專利名稱：使用生物反應(yīng)器的修復(fù)軟骨的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般至少涉及藥學(xué)、外科學(xué)、解剖學(xué)、生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和/或 分子生物學(xué)領(lǐng)域。在具體的方面，本發(fā)明涉及軟骨修復(fù)，例如關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)領(lǐng) 域。更具體地說，本發(fā)明領(lǐng)域涉及在機(jī)械應(yīng)激下使細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和/或分化形 成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞基質(zhì)包封裝置。
背景技術(shù)：
通常，關(guān)節(jié)軟骨是一種受損后不會(huì)自然再生的組織。近來，已嘗試通過在 實(shí)驗(yàn)室中再生一部分受損組織來重建受損的生物學(xué)組織。這種方法稱為"組織 工程"，已受到廣泛關(guān)注。
組織工程涉及能夠于生物學(xué)組織特異性相互作用的生物相容性材料的開 發(fā)以制備功能性組織等價(jià)物。組織工程的基本概念是，從患者收集所需組織， 由組織樣本分離細(xì)胞，使細(xì)胞增殖，將增殖的細(xì)胞接種到可生物降解的聚合物 支架上，體外培養(yǎng)細(xì)胞預(yù)定的時(shí)間，然后將細(xì)胞/聚合物構(gòu)建物移植回患者體內(nèi)。 移植后，移植支架中的細(xì)胞利用通過體液的擴(kuò)散獲取的氧氣和營養(yǎng)，增殖分化 形成新的組織，支架則發(fā)生溶解。
用于再生生物學(xué)組織的支架通常包括用作基質(zhì)的材料，使細(xì)胞粘附材料表 面并形成三維組織。這種材料應(yīng)是無毒、生物相容且可生物降解的。滿足上述
9物理性質(zhì)要求的最常用的可生物降解聚合物包括有機(jī)聚合物，例如聚乙醇酸
(PGA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚-e-己內(nèi)酯(PCL)、聚氨基酸、聚酐、聚原 酸酯；天然水凝膠，例如膠原、透明質(zhì)酸、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖；合成水 凝膠，例如聚(環(huán)氧乙垸)(PEO)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(反 丁烯二酸丙烯酯-共-乙二醇)[P(PF-co-EG)以及它們的共聚物。
研究上述聚合物來構(gòu)建多孔支架。然而，常規(guī)制造技術(shù)一般導(dǎo)致支架的多 孔性低以至于不能充分支持細(xì)胞生長(zhǎng)。支架表面的空隙常常發(fā)生阻塞，營養(yǎng)不 能充分供給細(xì)胞，細(xì)胞難以生長(zhǎng)進(jìn)入支架內(nèi)。近來，組織工程領(lǐng)域中顯微制造 技術(shù)的應(yīng)用使得微米級(jí)分辨率的復(fù)雜支架的開發(fā)成為可能。這些支架稱為"顯 微射流支架"，具有允許支架內(nèi)流體流動(dòng)的顯微通道網(wǎng)絡(luò)。該顯微通道網(wǎng)絡(luò)有 助于向支架的不同部分提供營養(yǎng)物質(zhì)和可溶因子。
支架還可用半透膜進(jìn)行包封。美國專利公開第2006/0147486號(hào)涉及用半 透膜包封的多孔支架。半透膜選擇性地將營養(yǎng)物質(zhì)從支架外部導(dǎo)入支架，同時(shí) 將組織細(xì)胞產(chǎn)生的代謝廢物排泄到支架外部。該公開描述了使細(xì)胞在支架內(nèi)生 長(zhǎng)的體外方法，用于再生生物學(xué)組織。
美國專利6,627,422描述了一種半透膜包封的紗基質(zhì)中含有細(xì)胞的裝置。 在這種情況下，半透膜允許植入的細(xì)胞接受營養(yǎng)物質(zhì)，并且允許植入細(xì)胞產(chǎn)生 的治療性分子擴(kuò)散至宿主細(xì)胞。該裝置用于細(xì)胞療法包封的細(xì)胞向宿主分泌 內(nèi)源性蛋白質(zhì)。該裝置可用作人造生物器官(例如，分泌胰島素的人造胰腺)
