且使用時序檢驗來比較在不同層中的存活率。所有統(tǒng)計檢驗是雙側(cè)的，并且認(rèn)為P值< 0. 05%是顯著的。所有計算是用統(tǒng)計軟件包SPSS 16. 0 (SPSS Inc. Illinois，USA)作出的。b)結(jié)果305個乙狀結(jié)腸癌患者的基于組織微陣列的分析表明使用單克隆抗體5E2導(dǎo)致強(qiáng)的并且清楚的細(xì)胞核染色，其中261位受試者(86% )顯示了高表達(dá)(NF彡2% )。對于患有具有低表達(dá)的被5E2結(jié)合的蛋白的腫瘤的患者，基于整個隊列的細(xì)胞核部分的存活率分析顯示出顯著(P = 0. 001)較低的五年總存活率(0 (圖1A)。在五年后約60%的具有高表達(dá)水平的患者仍然存活，而在該時間期之后僅有約25%的具有低表達(dá)水平的患者存活。 此外，當(dāng)研究診斷為Dukes C和D期的受試者時，在預(yù)期存活率方面的差別可以被認(rèn)為是甚至更顯著的在五年后在這個亞組中約40%的具有高表達(dá)水平的患者仍然存活，而在相同的時間期之后僅有約10%的具有低蛋白表達(dá)水平的患者存活(ρ = 0.01)，參見圖1B。作為所使用的截斷的結(jié)果，“低的”種類包括基本上已經(jīng)失去它們的表達(dá)的患者。因此，蛋白表達(dá)的喪失似乎與顯著更差的預(yù)測相關(guān)聯(lián)，并且在該疾病的晚期(例如對于診斷為Dukes C和D 期的患者)這可以被認(rèn)為是特別顯著的。當(dāng)研究細(xì)胞核強(qiáng)度時得到類似的結(jié)果(圖2A和 B)。305個乙狀結(jié)腸癌患者的基于組織微陣列的分析表明使用單克隆抗體8F11導(dǎo)致強(qiáng)的并且清楚的細(xì)胞核染色，其中275個受試者(90%)顯示了高表達(dá)(NF >75%)。對于患有具有低蛋白表達(dá)的腫瘤的患者，基于整個隊列的細(xì)胞核部分的存活率分析顯示出顯著(p = 0. 004)更短的五年總存活率(0 (圖3A)。在五年后約60%的具有高蛋白水平的患者仍然存活，而在相同的時間期之后僅有約27%的具有低表達(dá)水平的患者存活。此外， 當(dāng)研究診斷為DukesC和D期的受試者時，在預(yù)期存活率方面的差別可以被認(rèn)為是甚至更顯著的。在五年后在這個亞組中約40%的具有高蛋白水平的患者仍然存活，而在相同的時間期之后僅有約12%的具有低蛋白表達(dá)水平的患者存活，參見圖;3B。因此，低水平的蛋白表達(dá)是與顯著更差的預(yù)測相關(guān)聯(lián)的，并且在該疾病的晚期(例如對于診斷為Dukes C和D期的患者)該相關(guān)性可以被認(rèn)為是甚至更顯著的。當(dāng)研究細(xì)胞核強(qiáng)度時得到類似的結(jié)果(圖 4A 和 B)。在圖5中，分析了 5E2和8F11的染色的相關(guān)性。通過交叉表對染色的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核部分進(jìn)行比較，并且顯示該兩種單克隆抗體之間的顯著(P = 0.001)相關(guān)性。因此， 這支持了兩種單克隆抗體與相同的表位相互作用。結(jié)論是，對于診斷患有結(jié)腸直腸癌(例如，乙狀結(jié)腸癌)的患者，5E2和8F11的使用對于建立一個用于患者的預(yù)測(即存活概率，例如五年存活率，如從圖1至4中可見的) 可能具有重要的價值。津立一個對于結(jié)腸盲腸癌患者的預(yù)測5. 一個非限制性實例
癌癥患者可以表現(xiàn)出由于腫瘤生長的多種癥狀或體征、局部癥狀(包括來自腫瘤生長在其中的病灶的疼痛和不適)或更多的全身癥狀(例如體重減輕和疲勞)。由于結(jié)腸直腸腫瘤的生長的體征還可以通過便血和/或機(jī)能障礙(例如，腹瀉/便秘)變得明顯。下面，使用一種能夠與SEQ ID NO=I的表位序列選擇性地相互作用的單克隆抗體 (mAB)。這樣的單克隆抗體的一個實例是如上在部分2的實例中得到的5E2。確立在患者中的結(jié)腸直腸癌診斷之后，獲得了來自乙狀結(jié)腸的腫瘤組織樣品。該腫瘤組織樣品可以在該癌癥的診斷期間從早期進(jìn)行的活檢中獲得或從來自較早手術(shù)去除的腫瘤的標(biāo)本中獲得。此外，為了提供一種“陰性參比”，從歸檔的材料中得到一種樣品，該材料包括缺乏可檢出的包含SEQ ID N0:1的蛋白(靶蛋白)的表達(dá)的組織。這類歸檔的組織例如可以是以前顯示的當(dāng)用mAB染色時展示無表達(dá)的結(jié)腸直腸癌組織。此外，為了提供一種“陽性參比”，從歸檔的材料中得到一種樣品，該材料包括具有預(yù)先建立的高靶蛋白表達(dá)的組織。