專利名稱：快速檢測(cè)尿液中人類免疫缺陷病毒-Ⅰ型抗體的垂直流免疫印跡法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種免疫化學(xué)和生物化學(xué)分析方法一垂直流免疫印跡法，特別適用 于嬰兒、采血困難和不愿采血者快速檢測(cè)尿液中人類免疫缺陷病毒-I型(HIV-1)抗體的垂 直流免疫印跡法。
背景技術(shù)：
自上世紀(jì)80年代被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人類免疫缺陷病毒(HIV)感染尚未找到有效的預(yù)防 和根治手段，早診斷、早隔離還是目前防止其進(jìn)一步傳播擴(kuò)散的主要辦法。用于檢測(cè)HIV感 染的方法包括核酸檢測(cè)、抗體檢測(cè)和病毒載量檢測(cè)等，其中抗體檢測(cè)因其簡(jiǎn)單、快速，被世 界衛(wèi)生組織和衛(wèi)生部規(guī)定作為臨床檢測(cè)的主要方法。臨床檢測(cè)HIV抗體，免疫印跡法(WB) 是重要的方法，主要用于確認(rèn)初篩結(jié)果為HIV陽(yáng)性的血清樣本。目前國(guó)內(nèi)未見人類免疫缺 陷病毒-I型抗體尿液檢測(cè)確認(rèn)方法。 與血液檢查相比，尿液檢查有多種優(yōu)點(diǎn)尿液為非創(chuàng)傷性獲得的樣品，適用于嬰 兒、采血困難和不愿采血者；尿液中HIV病毒滴度相當(dāng)?shù)?，目前尚未見?jīng)尿液感染HIV的相 關(guān)報(bào)道，消除了采集樣本過(guò)程中感染的風(fēng)險(xiǎn)；尿液抗體含量穩(wěn)定，常溫可存放55天，2 8°C 可儲(chǔ)存1年，儲(chǔ)存和運(yùn)輸條件要求比血液低等。但研究表明尿液中HIV-1抗體的濃度較低， 特別是血清中濃度較高的p24抗體濃度低，因此需要提高尿液檢測(cè)技術(shù)。
用傳統(tǒng)免疫印跡法檢測(cè)尿液樣本HIV-1抗體，被檢抗體在反應(yīng)緩沖液中自由水平 擴(kuò)散，結(jié)合時(shí)間長(zhǎng)、效率低，且靈敏度遠(yuǎn)低于血液檢測(cè)，不能作為常規(guī)檢測(cè)手段。本垂直流免 疫印跡法可快速檢測(cè)尿液人類免疫缺陷病毒-I型抗體，且簡(jiǎn)便實(shí)用、敏感特異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)性地研制出一種易于基層普及使用的簡(jiǎn)便、敏感、特異的快 速檢測(cè)尿液中人類免疫缺陷病毒-I型抗體的垂直流免疫印跡法。采用垂流檢測(cè)方法，利用 真空壓力作用，使尿液樣本在控制的時(shí)間內(nèi)垂直通過(guò)硝酸纖維素膜，同時(shí)反應(yīng)液中的抗體 也定向轉(zhuǎn)移到膜上與抗原結(jié)合，通過(guò)設(shè)定檢測(cè)流程和條件參數(shù)，從而提高抗體與抗原結(jié)合 的速率，縮短反應(yīng)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)尿液中HIV-1抗體的目的。 本快速檢測(cè)尿液中人類免疫缺陷病毒-I型抗體的垂直流免疫印跡法，是通過(guò)采 用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳和電轉(zhuǎn)，并與真空抽濾系統(tǒng)結(jié)合構(gòu)成 垂直流免疫印跡法檢測(cè)方法，使尿液樣本在可控的時(shí)間內(nèi)垂直通過(guò)硝酸纖維素膜，從而增 加抗原抗體的結(jié)合，提高檢測(cè)靈敏度，以快速檢測(cè)尿液中人類免疫缺陷病毒-I型(HIV-1) 的抗體來(lái)確認(rèn)HIV-1感染與否。 