專利名稱：針對腫瘤基質(zhì)抗原fap的dna組合物及其使用方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及脫氧核糖核酸(DNA)組合物，其編碼有效刺激免疫應 答對抗腫瘤中的基質(zhì)成纖維細胞的合適分子。更詳細地講，本發(fā)明涉 及DNA組合物，其編碼稱為成纖維細胞激活蛋白(FAP)的基質(zhì)抗原。 本發(fā)明還涉及以下的方法使用該DNA組合物以抑制腫瘤生長和腫 瘤轉(zhuǎn)移，并以增加化療藥物的細胞吸收。
背景技術(shù)：
逐漸變得清晰的是，腫瘤抗原是用于癌癥治療的難以捉摸的靶 標。這可通過對腫瘤細胞唯一的各種特征來解釋，這些特征包括它們 的抗原的突變和由于MHC-抗原表達的下調(diào)的不足夠的抗原呈遞。此 外，細胞凋亡信號途徑的缺陷、以及細胞凋亡抑制劑例如存活蛋白、 XIAP或bcl-2家族的抗細胞凋亡成員的增量調(diào)節(jié)不僅對T細胞介導的 殺傷賦予抗性，而且也對化療藥物的凋亡誘導效應賦予抗性。
人們逐漸認識到基質(zhì)區(qū)室(stromal compartment)在腫瘤發(fā)生和腫 瘤侵入中起決定性的作用。已經(jīng)顯示基質(zhì)細胞刺激正常上皮細胞的轉(zhuǎn)型，互換生長因子、細胞因子和化學引誘物以激活鄰近的細胞外基質(zhì)和誘導贅生細胞的選擇和擴張。在一項研究中，將腫瘤細胞作為混懸液注射進小鼠中據(jù)報道為不致瘤的，但注射包含其基質(zhì)的實體瘤碎片
據(jù)報道卻引起腫瘤生長(見Singh等，J. 1992年；175:
139-146)。激活的胞外基質(zhì)顯然賦予由pi整聯(lián)蛋白介導的化學抗性，卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白附著于纖連蛋白，引起pi整聯(lián)蛋白刺激性酪氨酸激酶的激活，從而抑制化學療法誘導的細胞凋亡。該現(xiàn)象已經(jīng)在多柔比星敏感性骨髓瘤細胞中報道，該骨髓瘤細胞在附著纖連蛋白之后發(fā)展抗性。最近的報道表明，可通過腫瘤基質(zhì)成纖維細胞調(diào)控或通過分配腫瘤基質(zhì)網(wǎng)絡實現(xiàn)腫瘤排斥。另外，由于與腫瘤相關(guān)的巨噬細胞和成纖維細胞具有合成如VEGF、 TGF-pi和IL-10的蛋白質(zhì)的能力，因此它們據(jù)報道促進局部免疫抑制環(huán)境。VEGF起樹突細胞成熟的抑制因子的作用，因此導致耐受T細胞。VEGF也為涉及腫瘤-血管發(fā)生的主要因子。VEGF的激活引起存活蛋白和肺瘤-內(nèi)皮細胞中的許多其它的凋亡抑制蛋白的增量調(diào)節(jié)，保護它們免受化學療法的凋亡效應。相反，TGF-pi的抑制可引起腫瘤根除和對抗轉(zhuǎn)移的保護作用。IL-10抑制樹突細胞的成熟，因此抑制由Thl細胞介導的細胞介導性抗腫瘤應答。該效應使樹突細胞向基本無效的體液免疫反應轉(zhuǎn)變。
成纖維細胞為分泌富含膠原和其它大分子的細胞外基質(zhì)的結(jié)締組織細胞。腫瘤-基質(zhì)(即腫瘤支持組織)中的成纖維細胞合成成纖維細胞激活蛋白(FAP)，具有絲氨酸蛋白酶功能的II型跨膜蛋白質(zhì)。FAP在超過90%的與結(jié)腸癌、乳癌和肺癌有關(guān)的基質(zhì)成纖維細胞中選擇性地過量表達。在傷口愈合期間和在一些胎兒間充組織中也可觀察到FAP的短暫過量表達。另外，據(jù)報道該酶切割明膠和I型膠原，已經(jīng)牽涉進細胞外基質(zhì)重建中。椐報道FAP的過量表達引起腫瘤生長的促進和增加轉(zhuǎn)移的可能性，而用抗FAP抗體治療抑制腫瘤生長。此外，主要由成纖維細胞產(chǎn)生的I型膠原的腫瘤-基質(zhì)表達，相反地與包括化療藥物在內(nèi)的許多化合物的腫瘤內(nèi)吸收有關(guān)，由此維持基質(zhì)區(qū)室與化學療法抗性的相關(guān)性。
已經(jīng)使用疫苗以通過非常有限地給予預防劑提供對抗許多病癥的長期保護，所述預防劑刺激生物體的免疫系統(tǒng)以在病原體可增殖和
引起病理效應之前破壞疾病的病原體。在Bernard R. Glick和Jack J.Pasternak ， M /ecw/ar歷o阮Awo/ogy, WA7一/es am/ /i/7/ /z.ca"0朋o//^cow&'"a"f"A^，第二版，ASM Press第253-276頁(1998)中描述了疫苗和接種疫苗的許多方法。
接種疫苗為誘導身體自身的免疫系統(tǒng)以在感染介質(zhì)(infectiousagent)形成病理反應之前尋找并破壞感染介質(zhì)的方法。 一般而言，疫苗為活的但減毒的感染介質(zhì)(病毒或細菌)，或該感染介質(zhì)的滅活形式。由活細菌或病毒組成的疫苗必須為非致病性的。 一般而言，通過物理或化學處理將細菌或病毒的培養(yǎng)物減毒(減弱)。即使該感染介質(zhì)為無毒的，但它仍然可在用該疫苗治療的受試者中刺激免疫應答。
由抗原刺激免疫應答，該抗原可為特異性的大分子或感染介質(zhì)。這些抗原一般為蛋白質(zhì)、多糖、脂類、或糖脂，它們被名為B細胞和T細胞的淋巴細胞認為是"外來的"。將兩種類型的淋巴細胞暴露至抗原，刺激快速的細胞分裂和分化反應，引起被暴露的淋巴細胞克隆形成。B細胞產(chǎn)生漿細胞，漿細胞繼而產(chǎn)生稱為抗體(Ab)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)選擇性地結(jié)合在感染介質(zhì)上存在的抗原，從而中和或滅活病原體(體液免疫)。有時，B細胞應答需要CD4輔助T細胞的協(xié)助。
響應抗原暴露而形成的特異性的T細胞克隆為細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，該細胞能夠結(jié)合和消除存在抗原的病原體和組織(細胞介導的免疫或細胞免疫)。有時，抗原呈遞細胞(APC)如樹突細胞會通過胞吞作用包裹病原體或其它外來細胞。然后APC加工來自那些細胞的抗原，并將這些抗原以組織相容性分子肽復合體的形式呈遞到CTL上的T細胞受體(TCR),從而刺激免疫應答。
7以特異性抗體的形成為特征的體液免疫通常對抗急性細菌感染和來自病毒的重復感染最有效，而細胞介導的免疫對抗病毒感染、慢性胞內(nèi)細菌感染、和真菌感染最有效。也已知細胞免疫防止某些癌癥和引起器官移植的排斥。
在很長的時期內(nèi)，得自先前感染的抗原的抗體在血液中保持為可
檢測的，因此提供測定先前暴露于(exposureto)病原體的方法。當再暴露于相同的病原體時，免疫系統(tǒng)通過在病原體可增殖和產(chǎn)生致病性反應之前消除病原體而有效地防止再感染。
l鴻
抗原的非致病介質(zhì)產(chǎn)生。按該方式，受試者可受到對抗隨后暴露于病原體的保護作用，而不需要先前抗擊過感染。
然而，并非所有的感染介質(zhì)都可容易地如形成疫苗所需要地培養(yǎng)和滅活?，F(xiàn)代的重組DNA技術(shù)已經(jīng)允許設計新疫苗以設法克服該限制?？僧a(chǎn)生缺少致病基因的感染介質(zhì)，因此允許活的、無毒形式的生物體用作疫苗。也可能工程改造相對的非病原生物如E. coli以呈遞致病性載體的細胞表面抗原。經(jīng)接種該轉(zhuǎn)化載體的受試者的免疫系統(tǒng)受"欺騙"而形成針對該病原體的抗體?？蓪Σ≡w的抗原蛋白質(zhì)進行工程改造并使之在非致病性物種中表達，該抗原蛋白質(zhì)可經(jīng)分離和純化以生產(chǎn)"亞單位疫苗"。亞單位疫苗具有穩(wěn)定、安全和化學上明確定義的優(yōu)點；然而，它們的生產(chǎn)成本太高。
近年來出現(xiàn)制備疫苗的新方法，廣泛地稱為基因免疫。在該方法中，編碼病原體抗原的核酸(多核苷酸)可經(jīng)操作插入接受免疫的受試者細胞中。受處理的細胞，優(yōu)選抗原呈遞細胞(APC)如樹突細胞經(jīng)轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生病原體的抗原蛋白質(zhì)。然后這些在體內(nèi)產(chǎn)生的抗原觸發(fā)所需的宿主免疫應答。在這樣的基因疫苗中使用的遺傳物質(zhì)可為DNA構(gòu)建體或RNA構(gòu)建體。通常，編碼抗原的多核苷酸與其它促進多核苷酸序列聯(lián)合導入以增強基因的插入、復制、或表達?？赏ㄟ^許多遞送體系將編碼抗原基因的DNA疫苗導入受試者的
宿主細胞。這些遞送體系包括原核生物遞送體系和病毒遞送體系。例如， 一種方法為使用病毒載體，如摻有新型遺傳物質(zhì)的牛痘病毒，以接種宿主細胞?；蛘?，該遺傳物質(zhì)可摻入質(zhì)粒載體或可作為"棵"多核