這類歸檔的組織可以是例如以前顯示的當(dāng)用mAB染色時展示高表達(dá)(例如NF >75%或Nl=強(qiáng))的結(jié)腸直腸癌組織。將該樣品材料在緩沖的福爾馬林中進(jìn)行固定并且進(jìn)行組織處理從而得到該樣品材料薄切片Gym)。如根據(jù)部分4的實例所述，進(jìn)行了免疫組織化學(xué)。將來自每一樣品的一個或多個樣品切片固定在載玻片上，在60°C下孵育45分鐘，在二甲苯中脫石蠟(&15分鐘)，并且在梯度醇中水合。為了抗原恢復(fù)，將載玻片浸于TRS (靶標(biāo)恢復(fù)溶液，pH 6.0,Dako)中并且在一種Decloaking chamber (Biocare Medical)中在125°C下煮沸4分鐘。將載玻片放置于該Autostainer · (Dako)中并且開始用H2A (Dako)封閉內(nèi)源性過氧化物酶。安裝多個樣品切片的原因可能是為了增加結(jié)果的準(zhǔn)確度。將mAB加到這些載玻片上并且在室溫下孵育30分鐘，隨后用一種標(biāo)記的第二抗體(例如，羊抗兔過氧化物酶結(jié)合的Envision )在室溫下孵育30分鐘。為了檢測該第第二抗體體，將二氨基聯(lián)苯胺(Dako)用作色原體并且用Harris蘇木精(Sigma-Aldrich)進(jìn)行對比復(fù)染。在所有步驟之間，將載玻片在洗滌緩沖液(Dako)中漂洗。然后，用Pertex (Histolab)封固劑將這些載玻片封固。作為驗證該染色步驟的一種工具，可以使用二種對照細(xì)胞系；例如一個載玻片具有表達(dá)該靶蛋白的細(xì)胞(陽性細(xì)胞系)，并且一個載玻片具有無靶蛋白表達(dá)的細(xì)胞(陰性細(xì)胞系)。技術(shù)人員了解如何提供這類細(xì)胞系，例如按照Miodes等人披露的(2006)The biomedical scientist, ρ 515-520的指導(dǎo)。這些對照系載玻片可以與這些結(jié)腸直腸癌載玻片在同一步驟中同時染色，即與相同的第一和第二抗體孵育。例如，可以使用一種kar^cope T2自動化載玻片掃描系統(tǒng)(Aperio Technologies)在20倍放大率下在一個光學(xué)顯微鏡中掃描一個或多個乙狀結(jié)腸腫瘤組織載玻片、染色的參比載玻片、以及任選地具有對照細(xì)胞系的載玻片。如果使用對照細(xì)胞系，檢查這些以驗證該染色步驟。如果這些細(xì)胞系顯示可接受標(biāo)準(zhǔn)之外的染色結(jié)果，例如由技術(shù)人員識別的染色假象，則這些活檢樣品的染色被認(rèn)為是無效的并且用新的載玻片重復(fù)該整個染色步驟。如果這些陽性和陰性細(xì)胞系分別顯示強(qiáng)的染色強(qiáng)度和不清楚的或無染色強(qiáng)度，則該染色被認(rèn)為是有效的。根據(jù)在臨床組織病理學(xué)診斷中使用的標(biāo)準(zhǔn)通過目檢人工地對來自該腫瘤組織活檢的一個或多個染色的樣品載玻片進(jìn)行評估，并且與部分4的實例一致而將一個或多個結(jié)腸直腸腫瘤載玻片的免疫反應(yīng)性進(jìn)行分級。例如，可以確定細(xì)胞核部分(NF)。即，對在細(xì)胞核中顯示陽性染色的樣品載玻片中的腫瘤細(xì)胞的百分比進(jìn)行評估。在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中的中等或顯著和強(qiáng)的免疫反應(yīng)性被認(rèn)為是陽性的，并且在細(xì)胞核中無或弱的免疫反應(yīng)性被認(rèn)為是陰性的。例如，可以使用NF < 2%的參比值，并且在這種情況下，這種或這些樣品被分成NF < 2%或NF彡2%。在確定該NF時，人們通過目檢這些染色的參比載玻片(即“陽性參比”以及“陰性參比”)的幫助來完成該評估和分級。然后將來自該腫瘤組織的這種或這些樣品載玻片的這種或這些樣品值(即，一個或多個NF)與一個參比值進(jìn)行比較。如果這個或這些樣品值等于或低于該參比值，則得出結(jié)論，即該預(yù)測差于或等于一個與該參比值相關(guān)的參比預(yù)測。如上述，該參比值可以是NF <2%。在這種情況下，可以從圖IA中得到與該參比值相關(guān)聯(lián)的參比預(yù)測。在圖IA中，NF <2% (虛線)與25%的五年總存活概率相關(guān)聯(lián)。因此，如果所討論的患者的一個或多個樣品值是NF<2% (等于該參比值)，則對于該患者的預(yù)測是25%的五年總存活概率(等于該參比預(yù)測)。將在本申請中涉及的所有引證材料(包括但不限于公開文件、DNA或蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)登錄、以及專利)通過引用結(jié)合在此。因此很顯然本發(fā)明的描述可以在許多方面做出同樣的改變。