專利名稱：通過dna標(biāo)簽的生物的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用DNA標(biāo)簽的生物的鑒定方法，更具體地，涉及 通過特定的堿基序列的檢測，鑒定個體、種、棲息地等的方法。更具體地， 涉及預(yù)先將特定的堿基序列有意地添加給檢查對象，然后通過檢測該序列， 鑒定個體、種、棲息地等的方法。由于生物具有的DNA的堿基序列4艮據(jù) 個體、種、棲息地等而不同，通過利用本發(fā)明的鑒定方法，可以判別生物 的個體、種、棲息地等。而且，最近，食品帶有附加說明的封印的偽裝，
以及向食品混入基因重組體等已成為社會問題，本發(fā)明的鑒定方法就可以 應(yīng)用于這些偽裝和混入的判定等。
背景技術(shù)：
近年來，從食品的放心和安全的觀點(diǎn)看來，農(nóng)產(chǎn)物的產(chǎn)地判定和品種 鑒別等的鑒定的必要性日益增加，但很多情況下僅依據(jù)外觀無法鑒定產(chǎn)地 和品種，無法得出鑒定結(jié)果，因此最近，采用DNA的鑒定方法開始^皮應(yīng) 用(例如參考非專利文獻(xiàn)l)。
現(xiàn)在，為了使用DNA進(jìn)行產(chǎn)地和品種的鑒別，需要在各產(chǎn)地和品種 中預(yù)先檢索并確定堿基序列不同的DNA的部位，在實(shí)際的產(chǎn)地和品種的 鑒別時，用堿基序列分析和PCR - RFLP等方法分析作為檢查對象的生物 的DNA的該部位的堿基序列，判斷獲得的堿基序列與哪個產(chǎn)地或品種的 相同。迄今為止，為了確定這種鑒定中使用的DNA的部位， 一直在鑒定 對象的生物原本具有的DNA中，尋找具有與其它生物不同的堿基序列的 部位(例如參考專利文獻(xiàn)l、 2)。具體地，例如，為了確定草莓的品種鑒別 中使用的DNA部位，首先，大量收集例如名為"豐香(i J:0力、)"的同 一品種的草莓，分別從其中提取DNA,用多種限制性酶分別切割各DNA 后，分別進(jìn)行電泳，獲得切割模式。然后，大量收集希望與"豐香"相辨別 的名為"栃乙女(t!: 6&i:力)"品種的草莓，從其中分別提取DNA，用多種 限制性酶分別切割各DNA后，分別進(jìn)行電泳，獲得切割模式。然后，將"豐 香"和"栃乙女，，的各個限制性酶的切割模式互相比較，探尋"豐香"和"栃乙 女"的切割模式的差異。用相同限制性酶呈現(xiàn)不同的切割模式，是因為可以 用限制性酶切割的堿基序列的某些部位在"豐香，，和"栃乙女"中并不相同。 因此，將呈現(xiàn)出這種不同的切割模式的DNA的部位確定為用于判別"豐香" 和"栃乙女"的部位。因此，現(xiàn)在，為了確定用于判別產(chǎn)地和品種的DNA 的部位，需要花費(fèi)大量時間、費(fèi)用、勞動力。實(shí)際判別產(chǎn)地和品種時，將 從作為檢查對象的生物中提取的DNA，用在"豐香"和"栃乙女"中呈現(xiàn)不同 的切割模式的限制性酶切割后，進(jìn)行電泳，判斷獲得的切割模式呈現(xiàn)的是 "豐香"和"栃乙女，，中的哪一種圖i瞽，鑒定檢查對象生物是"豐香"還是"栃乙 女"。因此，實(shí)際的產(chǎn)地和品種的鑒定的方法，使用的是與最初的確定用于 判別"豐香"和"栃乙女"的部位的方法相同的方法。
另一方面，現(xiàn)在，在試驗性進(jìn)行的利用基因重組的基因治療和品種改 良中，正在開發(fā)在對象中導(dǎo)入發(fā)揮有益功能的基因和基因表達(dá)單元，使之 穩(wěn)定保持，并且檢測這些基因或基因表達(dá)單元保持在對象中的各種方法， 并使之實(shí)用化(例如非專利文獻(xiàn)2 ~ 4)。
專利文獻(xiàn)l:專利^Hf 2002-112774
專利文獻(xiàn)2:專利z^開2004-344004
非專利文獻(xiàn)l: 2006年7月21日農(nóng)林水產(chǎn)部新聞發(fā)布，關(guān)于2005年 產(chǎn)米農(nóng)產(chǎn)物檢查的通過DNA分析獲得的品種判別調(diào)查結(jié)果< http:〃www.maff.go.jp/www/press/2006/20060721press—3.pdf >
非專利文獻(xiàn)2: SambrookJ和Russell DW:第16章將克隆的基因?qū)?入培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞(Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells )，分子克隆實(shí)驗手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual),第三版，2001;第16.1-16.62頁。