苷酸，即簡單地作為純化的DNA直接遞送至宿主細胞。另外，DNA可穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染進減毒的細菌如鼠傷寒沙門氏菌(ypA/wwWwwJ 。當用經(jīng)轉(zhuǎn)化的沙門氏菌(5Wmo"e〃a) 口服接種病人時，細菌被運輸至腸(即次級淋巴組織)中的淋巴集結(jié)，然后刺激免疫應答。
如遺傳性疾病和癌癥。通?；虬┌Y疫苗導入APC編碼抗原的基因，經(jīng)如此轉(zhuǎn)化的APC產(chǎn)生特定類型胂瘤細胞的抗原。因此，對抗許多癌癥類型的有效的通用疫苗必然需要許多用于欲免疫對抗的每種類型癌細胞的單一疫苗。
持續(xù)需要的是用于免疫對抗各種類型癌癥的廣泛有效的DNA組合物，例如疫苗。本發(fā)明滿足該需要。
發(fā)明概述
有效抑制胂瘤生長和肺瘤轉(zhuǎn)移的DNA組合物包含以下的DNA構(gòu)建體編碼可在受試者的免疫細胞中表達的成纖維細胞激活蛋白(FAP)的至少一個表位的DNA構(gòu)建體，該受試者已經(jīng)被給予DNA構(gòu)建體。該DNA構(gòu)建體被摻入藥學上可接受的載體。該組合物可編碼FAP的單個表位、包含兩個或多個FAP表位的多肽、整個FAP蛋白質(zhì)、或其將刺激對抗腫瘤基質(zhì)細胞所需的免疫應答的任何部分。優(yōu)選地，該DNA構(gòu)建體編碼具有由SEQ ID NO: 2組成的氨基酸殘基序列的人FAP、或與SEQ ID NO: 2具有至少80%相似性并包括至少一個FAP表位的蛋白質(zhì)。
該DNA構(gòu)建體可為棵DNA構(gòu)建體，優(yōu)選為質(zhì)粒的形式。如有需要，可將這樣的棵DNA構(gòu)建體結(jié)合脂質(zhì)體遞送栽體、聚合物遞送載體、電穿孔、基因槍等。在一些優(yōu)選的實施方案中，將該DNA構(gòu)建體摻入減毒的病毒載體或減毒的細菌性載體中。
在優(yōu)選的實施方案中，該DNA構(gòu)建體被摻入減毒的細菌性載體，例如減毒的鼠傷寒沙門氏菌(^Sa/wo"e〃a 0^A/wwhwm)，最優(yōu)選鼠傷寒沙門氏菌(5Wwo"e〃a (v/ /^wwnYw^的雙重減毒的(^ra/r, c/aw》菌才朱o
任選該DNA組合物也可包含編碼免疫效應器蛋白例如細胞因子的DNA構(gòu)建體。優(yōu)選的細胞因子包括CCL21、 IL-2、和CD40LT。
本發(fā)明的DNA組合物可作為靶向腫瘤基質(zhì)成纖維細胞抗原FAP的疫苗，該腫瘤基質(zhì)成纖維細胞抗原FAP是作為T細胞介導的癌癥免疫療法的靶標?；|(zhì)成纖維細胞為在支持腫瘤生長的腫瘤環(huán)境中存在的非轉(zhuǎn)化細胞。對于指向?qū)贡荒[瘤細胞單一表達的抗原的療法，與靶向僅由胂瘤細胞表達的抗原的療法相比，靶向由基質(zhì)成纖維細胞表達的FAP的方法具有幾個優(yōu)點。首先，基質(zhì)成纖維細胞在遺傳上比經(jīng)常突變的異型腫瘤細胞群更加穩(wěn)定。因此，靶抗原的表達保持更加穩(wěn)定，充當用于免疫療法的更可靠的靶標。第二，從基質(zhì)成纖維細胞到T細胞受體復合物的抗原呈遞不會如在腫瘤細胞中經(jīng)常發(fā)生的被減量調(diào)節(jié)的MHC-抗原表達削弱。第三，由于在凋亡信號途徑中的缺陷、抗凋亡蛋白的增量調(diào)節(jié)、或?qū)TL的免疫抑制效應，腫瘤細胞往往曰漸變得對T細胞介導的殺傷具有抗性。另外，與涉及只被特定腫瘤類型表達的抗原的療法相反，對在超過90。/。的結(jié)腸癌、乳癌和肺癌的基質(zhì)區(qū)室中特異性過量表達的FAP進行定靶，允許治療組合物治療許多不同的惡性腫瘤。
在一個優(yōu)選的實施方案中，通過將作為口服DNA組合物的FAP自身抗原cDNA與減毒的細菌性遞送載體(例如減毒的鼠傷寒沙門氏菌菌林)遞送到周圍淋巴器官即小腸的淋巴集結(jié)中的抗原呈遞細胞，本發(fā)明的DNA組合物打破外周T細胞對FAP自身抗原的耐受。在預防性方法中，通過用本發(fā)明的DNA組合物接種疫苗誘導的T細胞介導的抗腫瘤免疫應答在兩個不同的鼠類腫瘤模型(即多重耐藥的CT26
10結(jié)腸癌和多重耐藥的D2F2乳癌)中抑制胂瘤生長。本DNA組合物還顯著地抑制CT26結(jié)腸癌治療模型中已確立的肺轉(zhuǎn)移的擴散。
優(yōu)選的DNA組合物包含減毒的沙門氏菌(5Wwo"e/W性載體，該載體為名為RE 88的鼠傷寒沙門氏菌f^ 0^/^7m/n'ww^)雙重減毒菌抹，包括G 麵—和爿rc^突變，得自Remedyne Corporation (Santa Barbara,CA)。減毒的沙門氏菌^S"fl/wo"e〃fl)性載體包括編碼可在免疫細胞中表達的FAP的至少一個表位的DNA。細菌本身不表達FAP，而是遞送FAP DNA至免疫細胞(例如巨噬細胞和樹突細胞)，免疫細胞隨后表達FAP。這樣的組合物可延長抗腫瘤效果達10個月，也實現(xiàn)鼠類模型中的T細胞、NK細胞和DC活化標記的顯著的增量調(diào)節(jié)。此外，體內(nèi)T細胞去除實驗表明僅牽涉到CD8+T細胞而不牽涉到CD4+T細胞。由CD8+ T細胞介導的體外細胞毒性效應特異性地把向過量表達FAP抗原的靶細胞。例如，在概念證實實驗中，來自用本發(fā)明組合物接種的小鼠的CD8+ T細胞誘導體外細胞毒素溶解經(jīng)工程改造以過量表達FAP的腫瘤細胞，這表明對FAP的特異性免疫應答。令人意想不到的是，即使還可發(fā)現(xiàn)FAP在傷口愈合期間短暫地過量表達，但是沒有觀察到由接種本發(fā)明的DNA組合物引起的傷口愈合損傷。
本發(fā)明的DNA組合物還可摻入編碼作為該組合物佐劑的免疫效應分子的DNA構(gòu)建體。這樣的免疫效應分子包括例如IL-2, T細胞增殖的誘導物；CCL21，化學誘導成熟樹突細胞和幼稚T細胞的趨化因子；和CD40LT,已知的樹突細胞成熟的誘導物。優(yōu)選所述編碼免疫效應蛋白的核酸被摻入質(zhì)粒。FAP和免疫效應蛋白DNA構(gòu)建體可被摻入同 一個質(zhì)?；騼蓚€單獨質(zhì)粒中。誘導對抗腫瘤-基質(zhì)成纖維細胞的CTL應答可抑制各種腫瘤的生長，對特殊的腫瘤類型為非特異性的。
本發(fā)明還提供抑制哺乳動物腫瘤生長或腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括按足以刺激對抗呈遞FAP抗原的腫瘤基質(zhì)細胞的免疫應答的量，將本發(fā)明的DNA組合物給予哺乳動物。
ii本發(fā)明的另一方面為有效的組合治療方法，該方法包括將化療藥
物聯(lián)合本發(fā)明的DNA組合物來給藥。在本發(fā)明的此方法實施方案中， 將各種化療藥物聯(lián)合本發(fā)明的包含編碼FAP或其免疫原性部分的 DNA構(gòu)建體的DNA組合物給予病人，所述化療藥物例如有多柔比星、 紫杉醇、和/或環(huán)磷酰胺，當按最大耐受量(MTD)給藥時該化療藥物不 引起骨髓抑制。本發(fā)明的FAP組合物與上述藥物的組合提供附加優(yōu) 點，該優(yōu)點為I型膠原表達的減量調(diào)節(jié)，和因此而增加的各種化療藥 物和其他化合物的腫瘤內(nèi)吸收。本發(fā)明的DNA組合物引起多種分子 的腫瘤細胞吸收增加，所述分子包括但不限于抗腫瘤化療藥物。例如， 低分子量染料螢光素(376 Da)、高分子量化合物伊文思藍白蛋白 (68,500 Da)和抗肺瘤化療藥物5-氟尿嘧咬(5-FU; 130Da),它們?nèi)慷?在經(jīng)本發(fā)明DNA組合物治療的小鼠中以相對于用非活性對照組合物 治療的小鼠高很多的水平被腫瘤細胞吸收。本發(fā)明的DNA組合物加 上抗肺瘤藥物多柔比星的組合在50%的接受本組合療法治療的小鼠中 誘導同位生長的乳腺腫瘤的完全排斥。在單獨用DNA組合物或單獨 用多柔比星治療的小鼠中沒有觀察到腫瘤的完全排斥。
優(yōu)選的方法提供用于增強哺乳動物化療藥物吸收的方法。該方法 包括按足以刺激對抗呈遞FAP抗原的哺乳動物細胞的免疫應答的 量，將本發(fā)明的DNA組合物給予哺乳動物，然后給予該哺乳動物有 效量的化療藥物。
另一優(yōu)選的方法實施方案為在哺乳動物中抑制腫瘤生長或腫瘤 轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括以下步驟按足以刺激對抗呈遞FAP抗原的 哺乳動物細胞的免疫應答的量，將本發(fā)明的DNA組合物給予哺乳動 物，隨后給予該哺乳動物有效抗腫瘤量的抗腫瘤化療藥物。
優(yōu)選通過本發(fā)明方法治療的哺乳動物為人。
在本發(fā)明的方法實施方案中，可以經(jīng)腸內(nèi)例如通過口服給藥，或 經(jīng)胃腸外例如通過注射或靜脈輸注，給予所述DNA組合物。優(yōu)選口服給予該組合物。該組合物可包裝在密封容器中，用對臨床醫(yī)生有效 地給予該組合物有用的信息貼標簽。.