本發(fā)明在傳統(tǒng)免疫印跡法的基礎(chǔ)上，采用將包被有HIV-1抗原的硝酸纖維素膜粘 合于自制反應(yīng)槽底的方法，通過(guò)與真空抽濾系統(tǒng)和支架搭建成垂直流檢測(cè)裝置，利用外力 作用使尿液樣本在一定時(shí)間內(nèi)垂直通過(guò)硝酸纖維素膜，加快了抗體與試劑條的反應(yīng)速率的同時(shí)，確保抗體和抗原充分反應(yīng)，提高檢測(cè)特異性。 本垂直流免疫印跡法，是通過(guò)十二烷基硫酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳和電轉(zhuǎn)，將 HIV-1抗原包被于硝酸纖維素膜上，然后將膜粘合于自制反應(yīng)槽的底部，并與真空抽濾系 統(tǒng)結(jié)合構(gòu)成垂直流免疫印跡法檢測(cè)方法，使尿液樣本在可控的時(shí)間內(nèi)垂直通過(guò)硝酸纖維素 膜，用來(lái)加速抗原抗體反應(yīng)，增加抗原抗體的結(jié)合，提高檢測(cè)靈敏度和特異性，從而通過(guò)快 速檢測(cè)尿液中人類免疫缺陷病毒-I型(HIV-1)抗體，以確認(rèn)HIV-1感染與否。
相應(yīng)的，本發(fā)明提供了一種垂直流免疫印跡法快速檢測(cè)尿液中HIV-1抗體的檢測(cè) 裝置，由包被有HIV-1抗原的硝酸纖維素膜、自制反應(yīng)槽、真空抽慮系統(tǒng)和支架共同組建而 成。 使用本垂直流免疫印跡法，可以簡(jiǎn)便、靈敏、特異的檢測(cè)尿液中HIV-1抗體，用于
實(shí)驗(yàn)室的診斷確認(rèn)、藥物治療效果評(píng)價(jià)、流行病學(xué)調(diào)查等，適宜基層普及使用，具有較大的
推廣應(yīng)用價(jià)值。 具體步驟如下 —、材料準(zhǔn)備 1、試劑 (1)裂解液lM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.8)、7% (W/V)十二烷基硫酸鈉；
(2)電泳液甘氨酸10克、三羥甲基氨基甲烷6克、十二烷基硫酸鈉2克于1升蒸 餾水(PH8. 7); (3)電轉(zhuǎn)液氯化鈉13克、乙二胺四乙酸二鈉2克、三羥甲基氨基甲烷9. 5克溶于 1升蒸餾水OW. 5); (4)封閉液5%牛血清白蛋白； (5)粘合劑a -氰基丙烯酸乙酯瞬間粘合劑； (6) 10倍漂洗液氯化鈉80克、磷酸氫二鈉28. 8克、磷酸二氫鉀2. 4克溶于1升 蒸餾水(IW. 0); (7)結(jié)合物堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗人免疫球蛋白(IgG)，按1 : 5000稀釋；
(8)底物1. 2克5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、2. 3克氯化硝基四氮唑藍(lán)溶于1 升蒸餾水。 2、載體硝酸纖維素膜(NC膜)。
3、抗原HIV-1抗原蛋白。
二、檢測(cè)方法
1 、制備HIV-1抗原NC膜 將滅活HIV-1抗原按1 : 2加入裂解液，充分混合，置于56t:水浴中裂解30分 鐘。裂解后的抗原用4%濃縮膠、12%分離膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳， 在150伏電泳60分鐘后取出蛋白膠，與硝酸纖維素膜和濾紙組成"三明治"，在90伏電轉(zhuǎn)55 分鐘后取出硝酸纖維素膜，于封閉液中封閉1小時(shí)，然后37t:烘干備用。
2、制備垂直流檢測(cè)裝置 將包被HIV-1抗原的硝酸纖維素膜(6cmX8cm)粘合到特制的反應(yīng)槽上，粘合劑涂 抹均勻，不留縫隙以免滲漏。待粘合劑徹底干燥后，將反應(yīng)槽置于盒狀支架上，并將支架上 的塑料管與真空抽濾器相連。注意整個(gè)裝置的密封性。