非專利文獻(xiàn)3: SambrookJ和Russell DW，方法介紹DNA雜交(方 法8 - 10 ) ( Protocol : Introduction to Southern hybridization (Protocols 8-10)),在第6章制備和分析真核基因組DNA (Chapter6 Preparation and analysis of eukaryotic genomic DNA )，分子克隆實(shí)驗手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual)，第三版，2001;第6.33-6.38頁。
非專利文獻(xiàn)4: SambrookJ和RussellDW，方法28通過雜交篩選細(xì) 菌菌落小規(guī)模(Protocol 28 Screening bacterial colonies by hybridization: Small numbers )，在第1章質(zhì)粒和它們在分子克隆中的使用(Chapterl Plasmids and their usefulness in Molecular Cloning )， 分子克隆實(shí)驗手 冊(Molecular Cloning : A laboratory manual )，第三版，2001;第1.1-1.142 頁。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題
然而，現(xiàn)在用于DNA的鑒定中使用的方法，即通過對其它生物所具 有的DNA的堿基序列與鑒定對象所具有的DNA的堿基序列分別進(jìn)行分 析，對它們進(jìn)行相互比較，確定鑒定對象中固有的DNA的堿基序列，通 過檢測該DNA的序列進(jìn)行鑒定的方法，在多種堿基序列的分析和比較的 操作中，需要大量的勞動力、時間和費(fèi)用。
本發(fā)明的目的在于提供新的生物的鑒定方法，以代替這種伴隨大量勞 動力的鑒定方法。
解決問題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明人為了解決上述問題，反復(fù)進(jìn)行了積極的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，為 了容易地確定并鑒定鑒定對象中特異的堿基序列，通過設(shè)定特定的DNA 堿基序列為DNA標(biāo)簽，檢測該特定的DNA的堿基序列，可以比現(xiàn)行的方 法節(jié)約大量勞動力和時間以及費(fèi)用，基于這種認(rèn)識，完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供了以下的(1)~(7)。
(1) 生物的鑒定方法，該方法是鑒定是否是特定生物或該生物的后代
的方法，其特征在于預(yù)先在所述特定生物或在其上寄生或共生的生物的 細(xì)胞中導(dǎo)入DNA標(biāo)簽，根據(jù)是否能從作為鑒定對象的生物或在其上寄生 或共生的生物提取的DNA中檢測出所述DNA標(biāo)簽，判斷所述鑒定對象生 物是否是所述特定生物或該生物的后代。
(2) 根據(jù)(l)所述的生物的鑒定方法，其特征在于，向細(xì)胞中導(dǎo)入DNA 標(biāo)簽是向基因組DNA中插入DNA標(biāo)簽。
(3) 根據(jù)(2)所述的生物的鑒定方法，其特征在于，在基因組DNA中不 具有功能的部位插入DNA標(biāo)簽。
(4) 根據(jù)(2)或(3)所述的生物的鑒定方法，其特征在于，向基因組DNA 中的1處以上的部位插入1種DNA標(biāo)簽。
(5) 根據(jù)(2)或(3)所述的生物的鑒定方法，其特征在于，向基因組DNA 中的1處以上的部位插入多種DNA標(biāo)簽。
(6) (2)~(5)的任意一項所述的生物的鑒定方法，其特征在于，DNA標(biāo)序列。
(7) (2)~(5)的任意一項所述的生物的鑒定方法，其特征在于，DNA標(biāo)
將DNA標(biāo)簽插入到該生物中原本不存在該DNA標(biāo)簽的部位,
發(fā)明的效果
如上述(1)和(2)的方法所述，通過在特定生物中預(yù)先導(dǎo)入具有特定的堿 基序列的DNA標(biāo)簽，就可以不花費(fèi)過多的勞動力、時間和費(fèi)用，確定用 于鑒定的DNA的堿基序列。另外，通過在特定生物中寄生或共生的生物 中預(yù)先導(dǎo)入具有特定的堿基序列的DNA標(biāo)簽，使該生物在特定生物中寄 生或共生后，檢測該DNA標(biāo)簽，即使在難以直接向特定生物中導(dǎo)入DNA 標(biāo)簽的情形下，也能夠間接導(dǎo)入DNA標(biāo)簽。
另外，如上述(3)的方法那樣，通過在特定生物的基因組DNA中不具
有功能的部位插入DNA標(biāo)簽，能夠不使特定生物的性質(zhì)發(fā)生任何變化地 添加DNA標(biāo)簽。