本發(fā)明的DNA組合物用于治療和預防許多病癥。例如，患有結(jié) 腸直腸癌、乳腺癌、肺癌等的患者可受益于通過本發(fā)明的組合物的免 疫。
附圖簡迷


圖1為鼠類FAP DNA構(gòu)建體的表征和化學抗性肺瘤細胞系的表 征。分圖A闡明編碼完整鼠類FAP的質(zhì)粒cDNA,該質(zhì)粒cDNA被 插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO載體(pFAP)的EcoRI位點中。分圖B顯 示在瞬時轉(zhuǎn)染CT26細胞之后通過蛋白印跡法證明的FAP蛋白表達。 分圖C顯示用標明的濃度的各種化療藥物治療的CT26結(jié)腸癌和D2F2 乳癌細胞。在孵育48小時之后，用Hoechst-33342染料著色評定細胞 核的凋亡。柱條表明3次試驗的平均值加上標準差。
圖2a -圖2c闡明基于FAP的DNA組合物對肺瘤生長的作用。 預防設置(setting):在按照材料和方法中描述進行間隔1周的3次接種 疫苗中的最后一次之后10天，用致死量的3 x 104CT26細胞皮下注射 (圖2a)或用致死量的3 x 105 D2F2細胞原位(圖26)攻擊BALB/c小鼠 (n=8)。描述8只小鼠的平均腫瘤生長，平均值土SE, P<0.01。 治療 設置首先對BALB/c小鼠(11=8)靜脈注射105 CT26細胞，然后在3 天和IO天之后一旦確定肺轉(zhuǎn)移就馬上進行治療。在18天之后，將肺 切除并稱重(正常的肺重量為約0,2g)，檢查轉(zhuǎn)移情況，通過目測評價 打分，如下評定被融合轉(zhuǎn)移灶覆蓋的肺表面百分比0 = 0%, 1《20%， 2 = 20-50%， 3>50%，尸O.01(圖2c)。。
圖3闡述由CD8+T細胞誘導的細胞毒性。(A)描述的是在經(jīng)治療 小鼠的效應期期間抗體介導的排除對壽命的影響(*表示與對照組相比 的統(tǒng)計顯著性，pO.Ol)。 (B)將CD8十T細胞從經(jīng)治療小鼠的脾中純 化，用經(jīng)Y輻射的腫瘤靶細胞進行刺激，然后與經(jīng)pGFP或pGFP/pFap轉(zhuǎn)染的CT26細胞孵育48h。如下通過用Hoechst-33342染料著色評定 細胞核的凋亡細胞核的凋亡階段0:不凋亡；階段1:大規(guī)模染色 質(zhì)凝聚；階段2a:染色質(zhì)斷裂；階段2b:凋亡小體。(C, D)用經(jīng)pFap 轉(zhuǎn)染的A31成纖維細胞對得自經(jīng)pFap和空載體免疫的小鼠(r^3)脾細 胞刺激5d，然后對其進行"Cr-釋放試驗。(D)使效應細胞和靶細胞與 抗MHC I類抗體共孵育(平均值+SD, *表示與空載體相比的統(tǒng)計顯著 性，p<0.05)。 (E)經(jīng)治療小鼠(r^2)的CT26胂瘤的單細胞懸液FACS 分析，用抗CD3+PerCP-Cy5.5抗體和抗CD8+FITC抗體著色。描述了 兩個實驗中的一個。(F)用抗CD8 FITC抗體和DAPI核染劑著色的、 經(jīng)pFap和空載體治療的小鼠的CT26腫瘤的代表性部分。
圖4顯示FAP/I型膠原的表達和螢光素/白蛋白/5-FU的瘤內(nèi)吸收。 (A)在經(jīng)治療小鼠的皮下(s.c.) CT26腫瘤中FAP(上面的分圖)和I型膠 原(下面的分圖)表達的免疫組織化學分析。(B)在經(jīng)治療小鼠的皮下 CT26肺瘤中FAP和I型膠原的免疫印跡。(C， D, E)條形圖表明在螢 光素的腹膜內(nèi)(i,p.)注射、伊文思藍白蛋白的靜脈內(nèi)(i.v.)注射或14C-5-氟尿嘧啶的靜脈內(nèi)注射之后，來自經(jīng)治療的BALB/c小鼠(n-4)的皮下 CT26腫瘤勻漿的光密度或閃爍測量結(jié)果的平均值+SE。分別為 P<0.05、 PO.01和P0.05。
圖5闡述生物和化學聯(lián)合療法的抗轉(zhuǎn)移效果和副作用。(A)預防設 置在以1周為間隔用對照疫苗、PBS.或本發(fā)明的疫苗的3次接種疫 苗中的最后一次之后10天，用3 x 105 D2F2細胞原位(o丄)攻擊BALB/c 小鼠(11=8;平均值士SE)。在5、 10和15天之后，用多柔比星治療上述 小鼠。(B)治療設置在用1()S個D2F2腫瘤細胞靜脈內(nèi)注射之后5天， 用pFap疫苗或?qū)φ找呙缑恐苤委烞ALB/c小鼠(n-8)。在每次接種后 的1天，用多柔比星靜脈內(nèi)治療上述小鼠(*描述與對照組相比的統(tǒng)計 顯著性，pO.OOOl， * *描述與對照組、對照/多柔比星組、pF叩組和 pFap/多柔比星組相比的顯著性，pO.OOOl)。圖6(A)瘤內(nèi)的多柔比星濃度用5x 105 D2F2細胞皮下攻擊經(jīng) 治療的BALB/c小鼠(11=4)，在16天之后用LC-MS測定混合的腫瘤溶 胞產(chǎn)物中的多柔比星濃度(代表兩個實驗，平均值+SD, PO.OOl)。 (B) 在經(jīng)治療小鼠(11=4)的上背部造成3 mm直徑的圓形傷口 ，測量直至傷 口完全閉合的平均時間(平均值+SD)。
圖7顯示編碼人FAP的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO:l)。 圖8闡述人FAP的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO:2)。 圖9顯示編碼鼠類FAP的核酸的核苷酸序列(SEQIDNO:3)。 圖10顯示鼠類FAP的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO:4)。 圖.11顯示編碼人IL-2的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。 圖12顯示人IL-2的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO:6)。 圖13顯示編碼鼠類IL-2的核酸的核苷酸序列(SEQIDNO:7)。 圖14顯示鼠類IL-2的氨基酸殘基序列(SEQ IDNO:8)。 圖15顯示編碼人CCL21的核酸的核苷酸序列(SEQIDNO:9)。 圖16顯示人CCL21的氨基酸殘基序列(SEQIDNO:10)。 圖17顯示編碼鼠類CCL21b的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO:ll)。
圖18顯示鼠類CCL21b的氨基酸殘基序列(SEQIDNO:12)。 圖19闡述人CCL21和鼠類CCL21b之間的氨基酸序列相似性。 圖20顯示編碼鼠類CCL21a的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)。
圖21顯示鼠類CCL21a的氨基酸殘基序列(SEQ IDNO:14)。 圖22顯示編碼人CD40L的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)。 圖23顯示人CD40L的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO:16)。
優(yōu)選的實施方案的詳述
本發(fā)明提供有效抑制腫瘤生長或腫瘤轉(zhuǎn)移的DNA組合物，該 DNA組合物靶向被稱為成纖維細胞激活蛋白(FAP)的腫瘤基質(zhì)抗原。
15該DNA組合物包含編碼可在免疫細胞中表達的FAP的至少一個表位 的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體被摻入藥學上可接受的載體中。該DNA構(gòu) 建體可編碼FAP的單個表位、包含F(xiàn)AP的兩個或多個表位的多肽、 整個FAP蛋白質(zhì)、或其將刺激所需對抗腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移的免疫應答的 任何部分。
當用于本文和所附權(quán)利要求時，術(shù)語"DNA構(gòu)建體"是指編碼目標 蛋白質(zhì)或多肽例如FAP表位、FAP蛋白質(zhì)、IL-2、 CCL21等的DNA 結(jié)構(gòu)。DNA構(gòu)建體包括可在靶細胞中轉(zhuǎn)錄的任何DNA，包括線性DNA 和質(zhì)粒DNA,以及已摻入細胞或病毒的遺傳物質(zhì)中的DNA。優(yōu)選該 DNA構(gòu)建體為已4參入病毒遞送載體或細菌性遞送載體(例如不致病的 減毒的病毒載體或細菌性載體)中的DNA。當用本發(fā)明的組合物治療 受試者時，編碼FAP的DNA被遞送至免疫細胞(例如，巨噬細胞和樹 突細胞)，然后表達FAP蛋白質(zhì)。FAPDNA的病毒載體和細菌性載體 本身不表達FAP。
本發(fā)明的DNA組合物刺激CTL的形成，CTL有效對抗呈遞FAP 抗原的細胞例如腫瘤基質(zhì)細胞(如基質(zhì)成纖維細胞)。。這樣的腫瘤基 質(zhì)細胞選擇性地被CTL靶定，后者隨接種本發(fā)明的DNA組合物而產(chǎn) 生。本發(fā)明的組合物可減少I型膠原的腫瘤基質(zhì)表達，隨后增強化療 藥物的吸收。
本文所用術(shù)語"免疫"是指對抗表達抗原細胞的的長期免疫保護。 術(shù)語"接種"是指暴露于抗原，這致使在經(jīng)治療的受試者中產(chǎn)生對表達 該抗原的細胞的免疫。
術(shù)語"FAP蛋白"是指人FAP、或者與人FAP具有至少80%序列相 似性且包括至少一個的人FAP表位的多肽。術(shù)語"FAP DNA"是指編碼 人FAP的DNA、或編碼與人FAP具有至少80%序列相似性且包括至 少一個的人FAP表位的多肽的DNA。.
