專利名稱：檢測人類免疫缺陷病毒的方法及試劑盒的制作方法
檢測人類免疫缺陷病毒的方法及試劑盒所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及檢測臨床樣品中艾滋病病原體人類免疫缺陷病毒(Human Imraimodificidncy Virus, HIV) HIV I型(HIV-1)的方法及試劑盒，特別是涉及以實(shí)時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng) 技術(shù)早期診斷HIV-l感染的方法及所使用的試劑盒。發(fā)明背景艾滋病的全稱叫獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS), 是一種由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的傳染病。HIV主要型別為HIV-1和HIV-2，艾滋病 大多由HIV-1引起。HIV感染人體后特異性地侵犯并損耗T淋巴細(xì)胞造成肌體細(xì)胞免疫損傷。 HIV感染的初期，感染者可以是無癥狀的病毒攜帶狀態(tài)。但感染發(fā)展到一定程度，感染者的 免疫系統(tǒng)受到相當(dāng)程度的損害時，病人將出現(xiàn)持續(xù)性全身淋巴結(jié)腫大綜合征(PGL)和艾滋病 相關(guān)綜合征(ARC),最后并發(fā)各種嚴(yán)重機(jī)會性感染和惡性腫瘤，成為艾滋病。目前無特效治 療，病死率極高。自1981年在美國洛杉磯首次發(fā)現(xiàn)艾滋病病例后，艾滋病正在全世界迅速流行。據(jù)世界衛(wèi) 生組織2004年12月報(bào)告提供的數(shù)據(jù)，全世界感染艾滋病病毒者達(dá)3940力'，其中僅2004年 死于艾滋病的人數(shù)就達(dá)到310力。現(xiàn)在艾滋病流行正以每天8500個新感染者的速度發(fā)展。尤 其是占亞洲人口近50%的中國、印尼和越南的艾滋病病毒感染人數(shù)急劇增長。在中國，自從1985年6月發(fā)現(xiàn)第--例艾滋病患者以來，艾滋病病毒己蔓延到所有31 個省、自治區(qū)和直轄市。到2004年12月底，中國累積報(bào)告HIV感染人數(shù)89067人，AIDS 病例數(shù)20786例，死亡5024人。據(jù)中國CDC及WHO預(yù)測，HIV/AIDS實(shí)際感染人數(shù)約84萬 人。1999年，分子流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)我國已有HIV-2型病毒存在，并首次從基因水平上確認(rèn) 我國存在HIV-1和HIV-2的混合感染，但目前我國存在的主要是HIV-1型感染，HIV-2型感染目前只有個別病例報(bào)道。HIV感染的病毒學(xué)診斷技術(shù)一般包括病毒分離和病毒成份(如抗原、核酸)的檢測。實(shí)驗(yàn) 室檢査包括病毒分離培養(yǎng)、病毒核酸檢測、病毒蛋白抗原檢測、HIV抗體檢測等方法。
從早期的病毒分離培養(yǎng)，到FDA批準(zhǔn)了第 一個HIV抗體篩選試劑并用應(yīng)用于獻(xiàn)血員篩選 形成第一代的抗體檢測試劑以來(1985年3月1 H)，迄今已經(jīng)發(fā)展到第四代HIV抗體/抗原 試劑，窗口期從最初3個月縮短到大約兩周。提高檢測的敏感性，縮短窗口期是HIV抗體檢 測試劑持續(xù)發(fā)展的方向。利用PCR檢測病毒RNA具有早期發(fā)現(xiàn)、靈敏度和特異性高等優(yōu)點(diǎn)。RT-PCR方法雖然靈敏并 能在早期對病毒進(jìn)行檢測，但是因其歩驟繁瑣且容易造成污染，從而使其使用上受到一定限 制。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是上世紀(jì)90年代中期基于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)發(fā)展起來的。與傳統(tǒng)的(終 點(diǎn)檢測)PCR技術(shù)相比，實(shí)時定量監(jiān)測方法不僅實(shí)現(xiàn)了低拷貝數(shù)靶多核苷酸的定量分析，而且 還具有特異性和精確度更強(qiáng)、自動化程度更高以及污染的可能性更小等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)時熒光PCR技術(shù)是在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系中加入熒光標(biāo)記探針，使用一種帶有核電偶聯(lián)裝置(CCD)的PCR擴(kuò)增儀。通過檢測熒光信號的動態(tài)變化實(shí)時反映PCR的每個循環(huán)的擴(kuò)增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光。收集檢測熒光信號，并通過軟件分析匯總到工作站得到擴(kuò)增曲線。通過對擴(kuò)增曲線以及循環(huán)閾值(Ct)的分析，即可以對檢測樣品進(jìn)行定性和定量分析。實(shí)時熒光PCR將DM擴(kuò)增與檢測過程融合為--體動態(tài)檢測DNA擴(kuò)增的全過程，省掉了 PCR后處理過程大大縮短了結(jié)果分析時間，使得該方法更加快捷、方便。由于實(shí)時熒光PCR采取一種封閉的檢測模式，從而減少了氣溶膠污染和山此的造成的假陽性。因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。TaqMan PCR技術(shù)是實(shí)時熒光PCR的一種(Mackay 1M " a/. Rea卜time PCR in virology..Nucleic Acids Res. 2002 5;30(6):1292-1305; Lie, Y.S.， Petropoulos, C. J. ， Advancesin quantitative PCR technology: 5' nuclease assays. Current Opinion in Biotechnology1998. 9， 43 - 48.)。與傳統(tǒng)的PCR相對比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團(tuán)，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)。如果擴(kuò)增過程中有靶序列的存在，擴(kuò)增的過程中探針分子逐漸被水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光信號。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。利用新興的熒光定量技術(shù)，能夠?qū)颖具M(jìn)行定量檢測，對病情檢測尤其是處在"窗口期" 病人的檢測十分有利。