另外，如上述(4)的方法那樣，通過向特定生物的基因組DNA的多個 位點(diǎn)插入1種DNA標(biāo)簽，通過變化DNA標(biāo)簽的種類和插入位點(diǎn)，能夠制 備DNA標(biāo)簽的多種模式，可以在多種鑒定對象中分別使用這些模式進(jìn)行鑒定。
另外，如上述(5)的方法那樣，通過向特定生物的基因組DNA的多個 位點(diǎn)插入多種DNA標(biāo)簽，通過變化DNA標(biāo)簽的拷貝數(shù)和插入位點(diǎn)，能夠 制備DNA標(biāo)簽的多種模式，能夠在多種特定生物中分別使用這些模式進(jìn) 行鑒定。而且，即使一部分DNA標(biāo)簽由于偶發(fā)的重組等而脫落，也可以 使用殘留的DNA標(biāo)簽進(jìn)行鑒定。
另外，如上述(6)的方法那樣，通過使用特定生物原本不具有的DNA 的堿基序列作為DNA標(biāo)簽，能夠明確鑒定特定生物中有無DNA標(biāo)簽。
另外，如上述(7)的方法那樣，通過使用特定生物原本具有的DNA的 一部分的堿基序列作為DNA標(biāo)簽，不需要設(shè)計新的堿基序列，因此可以 節(jié)約勞動力、時間和費(fèi)用而確定DNA標(biāo)簽。而且，通過在特定生物中原 本不存在該DNA標(biāo)簽的位置插入該DNA標(biāo)簽，通過只觀察插入位置的差 異，就可以分辨是否是DNA標(biāo)簽。
附圖的簡要說明


圖1 是表示在特定生物的DNA中預(yù)先插入DNA標(biāo)簽，通過檢測該 DNA標(biāo)簽進(jìn)行鑒定的方法的流程圖。
符號的說明
1- ■ ■特定生物、2. . ■測序引物結(jié)合序列部分、3. ■ ■標(biāo)簽信息 序列部分、4, ■ , DNA標(biāo)簽、5, ■.標(biāo)簽信息序列、■ ■標(biāo)簽信息 序列的測序沖莫式、7, ■ ■插入了 DNA標(biāo)簽的基因組DNA、 8,,,具有 插入了 DNA標(biāo)簽的基因組DNA的細(xì)胞、9.,.特定生物的基因組DNA
的一部分、10. ■ ■鑒定對象生物、11. ■ ■含有鑒定對象生物作為材料 的加工品、12, ■,從鑒定對象生物提取的基因組DNA、 13. ■,測序引 物、14. ■ ■測序片段、15. ■ ■鑒定對象生物的測序模式
具體實(shí)施例方式
以下對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的"i兌明。
本發(fā)明的生物的鑒定方法是鑒定是否是特定生物或該生物的后代的方 法，所述方法的特征在于，預(yù)先在所述特定生物或在其上寄生或共生的生 物的細(xì)胞中導(dǎo)入DNA標(biāo)簽，根據(jù)是否能從作為鑒定對象的生物或在其上 寄生或共生的生物提取的DNA中檢測出所述DNA標(biāo)簽，判斷所述鑒定對 象生物是否是所述特定生物或該生物的后代。
特定生物可以由本發(fā)明的鑒定方法的實(shí)施者任意決定，例如，可以以 特定的個體、屬于分類學(xué)上的特定的單位(品種、種、屬等)的生物、特定 的棲息地的生物等作為特定生物。特定生物可以是動物、植物、微生物的 任意一種，另外，也可以是多細(xì)胞生物或單細(xì)胞生物的任意一種。
導(dǎo)入DNA標(biāo)簽的細(xì)胞沒有特別的限定，優(yōu)選將導(dǎo)入的DNA標(biāo)簽傳播 到該生物的后代的那樣的細(xì)胞。作為這種細(xì)胞，例如，如果是動物細(xì)胞， 可以例舉受精卵、精子、卵等，如果是植物細(xì)胞，可以例舉，像構(gòu)成愈傷 組織的細(xì)胞那樣的可以分化成個體的細(xì)胞。
DNA標(biāo)簽通常導(dǎo)入到特定生物，但也可以導(dǎo)入到在特定生物上寄生或 共生的生物。作為特定生物和在其上寄生等的生物的具體例，例如，可以 列舉海苔和與其共生的oc-變形菌綱(a-Proteobacteria)、蜂蟲和與其共生 的巴克納氏菌(Buchnera)、造成赤潮的纖毛蟲的中縊蟲(Mesodinium)和 與其共生的隱藻、所有的病毒及其寄生的宿主等。
在細(xì)胞中導(dǎo)入DNA標(biāo)簽的方法沒有特別的限定，優(yōu)選將DNA標(biāo)簽插 入基因組DNA的方法。作為這種方法，例如，可以列舉使用同源重組和 在基因組中整合DNA的載體的方法等。利用同源重組的方法(動物基因 組Paul D. Richardson等人，基因修復(fù)和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因療法(Gene