用于本發(fā)明的DNA組合物的DNA構(gòu)建體優(yōu)選包含編碼包含F(xiàn)AP 的一個或多個表位的多肽的核酸，該DNA構(gòu)建體可操作地連接至在免疫細胞中基因表達所需的調(diào)控元件。優(yōu)選該DNA構(gòu)建體編碼全長 FAP蛋白質(zhì)，或編碼與FAP具有至少80%的高度相似性且包括至少 一個FAP表位的多肽。有用的DNA構(gòu)建體優(yōu)選包括在免疫細胞內(nèi)核 普酸表達所需的調(diào)控元件。這樣的元件包括例如啟動子、起始密碼子、 終止密碼子、和多聚腺苷酸化信號。另外，編碼免疫原性革巴標蛋白質(zhì) 的序列的表達經(jīng)常需要增強因子。如本領域已知，這些元件優(yōu)選可搡 作地連接至編碼期望蛋白質(zhì)的序列。優(yōu)選這些調(diào)控元件經(jīng)過選擇，在 其將被給予的物種中可操作。優(yōu)選該DNA構(gòu)建體為質(zhì)粒形式，并被 才參入病毒載體或細菌性載體中。最初，編碼FAP蛋白的DNA構(gòu)建體 可通過轉(zhuǎn)染，使用本領域熟知的方法摻入細菌性載體。隨后，可以培 養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細菌以提供細菌的備用菌種，該菌種包括在細菌的遺傳物 質(zhì)內(nèi)的FAPDNA。所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的細菌的培養(yǎng)提供用于本發(fā)明的DNA 組合物的備用源。
優(yōu)選起始密碼子和終止密碼子作為編碼FAP的核苦酸序列的一部分 包括在本發(fā)明的DNA組合物之中。起始密碼子和終止密碼子必須與 編碼序列在同一個框內(nèi)。
優(yōu)選本發(fā)明的組合物中所包括的啟動子和多聚腺苷酸化信號經(jīng) 過選擇，而在待免疫的受試者的細胞內(nèi)具有功能性。
用于本發(fā)明組合物的、特別是產(chǎn)生用于人的基因疫苗DNA組合 物的啟動子的實例，包括一(旦不限于來自猿猴病毒40 (SV40)的啟動子、 小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子、人類免疫缺陷病毒(HIV)如HIV長 末端重復(LTR)啟動子、莫洛尼病毒、巨細胞病毒(CMV)如CMV直接 早期啟動子，埃巴病毒(EBV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)以及來自人基因的 啟動子，例如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸、 和人金屬硫蛋白的基因的啟動子。
用于本發(fā)明的DNA組合物的、特別是產(chǎn)生用于人的DNA組合物 的多聚腺苷酸化信號的實例包括但不限于SV40多聚腺苷酸化信號和 LTR多聚腺苷酸化信號。除DNA表達所需的調(diào)控元件之外，其它元件也可包括進DNA分 子中。這樣的附加元件包括增強子。該增強子可為，例如，人肌動蛋 白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸增強子和病毒增強子例如 來自CMV、 RSV和EBV的那些增強子。
調(diào)控序列和密碼子 一 般依賴于物種，因此為了最大化蛋白質(zhì)產(chǎn) 生，優(yōu)選調(diào)控序列和密碼子經(jīng)過選擇，以在待免疫的物種中有效的。 本領域技術(shù)人員可制備在給定受試物種中具有功能性的DNA構(gòu)建體。
用于本組合物的DNA構(gòu)建體可為"棵"DNA,如在Restifo等Gewe 7T^ra/^2000; 7:89-92中定義，其相關(guān)公開通過引用結(jié)合到本文中。 優(yōu)選該DNA構(gòu)建體為質(zhì)粒形式或為被摻入減毒病毒或減毒細菌的遺 傳物質(zhì)中的DNA。有用的遞送載體(viehicle或carrier)包括可生物降解 的微膠嚢、免疫激活復合物(ISCOM)、用于棵DNA構(gòu)建體的脂質(zhì)體、 和用于經(jīng)遺傳工程改造的減毒活病毒或減毒活細菌的各種生理學可 接受的緩沖劑。
可被轉(zhuǎn)化以摻入FAP DNA構(gòu)建體的合適減毒活細菌性載體的實 例包括鼠傷寒沙門氏菌(5Wmowe〃a 0^A/mwn'wm」、傷寒沙門氏菌 (Sa/mwie〃a 0^/ ;)、志賀氏菌屬(5^^//^細菌、芽孢桿菌屬(Sac!7/iw」 纟田菌、乳酸桿菌(XflctoZ fl"'〃w力、卡介苗(Sfld〃e Ca//wg"g-Gwen'w) fSCG,大腸桿菌fEscAen'c/n'a co/"、霍亂弧菌(T/Z n'o cAo/erae,彎曲 桿菌(Taw;^/o^"e^、李斯特菌(丄Wen'a入或本領域已知的任何其它
合適的細菌性載體。優(yōu)選載體為減毒的活鼠傷寒沙門氏菌(^3/附0^//"
(y; /n'mw7'wmj載體，尤其當該組合物被預定為口服時。優(yōu)選的減毒活鼠 傷寒沙門氏菌(Sa/mo"e〃a 包括」ra^ -菌林例如SL7207，
或雙重減毒的\ c/am —菌林例如RE88。雙重減毒的v4ra^ -、 —鼠傷寒沙門氏菌(SWwowe〃a />p/ >mn'wm_;為特別優(yōu)選的載體。
本領域充分描述了用外源DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化活細菌性載體的方法。 參見，例如，Joseph Sambrook和David W. Russell, M /ecw/ar C7om'"g, J Z^,一 Mawwa/,第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York (2001) (Sambrook和Russell)。在轉(zhuǎn)化 之后，外源遺傳物質(zhì)被摻入細菌的遺傳物質(zhì)中，因此隨著細菌繁殖， 外源DNA與該生物體的天然DNA —起復制。因此，細菌一旦經(jīng)轉(zhuǎn)化， 生物的正常繁殖過程就提供外源DNA的備用供給。
優(yōu)選的病毒載體包括噬菌體、皰滲病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、 辛德比斯病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、痘苗病毒、和禽痘病毒。本領域也 充分描述了用外源DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化病毒載體的方法。參見上述的 Sambrook和Russell 。
有用的脂質(zhì)體載體為單層的或多層的嚢泡，并具有由親脂材料形 成的膜和內(nèi)部的水性部分。將水性部分用于本發(fā)明以包含待遞送至耙 細胞的多核苦酸材料。 一般優(yōu)選形成脂質(zhì)體的材料具有陽離子基團(例 如季銨基團)和一個或多個親脂基團(例如具有約6個-約30個碳原子 的飽和或不飽和烷基)。 一組合適的材料在歐洲專利公開第0187702號 中描述，在Wolff等的美國專利第6,228,844號中進一步論述，其有 關(guān)公開通過引用結(jié)合到本文中。在文獻中描述了許多其它合適的形成 脂質(zhì)體的陽離子脂類化合物。參見例如L. Stamatatos等，歷0cAew/W7 1988; 27: 3917-3925;和H. Eibl等，歷—CA纖'勿1979; 10: 261-271 ?；蛘撸墒褂梦⑶蝮w如共聚丙交酯-乙交酯 (polylactide-coglycolide)可生物降解的微球體。如本領域已知的，將核 酸構(gòu)建體裝入膠嚢或另外與脂質(zhì)體或微球體復合，用于將核酸釋放至 組織。
其它有用的載體包括包含可生物降解聚原酸酯材料的聚合微球 體，如Wang等，淑Ma紋,2004; 3(3): 190-6. Epub 2004年2月15 日中所描述的，其相關(guān)公開通過引用結(jié)合到本文中。
優(yōu)選用于本發(fā)明的組合物包含編碼人FAP或其功能性同源體的 DNA構(gòu)建體。FAP的功能同源體優(yōu)選具有與人FAP至少約80%氨基 酸殘基序列相似性，更優(yōu)選至少約90%，最優(yōu)選與人FAP至少約95% 相似性。GenBank是National Institutes of Health(NIH)的基因序列數(shù)據(jù)庫， 是所有公開可用的DNA序列的注解集合。GenBank是International Nucleotide Sequence Database Collaboration 的 一 部分，是DNA DataBank of Japan(DDBJ) 、 European Molecular Biology Laboratory(EMBL)、和National Center for Biotechnology Information的 GenBank的聯(lián)合成果。
編碼人FAP的cDNA的核酸序列，SEQ ID NO:l(圖7)已經(jīng)發(fā)表 在GenBank中，登記號為BC026250,.其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本 文中。人FAP的相應的氨基酸殘基序列為SEQ ID NO:2(圖8)。
編碼鼠類FAP的DNA的核酸序列，SEQ ID NO:3(圖9)已經(jīng)發(fā)表 在GenBank中，登記號為BC019190,其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本 文中。鼠類FAP的相應的氨基酸殘基序列為SEQ ID NO:4(圖10)。
由于遺傳密碼的固有簡并性，編碼人FAP的氨基酸序列的其它 DNA序列可用于本發(fā)明的實踐。這樣的DNA序列還包括能夠與人 FAP雜交的那些DNA序列。
核酸具有對于SEQ ID NO:l的那些核苷酸殘基而言不同的核苷酸殘基 的刪除、添加或取代，所述刪除、添加或取代產(chǎn)生編碼相同F(xiàn)AP基因 產(chǎn)物的序列。編碼人FAP的功能等效同源體的DNA分子也可用于本 發(fā)明的DNA組合物。
由核酸編碼的基因產(chǎn)物也可包含在FAP氨基酸殘基序列之內(nèi)的 氨基酸殘基的刪除、添加或取代，該刪除、添加或取代致使沉默的變 化(silent change),因此產(chǎn)生功能等效的FAP?？筛鶕?jù)相關(guān)殘基在極性、 電荷、溶解性、疏水性、親水性、和/或兩親性質(zhì)上的相似性進行這樣
的氨基酸取代。例如，帶負電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正 電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似親水性值的含不帶電的極 性頭基團的氨基酸包括以下亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸；甘氨酸、 丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。
20本文所用功能等效FAP是指包括一個或多個表位的蛋白質(zhì)，當被T