研究表明，感染5天就能在外周血中檢出HIV RNA，因此在現(xiàn)有基礎(chǔ) 上檢測HIV RNA可以實(shí)現(xiàn)進(jìn)一歩早期診斷。HIV熒光定量檢測在艾滋病輔助診斷、病程監(jiān)控、指導(dǎo)治療方案及療效判定、預(yù)測疾病進(jìn)程等方面均具有非常重要的作用。 然而，在目前國內(nèi)外已經(jīng)批準(zhǔn)用于HIV-1的核酸檢測的試劑中，尚未使用套式PCR方法。 本發(fā)明選取人類免疫缺陷病毒(HIV-1)基因組中高度保守的單拷貝基因序列為擴(kuò)增耙區(qū)域， 設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針進(jìn)行靶序列擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度達(dá)148bp。使用逆轉(zhuǎn)錄體系將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，對cDNA進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增。然后，利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，定量檢 測血清樣本中人類免疫缺陷病毒(HIV-1) RNA。臨床考核結(jié)果表明，本發(fā)明的方法可用于人 類免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的輔助診斷和艾滋病病人藥物治療的療效監(jiān)控。由于臨床上HIV-1的病毒載量通常較低(100 10000IU/ml)，因此本發(fā)明應(yīng)用濃縮裂解 病毒和靈敏的套式PCR方法，巧妙地解決了短時間內(nèi)準(zhǔn)確定量的方法學(xué)問題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的產(chǎn)品靈敏度達(dá)到100IU/ral。眾所周知，在使用已知的實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測和定量分析臨床樣品中某特定靶核酸 的實(shí)踐中，為了減少和避免檢測結(jié)果的假陰性或假陽性，提高定量分析的準(zhǔn)確性， 一個關(guān)鍵 性的基本技術(shù)環(huán)節(jié)是如何基于已知的靶多核苷酸序列設(shè)計(jì)并制備適當(dāng)?shù)囊锖凸押塑账崽?針。本發(fā)明人在以往多年從事PCR技術(shù)特別是實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，將該技術(shù) 應(yīng)用于H工V-l的基因組多核苷酸的檢測和定量分析，成功地完成了本發(fā)明。發(fā)明的目的本發(fā)明的一個目的是提供一種使用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)定量檢測樣品中HIV病毒的方 法，該方法包括(1)提供包括樣品、核酸擴(kuò)增體系，和熒光監(jiān)測體系在內(nèi)的反應(yīng)與檢測混 合物，(2)通過擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增所說的靶多聚核苷酸，(3)使所說的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò) 增的靶多核苷酸間接結(jié)合，(4)確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，(5)根據(jù)循環(huán)反應(yīng)中產(chǎn) 生的熒光量，結(jié)合定量標(biāo)準(zhǔn)曲線確定靶多核苷酸的存在及其相對量(即靶核酸序列的拷貝數(shù))； 其中核酸擴(kuò)增系統(tǒng)包括可與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物，并且熒光實(shí)時監(jiān)測系統(tǒng)包括一 個可與靶多核苷酸特異性結(jié)合的寡核苷酸探針；特征在于所使用的是套式PCR，正向和反向 寡核苷酸外引物分別是5' - GTT AAG GCC (;CC TGT TGG T -3' (SEQ ID NO: l)和5' 一 TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3， (SEQ ID NO: 2)，正向和反向寡核苷酸內(nèi)引物分別是5'— CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3 (SEQ ID NO: 3)，和5， -CCT GCA CTG TAC CCC (XA ATC C-3' (SEQ ID NO: 4)并且所使用的寡核苷酸探針是5' -ACAGC AGTAC AAAT(; GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的樣品是可疑HIV病毒感染者的臨床血液樣 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的靶多核苷酸來自HIV-l病毒。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的核酸擴(kuò)增系統(tǒng)是套式聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)， 并且所說的第 一次擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)是大約重復(fù)15次的聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)；第二次擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán) 是大約重復(fù)35次的聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的核酸擴(kuò)增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、 (b) 2'-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第 -條鏈結(jié)合的正向引物，和(d) 能夠與雙鏈耙多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的熒光實(shí)時檢測體系包括能夠與靶多核苷酸 結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，所說的方法進(jìn)一歩包括(1)確定樣品中的靶多核苷 酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光水平達(dá)到基線以上的固定閾值時所需的閾循環(huán)次數(shù)；(2)將已確定 的樣品中靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中己知量靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，以 計(jì)算出樣品中靶多核苷酸的相對量。