雖然營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散增加的支架構(gòu)建技術(shù)取得了一些進(jìn)展，但是， 一旦移植 到患者體內(nèi)，支架的營養(yǎng)供應(yīng)有限。事實(shí)上，在體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)和氧通過鄰近椎 間盤的椎骨終板中的血管而被遞送至盤細(xì)胞。在退行性盤疾病中，椎骨終板功 能受損，不能使足夠的營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散到植入的細(xì)胞支架。
可使用不同細(xì)胞類型來構(gòu)建關(guān)節(jié)軟骨?？墒褂脧默F(xiàn)有軟骨活檢獲取的關(guān)節(jié) 軟骨的原代分化細(xì)胞(即軟骨細(xì)胞)。這些細(xì)胞常常來自自體來源，因?yàn)楫愒醇?xì) 胞或來自尸體的細(xì)胞存在病原體轉(zhuǎn)移的固有風(fēng)險(xiǎn)。間充質(zhì)細(xì)胞干細(xì)胞(MSC)是 一種骨髓中發(fā)現(xiàn)的胚胎樣細(xì)胞，能夠分化形成不同類型的間充質(zhì)組織，尤其是 軟骨組織；因而成為軟骨工程技術(shù)的另一細(xì)胞來源。
然而，這些細(xì)胞來源存在許多問題。椎間盤的軟骨細(xì)胞難以獲取，因?yàn)樽泽w細(xì)胞是從患者椎間盤獲取的，需要侵入性手術(shù)(背部外科手術(shù))進(jìn)行活組織檢 查。如果從健康椎間盤獲取細(xì)胞，則危害健康盤的功能。如果在椎間盤切除 術(shù)期間從受損盤收集細(xì)胞，則會(huì)提供來自變性組織的異常細(xì)胞。而且，軟骨細(xì) 胞因?yàn)槿シ只y以培養(yǎng)擴(kuò)增。對(duì)于來自其他軟骨組織的軟骨細(xì)胞，耳彈性軟
骨容易收集，但僅能產(chǎn)生透明軟骨而不能產(chǎn)生椎間盤中的纖維軟骨。MSC也
存在一些缺點(diǎn)，因?yàn)樾枰M(jìn)行骨髓活組織檢查。雖然組織工程技術(shù)需要大量細(xì) 胞，卻難以獲取足夠量的成人干細(xì)胞。
許多文獻(xiàn)報(bào)道了刺激間充質(zhì)干細(xì)胞形成軟骨或去分化軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)條
件。這些條件是高密度微量培養(yǎng)；低氧；補(bǔ)充生長(zhǎng)因子，例如骨形態(tài)發(fā)生蛋 白(BMP)，尤其是BMP-2、 -4、 -6和-7，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子卩(TGF-卩)，和/或胰島素 生長(zhǎng)因子I(IGF-I);補(bǔ)充抗壞血酸；在特定基質(zhì)上培養(yǎng)，例如藻酸鹽；機(jī)械應(yīng) 激下培養(yǎng)，例如間歇性流體靜壓(IHP)(Watt， 1988; Dozin等，1992; Sullivan 等，1994; Denker等，1999; ZurNieden等，2005; Zhou等，2004; Majumdar 等，2001; Barry等，2001; Elder等，2005; Mow等，1992; Domm等，2000)。 很少有研究報(bào)道人表皮成纖維細(xì)胞(HDF)轉(zhuǎn)換形成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。美國 專利6,489,165涉及高密度微量培養(yǎng)和低氧條件下HDF轉(zhuǎn)化形成軟骨細(xì)胞樣細(xì) 胞。French MM等(2004)報(bào)道，當(dāng)細(xì)胞在蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖上生長(zhǎng)并補(bǔ) 充胰島素生長(zhǎng)因子I(IGF-I)時(shí)，HDF轉(zhuǎn)化形成軟骨細(xì)胞。