細胞識別時其允許這些相同的T細胞識別展示在表達FAP的細胞上的 FAP表位。在優(yōu)選的實施方案中，功能等效FAP具有對于人FAP的 氨基酸殘基序列(SEQ ID NO:2)而言具有至少約80%相似性、例如至少 約90%相似性或至少約95%相似性的氨基酸殘基序列。
可工程改造編碼FAP的DNA構(gòu)建體，以為了各種目的而改變 FAP編碼序列(相對于天然FAP cDNA， SEQ ID NO:l而言)，這些目 的包括但不限于修飾FAP基因產(chǎn)物的加工和表達的改變。例如，可使 用本領域熟知的技術(shù)如定點誘變在DNA中引入突變，以插入新的限 制酶切位點，改變糖基化模式、磷酸化作用等。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的DNA組合物包含編碼FAP 的DNA構(gòu)建體和可^t喿作地編碼至少一種免疫效應蛋白的DNA構(gòu)建 體，兩者都可在免疫細胞中表達。當用于本文和所附權(quán)利要求時，詞 組"免疫效應蛋白"意指參與免疫系統(tǒng)途徑的調(diào)控的蛋白質(zhì)。優(yōu)選所述 免疫效應蛋白為細胞因子。
細胞因子為由細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和多肽，可影響其它細胞的行 為，例如細胞增殖、細胞分化、免疫應答的調(diào)控、造血作用、和炎癥 反應。細胞因子已經(jīng)被劃分成許多家族，包括趨化因子、血細胞生成 素、免疫球蛋白、腫瘤壞死因子、和多種未確定的分子。 一般見Ox/oW ￡)/c"o a/7 o/ 5!'oc/ie/w'W^. a打c/ Afo/ecw/ar 5z'o/ogy， 4奮i丁片反，Oxford University Press， 2000; 和C. A. Janeway， P. Travers， M. Walport和 M. Schlomchik， /w顯加6/o/ogy,第五版，Garland Publishing， 2001(下 文稱"Janeway and Travers")。在Janeway and Travers ， 附錄III， 第 677-679頁介紹細胞因子的簡明分類，其相關(guān)公開內(nèi)容通過引用結(jié)合 到本文中。
血細胞生成素包括，例如促紅細胞生成素、白介素-2(IL-2，由T 細胞產(chǎn)生的133個氨基酸蛋白質(zhì)，與T細胞增殖有關(guān))、IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-9、 IL-ll、 IL-13、 IL-15 (114個氨基酸的IL-2樣蛋白質(zhì)，刺激腸上皮細胞、T細胞和NK細胞的生長)、粒細胞集落 刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、制瘤素 M(OSM)、和白血病抑制因子(LIF)。
干擾素包括例如IFN-a、 IFN-卩和IFN-y (由T細胞和NK細胞產(chǎn) 生的143個氨基酸的同源二聚體蛋白，參與巨噬細胞激活、MHC分 子表達增加和抗原處理成分增加、IG類型轉(zhuǎn)換、和Th2的抑制)。
免疫球蛋白包括，例如，B7.1(CD80)、和B7.2(CD86),兩者共同 刺激T細胞應答。
腫瘤壞死因子(TNF)家族包括，例如，TNF-a、 TNF-p(淋巴毒素)、 淋巴毒素-(3(LT-l3)、 CD40配體、Fas配體、CD27配體、CD30配體、 4-1BB配體、胂瘤壞死因子相關(guān)性凋亡誘導配體(Trail)和OPG配體。
本領域熟知CD40配體(CD40L)的生物學作用，尤其是在T細胞 活化的共同刺激期間其與在抗原呈遞細胞上表達的CD40的相互作 用。CD40為在所有成熟B細胞、大多數(shù)成熟B細胞惡性腫瘤、和一 些早期B細胞急性淋巴細胞性白血病的表面上表達的48 kDa糖蛋白， 但它不在漿細胞上表達，Clark, Z^we/l""gms 1990， 35:33-36。 CD40L: 約35 kDa的II型膜蛋白在抗原識別時在T細胞表面上表達。當作為 同源三聚體表達時，TNF家族的成員為生物學最有活性的。在這方面 CD40L也不例外，其可通過融合到該配體整個胞外結(jié)構(gòu)域N-末端的 33個氨基酸的亮氨酸拉鏈模體的修飾，作為同源三聚體(CD40LT)表 達。Gu畫than等，J,/wm/"o/ 1998， 161:4563已報導，CD40LTDNA 增強細胞免疫應答，例如當用編碼高免疫原性模型抗原P-半乳糖苷酶 治療小鼠時，誘導IFN-y和細胞溶解性T細胞活性。
CD40LT為在誘導對抗腫瘤自身抗原的有效保護性免疫所需要的 T細胞活化中的重要因子。 一旦負載抗原的MHCI類復合體被樹突細 胞(DC)吸收并呈遞給幼稚T細胞，第一抗原信號馬上通過T細胞受體 (TCR)釋放，增量調(diào)節(jié)CD40LT。然后CD40LT通過CD40與CD40LT 的相互作用在T細胞表面上誘導DC上的協(xié)同刺激活性。因此已接觸過抗原的這些APC可表達共同刺激性分子B7.1 (CD80)和B7.2 (CD86)，后兩者通過與CD28相互作用傳送第二共同刺激信號至T細 胞導致T細胞完全活化的事件，以同時產(chǎn)生促炎細胞因子INF-Y和 IL12, 4丸行效應物功能。
沒有分配到特定家族的許多細胞因子包括，例如，肺瘤生長因子 -卩(TGF-(3)、 IL-la、 IL-1卩、IL-1 RA、 IL-IO、 IL-12(自然殺傷細胞刺激 因子；具有197個氨基酸的鏈和306個氨基酸的鏈的異二聚體，與活 化NK細胞和誘導T細胞分化成丁Hl-樣細胞有關(guān))，巨噬細胞抑制因 子(MIF)、 IL陽16、 IL-17(細胞因子產(chǎn)生誘導因子，在上皮細胞、內(nèi)皮細 胞和成纖維細胞中誘導細胞因子產(chǎn)生)，和IL-18。
趨化因子為細胞因子的家族,所述細胞因子為相對小的化學引誘 物蛋白質(zhì)和多肽，該家族刺激各種細胞(如吞噬細胞和淋巴細胞)的遷 移和活化，例如白細胞遷移。趨化因子在炎癥和其它免疫應答中起作 用。趨化因子已經(jīng)被劃分成許多家族，包括C趨化因子、CC趨化因 子、CXC趨化因子、和CX3C趨化因子。這些名稱是指分子中的半胱 氨酸(C)殘基的數(shù)目和間隔;C趨化因子具有一個半胱氨酸，CC趨化 因子具有兩個相鄰的半胱氨酸，CXC具有被單個氨基酸殘基分隔的兩 個半胱氨酸，CX3C趨化因子具有被三個氨基酸殘基分隔的兩個半胱 氨酸。趨化因子與存在于細胞表面的許多趨化因子受體相互作用。見 Janeway和Travers，附錄IV,第680頁，通過引用結(jié)合到本文中。
另外，趨化因子可具有免疫調(diào)節(jié)活性，并參與對癌癥的免疫應答。 例如，鼠類6Ckine/SLC，小鼠的人次級淋巴組織趨化因子(SLC)(現(xiàn)在 通常稱為CCL21)類似物已被報導在C26結(jié)腸癌腫瘤細胞系中引出抗 腫瘤應答。見Vicari等，J. 7www"o/. 2000; 165(4): 1992-2000。人 CCL21及其鼠類相應物6Ckine/SLC被歸類為CC趨化因子，與CCR7 趨化因子受體相互作用。Vicari等報導鼠類6Ckine/SLC (muCCL21) 也是CXCR3趨化因子受體的配體。人CCL21、鼠類muCCL21和多種其它趨化因子參與到各種免疫系統(tǒng)細胞如樹突細胞、T細胞和自然
殺傷(NK)細胞的調(diào)節(jié)。
Mig和IP-10為與和激活的T細胞有關(guān)的CXCR3受體相互作用 的CXC趨化因子。淋巴細胞趨化蛋白為與和T細胞以及NK細胞有 關(guān)的XCR1受體相互作用的C趨化因子。Fractalkine為與和T細胞、 單核細胞以及嗜中性白細胞有關(guān)的CX3CR1受體相互作用的CX3C趨 化因子。
由本發(fā)明的DNA組合物編碼的特別優(yōu)選的免疫效應蛋白包括細 胞因子IL-2 (血細胞生成素)、CCL21(趨化因子)、以及CD40配體如 CD40配體三聚體(CD40LT)、 TNF家族細胞因子。
人IL-2的DNA和蛋白質(zhì)序列已經(jīng)發(fā)表于GenBank中，登記號為 BC070338,其公開通過引用結(jié)合到本文中。鼠類IL-2的DNA和蛋白 質(zhì)序列已經(jīng)發(fā)表于GenBank中，登記號為NM 008366，其公開內(nèi)容 通過引用結(jié)合到本文中。
編碼人IL-2的核酸序列呈現(xiàn)于圖11中(SEQIDN0:5),其相應的 氨基酸殘基序列(SEQIDNO:6)在圖12中提供。編碼鼠類IL-2的核酸 序列呈現(xiàn)于圖13中(SEQIDNO:7),其相應的氨基序列(SEQ ID NO:8) 在圖14中提供。
人CCL21的DNA和蛋白質(zhì)序列已經(jīng)發(fā)表于GenBank中，登記號 為AB002409,其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。鼠類CCL21a變 體的DNA和蛋白質(zhì)序列已經(jīng)發(fā)表于GenBank中，登記號為 NM011335，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。鼠類CCL21b變體 的DNA和蛋白質(zhì)序列已經(jīng)發(fā)表于GenBank中，登記號為NM011124， 其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合刊登于本文中。
編碼人CCL21的核酸序列呈現(xiàn)于圖15中(SEQIDNO:9)，其相應 的氨基酸殘基序列(SEQ ID NO:10)在圖16中提供。編碼鼠類CCL21 (CCL21b變體)的核酸序列呈現(xiàn)于圖17中(SEQ ID NO:ll),其相應的 氨基序列(SEQEDNO:12)在圖18中提供。在圖19中展示人CCL21與其鼠類相應物(鼠類CCL21b)之間的蛋 白質(zhì)序列相似性。在人CCL21 (SEQ ID NO:10)與鼠類CCL21b(SEQ ID NO:12)之間具有約73%的氨基酸殘基序列同一性。編碼鼠類CCL21的CCL21a變體的核S^f列呈現(xiàn)于圖20中(SEQ IDNO:13)，其相應的氨基酸序列(SEQIDNO:14)在圖21中提供。人CD40配體(CD40L)為261個氨基酸的蛋白質(zhì)，其以最有活性 的形式作為三聚體(CD40LT)存在。編碼人CD40L(也稱為CD154)的 DNA序列已經(jīng)發(fā)表于GenBank中，登記號為NM 000074，其公開內(nèi) 容通過引用結(jié)合到本文中(圖22， SEQIDNO:15)。 CD40L的相應蛋白 質(zhì)序列在圖23中顯示(SEQ IDNO:16)。本發(fā)明的方法方面包括給予哺乳動物包含DNA構(gòu)建體的DNA 組合物，該DNA構(gòu)建體編碼可在哺乳動物的免疫細胞中表達的FAP。 優(yōu)選所述哺乳動物為人。該組合物可經(jīng)口、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮 下、皮內(nèi)、或局部地進行給藥，視該組合物被制備的特定劑型而定。 優(yōu)選以口服給藥劑型制備該組合物，例如溶液、混懸液、乳劑、膠嚢、 片劑等?？墒褂帽景l(fā)明的DNA組合物以在接受該組合物治療的患者中提 供腫瘤生長和/或腫瘤轉(zhuǎn)移的長期抑制。在一個優(yōu)選的實施方案中，所 述DNA組合物與抗腫瘤化療藥物^:合給予。