本發(fā)明的另一個目的是提供一種使用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)定量檢測臨床樣品中HIV病毒 的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液A、 RNA提取液B、逆轉(zhuǎn)錄酶系、逆轉(zhuǎn)錄酶 反應(yīng)體系、經(jīng)焦碳酸乙二酯處理的純水(DEPCH20)、 PCR擴(kuò)增反應(yīng)液I (用于第一次PCR擴(kuò)增 反應(yīng))、PC財(cái)廣增反應(yīng)液Il (用于第二次PC時廣增反應(yīng))、稀釋液、陰性對照樣品、強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn) 品和RNA陽性對照品，以及加蓋密封的多個試劑瓶或離心管。(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶 或離心管的包裝盒。RNA提取液A是Si02經(jīng)DEPC水處理后，高壓滅菌后4'C保存并分裝的市售標(biāo)準(zhǔn)試劑。RNA提 取液B山GuSCN (異硫氰酸胍)120g， 0. 1M Tris-HC1 (pH 6.4) 100ml 0. 2M， EDTA (PH8. 0) 22ml混合組成，4t保存。PCR反應(yīng)液I由正向和反向寡核苷酸外引物(25pmo]/ul)各O. lul、 2mM dNTPs 5 ul 、 5XRT Buffer 4 ul組成，共18 ul混合，-20。C保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)液II 由正向和反向寡核苷酸內(nèi)引物(25pmol/ul)各0.4ul、熒光探針SEQ ID NO. 3 (20Pmol/ul) 0. 5ul 、 2mM dNTPs 5 ul 、 5XRT Buffer 10 u] 、 ddH20 29. 10. 4ul組成，-20。C保存。根據(jù)本發(fā)明的再-個優(yōu)選實(shí)施方案，所使用的是套式PCR，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增 體系的正向和逆向寡核苷酸外引物分別是5' - GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3' (SEQ 1D NO: l)和5' - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3' (SEQ ID NO: 2)，正向和反向寡核苷 酸內(nèi)引物分別是5' - CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3(SEQ ID NO: 3)'和5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'(SEQ ID N'O: 4)。根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測體系的寡核苷酸探
針是5'-ACAGC AGTAC AAATG GCA〔;T ATTCA TTCAC-3，(SEQ ID NO: 5)。


圖l顯示Std curve窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。針對模板數(shù)為10' l(r拷貝的反應(yīng)體系進(jìn)行TaciMan PCR分析。當(dāng)100拷貝數(shù)為100時，檢測樣品得Ct值在20左右，即檢測下限靈敏度可到達(dá)100拷 貝。繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.01, R = -0.998168。圖2顯示強(qiáng)中弱三個陽性標(biāo)本曲線。三個標(biāo)本的Ct值分別是11.07, 14.11， 17.07;結(jié)合 擴(kuò)增曲線為S形，均能夠判定位陽性。圖3顯示陰性標(biāo)本曲線。三個標(biāo)本的擴(kuò)增曲線為比較平直的折線，與熒光檢測閾值線沒 有交點(diǎn)，或者顯示Ct值為30并且擴(kuò)增曲線不具有S形特征。圖4顯示5個臨床陽性標(biāo)本曲線，CT值均小于:K)，擴(kuò)增曲線為S形，均能夠判定為陽性。發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容本發(fā)明涉及實(shí)時定量熒光PCR方法及試劑盒，特別是涉及實(shí)時定性定量熒光聚合酶鏈反應(yīng) 方法及其試劑盒在HIV病毒感染的早期實(shí)驗(yàn)室診斷中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種使用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)定性定量檢測臨床樣品中HIV病毒存在的 方法，該方法包括(1)提供包括HIV病毒基因組核酸的樣品、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、核酸擴(kuò)增 體系，和熒光監(jiān)測體系的反應(yīng)與檢測混合物，(2)通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到PCR擴(kuò)增的靶DNA序 歹ij， (3)通過擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增所說的靶多核苷酸，(4)使所說的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的 靶多核苷酸間接結(jié)合，(5)確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，(6)分析擴(kuò)增循環(huán)后產(chǎn)生的 熒光量以確定靶多核苷酸的存在及其相對量；其中核酸擴(kuò)增體系包括可與靶多核苷酸結(jié)合的 寡核苷酸引物，并且熒光檢測體系包括可與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸探針；特征在于所使 用的是套式PCR，正.