盤變性疾病
盤變性疾病(DDD)每年需要4500位脊柱外科醫(yī)生進(jìn)行700， 000例手術(shù)， 并且大多數(shù)盤疾病發(fā)生在年輕患者中。因此，開發(fā)治療該疾病的有效且安全的 方案是至關(guān)重要的。
椎間盤(IVD)是一種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，包括三種獨(dú)特的組織環(huán)、核和軟骨終 板。環(huán)是良好有序多層結(jié)構(gòu)的膠原纖維。核主要由糖胺聚糖(親水聚合物)構(gòu)成)。 軟骨終板提供營養(yǎng)物質(zhì)。上述組織的組合使正常盤執(zhí)行兩種相反功能穩(wěn)定和 彎曲。
椎間盤吸收沖擊，維持運(yùn)動(dòng)并保持穩(wěn)定。類似于其他軟骨，椎間盤(用作 兩個(gè)椎骨間的連接件)的內(nèi)在修復(fù)能力較低，因?yàn)槠錈o血管，只有由終板被動(dòng)
11擴(kuò)散供應(yīng)營養(yǎng)。因此， 一旦變性過程被激活，最終認(rèn)為是一不可逆的狀況。一 旦受損，變性盤隆起或突出，因而需要切除。
目前，盤變性疾病導(dǎo)致的慢性腰背疼痛患者的常用外科治療方法是椎間盤 切除術(shù)或脊柱融合術(shù)。椎間盤切除術(shù)是一種合適的手術(shù)，通過環(huán)內(nèi)開窗術(shù)常規(guī) 進(jìn)行以切除變性核能夠切除突出核(疝切開術(shù))和殘余的變性椎間核片段。雖 然該過程對(duì)于減輕和緩解神經(jīng)系統(tǒng)(根部或馬尾)是理想的，卻不適于脊柱手術(shù)， 因?yàn)樗梢饾撛诘闹職埿约膊?，?dǎo)致需要額外進(jìn)行侵入性外科手術(shù)(如融合 或關(guān)節(jié)成形術(shù))的變性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。椎間盤切除術(shù)能夠短時(shí)間緩解神經(jīng)根疼痛， 但卻導(dǎo)致盤高度降低，神經(jīng)-孔狹窄，處理水平不穩(wěn)定，(對(duì))背痛(的治療) 結(jié)果差，和/或諸如椎管狹窄或小平面疼痛的并發(fā)癥。
脊柱融合是腰背部疼痛的最優(yōu)選治療方法。在該外科手術(shù)中，切除整個(gè)盤， 通過插入移植物(例如，保持架、骨移植物和/或固定裝置)將兩個(gè)相鄰椎骨聯(lián)合 到一起(融合)。該手術(shù)適用于晚期盤變性患者。每年單在美國就有超過200,000 例脊柱融合術(shù)，但是由于運(yùn)動(dòng)缺失，脊柱融合術(shù)改變了椎間盤的生物機(jī)械性質(zhì) 并增加對(duì)融合盤附近的盤上的應(yīng)力和應(yīng)變。實(shí)際上，椎間盤切除術(shù)和融合術(shù)加 劇了患病盤、相鄰盤和周圍組織(例如小平面關(guān)節(jié))的病癥，導(dǎo)致進(jìn)一步的變性。
這些手術(shù)的失敗要求探尋開發(fā)非融合技術(shù)，例如盤或盤核假體。出現(xiàn)了用 人造盤的盤關(guān)節(jié)成形術(shù)來治療盤變性患者。其優(yōu)點(diǎn)在于，保持運(yùn)動(dòng)功能，降低 相鄰區(qū)段變性的發(fā)生率，避免融合相關(guān)并發(fā)癥，并允許盡早恢復(fù)功能。今天， 市售兩種類型的裝置整體盤置換和核置換，但這兩種裝置都具有較大的缺陷。
整體盤置換是大塊金屬假體來置換整個(gè)盤環(huán)、核和終板。這些假體采用侵入 性前路(經(jīng)腹膜或腹膜后)手術(shù)，需要血管外科手術(shù)。己報(bào)道移出、磨損碎片、 相鄰椎間盤變性、小平面關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)病以及該類型假體沉陷等問題。人造核替 代品保留剩余的盤組織及其功能。其設(shè)計(jì)使其能夠通過后路途徑植入，但這種 核假體的主要限制在于，僅適用于盤變性處于早期或中期的患者，因?yàn)樗枰?存在有能力的天然環(huán)。植入物擠壓仍然是主要的考慮。作為一種水凝膠基裝置，
