抗體進(jìn)化免疫原的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請要求2012年9月12日提交的美國臨時專利申請61/700252、2012年10月 1日提交的美國臨時專利申請61/708466和2013年2月13日提交的美國臨時專利申請 61/764421的優(yōu)先權(quán)，上述每一項(xiàng)申請的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合入本文中。
[0002] 本發(fā)明在美國國立衛(wèi)生研宄院授予的資助AI1067854和AI100645的政府支持下 進(jìn)行。美國政府對本發(fā)明擁有某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明主要涉及HIV-1，尤其涉及廣泛中和HIV-1抗體，和HIV-1免疫原，以及在主 體（例如人）中使用該免疫原來誘導(dǎo)廣泛中和HIV-1抗體的產(chǎn)生的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] HIV-1包膜（Env)廣泛中和抗體（BnAbs)的誘導(dǎo)是HIV-1疫苗研發(fā)的關(guān) 鍵目標(biāo)。BnAbs可以靶向保守區(qū)域，該保守區(qū)域包括構(gòu)象多糖、gp41近膜區(qū)、VI/ V2區(qū)域、gpl20上結(jié)合多糖的C3/V3,和CD4結(jié)合位點(diǎn)（CD4bs) (Walker et al， Science 326:285-289 (2009), Walker et al, Nature 477:466-470 (2011), Burton et al, Science 337:183-186 (2012), Kwong and Mascola, Immunity 37:412-425(2012), ffu et al, Science 329:856-861 (2010), ffu et al, Science 333:1593-1602(2011), Zhou et al， Science 329:811-817(2010)， Sattentau and McMichael， F1000 Biol. Rep. 2:60 (2010), Stamatotos, Curr. Opin. Immunol. 24:316-323 (2012))。大部分成熟 BnAbs 具有一個或多個不尋常的特征（長重鏈第三互補(bǔ)決定區(qū)域[HCDR3s]，對于非-HIV-1抗 原具有多反應(yīng)性，以及高水平的體細(xì)胞突變），表明了對其誘導(dǎo)的大量障礙（Kwong and Mascola,Immunity 37:412-425 (2012), Haynes et al, Science308:1906-1908(2005), Haynes et al, Nat. Biotechnol. 30:423-433 (2012), Mouquet and Nussenzweig,Cell Mol. Life Sci. 69:1435-1445 (2012)，Scheid et al，Nature458:636-640 (2009))。尤其 是，CD4bs BnAbs具有極高水平的體細(xì)胞突變，表明了復(fù)雜或延長的成熟通路（Kwong and Mascola, Immunity 37:412-425(2012), ffu et al,Science 329:856-861(2010), ffu et al，Science 333:1593-1602(2011)，Zhou et al, Science 329:811-817(2010))。此外，難 以發(fā)現(xiàn)以高度親和力與BnAb生殖細(xì)胞系或未突變的共同祖先（UCA)結(jié)合的Env，其是可作 為用于誘導(dǎo) BnAbs 的候選免疫原的特征（Zhou et al, Science 329:811-817(2010)，Chen et al, AIDS Res. Human Retrovirol. 23:11 (2008), Dimitrol, MAbs 2:347-356 (2010), Ma et al, PLoS Pathog. 7:e100 2200 (2001), Pancera et al, J. Virol. 84:8098-8110(2010), Xiao et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.390:404-409(2009))。迄今為止已發(fā)現(xiàn) Evn 結(jié)合至靶向 gp41 近膜區(qū)的 BnAb 的 UCA(Ma et al, PLoS Pathog. 7:e100 2200(2001)，Alam et al, J. Virol. 85:11725-11731 (2011))，以及結(jié)合至一些 Vl/V2BnAb 的 UCA(Bonsignori et al, J. Virol. 