此類改變將不被視為是偏離了本發(fā)明的精神以及范圍，并且對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言將是顯而易見的所有此類變更旨在包含在以下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種能夠與一種表位序列選擇性地相互作用的親和配體，該表位序列由47個或更少的氨基酸組成并且包括SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的親和配體，其中所述表位序列包括SEQID NO :1的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的親和配體，其中所述表位序列包括氨基酸序列SEQID NO 3 和 / 或 SEQ ID NO :4ο
4.根據(jù)權(quán)利要求2和3的任一項所述的親和配體，其中所述表位序列包括一種選自下組的氨基酸序列，該組的組成為SEQ ID NO 6-14以及31-37。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的親和配體，其中所述表位序列由選自下組的一個氨基酸序列組成，該組的組成為SEQ ID NO 6-14以及31-37。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的親和配體，其中所述表位序列包括氨基酸序列SEQID NO :5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的親和配體，其中所述表位序列包括選自下組的一個氨基酸序列，該組的組成為=SEQ ID NO 52-59以及78-82。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的親和配體，其中所述表位序列由選自下組的一個氨基酸序列組成，該組的組成為SEQ ID NO :52-59以及78-82。
9.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項所述的親和配體，其中所述表位序列由34個或更少的氨基酸殘基組成。
10.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項所述的親和配體，其中所述表位序列由17個或更少的氨基酸殘基組成。
11.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項所述的親和配體，該親和配體是一種抗體或它的一種片段或衍生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的親和配體，其中所述抗體是多克隆的。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的親和配體，其中所述抗體是單克隆的。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至10的任一項所述的親和配體，該親和配體是從選自下組的一種支架衍生的一種蛋白配體，該組的組成為葡萄球菌蛋白A和其域、脂質(zhì)運載蛋白、錨蛋白重復(fù)域、纖維素結(jié)合域、Y晶型、綠色熒光蛋白、人細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4、蛋白酶抑制劑、PDZ域、肽適體、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纖連蛋白III型域以及鋅指結(jié)構(gòu)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至10的任一項所述的親和配體，該親和配體是一種寡核苷酸分子。
16.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項所述的親和配體，該親和配體用于一種體內(nèi)方法，該方法用于建立一種對患有結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者的預(yù)測。
17.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項所述的親和配體作為一種預(yù)測試劑的用途。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用于建立一種對于患有結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者的預(yù)測的用途。