它易碎，因而不能抵抗腰椎的顯著的(outstanding)生物機(jī)械約束(剪切應(yīng)力)。 對(duì)于惰性材料，可隨時(shí)間喪失其機(jī)械性質(zhì)，報(bào)道存在撕裂和破裂。僅置換核并 保留受損環(huán)可產(chǎn)生植入物擠出或盤脫出復(fù)發(fā)的病癥。組織工程和再生醫(yī)學(xué)是治療DDD的新手段。采用許多方法使組織再生。
這些方法可歸為三類l)采用無添加細(xì)胞的生物材料來發(fā)送信號(hào)，吸引細(xì)胞和 促進(jìn)再生；2)僅使用細(xì)胞以形成組織；和3)細(xì)胞與生物材料支架聯(lián)用，支架 用作組織形成的框架。雖然多年來使用自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)(ACT)來修復(fù)關(guān)節(jié) 軟骨，盤修復(fù)的組織工程技術(shù)仍然處于萌芽期。正在進(jìn)行廣泛的研究，動(dòng)物試 驗(yàn)已表明組織工程化椎間盤的可行性。更有趣的是，近來的試驗(yàn)臨床研究表明， ACT是椎間盤脫出的有效治療方法。用于盤修復(fù)的ACT的主要缺點(diǎn)在與，需 要進(jìn)行盤組織活檢。因此，需要一種改良的方法來恢復(fù)盤解剖學(xué)結(jié)構(gòu)和改善其 功能，因而仍然需要軟骨修復(fù)的改良方法。本發(fā)明力圖滿足這些和其他目的并 為本領(lǐng)域長(zhǎng)久以來的需求提供解決方案。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及任何類型的軟骨生物學(xué)修復(fù)的方法和組合物，例如包括椎間和 關(guān)節(jié)軟骨。更具體地但非排他性地，本發(fā)明涉及采用可植入裝置實(shí)現(xiàn)軟骨生物 學(xué)修復(fù)的方法和組合物，所述裝置是惰性結(jié)構(gòu)和活體結(jié)構(gòu)的組合，惰性結(jié)構(gòu)用 作體內(nèi)生物反應(yīng)器，活體結(jié)構(gòu)包括軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞，例如在具體的 實(shí)施方式中，來自示例性的人表皮成纖維細(xì)胞(HDF)的細(xì)胞。更具體地但非排 他性地，本發(fā)明涉及結(jié)合惰性結(jié)構(gòu)和活體核(living core)的混合(hybrid)構(gòu) 建物。在某些方面，所述惰性結(jié)構(gòu)不僅用作遞送系統(tǒng)以供養(yǎng)活體核組件并使其 生長(zhǎng)，而且用作細(xì)胞分化的誘導(dǎo)物。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述惰性結(jié)構(gòu)包 括兩種可膨脹的球囊樣生物聚合物，即包封在外膜(類似球囊)內(nèi)的內(nèi)膜(也類似 球囊)。因此，惰性結(jié)構(gòu)包括兩種大致同心的可膨脹膜。這兩種膜可進(jìn)一步限 定為第一包封膜，結(jié)構(gòu)上位于第二包封膜之內(nèi)。在具體的實(shí)施方式中，形狀可 為大致球形、大致橢圓形、大致圓形、大致圓球形、大致扁圓形、大致扁球形、 大致珠滴形、球囊樣等等。在其他具體的實(shí)施方式中，形狀是個(gè)體特異性的， 符合個(gè)體關(guān)節(jié)或椎間盤區(qū)域中殘余空穴的形狀和尺寸。
在某些方面，本發(fā)明例如從干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等體外產(chǎn)生天然組織。更具 體地但非排他性地，本發(fā)明涉及使人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和分化形成軟骨細(xì)胞樣細(xì) 胞的方法。將細(xì)胞，在某些實(shí)施方式中是自體細(xì)胞，置入由一種或多種生物聚
13合物構(gòu)成的支架基質(zhì)(例如以模擬天然基質(zhì))。支架可體外接種，并且在某些 方面可向細(xì)胞、基質(zhì)或兩者提供生長(zhǎng)因子。將支架置于生物反應(yīng)器內(nèi)，生物反 應(yīng)器是用于灌注基質(zhì)的系統(tǒng)并允許向支架施加機(jī)械力。施加力之后，有助于細(xì) 胞分化，尤其是形成軟骨。