向和反向寡核苷酸外引物分別是5' - GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3' (SEQ ID NO: l)和5' — TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3' (SEQ ID NO: 2)，正向和反 向寡核苷酸內(nèi)引物分別是5' - CAA TCC CCA AA(; TCA AG(; AGT-3(SEQ ID NO: 3)'和 5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3' (SEQ ID NO: 4)并且所使用的寡核苷酸探針是5' -ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。與基于擴(kuò)增反應(yīng)完成后進(jìn)行單一終點(diǎn)檢測的傳統(tǒng)PCR方法不同，實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)方 法可以在擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程中隨時監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而大大提高了定量檢測的準(zhǔn)確性和 精密度。如眾所周知，實(shí)時熒光定量PCR是在PCR擴(kuò)增中，同時加入引物和5' 、 3'末端分別 標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(例如6-F層amidite羧基熒光素6)和熒光淬滅基團(tuán)(例如6-羧基四甲基若丹明)的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒有與靶序列互補(bǔ)結(jié)合，其序列保持完整，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號將被淬滅基團(tuán)吸收，所以沒有熒光信號產(chǎn)生；而當(dāng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行時，DNA聚合酶的5' -3'外切酶活性將降解熒光探針，導(dǎo)致熒光報(bào)告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)分離，因而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收并記求到熒光信號。每擴(kuò)增一條DNA鏈即有 一個熒光分子產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同歩，實(shí)時地監(jiān)測整個PCR反應(yīng)進(jìn)程，并可借助標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知靶多核苷酸(模板)進(jìn)行定量分析。與通常的實(shí)時定量熒光PCR技術(shù)相似，本發(fā)明的檢測樣品中HIV病毒基因組雙鏈靶多核苷酸存在的方法中同樣包括(1)提供包括(a)待檢樣品，(b)耐熱DNA聚合酶和(c) 2-脫氧核苷三磷酸(dNTP)的擴(kuò)增反應(yīng)體系，以及包括(a)能夠與待檢雙鏈靶多核苷酸的第--條互補(bǔ)鏈結(jié)合的正向引物，(b)能夠與待檢雙鏈耙多核苷酸的第二條互補(bǔ)鏈結(jié)合的反向引物，以及(c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的任一條鏈結(jié)合并且兩末端分別標(biāo)記有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬火基團(tuán)的寡核苷酸探針的熒光檢測體系；(2)通過一次或多次聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增所說的靶多核苷酸；(3)退火后使所說的熒光發(fā)生基團(tuán)通過探針與靶多核苷酸結(jié)合并產(chǎn)生熒光信號；(4)檢測并確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量；(5)分析一次或多次擴(kuò)增循環(huán)所發(fā)出的熒光量，以檢測耙多核苷酸的存在；特征在于其中所說的靶多核苷酸是HIV病毒基因組多核苷酸，所使用的PCR技術(shù)是套式PCR技術(shù)，TF.向和反向寡核苷酸外引物分別是5' - GTT AAG GCC GCCTGT TGG T -3'(SEQ ID NO: l)和5' - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3'(SEQ ID NO:2)，正向和反向寡核苷酸內(nèi)引物分別是5' -CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3(SEQIDNO: 3)，和5' -(XT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'(SEQ ID NO: 4)并且所使用的寡核苷酸探針是5，-ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。如前所述，為了檢測出臨床樣品中可能存在的所有HIV病毒株，并能夠準(zhǔn)確有效地將HIV 病毒感染與人乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒、乙型肝炎黃 病毒、以及甲型肝炎病毒等其他常見相關(guān)病毒等感染鑒別開來，設(shè)計(jì)并制備實(shí)現(xiàn)這些目的的 寡核苷酸引物和探針是一個非常重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。為此，我們在使用適當(dāng)?shù)暮怂岱治鲕浖?己知的HIV—1病毒的基因組核苷酸序列進(jìn)行分析，進(jìn)一歩使用適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件(例如 Primer Express 2)選擇并設(shè)計(jì)具有下示核苷酸序列的寡核苷酸引物l: 5' - GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3' (SEQ ID NO: 1)、引物2: 5' - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3， (SEQ ID NO: 2)，引物3: 5' - CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3(SEQ ID NO: 3)'， 引物 4: 5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3' (SEQ ID NO: 4);以及具有下示序列的寡核 苷酸探針5'-ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。