19.用于確定一種對于患有結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者的預(yù)測是否差于或等于一種參比預(yù)測的方法，該方法包括以下步驟a)提供一種較早從所述受試者獲得的樣品；b)使用一種根據(jù)權(quán)利要求1至16的任一項所述的親和配體對所述樣品的至少一部分中存在的包括氨基酸序列SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的蛋白的量進(jìn)行評估，并且確定一個對應(yīng)于所述評估的量的樣品值；c)將步驟b)中所得到的所述樣品值與一個與所述參比預(yù)測相關(guān)的參比值進(jìn)行比較； 并且如果所述樣品值低于或等于所述參比值，d)則得出結(jié)論，即用于所述受試者的所述預(yù)測差于或等于所述參比預(yù)測。
20.一種治療對其有需要的受試者的方法，其中所述受試者患有一種結(jié)腸直腸癌，該方法包括以下步驟a)提供一種來自所述受試者的樣品；b)使用一種根據(jù)權(quán)利要求1至16的任一項所述的親和配體對所述樣品的至少一部分中存在的包括氨基酸序列SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的蛋白的量進(jìn)行評估，并且確定一個對應(yīng)于所述評估的量的樣品值；c)將步驟b)中所得到的所述樣品值與一個與所述參比預(yù)測相關(guān)的參比值進(jìn)行比較； 并且如果所述樣品值低于或等于所述參比值，d)則用一種輔助結(jié)腸直腸癌治療方案來治療所述受試者。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中步驟c)的所述參比值是與一個參比預(yù)測相關(guān)的并且所述步驟d)的輔助結(jié)腸直腸癌治療方案是適合于用于所述受試者的預(yù)測的，該預(yù)測是差于或等于所述參比預(yù)測的。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，其中所述輔助結(jié)腸直腸癌治療方案是選自化學(xué)療法、新輔助療法以及它們的組合。
23.根據(jù)權(quán)利要求20至22的任一項所述的方法，其中所述輔助結(jié)腸直腸癌治療方案是新輔助療法。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述新輔助療法是選自i)只有放射療法以及 )放射療法與化學(xué)療法相結(jié)合。
25.根據(jù)權(quán)利要求19至M的任一項所述的方法，其中步驟b)的蛋白包括SEQID NO 1。
26.根據(jù)權(quán)利要求19至25的任一項所述的方法，其中步驟b)包括在能夠使所述親和配體結(jié)合到所述樣品中的蛋白上的條件下將所述親和配體施用于所述樣品，并且所述評估的量是通過對所述親和配體的量進(jìn)行評估而得到的，所述親和配體是與所述樣品的所述至少一部分相關(guān)聯(lián)的。
27.根據(jù)權(quán)利要求19至沈的任一項所述的方法，其中步驟b)包括bl)在所述條件下將所述親和配體施用于所述樣品，所述條件使得所述親和配體能夠結(jié)合到所述樣品中的蛋白上；b2)從所述樣品中去除未結(jié)合的親和配體；并且b3)對保持與所述樣品的所述至少一部分結(jié)合的親和配體的量進(jìn)行評估，從而獲得所述評估的量。
28.根據(jù)權(quán)利要求19至27的任一項所述的方法，其中所述親和配體包括一種選自下組的標(biāo)記物，該組的組成為熒光染料類和金屬類、發(fā)色染料類、化學(xué)發(fā)光化合物類和生物發(fā)光蛋白類、酶類、放射性同位素類、顆粒以及量子點。
29.根據(jù)權(quán)利要求19至觀的任一項所述的方法，其中所述親和配體是使用能夠識別所述親和配體的一種第二親和配體來檢測的。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中所述第二親和配體包括一種選自下組的標(biāo)記物，該組的組成為熒光染料類和金屬類、發(fā)色染料類、化學(xué)發(fā)光化合物類和生物發(fā)光蛋白類、酶類、放射性同位素類、顆粒以及量子點。
31.根據(jù)權(quán)利要求19至30的任一項所述的方法，其中所述結(jié)腸直腸癌是處于DukesA 或B期的。
32.根據(jù)權(quán)利要求19至31的任一項所述的方法，其中所述結(jié)腸直腸癌是結(jié)腸直腸腺瘤。
33.根據(jù)權(quán)利要求19至31的任一項所述的方法，其中所述結(jié)腸直腸癌是結(jié)腸直腸癌瘤。
34.根據(jù)權(quán)利要求19至30以及權(quán)利要求32至33的任一項所述的方法，其中所述結(jié)腸直腸癌是轉(zhuǎn)移性的。