Repair and Transposon畫Mediated Gene Therapy ) , Stem Cells: 2002; 20: 105-118、植物基因組EndoM等人，在擬南芥CAF-1突變體中同源重組 和 T-DNA 整合的增力口的頻率(Increased frequency of homologous recombination and T-DNA integration in Arabidopsis CAF-1 mutants ), EMBO J., 2006年11月29日；25(23): 5579-90，電子公開:2006年11月 16日)和使用在基因組中整合DNA的載體的方法(慢病毒的例子Bryda EC 等人，在用慢病毒產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物中檢測和鑒定多個染色體整合位點(diǎn)的 方法(Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus )， Biotechniques: 2006年12月，41(6): 715-9、逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子Koo， B.C. 等人，使用基于MoMLV的逆病毒載體產(chǎn)生表達(dá)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白的胚 系轉(zhuǎn)基因雞 (Production of germline transgenic chickens expressing enhanced green fluorescent protein using a MoMLV-based retrovirus vector) ， FASEBJ.， 2006年11月，20(13): 2251-60)是眾所周知的，只要 是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以利用這些方法在基因組DNA中插入DNA標(biāo)簽。
方法，也可以使之以游離的狀態(tài)存在于細(xì)胞中那樣導(dǎo)入DNA標(biāo)簽。這樣 的導(dǎo)入方法也是眾所周知的(EB病毒的例子Ren， P.等人，在人胚胎干 細(xì)胞中建立和應(yīng)用基于EB病毒的游離型載體(Establishment and Applications of Epstein-Barr Virus-Based Episomal Vectors in Human Embryonic Stem Cells ) ， Stem Cells: 2006,24 (5) 1338-1347)，只要是本 領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以利用該方法在細(xì)胞中插入DNA標(biāo)簽。
在基因組DNA中插入DNA標(biāo)簽時，理論上，DNA標(biāo)簽的堿基序列 和數(shù)量和長度、插入部位的性質(zhì)和數(shù)量、插入形態(tài)、檢測方法這七點(diǎn)都成 為重大問題。
作為DNA標(biāo)簽的堿基序列，理論上，可以有以下兩種選擇使用特 定生物或在其上寄生或共生的生物(以下稱為"特定生物等，，)中原本存在的 堿基序列，或使用特定生物等中原本不存在的堿基序列。特定的DNA的
堿基序列是否存在于特定生物等中，如果是特定生物等所具有的DNA的 堿基序列全部完成分析的生物，作為本領(lǐng)域技術(shù)人員，使用公知的同源檢 索用軟件，檢索該DNA的堿基序列數(shù)據(jù)與作為DNA標(biāo)簽使用的預(yù)定的 I)NA的堿基序列的同源性，可以容易地進(jìn)行確認(rèn)(例如，參考DNA Data Bank of Japan 同源性檢索用軟件 FASTA 的說明 < http:〃www.ddbj.nig.ac.jp/search/explain/fasta」xt-j.html 〉)。 特定生物等 具有的DNA的堿基序列還沒有完全完成分析時，不需要對特定生物等具 有的DNA的堿基序列進(jìn)行詳細(xì)的分析，可以通過DNA印跡雜交和斑點(diǎn)印 跡雜交等分子生物學(xué)的基本實(shí)驗方法，進(jìn)行確認(rèn)(例如，參考Sambrook J 和Russell DW，方法介紹DNA雜交(方法8 - 10 X Protocol: Introduction to Southern hybridization (Protocols 8-10))，在第6章制備和分析真核 基因組DNA ( Chapter6 Preparation and analysis of eukaryotic genomic I)NA )，分子克隆實(shí)驗手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual)， 第三版，2001;第6.33-6.38頁，日本專利局資料室其它參考信息標(biāo)準(zhǔn) 技術(shù)集 核酸的擴(kuò)增和檢測 2-2-5 DNA雜交<
https:〃www.jpo.go.jp/shiryou/s—sonota/hyoujun—gijutsu/kakusan/0018.htm
1〉)。而且，對于DNA標(biāo)簽的堿基序列，可以選擇該序列自身具有某種功