85:9998-10009 (2011))，但是目前沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)合 CD4bs BnAb 世系的 UCA 的異源性 Env(Zhou et al, Science 329:811-817(2010)，Xiao et al，Biochem.Biophys. Res. Commun. 390:404-409(2009),Mouquet et al, Nature 467:591-595 (2010), Scheid et al, Science 333:1633-1637(2011)，Hoot et al，PLoS Pathog. 9:e100 3106(2013))， although Envs that bind CD4bs BnAb UCAs should exist (Hoot et al,PLoS ?&七11(^.9:61003106(2013))，雖然結(jié)合0)牝8 81^13此六的￡1^應(yīng)該存在。
[0005] 百分之八十的異性HIV-1感染通過一種傳播/首建（transmitted/founder (T/F)) 病毒建立（Keele et al，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:7552-7557 (2008))。對此病毒的初 始中和抗體反應(yīng)在傳播大約3個月之后產(chǎn)生，并且是株系特異性的（Richman et al，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:4144-4149 (2003), Corti et al, PLoS One 5:e8805 (2010))〇 對于T/F病毒的抗體反應(yīng)驅(qū)使病毒逃逸，以致病毒突變體變得對自身血漿的中和作用 具有抗性（Richman et al，Proc. Natl. Acad. Sci. USA100:4144-4149 (2003)，Corti et al，PLoS One 5:e8805(2010))。該抗體-病毒比賽導(dǎo)致約80%的病人中中和抗體的很 差或受限的特異性；但是，在約20%的病人中，T/F病毒的進(jìn)化的變異體以相當(dāng)大的中 和寬度誘導(dǎo)抗體，例如 BnAbs(Walker et al, Nature 477:466-470(2011)，Bonsignori et al, J.Virol. 85:9998-10009(2011), Corti et al, PLos One 5:e8805 (2010), Gray et al, J. Virol. 85:4828-4840(2011), Klein et al, J. Exp. Med. 209:1469-1479 (2012), Lynch et al, J.Virol.86:7588-7595 (2012), Moore et al, Curr.Opin.HIV AIDS 4:358-363 (2009), Moore et al,J.Virol.85:3128-3141 (2011), Tomaraset al, J. Virol. 85:11502-11519(2011))〇
[0006] 存在許多潛在的分子途徑，通過這些潛在的分子途徑，HIV-1可能進(jìn) 化，并且具有不同中和特異性的抗體的種類可能確實(shí)遵循不同的途徑（Wu et al,Science333:1593-1602 (2011), Haynes et al, Nat. Biotechnol. 30:423-433(2012), Dimitrol, MAbs 2:347-356 (2010), Liao et al, J. Exp. Med. 208:2237-2249 (2011))〇 由于初始自身中和抗體反應(yīng)對于T/F病毒是特異性的（Moore et al，Curr.0pin.HIV AIDS4:358-363 (2009))，可以使一些T/FEnv預(yù)先傾向于結(jié)合在產(chǎn)生BnAb的稀少病人 中觀察到的BnAb的生殖細(xì)胞系或未突變的共同祖先（UCA)。因此，盡管中和寬度通常 是直到慢性感染時才被觀察到，但是在早期感染中在病毒進(jìn)化和正在成熟的BnAb世 系之間的相互作用的精確理解可針對最終導(dǎo)致BnAb發(fā)展的事件提供洞察力。被研宄 的BnAb至今僅僅已從在慢性感染期間被取樣的個體中分離（Walker et al, Science 326:285-289(2009), Burton et al, Science 337:183-186 (2012), Kwong and Mascola, Immunity 37:412-425(2012), Wu et al, Science329:856-861 (2010), Wu et al, Science 333:1593-1602(2011), Zhou et al, Science329:811-817 (2010), Bonsignori et al, J. Virol.85:9998-10009(2011), Corti et al, PLoS One 5:e8805(2010), Klein et al, J. Exp. Med. 209:1469-1479(2012))。因此，從病毒傳播時開始的通過廣泛中和的發(fā)展的病 毒和抗體的進(jìn)化軌跡還是未知的。