該DNA組合物可與化療 藥物一起以組合劑型給藥，或者該組合物和化療藥物可以以單獨劑型 并以適合待給予化療藥物藥理學的單獨劑量間隔進行給藥。與本發(fā)明的DNA組合物聯(lián)用的化療藥物包括抗腫瘤劑例如多 柔比星、紫杉醇、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、氨甲蝶呤等。本發(fā)明的DNA組合物優(yōu)選用藥學上可接受的載體或賦形劑例如 水、鹽水、葡萄糖、甘油等及其組合配制，以輔助組合物的配制成制 劑和給予。該組合物也可包含輔助物質(zhì)例如潤濕劑、乳化劑、緩沖劑、 和制藥領域熟知的其它輔助物質(zhì)。優(yōu)選將本發(fā)明組合物作為藥學上可接受的載體中的溶液或混懸液，以基于FAP編碼DNA的重量計算約1 -約10微克/毫升的DNA 濃度，經(jīng)口給予哺乳動物例如人。用于本發(fā)明的DNA組合物的特別 優(yōu)選的劑型為在合適的緩沖溶液中的經(jīng)FAP轉(zhuǎn)染的減毒細菌的混懸 液，該劑型可配制用于口服給藥。該組合物的合適的劑量取決于欲治 療的受試者，取決于組合物的活性，部分地取決于醫(yī)師對給藥或給予 該組合物的要求的判斷。如果將使用多于一次的給藥，那么給予哺乳動物的劑量和給藥方 案將根據(jù)不同的哺乳動物和劑型而改變。有效劑量和給藥方案可通過 臨床劑量-反應研究憑經(jīng)驗確定，如本領域所熟知。選擇劑量和給藥方 案以提供免疫細胞中的足量的FAP表達，以刺激哺乳動物的免疫應答 對抗存在FAP抗原的細胞。優(yōu)選給予受試哺乳動物的組合物的劑量在 哺乳動物的免疫細胞中刺激足量的FAP抗原表達，以維持對抗存在 FAP的細胞的免疫應答，所述免疫應答將持續(xù)至少1個月，例如至少 6個月或至少約1年的時期。本發(fā)明的組合物可以多劑量或單位劑量的形式包裝在適當滅菌 的容器例如安瓿、瓶、或小瓶中。優(yōu)選在裝入本發(fā)明的DNA組合物 之后密封容器。優(yōu)選該組合物被包裝在具有附貼標簽的容器中，該標 簽標識該組合物，并以政府才幾構(gòu)例如United States Food and Drug Administration規(guī)定的形式的反映合適的法律下該組合物的批準、劑量 信息等的告示。該標簽優(yōu)選包含對保健專業(yè)人員將所述組合物給予患 者有用的、關(guān)于組合物的信息。該包裝還優(yōu)選包含關(guān)于組合物的給藥、 用法說明、適應癥和任何必要的警告的印刷信息材料。提供以下實施例以進一步闡述本發(fā)明的特征和實施方案，這些實 施例并不旨在限制。材料、方法和實施例.動物、細菌菌種、和細胞系。雌性BALB/c小鼠，6-8周齡，得 自Scripps Research Institute (TSRI) Rodent Breeding Facility。所有的動物實-瞼均依照關(guān)于Care and Use of Laboratory Animals的National Institutes of Health Guide 4丸4亍，并經(jīng)TSRJ Animal Care Committee批 準。雙重減毒的鼠傷寒沙門氏菌fSfl/mowe〃a ^p/n'mwn'ww)菌株RE88 (^rov4 — dam —)由Remedyne Corporation (Santa Barbara, Califomia)4是供。 鼠類D2F2乳腺癌細胞得自Dr. Wei-Zen Wei， Karmanos Cancer Center, Detroit, MI,而CT26結(jié)腸癌細胞得自ATCC (Manassas, Virginia),然 后將這些細胞培養(yǎng)幾個月，以獲得化學抗性的亞克隆。在1% DMSO、所述濃度的依托泊苦、5-氟尿嘧啶、多柔比星、 長春堿或紫杉醇(Sigma, St. Louis, Missouri)的存在下，培養(yǎng)鼠類CT26 和D2F2癌細胞。在48小時之后，在與DNA特異性Hoechst 33342 染料(2 (iM; Molecular Probes, Eugene, Oregon)溫育之后，計數(shù)凋亡的纟田 胞核。CT26結(jié)腸癌細胞和D2F2乳腺癌細胞的兩個克隆分別具有獲得性 化學抗性(見圖1,分圖C)。在將五種不同的誘導凋亡的化療藥物添加 至CT26結(jié)腸癌克隆(圖1，分圖C)時，唯獨長春堿能夠誘導輕度的細 胞凋亡效應，然而僅在5 的非常高的濃度下。對于5-氟尿嘧啶(5-FU) 而言，原始的母CT26細胞系(ATCC存CLR-2326)的1(:50為約1.85岸， 然而5-FU甚至在高達100 (iM的濃度時仍不能在抗性CT26克隆中誘 導細胞核的凋亡。在抗性D2F2乳腺癌細胞中，根據(jù)Hoechst-33342 染料染色所確定，唯獨多柔比星在l pM的最高濃度時能夠誘導細胞 核的凋亡。這些結(jié)果證明這兩種腫瘤細胞系均為多重耐藥的。統(tǒng)計分析。通過學生t檢驗確定實驗組和對照之間差異數(shù)據(jù)的統(tǒng) 計學顯著性。通過曼-惠特尼檢驗確定轉(zhuǎn)移評分的顯著性。通過log-rank 檢驗確定存活數(shù)據(jù)的顯著性。假如P值0.05，那么數(shù)據(jù)被視為具有顯 著性。實施例l.編碼鼠類FAP的DNA組合物1的制備.將編碼鼠類FAP (SEQ ID NO: 4,圖IO)的cDNA(SEQ ID NO: 3,圖 9;由Dr. J. D, Cheng提供)亞克隆入pcDNA3.1/V5-His-TOPO載體 (Invitrogen, San Diego, California)的五coW限制性酶切位點，以得到真 核生物表達載體pcDNA3.1-FAP (pFAP)(見圖1，分圖A)。通過對來 自經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染的CT26結(jié)腸癌細胞的溶胞產(chǎn)物進行蛋白質(zhì)印跡，來證 明來自上述載體的95kDaFAP蛋白的正確表達，該結(jié)腸癌細胞本身不 表達FAP(圖1，分圖B)。對經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染的D2F2乳腺癌細胞也進行同 樣處理。對于瞬時轉(zhuǎn)染而言，對CT26和D2F2細胞如先前所迷進行 電穿孔(見Loeffer等，薦戰(zhàn)2001， 15: 758-767,通過引用結(jié)合到 本文中)。通過蛋白質(zhì)印跡法用多克隆兔抗鼠類FAP抗體(由Dr. J. D. Cheng提供)，來證明FAP蛋白質(zhì)表達。如下制備DNA組合物1:按照制造商推薦的方法，利用Bio-Rad 脈沖發(fā)生器在2kV、 960 jaF、和200Ohm下，將pcDNA3.1-FAP栽體 (約2昭的pDNA)電穿孔入新制備的雙重減毒的鼠傷寒沙門氏菌 (5a/mo e//a ^; /n'mwn'MW」(菌林RE88)。在含氨千青霉素的平板上選擇 包含所述載體的減毒的鼠傷寒沙門氏菌(^a/mo"e//a &/ / >m/〃'ww,第 二天挑取菌落，菌落在添加氨千青霉素的LB肉湯(10g蛋白胨，5g酵 母提取物，10g氯化鈉；EM Science, Gibbstown,NJ)中培養(yǎng)過夜。分離 細菌并在磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌。然后將洗涂的細菌懸浮在PBS 介質(zhì)(medium)中，濃度為約109個重組沙門氏菌(5Wwo"e〃a, /毫升 PBS,以形成含以下DNA構(gòu)建體的DNA組合物1溶液該DNA構(gòu) 建體可操作地編碼鼠類FAP且摻入減毒的鼠傷寒沙門氏菌〈6Wwone〃a (y; /n'mim'wmj (vira/i- c/am —)載體中。將該組合物貯藏在密封的安瓿中直 至使用。也依照同樣的方法制備由單獨用pcDNA3.1載體(不含F(xiàn)AP DNA)轉(zhuǎn)化的沙門氏菌「*^/附0^//^組成的"對照疫苗"。在對沙門氏菌 Pa/m卵e"flJ進行轉(zhuǎn)化之前，將質(zhì)粒DNA貯藏在約-80。C下。在構(gòu)建如上所述(圖1 ，分圖A)的真核生物表達載體 pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Fap (pFap)之后，通過對來自經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染的CT26結(jié)腸癌細胞和D2F2乳腺癌細胞的溶胞產(chǎn)物的進行蛋白印跡，來 證明88kDaFAP蛋白的正確表達，這些細胞本身不能表達FAP(圖1， 分圖B)。實施例2.編碼鼠類FAP、鼠類IL-2、和鼠類CCL21的DNA組合 物2的制備.通過在實施例1中描述的相同的一般方法，將來自ATCC,登記 號39892, Manassas, Virginia的編碼鼠類IL-2的cDNA (DNA SEQ ID NO:5)、和來自Invitrogen, San Diego， California的鼠類CCL21a的 cDNA (DNA SEQ ID NO:7)亞克隆到實施例1的鼠類pFAP載體中。通 過在實施例1中所描述的方法，用所產(chǎn)生的載體(pFAP/IL-2/CCL21) 轉(zhuǎn)化RE88鼠傷寒沙門氏菌(3"a/mowe^0;/ /u'wwWwm,以提供包含以下 DNA構(gòu)建體的DNA組合物2溶液該DNA構(gòu)建體可操作地編碼鼠 類FAP、鼠類IL-2、和鼠類CCL21a，且被摻入減毒的鼠傷寒沙門氏 菌fSa/附o"e〃a ^y; /^wwn'w^載體中。實施例3.本發(fā)明的DNA組合物在結(jié)腸癌和乳腺癌的鼠類模型中的 評估.口服接種，腫瘤細胞攻擊和用多柔比星治療.對于預防設置 (prophylactic setting)中的實驗而言，通過用包含約109個鼠傷寒沙門氏 菌0. (Kp/n'mMn'wm)04m4 Jam—)的約100 )al PBS的口服管飼法，按約 1周間隔對BALB/c小鼠(/ =8)接種3次，該鼠傷寒沙門氏菌(3". 0^Wmwn'wm)為用編碼鼠類FAP的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的鼠傷寒沙門氏菌 (實施例1的DNA組合物1)、用編碼鼠類FAP、 IL-2和CCL21的載 體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的鼠傷寒沙門氏菌(實施例2的DNA組合物2)、或?qū)嵤├?1的對照疫苗，上述過程通過使用在Niethammer,等.，A^, Mec/., 2002, 8: 1369-1375中描述的方法來進行。在隨后的約10天，通過在左前脅29腹皮下(s.c.)注射約3 x 104 CT26結(jié)腸癌細胞或通過在左邊最下面第二 乳腺脂肪墊原位(o.t.)注射約3 x 105D2F2乳腺癌細胞，來對動物攻擊。 通過以2維(即長和寬，以毫米為單位)測量腫瘤并按長度的一半 乘以寬度的平方計算體積，來計算出腫瘤體積(以mn^為單位)。在治 療設置中，通過靜脈內(nèi)(i.v.)注射約1 x io5 CT26結(jié)腸癌細胞來進4亍起 始的肺瘤細胞接種，在此之后約3天和10天通過用對照疫苗或活性 DNA組合物來進行口服接種。在約18天之后，對肺稱重(正常肺重為 約0.2 g)，并通過目測評估被融合的轉(zhuǎn)移灶覆蓋的肺表面百分比，來 對肺部腫瘤轉(zhuǎn)移情況進行檢查和評分，評分方法如下0%的覆蓋度 為0分，小于約20%的覆蓋度為l分，約20%-50%的覆蓋度為2分， 大于約50%的肺表面被覆蓋為3分。在腫瘤攻擊之后的5、 10和15 天，用靜脈內(nèi)給藥的約10 mg/kg多柔比星(Sigma)對各組小鼠進行多 柔比星治療。