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3、檢測(cè)流程及條件參數(shù) 上述制備的反應(yīng)槽，每槽加入1毫升尿液樣本，置于搖床旋搖5分鐘。連接垂直流 反應(yīng)檢測(cè)裝置，打開真空抽濾器，由小到大調(diào)節(jié)壓差為"0. 5個(gè)"工業(yè)大氣壓，控制抗原_抗 體反應(yīng)時(shí)間(約為15分鐘)。抽濾完畢，加入漂洗液，置于搖床旋搖5分鐘后棄去，共3次。 然后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗人IgG，置于搖床旋搖30分鐘。反應(yīng)完畢，加入漂洗液，置 于搖床旋搖5分鐘后棄去，共3次。再加入底物，置于振蕩器上旋搖10分鐘后棄去，觀察反 應(yīng)結(jié)果。 4、檢測(cè)結(jié)果顯示及判斷(見圖1、圖2) 采集12例HIV-1抗體陽(yáng)性志愿者的血液樣本和尿液樣本、10例陰性志愿者血液樣 本和尿液樣本，分別用垂直流免疫印跡法和傳統(tǒng)免疫印跡法檢測(cè)，通過(guò)觀察HIV-1主要抗 原蛋白陽(yáng)性反應(yīng)條帶，如ENV帶(gp41、 gpl20/gp160)、 P0L帶(p31) 、 GAG(p24)等，最后按 照世界衛(wèi)生組織相關(guān)規(guī)定判斷檢測(cè)結(jié)果。圖l為垂直流免疫印跡法檢測(cè)尿液樣本結(jié)果，左 側(cè)為1-12號(hào)陽(yáng)性志愿者的尿液樣本檢測(cè)結(jié)果，右側(cè)為13-22號(hào)陰性志愿者的尿液樣本檢測(cè) 結(jié)果。圖2為傳統(tǒng)免疫印跡法檢測(cè)血液樣本結(jié)果，每份血液樣本與尿液樣本來(lái)源對(duì)應(yīng)，左側(cè) 為1-12號(hào)陽(yáng)性志愿者的血液樣本檢測(cè)結(jié)果，右側(cè)為13-22號(hào)陰性志愿者的血液樣本檢測(cè)結(jié) 果。 按世界衛(wèi)生組織相關(guān)規(guī)定判斷圖1和圖2所示的檢測(cè)結(jié)果，垂直流免疫印跡法檢 測(cè)尿液樣本與傳統(tǒng)免疫印跡法檢測(cè)血液樣本，對(duì)22位志愿者HIV感染情況的判斷結(jié)果相 同(見表1)，表明垂直流免疫印跡法可簡(jiǎn)便、特異、敏感的快速檢測(cè)尿液中人類免疫缺陷病 毒-I型抗體。 因此，本發(fā)明在傳統(tǒng)免疫印跡法的基礎(chǔ)上，采用垂直流技術(shù)，使尿液樣本在可控的 時(shí)間內(nèi)垂直通過(guò)硝酸纖維素膜，既加速了抗原抗體反應(yīng)，縮短檢測(cè)時(shí)間，又增加了抗原抗體 的結(jié)合度，從而提高檢測(cè)靈敏性。通過(guò)本發(fā)明可快速檢測(cè)尿液中的HIV-1抗體，確認(rèn)HIV-1 感染狀況。可用于實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)確認(rèn)、藥物治療效果評(píng)價(jià)、流行病學(xué)調(diào)查等，適宜基層普及 使用，具有較大的推廣應(yīng)用價(jià)值。