[0007]已提出通過靶向未突變的共同祖先（UCA)、BnAb的推定的天然B細(xì)胞 受體開始的疫苗策略，其具有相關(guān)的Env免疫原以引發(fā)具有最終發(fā)展寬度的潛 力的抗體世系0^16七&1，5(^61?^ 333:1593-16〇2(2〇11)，他711686七31，恥七. Biotechnol. 30:423-433 (2012), Scheid et al, Nature 458:636-640 (2009), Chen et al,AIDS Res. Human Retrovirol.23:11 (2008), Dimitrol, MAbs 2:347-356(2010), Ma et al, PLoS Pathog. 7 : e100 2200 (2001) , Xiao et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 390:404-409(2009), Alam et al, J. Virol. 85:11725-11731 (2011), Mouquet et al, Nature467:591-595 (2010))。隨后將是用特異性選出以刺激產(chǎn)生BnAb的細(xì)胞突變通路 的Env免疫接種。本策略的兩個方面都已證明是具有挑戰(zhàn)性的，這是因?yàn)槿鄙倌軌蚺cUCA 相互作用的特異性Env和BnAb的早期中間（I)抗體的知識。
[0008] 本發(fā)明至少部分產(chǎn)生于導(dǎo)致來自非洲病人的CH103⑶4bs BnAb克隆性世系CH505 的分離的研宄，其從急性HIV-1感染隨著BnAb發(fā)展。本研宄顯示了 CH103BnAb世系比大 多數(shù)其他CD4結(jié)合位點(diǎn)BnAb較少地突變，并且可能在早至HIV-1感染14周后就能被第一 次檢測到。通過該世系中的抗體的早期自身中和引發(fā)了病毒逃逸，但是在表位區(qū)域中和附 近的快速和廣泛的Env進(jìn)化在獲取定義為異源性病毒的中和的血漿抗體中和寬度之前。 CH103Fab和gpl20核心的共晶結(jié)構(gòu)分析證實(shí)了抗體中和的新穎的環(huán)結(jié)合模式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明主要涉及HIV-1和廣泛中和HIV-1抗體。更具體地，本發(fā)明涉及HIV-1免 疫原和包括其的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在主體（例如人）中誘導(dǎo)廣泛中和HIV-1抗體 的產(chǎn)生的方法，以及適合在該方法中使用的化合物和組合物。
[0010] 本發(fā)明的目的和優(yōu)勢將由下列說明而清楚表明。
【附圖說明】
[0011] 圖1A-1D。在供體CH505中的中和寬度的發(fā)展和抗體的分離。圖1A，顯示的是HIV-1 病毒RNA拷貝和縱向血漿樣品與HIV-1YU2核心gpl20、RSC3和陰性對照ARSC3蛋白的反 應(yīng)性。圖1B，使用第136周的PBMC來篩分CD19+、CD20+、IgG+、RSC3+和RSC3 A 371廠記憶B 細(xì)胞（〇. 198% )。以橙、藍(lán)和綠點(diǎn)表示的細(xì)胞產(chǎn)生mAb CH103、CH104和CH106,如通過索引 篩分來鑒定。圖1C，顯示的是CH103抗體的HIV-1中和強(qiáng)度和寬度。通過鄰接法（neighbor joining method) (NJ tree PHYLIP package software)創(chuàng)建的代表主要循環(huán)進(jìn)化枝的 196 個HIV-lEnvs的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹根據(jù)通過CH103的中和病毒的IC50染色。圖1D，通過顯示 的HIV-1抗體的CH103結(jié)合至YU2gpl20的交叉競爭，以及可溶性⑶4-Ig在ELISA中被確 定。