35.根據(jù)權(quán)利要求19至30以及權(quán)利要求32至34的任一項所述的方法，其中所述結(jié)腸直腸癌是處于Dukes C或D期的。
36.根據(jù)權(quán)利要求19以及權(quán)利要求21至35的任一項所述的方法，其中所述預(yù)測是一種存活概率，例如總存活率，并且所述參比預(yù)測是一種參比存活概率，例如總存活率，其中兩個存活率都是相同類型的存活率。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中該存活概率是五年、十年或15年存活的概率。
38.根據(jù)權(quán)利要求19至37的任一項所述的方法，其中所述受試者是人類。
39.根據(jù)權(quán)利要求19至38的任一項所述的方法，其中所述樣品是一種體液樣品。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述體液是選自下組，其組成為血液、淋巴、血漿、血清、腦脊液、尿液、精液以及滲出物。
41.根據(jù)權(quán)利要求19至38的任一項所述的方法，其中所述樣品是一種細(xì)胞學(xué)樣品。
42.根據(jù)權(quán)利要求19至38的任一項所述的方法，其中所述樣品是一種糞便樣品。
43.根據(jù)權(quán)利要求19至42的任一項所述的方法，其中所述樣品包括來自所述受試者的細(xì)胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求19至43的任一項所述的方法，其中所述樣品包括來自所述受試者的腫瘤細(xì)胞。
45.根據(jù)權(quán)利要求19至44的任一項所述的方法，其中所述樣品是一種組織樣品。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述組織樣品是一種結(jié)腸直腸組織樣品。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述結(jié)腸直腸組織樣品是一種結(jié)腸直腸癌組織樣品。
48.根據(jù)權(quán)利要求46或47所述的方法，其中所述組織樣品是從乙狀結(jié)腸得到的。
49.根據(jù)權(quán)利要求19至48的任一項所述的方法，其中所述步驟b)的評估限于所述樣品的細(xì)胞的細(xì)胞核。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述樣品的所述細(xì)胞是所述樣品的腫瘤細(xì)胞。
51.根據(jù)權(quán)利要求19至50的任一項所述的方法，其中所述參比值是一個對應(yīng)于在一個參比樣品中的包括氨基酸序列SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的蛋白的一個量的值。
52.根據(jù)權(quán)利要求19至51的任一項所述的方法，其中所述步驟b)的樣品值被確定為或者是1，這對應(yīng)于在所述樣品中可檢出包括SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO :2的氨基酸序列的蛋白，亦或是0，這對應(yīng)于在所述樣品中不可檢出包括SEQ ID N0:1和/或SEQ IDNO 2的氨基酸序列的蛋白。
53.根據(jù)權(quán)利要求19至51的任一項所述的方法，其中所述步驟c)的參比值對應(yīng)于一個不具有可檢出的包括SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO :2的氨基酸序列的蛋白的參比樣品 O
54.根據(jù)權(quán)利要求19至53的任一項所述的方法，其中步驟c)的所述參比值是0。
55.根據(jù)權(quán)利要求19至M的任一項所述的方法，其中所述參比值是選自下組，其組成為一種細(xì)胞質(zhì)部分、一種細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)度、一種細(xì)胞質(zhì)部分與一種細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)度的一種函數(shù)、一種細(xì)胞核部分、一種細(xì)胞核強(qiáng)度、以及一種細(xì)胞核部分與一種細(xì)胞核強(qiáng)度的一種函數(shù)。