為了去除CD4+和CD8+T細胞或NK細胞亞群，從用腫瘤細胞攻 擊的前1天開始，每隔7天腹膜內(nèi)(i.p，)注射靶向均來自National Cell Culture Center (Minneapolis, Minnesota)的CD4(克隆GK1.5)或CD8(克 隆2.43)的抗體(500昭)，或抗脫唾液酸的GM1抗體(Wako BioProducts, Richmont, Virginia)<
cd8+t細胞的細胞毒性.在按1周間隔的最后3次治療之后約10 天，收集來自各已治療組的BALB/c小鼠(>1=4)的脾細胞。使用CD8a 微珠(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach，Germany)，按照制造商的實 驗方案純化CD8+細胞。然后使這些細胞與經(jīng)y -照射(IOOO Gy, 45分鐘) 的CT26細胞共培養(yǎng)5天來進行刺激，所述CT26細胞用 pcDNA3.1/Zeo(實施例1的空載體)或pcDNA3.1/Zeo-FAP(實施例1的 pFAP載體)瞬時轉(zhuǎn)染。此后，使CD8+T細胞與CT26癌細胞(E:T-100:1) 共培養(yǎng)，后者已用作為對照的綠色熒光蛋白(GFP)、 (PEGFP; Clontech, Palo Alto, Califomia)或GFP加上編碼鼠類FAP的pFAP質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染。在約48小時之后，如上所述用DNA特異性Hoechst 33342染料(2pM) 來評估細胞核的凋亡。
為了進行51Cr釋放試驗，按周為間隔對Balb/c小鼠(『3)治療4 次。脾細胞在最后一次治療之后13天收獲，并與經(jīng)Y照射(約1000 Gy, 45分鐘)的用pF叩進行逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的A31成纖維細胞(ATCC, Manassas, Virginia)孵育5天。然后使受激的脾細胞與經(jīng)標記的 A31-pFap孵育約4小時，并計算溶解百分比。還使細胞與濃度為約 10 pg/ml的抗-MHC I類抗體(BD Biosciences, Rockville, Maryland)共 孵育。
免疫組織化學。使冷凍切片(約8(xm厚)固定于丙酮中并拉緊。在 與初級抗體(多克隆兔抗-鼠類FAP抗體(由Dr. J. D. Cheng提供)或多克 隆兔抗-鼠類I型膠原抗體(Chemicon, Temecula, California))溫育之后， 依照制造商的實驗方案(DAKO LSAB+試劑盒，過氧化物酶，DAKO, Carpinteria， California)使切片免疫染色。
為了進行聚焦顯微鏡檢查法，固定的冷凍切片用抗-鼠類CD8抗 體、生物素化的抗-鼠Ig次級抗體、經(jīng)FITC標記的鏈霉抗生物素蛋白 (BD Bioscience, Rockville, Maryland)染色，并用DAPI (Sigma, St. Louis, Missouri)共染。使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)來獲取圖像，使用 Zeiss Image Examiner軟件(Carl Zeiss)處理該圖像。為了進行T細胞浸 潤的FACS分析，用pFap或空載體按每周為間隔治療Balb/c小鼠 0=6)3次。在最后一次治療之后的一周，用約3xl05CT26腫瘤細胞 皮下(s.c.)攻擊動物。在3周后采集腫瘤，并通過在補充有I型膠原酶 (125U/ml;GIBCO,Gaithersburg,Maryland)的培養(yǎng)基中孵育切成薄片的 腫瘤組織45分鐘，來制備單細胞懸浮液。在過濾之后，對兩種小鼠 的細胞進行混合(pool)，用抗-CD3+PerCp-Cy5.5和抗-CD8+FITC(BD Biosciences, Rockville，Maryland)染色，并用FACS進行分析。
螢光素、伊文思藍白蛋白和"C-5-氟尿嘧啶的瘤內(nèi)吸收。在用對 照疫苗(實施例1)、 DNA組合物l(實施例l)或DNA組合物2(實施例2)按1周為間隔治療3次的最后1次之后，在10天后通過在左前脅腹 皮下注射約3 x 104個CT26細胞來攻擊小鼠。在此后約19天，給小 鼠腹膜內(nèi)(i.p.)注射按約12pl/g體重計算的1 %螢光素鈉(Sigma),靜脈 內(nèi)(i.v.)注射約lOOjil伊文思藍白蛋白(Sigma),或靜脈內(nèi)(i.v.)注射約 2.5(iCi的"C-5-氟尿嘧咬(Sigma)。分別在約5分鐘、30分鐘或1小時 之后處死小鼠，以分別在490nm、 612nm處、或以y-計數(shù)器測定腫瘤 勻漿上清液的吸收或閃爍。
為了測定瘤內(nèi)的多柔比星吸收，用約5x IO5 D2F2細胞在右脅腹 皮下(s.c.)攻擊Balb/c小鼠0=4)。 16天后靜脈內(nèi)(i.v.)多柔比星 (10mg/kg),并在此后45分鐘采集腫瘤。使用在1100系列LC-MS上 的Eclipse XCB-C8柱(Agilent, Foster City，California),對照內(nèi)標柔紅霉 素來測量樣品。
潛在的副作用的評估。為了確定對傷口愈合的任何有害作用，對 小鼠施行外科手術(shù)制造傷口 。在按1周.間隔的3次治療中的最后一次 之后約10天，用皮膚打孔器(Miltex Inc., Bethpage, New York)在 BALB/c小鼠(^=4)的上背部造成約3 mm直徑的圓形傷口。測量傷口 閉合所需的時間。盡管事實上FAP在傷口愈合期間過量表達，但本發(fā) 明的組合物不干擾傷口愈合過程。在經(jīng)治療的BALB/c小鼠("=4)的背 部施以約3 mm直徑的圓形傷口之后，觀察到經(jīng)治療小鼠和未治療小 鼠之間的傷口愈合無顯著差異。為了進行組織學分析，在檢查之前7、 14、 21天對經(jīng)治療小鼠施加傷口。由小鼠病理學家進行皮膚活組織檢 查，以及檢查26種器官和組織。
用基于FAP的DNA組合物的預防性治療抑制原發(fā)性腫瘤生長。 在用對照疫苗(實施例1)、DNA組合物l(實施例1)或DNA組合物2(實 施例2)按1周間隔3次治療中的最后一次之后的10天，如上所述用 CT26結(jié)腸癌細胞在皮下攻擊或用D2F2乳腺癌細胞原位攻擊不同組的 BALB/c小鼠("=8)。本發(fā)明的DNA組合物抑制多重耐藥性CT26細胞 (圖2fl)、以及耐藥性D2F2細胞(圖2^的原發(fā)性腫瘤生長。編碼FAP、CCL21、和IL-2的組合的DNA組合物2,對抑制原發(fā)性腫瘤生長是 近似等效的(圖2力。
本發(fā)明的DNA組合物減少在治療設置中已確立的轉(zhuǎn)移的生長。 在用約1 x io5 CT26結(jié)腸癌細胞初次靜脈內(nèi)接種之后3天和10天，用 實施例1的DNA組合物1治療的BALB/c小鼠與用實施例1的對照 疫苗治療的小鼠相比，前者導致實驗性肺轉(zhuǎn)移顯著減少。相反，對照 組的小鼠顯示大范圍的轉(zhuǎn)移并在腫瘤細胞接種之后的18天開始死亡 (圖^)。相似地，pFAP單獨與pCCL21的組合也是近似等效的(圖M)。
CD8+T細胞提供有效的抗腫瘤免疫應答。小鼠用DNA組合物 l(實施例l)按1周間隔靜脈內(nèi)(i.v.)治療3次，并用約1 x 105 CT26細 胞攻擊。然后在效應期用抗CD4+或CD8+T細胞抗體、以及抗NK細 胞的抗體對小鼠進行去除其相應的效應細胞處理(圖3,分圖A)。 CD4+ 細胞和NK細胞的去除不降低pFAP治療的效杲，表明CD8+ T細胞在 免疫應答中起重要作用。
為了評估用本發(fā)明的FAP DNA組合物治療能夠打破外周T細胞 對FAP自身抗原耐受的程度，純化來自用pFAP或空載體轉(zhuǎn)染的細菌 治療的動物的CD8+ t細胞。這些細胞然后用經(jīng)y照射的腫瘤靶細胞 剌激，并與用作為對照的GFP或GFP/pFap瞬時轉(zhuǎn)染的肝臟腫瘤靶細 胞孵育。如圖3,分圖B所示，根據(jù)通過用Hoechst-33342染料對經(jīng) pFap轉(zhuǎn)染的靶細胞進行染色的評估，只有從用pFap治療的小鼠純化 的CD8+T細胞能夠誘導細胞核的凋亡。
經(jīng)治療小鼠的脾細胞也用于常規(guī)的"Cr-釋放試驗。為了該目的， 來自用組合物1和對照疫苗治療的小鼠的脾細胞與用pFap進行逆轉(zhuǎn) 錄病毒感染的經(jīng)Y照射的A31成纖維細胞孵育5天。經(jīng)刺激的脾細胞 然后與標記的A31-pFap細胞孵育4小時，并計算溶解的百分比。在 耙細胞對效應細胞的比例為1:100和1:25時，來自用組合物1治療的 小鼠的脾細胞能夠比空載體對照顯著溶解更多的成纖維細胞(圖3,分 圖C)。與抗-MHCI類抗體共孵育消除該效應(圖3，分圖D)。
33在此外的評估中，用組合物1或?qū)φ找呙缰委熜∈?次，然后用
約3x 104 CT26腫瘤細胞攻擊，以研究在經(jīng)pFap治療的小鼠的胂瘤中 的CD8+T細胞浸潤。在3周之后，采集腫瘤，并對單細胞懸浮液中 的CD3+和CD8+細胞染色，并通過FACS分析。當與空載體對照比較 時，用組合物1治療的小鼠顯示腫瘤組織中的CD3+、 CD8+細胞顯著 增加(圖3，分圖E)。
也用抗-CD8 FITC和DAPI核染劑對腫瘤切片染色。使用共聚焦 顯微鏡，用組合物1治療的小鼠的肺瘤比用實施例1的對照疫苗接種 的小鼠顯示更顯著的CD8+細胞浸潤(圖3,分圖F)。總之，這些發(fā)現(xiàn) 證明輩巴向FAP的本發(fā)明的DNA組合物可以克服外周T細胞對FAP 自身抗原的耐受。
I型膠原表達的抑制增加瘤內(nèi)的染料吸收。成纖維細胞是I型膠 原的原始來源，已經(jīng)報道該分子的表達與不同分子量的化合物的瘤 內(nèi)吸收呈反向相關(guān)。為了評價該同樣的機制是否能應用至本發(fā)明的 DNA組合物，經(jīng)治療的疫苗的小鼠的腫瘤切片用抗FAP的抗體(圖4， 分圖A，上面的照片)或抗I型膠原的抗體(圖4，分圖A,下面的照片) 染色。用組合物1治療的小鼠組別與僅用對照疫苗(實施例l)治療的小 鼠組別相比，在前者中檢測到FAP以及I型膠原表達的減少。用相同 抗體染色的這些腫瘤提取物的相應蛋白印跡顯示FAP表達減少約 82.63 ± 2.54%(圖4,分圖B，上面的照片)而I型膠原表達減少約76.36 ±2.01%(圖4,分圖B,下面的照片)。
然后用大小和結(jié)構(gòu)上不同的三種化合物注射小鼠即如上所述的 螢光素(376Da)(圖4,分圖C)、伊文思藍白蛋白(68,500 Da)(圖4，分 圖D)或化療藥物5-氟尿嘧啶(130 Da)(圖4,分圖E)。用pF叩DNA組 合物1治療的小鼠的腫瘤比給予對照疫苗的小鼠的腫瘤顯著結(jié)合更多 (pO,05)的這些相應的分子。
DNA組合物和化學療法的聯(lián)合導致腫瘤排斥。用本發(fā)明的DNA 組合物免疫接種與D2F2細胞部分敏感的化學治療藥多柔比星聯(lián)合，開發(fā)了治療方案(圖l,分圖C)。用實施例1的對照疫苗、或?qū)嵤├?