[0012] 圖2A-2D。隨出現(xiàn)的時間的CH103-克隆家族，VHDJH突變和HIV-lEnv反應(yīng)性。來 自分選的單個記憶B細(xì)胞和焦磷酸測序的V HDJH(圖2A)和VJJ圖2B)序列的系統(tǒng)發(fā)育。使 用DNA序列和http://www. ebi. ac. uk/Tools/phvlogenv/的EBI生物資訊服務(wù)器作圖，使 用dnaml最大可能性法進(jìn)行祖先重建。使用鄰接法闡明在克隆歷史的情況下取樣日期和讀 數(shù)豐富度的一致性。在V H單系進(jìn)化枝并入單個分支的時點(diǎn)，突變頻率顯示在右邊。分離的 成熟抗體是紅色的，來自于焦磷酸測序的序列是黑色的。至被觀察的成熟抗體的推斷的進(jìn) 化途徑為粗體。圖2C，具有推測的中間體的CH103世系（圓圈，11-4、17和18)，突變的V H 位點(diǎn)百分比和時間（藍(lán)色）被表示出來。圖2D，抗體對自身CH505(左框）和異源B. 63521 的結(jié)合親和力（Kd，nM)通過SPR測量（右框）。
[0013] 圖3A-3D。在復(fù)合體中的具有HIV-lgpl20的外部結(jié)構(gòu)域（0D)的抗體CH103的結(jié) 構(gòu)。圖3A，具有g(shù)pl20多肽的復(fù)合體的總體結(jié)構(gòu)用紅條帶描繪，CH103作為分子表面顯示 (重鏈為綠色，輕鏈為藍(lán)色）。圖3B，被CH103連接的0D (紅色）和被CH103連接的核心 gpl20(灰色）的疊加，多肽以條帶表現(xiàn)形式顯示。圖3C，0D (紅色）上的CH103表位（綠 色），初始CD4結(jié)合位點(diǎn)疊加（黃色邊界）在表面表現(xiàn)形式上。圖3D，結(jié)晶的gpl20的外部 結(jié)構(gòu)域的序列比對顯示在第一行，多樣的HIV-lEnv被CH103識別。第二結(jié)構(gòu)單元在比對上 用灰色虛線標(biāo)記，表示無規(guī)則區(qū)域。黃色或綠色的標(biāo)志表示gpl200D分別接觸⑶4和CH103， 開口圓表示主鏈接觸，帶射線的開口圓表示側(cè)鏈接觸，實(shí)心圓表示主鏈和側(cè)鏈接觸兩者。
[0014] 圖4A-4D。CH103互補(bǔ)位、關(guān)鍵殘基和所需的免疫前驅(qū)體。圖4A，具有CH103的可 變結(jié)構(gòu)域的復(fù)合體的總體結(jié)構(gòu)以條帶表現(xiàn)方式來描繪，gpl20以分子表面顯示。染色方案 與圖3A相同。圖4B，CH103抗體決定簇表面顯示在表面下的多肽帶的上部。通過貢獻(xiàn)抗體 組分對表面著色和標(biāo)記。圖4C，通過基礎(chǔ)殘基的成熟狀態(tài)染色的CH103互補(bǔ)位表面。未突 變的殘基染洋紅色，而親和力成熟的殘基對重鏈和輕鏈分別染綠色和淺藍(lán)色。圖4D，CH103 克隆性世系成員的重鏈和輕鏈的序列比對。對框架和CDR殘基進(jìn)行標(biāo)記，對與gpl20相互 作用的殘基也標(biāo)記（開口圓，主鏈相互作用；帶射線的開口圓，側(cè)鏈相互作用；實(shí)心圓，主鏈 和側(cè)鏈相互作用兩者）。未突變的互補(bǔ)位殘基用洋紅色突出，成熟獲得的互補(bǔ)位殘基對重鏈 以綠色突出，對輕鏈以藍(lán)色突出。
[0015] 圖5。在Ch505Env的關(guān)鍵區(qū)域中序列標(biāo)識表現(xiàn)出變異。每個位點(diǎn)的每個氨基酸變 異體的頻率通過其高度表示，缺失以灰色欄表示。第一重現(xiàn)突變N279K在第4周出現(xiàn)（空 心箭頭）。BnAb活性發(fā)展的時間（從圖8和表1)在左邊。病毒多樣化（在獲得寬度之前） 通過每個區(qū)域的右邊的垂直箭頭突出。⑶4和CH103接觸殘基和基于HIV-1HXB2的氨基酸 位置數(shù)目沿著每個標(biāo)識欄的底部顯示。
[0016] 圖6A和6B。在CH103克隆性世系中的中和寬度的發(fā)展。圖6A，系統(tǒng)發(fā)育CH103克 隆性世系樹，其顯示自體同源T/F (C. CH505)、異源等級進(jìn)化枝A (A. Q842)和B (B. BG1168)病 毒的中和的IC50(微克/毫升）。圖6B，進(jìn)化中的病毒和發(fā)展中的克隆性世系（其在CH103 發(fā)展的變異體和同時期的病毒的模型中繪圖）之間的相互作用。HIV gpl20的外部結(jié)構(gòu)域 以蠕蟲表示方式描繪，蠕蟲厚度和顏色（白色到紅色）描繪了在每個時間點(diǎn)每個位點(diǎn)序列 多樣性的程度。抗體中間體的模型以卡通圖顯示，在每個時間點(diǎn)的體細(xì)胞突變在球體中突 出，并對從18至成熟抗體攜帶的突變著紅色，對從14至成熟抗體攜帶的突變著藍(lán)綠色，對 從13至成熟抗體攜帶的突變著綠色，對從12至成熟抗體攜帶的突變著藍(lán)色，對從II至成 熟抗體攜帶的突變著橙色，對從II的CH103突變著洋紅色。直至成熟抗體，并沒有一直攜 帶的短暫突變著深橄欖色。抗體（互補(bǔ)位）殘基以表面表現(xiàn)形式顯示，并通過如圖5中的 其化學(xué)類型來著色。
[0017] 圖7A和7B。第4周（圖7A)和第14周（圖7B)的漢明間距（hamming distance) 頻率分布。最佳匹配泊松分布的模型以紅線顯示。使用泊松匹配工具（見如下參考）在來自 于主體CH505的第一個可獲得的樣品（圖7A)中的序列多樣性的分析表明，序列與星形系 統(tǒng)發(fā)育相一致，并且突變根據(jù)泊松分布（適合度P = 〇. 11)積累。這與建立感染的單個首建 病毒一