圖1為垂直流免疫印跡法檢測(cè)尿液樣本結(jié)果，左側(cè)為1-12號(hào)陽(yáng)性志愿者的尿液樣 本檢測(cè)結(jié)果，右側(cè)為13-22號(hào)陰性志愿者的尿液樣本檢測(cè)結(jié)果。 圖2為傳統(tǒng)免疫印跡法檢測(cè)血液樣本結(jié)果，每份血液樣本與尿液樣本來(lái)源對(duì)應(yīng)， 左側(cè)為1-12號(hào)陽(yáng)性志愿者的血液樣本檢測(cè)結(jié)果，右側(cè)為13-22號(hào)陰性志愿者的血液樣本檢 測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下非限制性實(shí)施例旨在更加詳細(xì)地闡釋本發(fā)明，而不以任何方式限制本發(fā)明的 范圍。 實(shí)施例
—、材料準(zhǔn)備
1、試劑
(1)裂解液lM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.8)、7% (W/V)十二烷基硫酸鈉；
(2)電泳液甘氨酸10g、三羥甲基氨基甲烷6g、十二烷基硫酸鈉2g溶于1升蒸餾 水(PH8. 7); (3)電轉(zhuǎn)液氯化鈉13g、乙二胺四乙酸二鈉2g、三羥甲基氨基甲烷9. 5g溶于1升
蒸餾水(ra7.5); (4)封閉液5 %牛血清白蛋白； (5)粘合劑a -氰基丙烯酸乙酯瞬間粘合劑； (6) 10倍漂洗液氯化鈉80g、磷酸氫二鈉28. 8g、磷酸二氫鉀2. 4g溶于1升蒸餾 水(IW. 0); (7)結(jié)合物堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗人IgG，按1 : 5000稀釋； (8)底物1. 2g 5-溴-4-氯_3_吲哚基磷酸酯、2. 3g氯化硝基四氮唑藍(lán)溶于1升 蒸餾水。 2、載體硝酸纖維素膜(NC膜)。
3、抗原HIV-1抗原蛋白。
二、檢測(cè)方法
1 、制備HIV-1抗原NC膜 將滅活HIV-1抗原按1 : 2加入裂解液，充分混合，置于56t:水浴中裂解30分 鐘。裂解后的抗原用4%濃縮膠、12%分離膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳， 在150伏電泳60分鐘后取出蛋白膠，與硝酸纖維素膜和濾紙組成"三明治"，在90伏電轉(zhuǎn)55 分鐘后取出硝酸纖維素膜，于封閉液中封閉1小時(shí)，然后37t:烘干備用。
2、制備垂直流檢測(cè)裝置 將包被HIV-1抗原的硝酸纖維素膜(6cmX8cm)粘合到特制的反應(yīng)槽上，粘合劑涂 抹均勻，不留縫隙以免滲漏。待粘合劑徹底干燥后，將反應(yīng)槽置于盒狀支架上，并將支架上 的塑料管與真空抽濾器相連。注意整個(gè)裝置的密封性。
3、檢測(cè)流程及條件參數(shù) 上述制備的反應(yīng)槽，每槽加入1毫升尿液樣本，置于搖床旋搖5分鐘。連接垂直流 反應(yīng)裝置，打開真空抽濾器，由小到大調(diào)節(jié)壓差為"0. 5個(gè)"工業(yè)大氣壓，控制抗原_抗體反 應(yīng)時(shí)間(約為15分鐘)。抽濾完畢，加入漂洗液，置于搖床旋搖5分鐘后棄去，共3次。然 后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗人IgG，置于搖床旋搖30分鐘。反應(yīng)完畢，加入漂洗液，置于 搖床旋搖5分鐘后棄去，共3次。再加入底物，置于振蕩器上旋搖10分鐘后棄去，觀察反應(yīng) 結(jié)果。 4、檢測(cè)結(jié)果顯示及判斷(見附圖1) 圖1中左側(cè)為12份陽(yáng)性樣本檢測(cè)結(jié)果；右側(cè)為10份陰性樣本檢測(cè)結(jié)果。按照世 界衛(wèi)生組織相關(guān)規(guī)定判斷檢測(cè)結(jié)果。 按上述方法條件進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)確認(rèn)，并與傳統(tǒng)免疫印跡法檢測(cè)血液樣本的結(jié)果 相比較，其HIV-1主要抗原蛋白均顯示陽(yáng)性反應(yīng)條帶，，如ENV帶(gp41、gpl20/gp160) 、POL 帶(p31)、GAG(p24)等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本垂直流免疫印跡法檢測(cè)尿液樣本與傳統(tǒng)免疫印跡 法檢測(cè)血液樣本的結(jié)果相符合。見表l。 表l主要抗原蛋白靈敏度比較結(jié)果(12份陽(yáng)性及不確定樣本)