能(例如，結(jié)構(gòu)基因、啟動子、增強(qiáng)子等)，或不具有功能。雖然可以選擇 具有功能的序列或者不具有功能的序列中的任一序列，但是在具有功能的 序列的情況下，由于存在使得特定生物等的表現(xiàn)型發(fā)生某種變化的可能性， 因此優(yōu)選選擇不具有功能的序列。
DNA標(biāo)簽的數(shù)量可以任意選擇，可以插入1種DNA標(biāo)簽，也可以插 入多種DNA標(biāo)簽。DNA標(biāo)簽的長度可以按照后述的DNA檢測方法任意 進(jìn)行選擇，優(yōu)選為數(shù)個堿基 數(shù)千個堿基左右的長度，更優(yōu)選為30個堿 基~ l，OOO個堿基左右的長度。
作為插入DNA標(biāo)簽的部位，理論上，在特定生物等中的插入部位可 以有以下兩種選擇在具有某種功能的部位插入，或者在不具有功能的部 位插入。但是，在特定生物等中具有某種功能的部位處插入DNA標(biāo)簽的
情況，因為在插入的生物中，插入部位原本應(yīng)當(dāng)發(fā)揮的功能缺失，發(fā)生某 種性質(zhì)的變化的危險性高，所以這樣的部位作為插入以鑒定作為目的的
DNA標(biāo)簽的部位并不合適。因此，實(shí)際上可以認(rèn)為，理想的是，在特定生 物等中不具有功能的部位中插入DNA標(biāo)簽。 一般來說，難以證明特定的 部位在特定生物等中不具有功能。但是，例如，人們已經(jīng)周知，生物所具 有的假基因中，有的已經(jīng)完全喪失功能(例如，參考Julie R. Wafaei和 Francis Y.M. Choy，葡糖腦苷脂酶重組等位基因在靈長類中葡糖腦苷脂 酶基因和假基因的分子進(jìn)4b ( Glucocerebrosidase recombinant allele: molecular evolution of the glucocerebrosidase gene and pseudogene in primates) ， Blood Cells Mol Dis.， 2005年9 — 10月；35(2): 277-85)。通過 在該部位中插入DNA標(biāo)簽，能絲毫無損于特定生物等所原本具有的功能 而添加DNA標(biāo)簽。即使在假基因的部位以外，如果是不具有功能的部位， 也可以作為插入部位的候補(bǔ)考慮，從這些部位中選擇l個或多個部位，作 為插入部位。而且，即使是具有某種功能的部位，也可以在其中不影響功 能的位置中插入DNA標(biāo)簽。作為這種例子，可以例舉用于純化體外合成 的蛋白的各種His標(biāo)簽融合蛋白中添加His標(biāo)簽的部位(例如，Mathur D 和Garg LC.，來自結(jié)核分枝桿菌H37Rv的功能性磷酸葡糖異構(gòu)酶具高 產(chǎn)率和純度的快速純化(Functional phosphoglucose isomerase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Rapid purification with high yield and purity )， Protein Expr Purif.， 2006年10月25日[電子公開早于印刷)。
以此為前提，插入部位的數(shù)量可以任意選擇。而且，作為插入形態(tài)， 理論上，可以從以下情況中通過任意組合進(jìn)行選擇在特定的l個或多個 部位中只插入1個DNA標(biāo)簽的情況，和對于1個部位一次次地插入多個 同種或異種的DNA標(biāo)簽的情況，或者，任意地連接同種或異種的DNA標(biāo) 簽的堿基序列的方向和數(shù)量而在1個或多個部位中插入的情況。
作為DNA標(biāo)簽的檢測方法，在特定生物等中使用原本不存在的堿基 序列作為DNA標(biāo)簽的情形時，從插入了該DNA標(biāo)簽的特定生物等中提取 DNA，確認(rèn)是否含有其中插入的DNA標(biāo)簽的特異的堿基序列。對于從特
ii定生物等中提取DNA，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就能夠通過合適地使用已 知的各種方法而容易地進(jìn)行(例如，參考Sambrook J和Russell DW，方法 介紹DNA雜交(方法8-10) (Protocol : Introduction to Southern hybridization (Protocols 8-10))，在第6章制備和分析真核基因組DNA
