專利名稱：應用凋亡特異的eIF-5A siRNA下調促炎細胞因子表達以治療敗血癥的制作方法
應用凋亡特異的elF-5A siRNA下 調促炎細胞因子表達以治療敗血癥
相關申請的交叉引用 在細胞凋亡中發(fā)揮關鍵作用的一類蛋白質為半胱氨酸蛋白酶家 族，稱為胱門蛋白酶，其在多數(shù)凋亡途徑中是必需的。Creagh& Martin (2001) Biochem. Soc. Trans, 29, 696-701; Dales et al. (2001) Leuk. Lymphoma, 41, 247-253。通過裂解多種細月包蛋白質響應凋亡刺激物的胱 門蛋白酶誘導凋亡，引發(fā)凋亡的一般表現(xiàn)，包括細胞皺縮、膜起泡和 DNA斷裂。Chang & Yang (2000) Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64, 821-846。
凋亡前體蛋白如Bax或Bak也通過釋放半胱天冬酶活化分子如線 粒體細胞色素C在凋亡途徑中發(fā)揮關鍵作用，因此通過凋亡促使細胞死 亡。Martinou & Green (2001) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol, 2, 63-67; Zou et al.
(1997) Cell, 90, 405-413?？沟蛲龅鞍踪|如Bcl-2通過對抗凋亡前體蛋白、 Bax和Bak的活性來促4吏細月包存活。Tsujimoto (1998) Genes Cells， 3, 697-707; Kroemer (1997) Nature Med., 3, 614-620。 Bax:Bcl-2的比例是決 定細月包結局的一種途徑；Bax過剩促進凋亡以及Bcl-2的過剩促4吏細胞 存活。Salomons et al. (1997) Int. J. Cancer, 71, 959-965; Wallace-Brodeur & Lowe (1999) Cell Mol. Life Sci.,55, 64-75。 白細胞介素18 (IL-18)是近來發(fā)現(xiàn)的IL-1家族的成員并且通過結 構、受體和作用與IL-1關聯(lián)。由于誘導干擾素-y(IFN-力、TNF-a和IL-l 的能力，IL-18是炎性和自身免疫性疾病的中心細胞因子。IL-1卩和IL-18 均能夠謙導產生TNF-a, TNF-a為已知在心肌缺血中促進心臟功能異常 的細胞因子(Maekawa et al., 2002)。通過與IL-18結合蛋白質的中和的 IL-18的抑制減小在在先結合的(suprafused)人前房心肌的局部缺血/ 再灌注模型中的局部缺血誘導的心肌功能異常。使用小鼠IL-18結合蛋 白質的IL-18中和能夠降4氐IFN-y、 TNF-a和IL-1卩轉錄物水平且月交原誘 導的關節(jié)炎小鼠模型的關節(jié)損傷(Banda et al., 2003)。因為小鼠黑素瘤模 型的IL-18結合蛋白質注射成功地抑制了轉移，IL-18生成或有效性的降 低也可證明對于控制轉移癌是有效的(Carrascal et al., 2003)。作為促炎細 胞因子如其重要性的進一步顯現(xiàn)，IL-18的血漿水平以患者慢性肝病評 價且增高的水平與疾病的嚴重程度相關(Ludwiczeketal., 2002)。相類似 地，IL-18和TNF-a以患有腎病的糖尿病患者的血清評價(Moriwaki et al.,
合蛋白質的改善的小鼠":外傷后^經(jīng)恢復的HIS的抑制而介導(Yatsiv etal.,2002)。 TNF-a (細胞因子TNF家族的一員)為具有的多效性的促炎細胞 因子，該多效性包括對多種細胞類型中的造血細胞、炎癥應答的誘導和 細胞死亡的誘導的共促有絲分裂的作用。TNF-a被細菌脂多糖類、諸蟲、
癥。然:，TNF-a的不適當?shù)恼T導是造成起因于急性和慢:炎^如自^ 免疫性疾病病癥的主要原因，并且也導致癌癥、AIDS、心臟病和敗血癥 (由Aggarwal and Natarajan, 1996; Sharma and Anker, 2002綜述)。疾病實 驗動物才莫型(即敗血病性休克和風濕性關節(jié)炎)和人類疾病(即炎性腸 疾病和急性移植物抗宿主反應疾病)表明了阻斷TNF-a的有利作用 (Wallach et al., 1999)。 TNF-a的抑制在減輕自身免疫性疾病如克羅恩氏