其中引物1位于來自加拿大的HIV-1病毒株CANB6FULL (基因存取號為AY779556)的 3885-3903位，包括19個堿基；引物2位于4091-4112位，含22個堿基;引物3位于3938-3958 位，含21個堿基；引物4位于4079-4100位，含22個堿基；熒光探針FPHIV位于4029-4058 位，含30個堿基，擴(kuò)增區(qū)段均位于HIV基因的POL蛋白的編碼區(qū)。外引物所對應(yīng)的擴(kuò)增區(qū)段長度為228bp。內(nèi)引物所對應(yīng)的擴(kuò)增區(qū)段長度為163bp?？墒褂肈NA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速液相層析法(FPLC)純化后 進(jìn)行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別在其5'端標(biāo)記作為熒光發(fā)生基團(tuán) (報(bào)道基團(tuán))的6-FAM amidite，并在其3'端標(biāo)記借助活性連接臂偶聯(lián)的作為熒光淬滅或抑 制基團(tuán)的TAMRA。以FPLC層析法純化熒光標(biāo)記的探針。然后，使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝 膠(20%)電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針。使用常規(guī)RNA提取方法或市售的RNA提取試劑盒，從得自受試者的早期血清樣品中提取 RNA，然后使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(在每微升由250mMTris-HCL(pH8. 0)、 250mMKCL、 20mM MgCU 和50 mM DTT組成的緩沖液中含有50單位mMLV酶和l單位RNA酶)將所提取的RNA轉(zhuǎn)化成。DNA， 并將此逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于繼后的PC財(cái)廣增。在含有引物1和2 (各20pmo1)、 DNA模板(PCR擴(kuò)增靶序列)、dNTP (lOrnM)、耐熱DNA聚合 酶(Plantini, DNA聚合酶)、PCR緩沖液和水的反應(yīng)體系中，使用ABI 7000型或其他結(jié)構(gòu)類 型的自動熒光檢測熱循環(huán)儀上對如上得到的(DNA序列進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增。所使用的反應(yīng)條 件是50°C—5分鐘；93'C預(yù)變性3分鐘；93°C 30秒一55°C 30秒一72°C 30秒，共進(jìn)行15個循 環(huán)。在含有引物3和4 (各20 pmol)、核酸探針、DNA模板(PCR擴(kuò)增靶序列)、dNTP (10mM)、 耐熱DNA聚合酶(Plantinium DNA聚合酶)、PCR緩沖液和水的反應(yīng)體系中，使用ABI 7000型 或其他結(jié)構(gòu)類型的自動熒光檢測熱循環(huán)儀上對如上得到的t.DNA序列進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。使 用PE GeneAmp 5700 (AB1 Prism 7300、 ABI Prism 7000、 DA—7600、 Line Gene、 iCycler 參照此方法)所使用的反應(yīng)條件是93'C預(yù)變性2分鐘后，9、TC 45秒，55°C l分鐘，進(jìn)行IO 次循環(huán)；然后93。C 30秒，55°C 45秒，進(jìn)行30個循環(huán)。使用Light Cycler所使用的反應(yīng)條件 是93t 2分鐘；93°C 5秒57°C 45秒，共40個循環(huán)；最后置37。C下保溫1秒。1. 陰性結(jié)果判定如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值為空白，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果判為樣品的HIV RNA含量小于檢測極限。2. 陽性結(jié)果判定如果增長曲線呈S型曲線且CT值〈40，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果按以下方法判斷 反應(yīng)完成后，借助裝置上配置的自動分析系統(tǒng)分析結(jié)果。在本研究中，對PEGeneAmp 5700(ABI Prism 7300、 ABI Prism 7000、 DA—7600、 Line Gene、 iCycler參照此方法)而由、
如果增長曲線不呈S型或循環(huán)閾(Ct)值等于30，結(jié)果即為陰性；如果增長曲線呈S型且Ct值 小于30，結(jié)果則為陽性。對Light Cycle而言，如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值為空白，結(jié) 果即為陰性；如果增長曲線呈S型曲線且CT值小于40，結(jié)果則為陽性。其中以反應(yīng)的前15個循 環(huán)所產(chǎn)生的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置為3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo) 準(zhǔn)偏差的10倍。 一般說來，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系。起始 拷貝數(shù)越多，Ct值越小。因?yàn)樵跀U(kuò)增反應(yīng)的Ct值之前的階段，擴(kuò)增系統(tǒng)中的酶、引物、探針 和dNTPs均大大過量，而且系統(tǒng)的p值和離子濃度等也相對穩(wěn)定，所以此時擴(kuò)增反應(yīng)的效率是 一個與模板數(shù)無關(guān)的飽和定值。與Ct值相關(guān)的只有起始模板數(shù)(多聚核苷酸樣品的拷貝數(shù)) 和與樣品無關(guān)的PCR系統(tǒng)效率。可利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中以靶多核苷酸起始拷貝數(shù)的對數(shù)為 橫坐標(biāo)，并以如上測得的Ct值為縱坐標(biāo)。獲得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可從基于平行 實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線上得知其起始拷貝數(shù)的對數(shù)，然后計(jì)算出該靶多核苷酸的起 始拷貝數(shù)(當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)達(dá)到Ct值即初始進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期時，Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一靶多 核苷酸在不同時間擴(kuò)增或同一時間在不同管內(nèi)擴(kuò)增所得到的Ct值總是恒定的)。