(Chapter6 Preparation and analysis of eukaryotic genomic DNA )， 分子 克隆實(shí)驗手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual)，第三版， 2001;第6.33-6.38頁)。而且，對于確認(rèn)提取的DNA中是否含有插入的 I)NA標(biāo)簽的特異的堿基序列，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就能夠通過已知的 以I)NA標(biāo)簽的堿基序列作為探針的DNA印跡雜交和斑點(diǎn)印跡雜交等分子 生物學(xué)的基本實(shí)驗方法(例如，參考Sambrook J和Russell DW,方法介 紹DNA雜交(方法8 - 10 ) ( Protocol : Introduction to Southern hybridization (Protocols 8-10))，在第6章制備和分析真核基因組DNA
(Chapter6 Preparation and analysis of eukaryotic genomic DNA ), 分子 克隆實(shí)驗手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual)，第三版， 2001;第6.33-6.38頁)、或堿基序列測定法(例如，參考Sambrook J和 Russell DW，第12章DNA測序(Chapter12 DNA s叫uencing)， 分子 克隆實(shí)驗手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual)， 第二版， 2001;第12.1-12.120頁)等，容易地進(jìn)行。
而且，作為使用原本在特定生物等中存在的堿基序列作為DNA標(biāo)簽 的時的DNA標(biāo)簽的檢測方法，可以列舉如下方法以DNA標(biāo)簽的堿基序 列作為探針，進(jìn)行從特定生物等中提取的DNA的DNA印跡雜交，檢測探 針與多個電泳條帶雜交的方法(例如，參考M Yoshida， M Sdki， K Yamaguchi,和K Takatsuki:在成人T細(xì)胞白血病的所有原發(fā)性肺瘤中人 T細(xì)胞白血病原病毒的單克隆整合暗示人T細(xì)胞白血病病毒在該疾病中的 病因性角色(Monoclonal integration of human T-cell leukemia provirus in
all primary tumors of adult T-cell leukemia suggests causative role of human T-cell leukemia virus in the disease ) ， Proc Natl Acad Sci USA. 1984年4月；81(8): 2534-2537)， 4吏用插入的DNA標(biāo)簽外側(cè)的插入部位附
近的堿基序列作為引物，進(jìn)行PCR，通過對該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，檢測含 有DNA標(biāo)簽的長度的片段的方法(例如，參考S Murata， N Takasaki， M Saitoh,和N Okada:通過使用短散在元件(SINEs)作為進(jìn)化的時間里程碑 來確定太平洋鮭魚之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(Determination of the phylogenetic relationships among Pacific salmonids by using short interspersed elements (SINEs) as temporal landmarks of evolution ) ， Proc Natl Acad Sci USA. 1993年8月1日；90(15): 6995-6999),同樣進(jìn)行PCR后，進(jìn)行雙鏈特異的 熒光性嵌入反應(yīng)，由于擴(kuò)增出比不含DNA標(biāo)簽時的PCR產(chǎn)物長的片段， 而確認(rèn)熒光增強(qiáng)的方法；使用插入的DNA標(biāo)簽外側(cè)的插入部位附近的堿 基序列作為引物，進(jìn)行實(shí)時PCR，由于擴(kuò)增出比不含DNA標(biāo)簽時的PCR 產(chǎn)物長的片段，而確認(rèn)熒光增強(qiáng)的方法；等等。只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員， 就能夠通過使用這些已知的分子生物學(xué)方法，容易地檢測DNA標(biāo)簽。
本發(fā)明中，對于通過以特定生物中原本不存在的堿基序列作為DNA 標(biāo)簽，預(yù)先插入特定生物的基因組DNA，判斷特定生物是否具有該堿基序 列進(jìn)行鑒定的方法，用圖l說明基本的思路。該鑒定方法包括2個步驟， 即，預(yù)先在特定生物中插入DNA標(biāo)簽的第1階段，和判斷鑒定對象生物 是否具有DNA標(biāo)簽的笫2階段。在圖l中，第1階段在〈A〉部分圖示、 第2階段在〈B〉部分圖示。