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主要抗原蛋白_尿檢垂直流法檢出率 與血檢符合率
p24， p31， gp41和gpl20/gpl60 33. 3%(4/12) 100%
ENV和GAG和POL帶各一條 58. 3% (7/12) 100%
ENV和 GAG或 POL帶各 一 條 100% (12/12) 100%
權(quán)利要求
一種快速檢測(cè)尿液中人類免疫缺陷病毒-I型抗體的垂直流免疫印跡法，其特征是通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和電轉(zhuǎn)，將人類免疫缺陷病毒-I型抗原包被于硝酸纖維素膜上，然后將膜粘合于自制反應(yīng)槽的底部，并與真空抽濾系統(tǒng)結(jié)合構(gòu)成垂直流免疫印跡法檢測(cè)方法，使尿液樣本在較短時(shí)間內(nèi)垂直通過(guò)硝酸纖維素膜，加速抗原抗體反應(yīng)，增加抗原抗體的結(jié)合，提高檢測(cè)靈敏度及特異性，從而快速檢測(cè)尿液中的人類免疫缺陷病毒-I型(HIV-1)抗體，以確認(rèn)HIV-1感染與否。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的垂直流免疫印跡法，其特征在于可以利用垂直流免疫印跡法 快速檢測(cè)尿液中HIV-1抗體，用于實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)確認(rèn)、藥物治療效果評(píng)價(jià)、流行病學(xué)調(diào)查研 究等。
全文摘要
本發(fā)明提供一種免疫化學(xué)和生物化學(xué)分析方法，特別適用于嬰兒、采血困難和不愿采血者快速檢測(cè)尿液中人類免疫缺陷病毒-I型(HIV-1)抗體的垂直流免疫印跡法。本發(fā)明是通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和電轉(zhuǎn)，將HIV-1抗原包被于硝酸纖維素膜(NC膜)上，然后將膜粘合于自制反應(yīng)槽的底部，并與真空抽濾系統(tǒng)結(jié)合構(gòu)成垂直流免疫印跡法檢測(cè)方法。該方法使尿液樣本在可控時(shí)間內(nèi)垂直通過(guò)硝酸纖維素膜，加速抗原抗體反應(yīng)，增加抗原抗體的結(jié)合度，從而提高檢測(cè)靈敏度。通過(guò)本發(fā)明可快速檢測(cè)尿液中的HIV-1抗體，確認(rèn)HIV-1感染狀況?？捎糜趯?shí)驗(yàn)室診斷確認(rèn)、藥物治療效果評(píng)價(jià)等，適宜基層普及使用，具有較大的推廣應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/561GK101726594SQ20091015662
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者倪崖, 房國(guó)堅(jiān), 李坤, 李忠輝, 譚卓, 黃云堅(jiān) 申請(qǐng)人:浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院