的組合物1治療BALB/c小鼠("=8)。然后用D2F2乳腺癌細胞原位攻 擊經(jīng)治療的小鼠。然后在肺瘤攻擊之后5、 10和15天用多柔比星或 作為對照的PBS治療這兩組小鼠。如圖5，分圖A所示，用免疫療法 (組合物1)或化學療法單獨治療僅能抑制肺瘤生長、但不能根除。相反， 用組合物1和多柔比星聯(lián)合治療的小鼠組不僅顯示腫瘤生長的顯著抑 制，而且在8只小鼠中的4只中完全排斥腫瘤(圖5,分圖A)。
在按治療設置的另 一聯(lián)合治療方法中，用D2F2腫瘤細胞靜脈內(nèi) (i.v.)攻擊BALB/c小鼠("=8)。在5天之后待轉(zhuǎn)移一旦確立，就用組合 物l每周1次治療小鼠。在每次治療之后一天，用多柔比星靜脈內(nèi)(i.v.) 注射小鼠。該聯(lián)合治療導致這些小鼠的壽命超過對照小鼠的3倍，所 述對照小鼠單獨用多柔比星或組合物1治療，并在35 -45天后已經(jīng) 死亡(圖5,分圖B)。
本發(fā)明的FAPDNA組合物增加多柔比星的瘤內(nèi)吸收。為了測定 腫瘤組織中的多柔比星濃度，用組合物1以1周的間隔治療小鼠(n-4) 3次，7天以后用5 x 105 D2F2腫瘤細胞進行攻擊，并在16天以后用 多柔比星進行靜脈內(nèi)(i.v.)注射。用液相色譜/質(zhì)譜法(LC-MS)測定瘤內(nèi) 的藥物濃度。與對照相比，用組合物1治療的小鼠的組織顯示腫瘤中 多柔比星吸收的顯著增加(圖6，分圖A)。這些結(jié)果與在用螢光素、白 蛋白和5-氟尿嘧啶治療的小鼠中觀察到的腫瘤的化學滲透一致(圖4， 分圖C-D)。
針對FAP的DNA疫苗不削弱傷口愈合或損傷正常組織。因為在
傷口愈合期間FAP會過量表達，所以要研究本發(fā)明的DNA組合物對 傷口愈合的作用。在經(jīng)治療的BALB/c小鼠("=4)的背上施以直徑約3 mm的圓形傷口。令人意想不到的是，觀察到經(jīng)治療小鼠和未治療小 鼠之間的傷口愈合無顯著性差異(圖6，分圖B)。由小鼠病理學家在不 同的時間點之后對這些傷口的組織學鑒定顯示在傷口愈合過程中無 任何定性的異常情況。為了排除由本發(fā)明的DNA組合物誘導的任何自身免疫反應，對以下組織和器官進行廣泛組織學鑒定皮膚、腦、
脊髓、肌肉、骨、滑膜、心臟、主動脈、肺動脈、胸腺、脾臟、淋巴 結(jié)、骨髓、曱狀旁腺、腎上腺、腎臟、子宮、陰道、陰蒂腺、舌、肝 臟、肺臟、胰臟、胃、小腸和結(jié)腸。觀察到與對照小鼠相比沒有可辨 別的差異。
上述實施方案的許多變更和修改可以在不脫離本發(fā)明新穎特征 的精神和范圍下起作用。就本文舉例說明的具體實施方案而論，無意 或不應該推斷任何限制。
權(quán)利要求
1. 包含DNA構(gòu)建體的DNA組合物，所述DNA組合物有效刺激對抗腫瘤基質(zhì)細胞的免疫應答，所述腫瘤基質(zhì)細胞表達成纖維細胞激活蛋白(FAP)，所述DNA構(gòu)建體編碼可在免疫細胞中表達的FAP的至少一個表位且被摻入藥學上可接受的載體中。
2. 權(quán)利要求1的DNA組合物，其中所述DNA構(gòu)建體編碼人FAP(SEQ ID NO: 2)或與其有至少80%序列相似性且包括人FAP的至少一個表位的蛋白。
3. 權(quán)利要求1的DNA組合物，其中所述DNA構(gòu)建體編碼人FAP(SEQ ID NO: 2)。
4. 權(quán)利要求1的DNA組合物，其中所述DNA構(gòu)建體為棵DNA構(gòu)建體。
5. 權(quán)利要求4的DNA組合物，其中所述棵DNA構(gòu)建體為質(zhì)粒的形式。
6. 權(quán)利要求1的DNA組合物，其中所述DNA構(gòu)建體凈皮摻入減毒的病毒載體中。
7. 權(quán)利要求1的DNA組合物，其中所述DNA構(gòu)建體被纟參入減毒的細菌性載體中。
8. 權(quán)利要求7的DNA組合物，其中所述減毒的細菌性載體為減毒的鼠傷寒沙門氏菌(5Wwo"e〃a (v/ /n'mwn'ww,
9. 權(quán)利要求1的DNA組合物，其中所述DNA構(gòu)建體為基本上純化的DNA，所述DNA具有由SEQIDNO:l組成的多核苷酸序列、或與其具有至少約80%序列相似性的多核苷酸序列。
10. 權(quán)利要求9的DNA組合物，其中所述DNA構(gòu)建體被摻入減毒的鼠傷寒沙門氏菌fSa/mowe〃a 0^p/u'mwn'wm」載體。
11. 權(quán)利要求1的DNA組合物，其中所述組合物還包含編碼可在免疫細胞中表達的免疫效應蛋白的DNA構(gòu)建體。
12. 權(quán)利要求11的DNA組合物，其中所述免疫效應蛋白為細胞因子。
13. 權(quán)利要求12的DNA組合物，其中所述細胞因子為CCL21、IL-2、或CD40LT。
14. 抑制哺乳動物中肺瘤生長或肺瘤轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括給予哺乳動物包含DNA構(gòu)建體的DNA組合物，所述DNA構(gòu)建體編少二個表位:且被^"入藥學上可接受的載體中；按以下的量給予所述的量。 —、、 。、、U';
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述哺乳動物為人。
16. 權(quán)利要求14的方法，其中所述DNA構(gòu)建體被摻入減毒的細菌性載體中。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述減毒的細菌性載體為減毒的鼠傷寒沙'門氏菌(5a/wo"e/Zfl妙/n'm鵬'誰,。
18. 權(quán)利要求14的方法，其中所述組合物經(jīng)口服給藥。
19. 抑制哺乳動物中腫瘤生長或腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括以下步驟給予哺乳動物包含DNA構(gòu)建體的DNA組合物；和隨后給予所述哺乳動物有效抗腫瘤量的抗腫瘤化療藥物，所述DNA構(gòu)建體編碼可在哺乳動物的免疫細胞中表達的成纖維細胞激活蛋白(FAP)的至少一個表位且被摻入藥學上可接受的載體中；按以下的量給予所述的量。 —、' '、、、U,;
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述哺乳動物為人。
21. 權(quán)利要求19的方法，其中所述化療藥物為多柔比星。
22. 權(quán)利要求19的方法，其中所述DNA構(gòu)建體被摻入減毒的細菌性載體中。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述減毒的細菌性載體為減毒的鼠"f另寒沙、門氏菌^SVz/wo"e〃a /^ A/wwn'wwj 。
24. 權(quán)利要求19的方法，其中所述組合物經(jīng)口服給藥。
25. 增加哺乳動物攝取化療藥物的方法，所述方法包括以下步驟 給予哺乳動物包含DNA構(gòu)建體的DNA組合物；和隨后給予所述哺乳 動物有效量的化療藥物，所述DNA構(gòu)建體編碼可在哺乳動物的免疫 細胞中表達的成纖維細胞激活蛋白(FAP)的至少 一個表位且^皮摻入藥 學上可接受的載體中，按以下的量給予所述組合物足以在哺乳動物 中刺激對抗表達FAP抗原的細胞的免疫應答的量。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述哺乳動物為人。
27. 權(quán)利要求25的方法，其中所述化療藥物為多柔比星。
28. 權(quán)利要求25的方法，其中所述DNA構(gòu)建體被摻入減毒的細 菌性載體中。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述減毒的細菌性載體為減毒的鼠 傷寒沙門氏菌(5"a/,"g〃"妙/n'w,'薩」。
30. 權(quán)利要求25的方法，其中所述組合物經(jīng)口服給藥。
31. 質(zhì)粒載體，其包含編碼人成纖維細胞激活蛋白(FAP)的至少一 個表位的DNA構(gòu)建體。
32. 權(quán)利要求31的載體，其中所述DNA構(gòu)建體編碼人FAP (SEQ ID NO: 2)或與其有至少80。/。序列相似性且包括人FAP的至少一個表 位的蛋白。
33. 權(quán)利要求31的載體，其還包^^編碼免疫效應蛋白的DNA構(gòu) 建體。
34. 權(quán)利要求33的載體，其中所述免疫效應蛋白為細胞因子。
35. 權(quán)利要求34的載體，其中所述細胞因子為CCL21、 IL-2、或 CD40LT。
全文摘要
有效刺激對抗腫瘤細胞和腫瘤轉(zhuǎn)移的免疫應答的DNA組合物，該DNA組合物包含編碼可在免疫細胞中表達的成纖維細胞激活蛋白(FAP)的至少一個表位的DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體被摻入藥學上可接受的載體中。該組合物可以編碼FAP的單個表位、包含F(xiàn)AP的兩個或多個表位的多肽、整個FAP蛋白、或其將刺激所需免疫應答的任何部分。在一個優(yōu)選的實施方案中，該組合物還包括編碼免疫效應蛋白例如細胞因子的DNA構(gòu)建體。本發(fā)明的DNA組合物可以單獨使用或與化療藥物聯(lián)用，以治療疾病例如腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移。
文檔編號C12Q1/68GK101506381SQ200780030551
公開日2009年8月12日 申請日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月21日
發(fā)明者A·G·尼薩默, J·A·克呂格爾, M·勒夫勒, R·A·雷斯菲爾德 申請人:斯克里普斯研究學院