病(van Deventer, 1999)和類風濕性關節(jié)炎(Richard-Miceli and Dougados, 2001)的患者方面是有效的。TNF-a促進B淋巴細胞存活和生長的能力 也在慢性B型淋巴細胞性白血病(B-CLL)起重要作用，并且由B-CLL中 的T細胞表達的TNF-a的水平與腫瘤塊和所述疾病的階段正相關 (Bojarska-Junak et al., 2002)。白細胞介素(IL-1卩)為已知誘導TNF-a產生 的細胞因子。 elF-5A的氨基酸序列在種之間是保守良好的，且在elF-5A中高賴 氨酸(hypusine)殘基周圍存在氨基酸序列區(qū)域保守，這表明該變體對 于存活是重要的。Park et al. (1993) Biofactors, 4, 95-104。到目前為止在 酵母中發(fā)現(xiàn)elF-5A兩種亞型失活或催化其活化第一步驟的DHS基因阻 斷了細胞分裂，這些發(fā)現(xiàn)進一步支持了上述假設。Schnier et al. (1991) MoL Cell. Biol, 11, 3105-3114; Sasaki et al. (1996) FEBS Lett., 384, 151-154; Park et al. (1998) J. Biol. Chem., 273, 1677-1683。然而，酵母中 eIF-5A蛋白質的缺失僅造成在總蛋白質合成中的微小的減少，表明 eIF-5A對于mRNA，s的特定亞基的翻i奪而非蛋白質整體合成(protein global synthesis )是必需的。"Effect of initiation factor elF-5A depletion on cell proliferation and protein synthesis," in Tuite, M. (ed.), Protein Synthesis and Targeting in Yeast, NATO Series H。與eIF-5A結合的配基高 度共用保守基序，近來這種發(fā)現(xiàn)也支持eIF-5A的重要性。Xu & Chen (2001)J. Biol. Chem., 276, 2555-2561。另外，^奮飾的eIF-5A的高賴氨酸 殘基對于RNA的序列特異性結合是重要的，并且該結合不提供核糖核 酸酶的保護。
14] 另夕卜，eIF-5A的細胞內缺失導致細胞核內特定mRNA的顯著地累 積，表明eIF-5A可促使特定類型的mRNA從細胞核到細胞質的穿梭運 動。Liu & Tartakoff (1997) Supplement to Molecular Biology of the Cell, 8, 426a. Abstract No. 2476, 37th American Society for Cell Biology Annual Meeting。在與核孔聯(lián)合的核內樣i絲的eIF-5A的累積及其與一般核豐餘出 受體的相互作用進一步表明eIF-5A是核穿梭蛋白質而非多核糖體的組 分。Rosorius et al. (1999) J. Cell Science, 112, 2369-2380。 [15j 第一針對于eIF-5A的cDNA在1989年由Smit-McBride等人從人 體克隆，從那以后cDNAs或對eIF-5A的基因從多種真核生物克隆，這 些真核生物包括酵母、大鼠、雞胚和番茄。Smit-McBndeetal. (1989) J.
Biol. Chem., 264, 1578-1583; Schmer et al. (1991)(酵母);Sano, A. (1995) in Imahori, M. et al. ( eds ) , Polyamines, Basic and Clinical Aspects, VNU Science Press, The Netherlands, 81-88 (大鼠)；Rinaudo & Park (1992) FASEB J.， 6, A453 (雞胚)；Pay et al. (1991) Plant Mol. Biol, 17, 927-929 (苜蓿)；Wang et al. (2001) J. Biol. Chem., 276, 17541-17549 (蕃茄)。

發(fā)明內容
16本發(fā)明涉及凋亡特異的真核啟動因子5A(eIF-5A)——稱為"凋亡 特異的elF-5A，，或"elF-5Al"。本發(fā)明也涉及禁止或抑制對象中的促炎 細胞因子，包括在體內(及體外和細胞內)通過抑制凋亡特異elF-5A的、 經(jīng)由使用elF5Al siRNAs或反義聚核苦酸的人。elF5Al siRNAs和elF5Al 的反義構造凈皮施用以減少促炎細l包因子如IL-ip、 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-10、 IFN國y、 TNF-a、 IL-3、 IL醫(yī)6、 IL國12(p40)、 IL-12(p70)、 G-CSF、 KC、 MIP畫la 和RANTES的表達，這對于敗血癥(sepsis)和/或失血所引發(fā)休克的治 療和預防有用。圖2示出抗elF-5Al的siRNA導致IL-2的表達減少。