也就是說，為 了基于上述的擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果推算出靶多核苷酸的量(起始拷貝數(shù))，本發(fā)明的方法還進(jìn)一歩包 括(1)確定樣品中的靶多核苷酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值時所需的 閾循環(huán)次數(shù)；(2)將已確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知量靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，從而計(jì)算出樣品中靶多核苷酸的量。本發(fā)明的另一個目的是提供一種使用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)定量檢測臨床樣品中HIV病毒的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液A、 RNA提取液B、 HIV-l逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液、逆轉(zhuǎn)錄酶系、經(jīng)焦碳酸乙二酯處理的純水(DEPC H20)、由己知常規(guī)成分組成的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液I (第一次PCR反應(yīng)液)和II (第二次PCR反應(yīng)液)、陰性質(zhì)控品、HIV臨界陽性質(zhì)控品)HIV強(qiáng)陽性質(zhì)控品和HIV陽性定量參考品，以及加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增體系的if.向和逆向外引物分別是5' - GTT AAG GCC GCC TGT T(;G T -3' (SEQ ID NO: l)和5， — TAC TAT TCT TTC CCCTGCACTG-3' (SEQIDN0: 2)， if.向和反向寡核苷酸內(nèi)引物分別是5' - CAA TCC CCA AAGTCA AGG AGT-3(SEQ ID NO: 3)'禾P 5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'(SEQ ID NO:4)根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測體系的寡核苷酸是 5'-aCAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)。
如甜所述，為了檢測出臨床樣品中可能存在的所有HIV病毒變異體，并能夠準(zhǔn)確有效地將 HIV病毒感染與人乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒、乙型肝炎 黃病毒、以及甲型肝炎病毒等其他常見相關(guān)病毒等感染鑒別開來，本發(fā)明基于HIV-l和相關(guān)病 毒基因組核苷酸序列的同源性比較，特別設(shè)計(jì)了適用本發(fā)明檢測試劑盒的寡核苷酸引物和探 針。使用這些引物和探針完成的實(shí)時定量檢測，大大減小了HIV病毒多核苷酸檢測的假陽性和假陰性。我們的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明檢測Hiv病毒基因組核苷酸的精確度幾乎為iooy。，靈敏度達(dá)到100個拷貝/mJ。值得特別說明的是，為了確保本發(fā)明的HIV病毒檢測方法的準(zhǔn)確性，我們使用了根據(jù)已知 的HIV病毒RNA序列合成的單鏈DNA作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。并且，還使用攜帶有HIV病毒核苷酸(,.DNA) 序列的重組質(zhì)粒作為DNA定量檢測標(biāo)準(zhǔn)品。借助這些額外標(biāo)準(zhǔn)品制作所謂的外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)曲 線，以進(jìn)一歩提高本發(fā)明試劑盒的檢測精確度和準(zhǔn)確性。實(shí)施例實(shí)施例l: HIV檢測試劑盒及其使用(1) 制備包括下列組成成分的試劑盒RNA提取液A (100 ul /管)l管、RNA提取液B (4000 ul /管)l管、H1V-l逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(180ri/管)l管、逆轉(zhuǎn)錄酶系(20 ul /管)1管、第一次PCR反應(yīng)管(l人份/管)若干、第二次PCR反應(yīng)管(l人份/管)若干、DEPCH20 (2000 lU/管)l管、強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品(1000 ul /管)l管、臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品(1000ul/管)l管、陰 性對照(1000 "l/管)l管、HIV陽性定量參考品(1X咖/ml， ,1/管)l管、H1V陽性定 量參考品(lXL0'IU/ml，醇l/管)l管、HIV陽性定量參考品axiO'IU/ml， 10W/管)l狩、 HIV陽性定量參考品(lX105IU/ml， 10W/管)l管。(2) 標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存無菌操作取疑似艾滋病人發(fā)病早期的血清標(biāo)本，然后將血 清通過漏斗樣紙杯收集到無菌塑料試管中并置于低溫冰箱(一7(TC或一2(TC)中冷凍保存。 如集中檢驗(yàn)，標(biāo)本需在(TC以下環(huán)境中運(yùn)送并于24小時內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。(3) 檢測歩驟和結(jié)果分析向新的經(jīng)高壓滅菌處理過的O. 5ml離心管中加入10u 1充分混勻的RNA提取液A(RNA提取液 A易沉淀，取樣前需用移液器反復(fù)吸打混勻后吸取)。再加入100u l血清標(biāo)本或陰性或臨界、 強(qiáng)陽性質(zhì)控品，然后加入200w l的RNA提取液B并充分混勻。室溫放置5分鐘后，8000轉(zhuǎn)/分(rpm) 離心1分鐘，小心吸去上清；再次加200W RNA提取液B，充分混勻(用移液器吹打)，8，000rpm 離心1分鐘，小心吸去上清；并用75%的預(yù)冷乙醇(用DEPC水配制)洗沉淀兩次(取75%乙醇4()0ul洗沉淀，充分震蕩混勻，8000轉(zhuǎn)/分(rpm)離心l分鐘后去上清后再用75。