56.根據(jù)權(quán)利要求19至55的任一項所述的方法，其中所述參比值是選自下組，其組成為一種細(xì)胞核部分、一種細(xì)胞核強(qiáng)度、以及一種細(xì)胞核部分與一種細(xì)胞核強(qiáng)度的一種函數(shù)。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述參比值是一種細(xì)胞核部分。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述參比值是25%或更少的細(xì)胞核部分。
59.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述參比值是一種細(xì)胞核強(qiáng)度。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述參比值是一種弱的細(xì)胞核強(qiáng)度或更低。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述參比值是無細(xì)胞核強(qiáng)度。
62.根據(jù)權(quán)利要求19以及權(quán)利要求25至61的任一項所述的方法，其中，如果所述樣品值高于或等于所述參比值，則該方法進(jìn)一步包括以下步驟e)則得出結(jié)論，即對于所述受試者的所述預(yù)測好于所述參比預(yù)測。
63.用于進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求19至62的任一項所述的方法的試劑盒，該試劑盒包括a)一種根據(jù)權(quán)利要求1至16的任一項所述的親和配體；以及b)用于對所述親和配體的量進(jìn)行定量所必需的試劑。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的試劑盒，其中所述親和配體包括一種選自下組的標(biāo)記物， 該組的組成為熒光染料類和金屬類、發(fā)色染料類、化學(xué)發(fā)光化合物類和生物發(fā)光蛋白類、 酶類、放射性同位素類、顆粒以及量子點。
65.根據(jù)權(quán)利要求63至64的任一項所述的試劑盒，其中用于對所述親和配體的所述量進(jìn)行定量所必需的所述試劑包括能夠識別所述親和配體的一種第二親和配體。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的試劑盒，其中所述第二親和配體包括一種選自下組的標(biāo)記物，該組的組成為熒光染料類或金屬類、發(fā)色染料類、化學(xué)發(fā)光化合物類和生物發(fā)光蛋白類、酶類、放射性同位素類、顆粒以及量子點。
67.根據(jù)權(quán)利要求63至66的任一項所述的試劑盒，進(jìn)一步包括至少一種用于提供一個參比值的參比樣品。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的試劑盒，其中至少一種參比樣品是一種不包含可檢出的包括SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的氨基酸序列的蛋白的組織樣品。
69.根據(jù)權(quán)利要求67至68的任一項所述的試劑盒，其中至少一種參比樣品包含包括 SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的氨基酸序列的蛋白。
70.根據(jù)權(quán)利要求67至69的任一項所述的試劑盒，其中至少一種參比樣品包括對應(yīng)于 25%或更少的細(xì)胞核部分的一個量的蛋白，該蛋白包括SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO 2 的氨基酸序列。
71.根據(jù)權(quán)利要求67至70的任一項所述的試劑盒，其中至少一種參比樣品包括對應(yīng)于一個弱的細(xì)胞核強(qiáng)度或更低的一個量的蛋白，該蛋白包括SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO 2的氨基酸序列。
72.根據(jù)權(quán)利要求67至71的任一項所述的試劑盒，其中至少一種參比樣品包括對應(yīng)于無細(xì)胞核強(qiáng)度的一個量的蛋白，該蛋白包括SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的氨基酸序列。
73.根據(jù)權(quán)利要求67至72的任一項所述的試劑盒，其中至少一種參比樣品包括對應(yīng)于一個值高于所述方法的所述參比值的一個量的蛋白，該蛋白包括SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO 2的氨基酸序列。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的試劑盒，其中至少一種參比樣品包括對應(yīng)于強(qiáng)細(xì)胞核強(qiáng)度的一個量的蛋白，該蛋白包括SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO :2的氨基酸序列。