圖11示出抗elF-5Al的siRNA導致IL-6的表達減少。
29] 圖12示出抗elF-5Al的siRNA導致IL-12(p40)的表達減少。 圖13示出抗elF-5Al的siRNA導致IL-12(p70)的表達減少。 圖14示出抗elF-5Al的siRNA導致IL-17的表達增加。 敗血癥是一個非常復雜的事件序列，還需要做大量的工作，去完 全了解患者如何從SIRS轉變成敗血癥休克。敗血癥休克的患者具有雙 相性免疫反應。最初他們對感染表現(xiàn)出強烈的炎性反應。這極有可能是 由于促炎細胞因子胂瘤壞死因子(TNF)、 IL-1、 IL-12、干擾素y(IFN-Y) 和IL-6的作用。然后機體通過在患者的免疫抑制期已顯示的產生抗炎細 胞因子(IL-10 )、溶解抑制因子(TNF受體、IL-1受體II型和IL畫1RA( IL畫1 的非活化形式))來調節(jié)應答。 所述級聯(lián)的累積效應是一種不平衡的狀態(tài)，使炎癥比抗炎有優(yōu)勢， 凝血作用比纖維蛋白溶解作用有優(yōu)勢。結果產生微血管血栓形成、血流 灌注不足、局部缺血和組織損傷?？赡馨l(fā)生嚴重的敗血癥、休克和多器 官功能障礙，導致死亡。 —般地，上述對論的elF5Al siRNA或elF5Al反義核苷酸的有效 量將由受者的年齡、體重和條件或疾病的嚴重程度決定。每日給藥可以 是一次或多次，或不太頻繁。應注意本發(fā)明不限于在此敘述的任何劑量。 [63] 藥學組合物可以按照適于對象情況的任何方法制成將要施用的藥 劑，例如，經(jīng)口、經(jīng)腸外(包4舌皮下、月幾肉內和4爭^^內)、經(jīng)直腸、經(jīng) 皮、經(jīng)頰、經(jīng)鼻或作為一種液體經(jīng)眼遞送。
64] siRNA或反義結構能夠作為"棵"siRNA或反義核苷酸遞送或包 裹于微嚢內制備，例如通過凝聚技術或通過界面聚合法(例如，分別通 過羥甲基纖維素或明膠微嚢和聚(曱基甲基丙烯酸酯)微嚢)、膠體給 藥系統(tǒng)(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳劑、納米微粒和納米膠嚢劑) 或4且滴乳狀液。所述4支術7>開于下述文獻中Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)。 另外，可用混合主鏈寡核苦酸(MBOs)。 MBOs包含硫代磷酸寡脫 氧核苦酸和適當位置的修飾的寡脫氧核苷酸或寡核苷酸的片段。MBOs 具有磷硫酰鍵的片段和其它修飾的寡核苷酸的片段，如甲基膦酸酯，其 為非離子的且對于核酸酶或2'-0-烷基寡核糖核苷酸很有抵抗力。
權利要求
1. 用于減少對象體內促炎細胞因子的表達的方法，包括給所述對象施用eIF5A1siRNA，由此所述eIF5A1siRNA減少所述對象中促炎細胞因子的表達。
2. 如權利要求l所述的方法，其中所述對象為人。
3. 如權利要求1所述的方法，其中所述促炎細胞因子選自由IL-1(3、 IL-2、 IL-4、 IL畫5、 IL-IO、 IFN-y、 TNF-a、 IL國3、 IL畫6、 IL-12(p40)、 IL-12(p70)、 G-CSF、 KC、 MIP-la和RANTES所組成的組。
4. 如權利要求l所述的方法，其中所述促炎細胞因子為TNF-a。
5. 如權利要求l所述的方法，其中所述促炎細胞因子為IL-6。
6. 如權利要求l所述的方法，其中所述促炎細胞因子為KC。
7. 如權利要求l所述的方法，其中所述促炎細胞因子為MIP-la。
8. 如權利要求1所述的方法，其中所述減少的促炎細胞因子的表 達進一步提供敗血癥的治療。
9. 如權利要求1所述的方法，其中所述elF5Al siRNA包含序列 CGG AAU GAC UUC CAG CUG A。
10. 用于減少所述促炎細胞因子的表達的藥用組合物，包括elF5A siRNA和藥學上可接受的載體。
11. 如權利要求11所述的組合物，其中所述siRNA包括所述核苷 酸序列CGG AAU GAC UUC CAG CUG A。
12. 預防對象失血性休克的方法，包括施用elF5Al siRNA或 elF5Al反義聚核苷酸來減少所述對象中IL-lp和/或TNF-a的表達，由此 預防失血性休克。
全文摘要
本發(fā)明涉及凋亡特異的真核起始因子5A(eIF-5A)——稱為凋亡特異的eIF-5A或eIF5-A1、核酸和多肽，本發(fā)明還涉及通過給哺乳動物施用抗eIF-5A1的siRNA來治療/預防敗血癥和/或失血性休克的下調哺乳動物中促炎細胞因子的方法。
文檔編號C12N15/11GK101384718SQ200780005097
公開日2009年3月11日 申請日期2007年3月20日 優(yōu)先權日2006年3月20日
發(fā)明者J·E·湯普遜 申請人:森尼斯科技術公司