/。乙醇400ii l洗-次)，65。C干燥并沉淀10分鐘。其中，配制75%乙醇時須使用試劑盒中提供的焦碳酸二乙酯處 理的純水(DEPC H20)。然后，在沉淀管加入18yl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液以及逆轉(zhuǎn)錄酶系2u ]，震蕩混勻，瞬時(3秒) 離心后37'C放置45分鐘，95'C加熱3分鐘。8000rpm離心l分鐘后，吸取5 y l逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入第 -次PCR反應(yīng)管中進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)。將HIV陽性定量參考品8000rpm離心數(shù)秒，備用。然后分別取PC財(cái)廣增一的擴(kuò)增產(chǎn)物5nl (標(biāo)本或陰性或臨界、強(qiáng)陽性質(zhì)控品)或陽性定量 參考品5w 1加入第二次PCR反應(yīng)管中，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)條件是95"預(yù)變性2 分鐘后，94°C 45秒，55°C l分鐘，進(jìn)行10次循環(huán)；然后93。C 30秒，55°C 45秒，進(jìn)行30 個循環(huán)(使用ABI Prism 7000)。反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)分析參數(shù)使標(biāo)準(zhǔn)曲線(Std curve ) 窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖達(dá)到最佳(即相關(guān)性數(shù)值<-0.95)(參見圖4)。由圖2和圖3可分別看出， 陽性標(biāo)本的熒光曲線與設(shè)定的閾值線有一交點(diǎn)，而陰性標(biāo)本的熒光曲線則低于閾值。最后由 儀器自動分析裝置計(jì)算出的未知標(biāo)本的測定數(shù)值(Qty)，即標(biāo)本中H1V病毒的RNA含量，為2. 07 X 10'IU/ml。實(shí)施例2:使用本發(fā)明的試劑盒檢測150例臨床血清樣品的結(jié)果及分析委托山西山西省疾病預(yù)防控制中心考核了300個臨床標(biāo)本。以Genelabs公司出品的免疫印跡試劑——H1V Blot檢測試劑盒為參考，以羅氏(ROCHE)公司出品的The AMPLICOR H]V-1MONITOR⑧Test (vl.5)試劑復(fù)核。考核結(jié)果表明陽性病例(達(dá)安PCR為陽性)共103個，數(shù)值分布為l. 86X10' — 4.61X105IU/ml。其中102個Western Blot結(jié)果均為陽性，符合，結(jié)果一致；l個Western Blot結(jié)果為陰性，結(jié)果不 一致。陰性病例(達(dá)安PCR為陰性)共197個，其中 178個Western Blot結(jié)果為陰性，結(jié)果一致；19個Western B]ot結(jié)果為陽性，結(jié)果不一致?？偡下?3. 3%。以羅氏(R0CHE)公司出品的The AMPLICOR 1UV-1 MONITOR Test (vl.5)試劑復(fù)核，PCR結(jié)果與復(fù)核結(jié)果一致的判斷為真陰(陽)性，PCR結(jié)果與復(fù)核結(jié)果不--致的判斷為假陰(陽)性。標(biāo)本復(fù)核結(jié)果為20個不一致的標(biāo)本中，真陰性18個，假陽性1個，假陰性1個。因此本次考核假陽性有l(wèi)個，假陰性1個，真陽性102個，真陰性196個。根據(jù)靈敏度計(jì)算公式以Genelabs公司出品的免疫印跡試劑——HIV Blot檢測試劑盒為參考，以羅氏(ROCHE)公司出品的The AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test (vl.5)試劑復(fù)核，本發(fā)明的試劑盒準(zhǔn)確度為99. 33%。而相反，以本發(fā)明的試劑盒為參考，以羅氏(ROCHE)公司出品的The AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test (vl.5)試劑復(fù)核，Genelabs公司出品的免疫印跡試劑——HIV Blot檢測試 劑盒準(zhǔn)確度為94%。以羅氏(ROCHE)公司出品的The AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test (vl.5)試劑復(fù)核，本 發(fā)明的試劑盒準(zhǔn)確度高于HIV Blot檢測試劑盒。 序列表<110〉中山大學(xué)安達(dá)基因股份有限公司<120>檢測HIV的方法及試劑盒<140>〈141〉<160>5〈210〉 1 <211> 19 <212> DNA 〈213〉人工序列 〈220〉〈223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400〉 1gttaaggccg cct.gt:tggt〈210> 2 <211>22 〈212> DNA <213〉人工序列 <220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400〉 2tactattctt tcccctgcac tg<210> 3 〈211>21 〈212〉 DNA 〈213>人工序列 〈220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400> 3caatccccaa agtcaaggag t〈210〉 4<211>22 ' <212> DNA <213〉人工序列 《220〉<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400〉 4cctgceictgt accccccaat cc<210〉 5 <211>30 〈212> DNA 〈213〉人工序列 <220>〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的探針。 <400>5acagcagtac aaatggcagt attcattcac
權(quán)利要求