在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明利用某些細(xì)胞分化形成的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。
在具體的實(shí)施方式中，例如，在特定培養(yǎng)條件下，例如低氧(Nicoll等，2001)、 高密度微量培養(yǎng)、在特定基質(zhì)如聚集蛋白聚糖上培養(yǎng)(French等，2004)， HDF 分化形成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。在具體的實(shí)施方式中，模擬椎間軟骨細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境 的因素是促使HDF的軟骨形成分化的強(qiáng)效刺激物，所述因素包括l)三個(gè)維
數(shù)；2)低氧張力(<5%); 3)機(jī)械應(yīng)力；和4)間歇性流體靜壓。在具體的實(shí)施方
式中，測(cè)定接種到三維藻酸鹽珠培養(yǎng)基中的HDF的細(xì)胞活力和軟骨形成分化。 在另一實(shí)施方式中，鑒定氧張力對(duì)藻酸鹽珠中培養(yǎng)的HDF分化的作用。在另 一實(shí)施方式中，表征流體靜壓對(duì)藻酸鹽珠中培養(yǎng)的HDF分化的作用。
細(xì)胞分化形成軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞可以任何合適的方式進(jìn)行，包括 裝置植入個(gè)體之前體外分化或裝置植入個(gè)體之前體外分化以及植入后的體內(nèi) 分化。
在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明裝置提供了關(guān)節(jié)體內(nèi)再生方法，所述關(guān)節(jié)包 括椎間盤、肘關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、顳下頜關(guān)節(jié)等。在本發(fā)明的某 些方面，活體腔室包括接種在生物材料中的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞(例如來自HDF 的細(xì)胞)的細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建物。在某些實(shí)施方式中，可體外啟動(dòng)活體腔室的培養(yǎng) 和分化。將活體核接種到惰性生物材料中并植入，細(xì)胞在體內(nèi)繼續(xù)增殖和分化。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的應(yīng)用所聚焦的軟骨是椎間盤軟骨。在本發(fā)明 的具體方面，本發(fā)明所用細(xì)胞經(jīng)受機(jī)械應(yīng)變而發(fā)生軟骨形成分化。因此，本發(fā) 明的實(shí)施方式提供了椎間惰性結(jié)構(gòu)作為體內(nèi)生物反應(yīng)器，用于誘導(dǎo)活體核的生 長(zhǎng)和分化。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了將惰性結(jié)構(gòu)和活體核組合起來的 混合(hybrid)構(gòu)建物，可采用最小侵入性外科手術(shù)將其植入軀體間空間中。