首先，對第1階段的在特定生物中插入DNA標(biāo)簽的步驟進(jìn)行說明。 例如，對圖l(a)那樣的在特定生物1的基因組DNA中插入標(biāo)簽的情形進(jìn)行 說明。首先，準(zhǔn)備特定生物1的受精卵(動物)或愈傷組織的細(xì)胞(植物)等。 這樣的細(xì)胞等，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以容易地制備。從特定生物 1的基因組DNA中原本不存在的堿基序列中，像(b)那樣，選擇DNA標(biāo)簽 4的堿基序列，制備具有該序列的DNA。制備的方法，如果是本領(lǐng)域技術(shù) 人員，就可以使用公知的分子生物學(xué)的方法中的任意一種。例如，如果DNA 標(biāo)簽短，可以采用分別化學(xué)合成單鏈后，使之退火，形成雙鏈的化學(xué)的合 成法；如果是可以制備適當(dāng)?shù)哪０錎NA的比較長的DNA標(biāo)簽，可以通過 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR:例如，參考MullisK以及其他5人，體外DNA的特 異寸生酶促才廣增聚合酶鏈反應(yīng)(Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction ) ， Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986; 51 Pt l:263畫73)制備。DNA標(biāo)簽4采用了測序引物結(jié)合序列部 分2連接在標(biāo)簽信息序列部分3的3，端的結(jié)構(gòu)。測序引物結(jié)合序列部分2 具有與測序引物13互補(bǔ)的堿基序列，當(dāng)通過堿基序列的分析檢測DNA標(biāo) 簽時，就成為測序引物結(jié)合的部位。標(biāo)簽信息序列部分3是從特定生物提 取的基因組DNA中原本不存在的比較短的堿基序列，具有例如(c)中所示 的標(biāo)簽信息序列5那樣的堿基序列，如果通過毛細(xì)管電泳分析堿基序列， 則顯示出例如標(biāo)簽信息序列的測序模式6這樣的模式。將具有這種結(jié)構(gòu)的 DNA標(biāo)簽4，通過體外的同源重組等(例如，參考Paul D. Richardson以及 其他3人，基因修復(fù)和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因療法(Gene Repair and Transposon-Mediated Gene Therapy) , Stem Cells: 2002; 20: 105-118), 插入到受精卵(動物)或愈傷組織的細(xì)胞(植物)等特定生物1的細(xì)胞的基因組 l)NA中，制備具有插入了 DNA標(biāo)簽4的基因組DNA7的細(xì)胞8 (d)。如果 放大該DNA標(biāo)簽插入部位，就如(e)那樣，形成特定生物的基因組DNA的 一部分9中插入了 DNA標(biāo)簽4的形態(tài)。通過具有這種插入了 DNA標(biāo)簽的 基因組DNA7的細(xì)胞8,制備具有插入了 DNA標(biāo)簽4的基因組DNA7的 個體。至此，就是第1階段的在特定生物中插入DNA標(biāo)簽的步驟。
然后，對圖KB〉部分中圖示的、第2階段的判斷鑒定對象生物是否 具有DNA標(biāo)簽的步驟進(jìn)行說明。從(f)那樣的鑒定對象生物10，或含有(g) 那樣的鑒定對象生物作為材料的加工品11中，提取鑒定對象生物中所含的 基因組DNA12 (h)。提取的方法，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，可以在已知的 分子生物學(xué)的方法中采用適于各種材料的任何方法(例如，參考Sambrook J和Russell DW,第6章制備和分析真核基因組DNA ( Chapter6 Preparation and analysis of eukaryotic genomic DNA )， 分子克隆實(shí)驗 手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual)，第三版，2001;第 6.1-6,64頁、以及Sambrook J和Russell DW，第7章提取、純化和分析 來自真沖亥細(xì)月包的mRNA( Chapter7 Extraction, purification, and analysis of