1、 一種使用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)定量檢測樣品中HIV-1病毒存在的方法，該方法包括(1)提供包括樣品、包括耐熱DNA聚合酶、2，-脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多 核苷酸的第一條鏈結(jié)合的TH向引物和能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物的核 酸擴(kuò)增體系，以及熒光監(jiān)測體系的反應(yīng)與檢測混合物，(2)通過擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增所說的耙 多核苷酸，(3)使所說的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的靶多核苷酸間接結(jié)合，(4)確定熒光發(fā)生 基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，(5)分析擴(kuò)增循環(huán)后產(chǎn)生的熒光量以確定靶多核苷酸的存在及其相對 量；其中核酸擴(kuò)增系統(tǒng)包括可與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物，并且熒光監(jiān)測系統(tǒng)包括可 與耙多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸探針；特征在于所使用的是套式PCR，核酸擴(kuò)增體系中TH向和反 向寡核苷酸外引物分別是5， — GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3' (SEQ ID NO: 1)和5' — TAC TATTCTTTCCCCTGCACTG-3' (SEQ ID N0: 2)，正向和反向寡核苷酸內(nèi)引物分別是5' - CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3(SEQ ID NO: 3)'和5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3， (SEQ ID NO: 4)并且其熒光監(jiān)測體系中所使用的寡核苷酸探針是5' -ACAGC AGTAC AAATG GCAGT 八TTCA TTCAC-3， (SEQ ID NO: 5)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所說的核酸擴(kuò)增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、(b) 2'-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物5' -GTT AAG GCC GCC TGT TGG T -3'，和(d)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物5' - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3' , (e)能與擴(kuò)增子雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的IH向引 物5'-CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3， (f)能與擴(kuò)增子雙鏈靶多核苷酸的第二條 鏈結(jié)合的反向引物5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所說的熒光檢測體系包括能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩 末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針5'-ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中第(5)步驟中所說的方法進(jìn)一歩包括(1)確定樣品 中的耙多核苷酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值時所需的閾循環(huán)次數(shù)；(2) 將已確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知量靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相 比較，以計(jì)算出樣品中靶多核苷酸的量。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所說的靶多核苷酸來自HIV-1病毒。
6、 使用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)定量檢測臨床樣品中HIV-1病毒的試劑盒，改試 劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液A、 RNA提取液B、逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系、經(jīng)焦炭酸乙 二脂處理的純水、擴(kuò)增反應(yīng)液I、擴(kuò)增反應(yīng)液II、稀釋液、陰性對照樣品、強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品和 RNA陽性對照品并加蓋密封的多個試劑瓶或離心管，(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或離心 管的包裝盒，特征在于靶多核苷酸擴(kuò)增體系的正向和反向寡核苷酸外引物分別是5' -GTTAAG GCC GCC TGT TGG T -3，和5， - TAC TAT TCT TTC CCC TGC ACT G-3' ， j下向和反向寡核 苷酸內(nèi)引物分別是5， - CAA TCC CCA AAG TCA AGG AGT-3'和5' -CCT GCA CTG TAC CCC CCA ATC C-3'，并且其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測體系的寡核苷酸探針是5'-ACAGC AGTAC AAATG GCAGT ATTCA TTCAC-3'。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測臨床樣品中艾滋病的病原體人類免疫缺陷病毒(HIV)I型(HIV-1)存在的方法及試劑盒，特別是涉及以實(shí)時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)早期診斷HIV-1感染的方法及所使用的試劑盒。
文檔編號G01N21/00GK101144771SQ20061003759
公開日2008年3月19日 申請日期2006年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月11日
發(fā)明者何蘊(yùn)韶, 周新宇, 鋼 程 申請人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司