75.根據(jù)權(quán)利要求73所述的試劑盒，其中至少一種參比樣品包括對應(yīng)于75%或更高的細(xì)胞核部分的一個量的蛋白，該蛋白包括SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO :2的氨基酸序列。
76.根據(jù)權(quán)利要求67至75的任一項所述的試劑盒，該試劑盒包括一種第一參比樣品，該參比樣品包括對應(yīng)于一個值(陽性參比值)高于所述方法的所述參比值的一個量的蛋白，該蛋白包括SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO :2的氨基酸序列； 以及一個第二參比樣品，該樣品包括對應(yīng)于一個值(陰性參比值)低于所述方法的所述參比值的一個量的蛋白，該蛋白包括SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO 2的氨基酸序列。
77.根據(jù)權(quán)利要求67至76的任一項所述的試劑盒，其中所述一種或多種參比樣品是一種或多種組織樣品。
78.一種分離的多肽，該多肽由47個或更少的氨基酸殘基組成并且包括SEQ ID NO=I 和/或SEQ ID NO 2的氨基酸序列。
79.根據(jù)權(quán)利要求78所述的多肽，包括SEQID NO :1的氨基酸序列。
80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的多肽，包括氨基酸序列SEQID N0:3和/或SEQ ID NO :4。
81.根據(jù)權(quán)利要求79和80的任一項所述的多肽，該多肽包括選自下組的一種氨基酸序列，該組的組成為=SEQ ID NO 6-14以及31-37。
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的多肽，該多肽由選自下組的一種氨基酸序列組成，該組的組成為:SEQ ID NO 6-14 以及 31-37。
83.根據(jù)權(quán)利要求78所述的多肽，包括SEQID NO :5的氨基酸序列。
84.根據(jù)權(quán)利要求78或83所述的多肽，該多肽包括選自下組的一種氨基酸序列，該組的組成為:SEQ ID NO :52-59 以及 78-82。
85.根據(jù)權(quán)利要求78或83所述的多肽，該多肽由選自下組的一種氨基酸序列組成，該組的組成為SEQ ID NO :52-59以及78-82。
86.根據(jù)權(quán)利要求78至85的任一項所述的多肽，該多肽由34個或更少的氨基酸殘基組成。
87.根據(jù)權(quán)利要求86的任一項所述的多肽，該多肽由17個或更少的氨基酸殘基組成。
88.根據(jù)權(quán)利要求78至87的任一項所述的多肽在免疫中作為一種抗原的用途。
89.根據(jù)權(quán)利要求78至88的任一項所述的多肽在多克隆或多克隆抗體的制備中的用
90.根據(jù)權(quán)利要求78至89的任一項所述的一種多肽作為一種抗原的用途。
91.根據(jù)權(quán)利要求78至89的任一項所述的一種多肽用于免疫的用途。
92.根據(jù)權(quán)利要求91所述的用途，其中該免疫是一種非人類哺乳動物的免疫。
93.根據(jù)權(quán)利要求78至89的任一項所述的一種多肽在抗體的制備中的用途。
94.根據(jù)權(quán)利要求93所述的用途，其中所述抗體是單克隆的或多克隆的。
95.根據(jù)權(quán)利要求78至89的任一項所述的多肽在選擇或純化一種親和配體中的用途。
96.根據(jù)權(quán)利要求95所述的多肽的用途，其中該親和配體是用于建立一個對于患有結(jié)腸直腸癌的哺乳動物受試者的預(yù)測的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能夠選擇性地與一種表位序列相互作用的親和配體，該表位序列包括47個或更少的氨基酸并且包括SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的氨基酸序列。此外，它涉及一種包括該表位序列的多肽并且涉及該親和配體和該多肽的用途。
文檔編號C07K14/47GK102171241SQ200980138943
公開日2011年8月31日 申請日期2009年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月6日
發(fā)明者F·龐頓, K·杰斯托姆, M·烏倫 申請人:阿特拉斯抗體有限公司