本發(fā)明的示例性目的是提供一種方法，該方法旨在修復(fù)變性椎間盤，例如 恢復(fù)椎間盤解剖學(xué)結(jié)構(gòu)并改善其功能。在本發(fā)明的具體方面，提供了修復(fù)受損 盤的方法，該方法采用由含有惰性(材料)的裝置和活體核組成的混合構(gòu)建物，所述惰性裝置旨在供養(yǎng)內(nèi)部活體核并使其分化。因此，惰性結(jié)構(gòu)可用作營養(yǎng)物 質(zhì)和生長(zhǎng)因子的遞送系統(tǒng)，用作生物反應(yīng)器，使自體表皮成纖維細(xì)胞分化形成 軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。在機(jī)械應(yīng)力(例如間歇性流體靜壓和/或流體剪切應(yīng)力)下，細(xì) 胞將獲取中央部核細(xì)胞和外周環(huán)細(xì)胞的特征。示例性的成纖維細(xì)胞衍生的軟骨 細(xì)胞樣細(xì)胞可從皮膚收集，例如通過活組織檢査，然后接種到三維聚合物支架 上，用于修復(fù)盤。在特定方面，該過程不再需要侵入性技術(shù)來獲取自體軟骨細(xì) 胞。本發(fā)明的某些方面，混合構(gòu)建物結(jié)合了惰性生物材料和活體細(xì)胞，生物材 料用作營養(yǎng)遞送系統(tǒng)，活體細(xì)胞可方便地從皮膚收集，其優(yōu)點(diǎn)在于，能夠自我 維持或重塑并可采用最小侵入性后路外科手術(shù)恢復(fù)盤功能。
在本發(fā)明的某些方面，從關(guān)節(jié)或椎間隙切除受損軟骨，并將混合構(gòu)建物安 裝到上述切除形成的空間內(nèi)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，采用最小侵入性外 科手術(shù)植入裝置。在具體的實(shí)施方式中，采用示例性的外科技術(shù)。在椎間盤的 一般實(shí)施方式中，如果必須切除兩個(gè)相鄰椎骨間的椎間盤(例如腰椎中)，從患 者背部后路進(jìn)行外科手術(shù)的侵入性較小。該最小侵入性手術(shù)能夠通過環(huán)內(nèi)小孔 (環(huán)切除術(shù))進(jìn)行軀體間空間的刮除術(shù)，切除盤核變性片段。利用該環(huán)中小孔， 本發(fā)明采用新型椎間修復(fù)包，所述修復(fù)包可滑過上述切口并膨脹到在軀體間空 間內(nèi)進(jìn)行核切除所形成的區(qū)域內(nèi)。在具體的實(shí)施方式中，切除受損盤和安裝組 織工程化構(gòu)建物在同一個(gè)后路手術(shù)中進(jìn)行，從而盡可能降低風(fēng)險(xiǎn)、外科手術(shù)并 發(fā)癥和再次介入的發(fā)生率以及手術(shù)時(shí)間。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種可植入的裝置，該裝置包括細(xì)胞
/支架組合物(composition)和包封裝置，所述包封裝置包括第一大致同心膜； 位于所述第一大致同心膜同心外部的第二大致同心膜；所述第一大致同心膜內(nèi) 的第一容積；位于所述第一大致同心膜之外、所述第二大致同心膜之內(nèi)的第二 容積；以及從第二容積提取材料的結(jié)構(gòu)，其中，所述第一大致同心膜是半透膜 并容納細(xì)胞/支架組合物。如果各膜的中心基本上鄰近，就認(rèn)為膜相互間大致同 心。
在本發(fā)明的某些方面，除本發(fā)明可植入裝置外還向個(gè)體提供另一種療法。 例如，在植入裝置之前、期間和/或之后，可給予個(gè)體一種或多種抗生素。示例 性的術(shù)后療法包括非甾體抗炎藥(NSAID)、單純止痛藥(鎮(zhèn)痛藥)、和/或(需要
15時(shí))肌松藥，然后可能是術(shù)后功能恢復(fù)，例如術(shù)后第一、第二、第三周或更長(zhǎng) 時(shí)間。
在一些實(shí)施方式中，提供了用于軟骨修復(fù)的混合構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包括 由惰性材料構(gòu)成的包封裝置和由軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞構(gòu)成的活體核。包封裝置用作 軟骨工程技術(shù)的體內(nèi)生物反應(yīng)器。它通過提供生長(zhǎng)因子和營養(yǎng)物質(zhì)并傳遞生理