mRNA from eukaryotic cells )，分子克隆實(shí)驗手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual)，第三版，2001;第7.1-7.94頁)。如果鑒定對象生 物10具有DNA標(biāo)簽4，那么由于DNA標(biāo)簽4中含有測序引物結(jié)合序列部 分2，接著，用具有與該測序引物結(jié)合序列部分2的一部分互補(bǔ)的堿基序 列的測序引物13進(jìn)行測序反應(yīng)，制成能夠分析標(biāo)簽信息序列部分3的部分 的堿基序列的測序片段14，進(jìn)行堿基序列分析。將由該結(jié)果獲得的鑒定對 象生物10的測序模式15，與標(biāo)簽信息序列的測序模式6進(jìn)行比較檢查， 判斷鑒定對象生物的測序模式15中是否含有標(biāo)簽信息序列的測序模式6。 如果鑒定對象生物的測序模式15中含有標(biāo)簽信息序列的測序模式6，可以 鑒定，鑒定對象生物10，或含有鑒定對象生物作為材料的加工品11含有 DNA標(biāo)簽4。
實(shí)施例
以下，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的說明。但是當(dāng)然，本發(fā)明不受 該實(shí)施例限制。
為了獲得有用的DNA標(biāo)簽的堿基序列的例子，對于公開了全基因組 堿基序列的擬南芥，檢索基因組內(nèi)不存在的序列。作為擬南芥的數(shù)據(jù)庫， 使 用 由 The Arabidopsis Information Resource (TAIR) (http:Vwww.arabidopsis.org/)所提供的全基因組信息。檢索的結(jié)果是，作 為擬南芥的基因組內(nèi)不存在的序列，可以找到如序列編號1所示的堿基序 列。由此得知，可以尋求有效的堿基序列作為DNA標(biāo)簽。
本說明書包括作為本申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請(特愿 2007-011739號)的說明書和/或附圖中所述的內(nèi)容。而且，本發(fā)明中引用 的所有的出版物、專利和專利申請按原樣作為參考并入本說明書。
權(quán)利要求
1. 生物的鑒定方法，該方法是鑒定是否是特定生物或該生物的后代的方法，其特征在于，預(yù)先在所述特定生物或在其上寄生或共生的生物的細(xì)胞中導(dǎo)入DNA標(biāo)簽，根據(jù)是否能從作為鑒定對象的生物或在其上寄生或共生的生物提取的DNA中檢測出所述DNA標(biāo)簽，判斷所述鑒定對象生物是否是所述特定生物或該生物的后代。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的生物的鑒定方法，其特征在于，向細(xì)胞中導(dǎo) 入DNA標(biāo)簽是向基因組DNA插入DNA標(biāo)簽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物的鑒定方法，其特征在于，在基因組 I)NA中不具有功能的部位插入DNA標(biāo)簽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的生物的鑒定方法，其特征在于，向基因 組DNA中的1處以上的部位插入1種DNA標(biāo)簽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的生物的鑒定方法，其特征在于，向基因 組DNA中的1處以上的部位插入多種DNA標(biāo)簽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2 5任意一項所迷的生物的鑒定方法，其特征在于， l)NA標(biāo)簽的堿基序列是導(dǎo)入DNA標(biāo)簽的生物的基因組DNA中本來不存 在的堿基序列。
7. 權(quán)利要求2~5任意一項所述的生物的鑒定方法，其特征在于，DNA 標(biāo)簽的堿基序列是導(dǎo)入DNA標(biāo)簽的生物的基因組DNA中存在的堿基序 列，將DNA標(biāo)簽插入到該生物中原本不存在該DNA標(biāo)簽的部位。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種新的生物鑒定方法，以代替以往的伴隨大量勞動力的通過DNA進(jìn)行的生物鑒定方法，本發(fā)明開發(fā)了一種生物的鑒定方法，該方法是鑒定是否是特定生物或該生物的后代的方法，其特征在于，預(yù)先在所述特定生物或在其上寄生或共生的生物的細(xì)胞中導(dǎo)入DNA標(biāo)簽，根據(jù)是否能從作為鑒定對象的生物或在其上寄生或共生的生物提取的DNA中檢測出所述DNA標(biāo)簽，判斷所述鑒定對象生物是否是所述特定生物或該生物的后代。
文檔編號C12N15/09GK101379188SQ200780004858
公開日2009年3月4日 申請日期2007年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月22日
發(fā)明者五條堀孝, 今村馨, 奈須永典, 小林敬典, 辻本敦美 申請人:日本軟件開發(fā)株式會社;五十嵐孝雄;奈須永典