學(xué)負(fù)荷狀況(physiologic loading regimen)，使軟骨細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)和分化。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種可植入裝置，該裝置包括細(xì)胞/ 支架組合物和包封裝置，所述包封裝置包括具有內(nèi)側(cè)和外側(cè)的第一膜；具有 內(nèi)側(cè)和外側(cè)的第二膜，所述第一膜被包封在第二膜內(nèi)側(cè)；位于第一膜內(nèi)側(cè)的第 一容積；位于第一膜外側(cè)、第二膜內(nèi)側(cè)的第二容積；以及向第二容積添加流體、 從第二容積去除流體、或?qū)崿F(xiàn)這兩種作用的結(jié)構(gòu)，其中，所述細(xì)胞/支架組合物 位于第一膜內(nèi)側(cè)，所述第一膜具有以下一種或多種特征半滲透性；生物相容 性；可生物降解性；和可重吸收性；所述第二膜具有以下一種或多種特征生 物相容性、流體密封性、氧氣可滲透性；可重吸收性；可生物降解性；和可膨 脹性。
在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，支架由合成聚合物、天然水凝膠或合成水凝膠 構(gòu)成。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，合成聚合物是聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸 -共-乙醇酸、聚-s-己內(nèi)酯或聚(甘油-癸二酸酯)(PGS)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方 式中，合成聚合物是聚磷腈(polyphosphazene)、聚酑或聚原酸酯。在具體的 實(shí)施方式中，天然水凝膠包括膠原、透明質(zhì)酸、海藻酸、瓊脂糖、殼聚糖、纖 維蛋白、明膠或它們的共聚物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，合成水凝膠包括聚(環(huán) 氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(乳酸)、聚(反丁烯二酸丙烯酯-共-乙二 酉享)(poly(propylene fUmarate-co-ethylene glycol))或它們的共聚物。
在本發(fā)明的某些方面，裝置中的細(xì)胞是軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞，例如， 所述軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞分泌選自下組的分子聚集蛋白聚糖、II型膠 原、S0X-9蛋白、軟骨連接蛋白和基底膜蛋白多糖。在具體的例子中，細(xì)胞由 成纖維細(xì)胞和/或干細(xì)胞分化。示例性的成纖維細(xì)胞是表皮成纖維細(xì)胞、腱成纖 維細(xì)胞、韌帶成纖維細(xì)胞、滑液成纖維細(xì)胞、包皮成纖維細(xì)胞或它們的混合物。
在具體的方面，第一膜由可生物降解的、生物相容的、可重吸收的聚合物構(gòu)成。在其他方面，第一膜由聚丙烯酸酯、聚偏乙烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨 酯、聚苯乙烯、聚酰胺、醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚砜、聚磷腈、聚丙烯腈、 聚(丙烯腈/共氯化乙烯)或它們的衍生物、共聚物或混合物構(gòu)成。在具體的方面， 第一膜由聚電解質(zhì)絡(luò)合產(chǎn)生。在具體的方面，第二膜包括聚乙醇酸(PGA)、聚
乳酸(PLA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚-e-己內(nèi)酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚二 氧六環(huán)酮(PDO)、聚乙烯、聚(甘油癸二酸酯)(PGS)或它們的衍生物、共聚物或 混合物。在其他實(shí)施方式中，第二膜的重吸收速率比第一膜的重吸收速率慢。
在具體的實(shí)施方式中，可植入裝置包含一種或多種營養(yǎng)劑、生長(zhǎng)因子和/ 或藥物。在一些情況下，可植入裝置可進(jìn)一步限定為包含含有一種或多種營養(yǎng) 劑、生長(zhǎng)因子和/或藥物的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基。在具體的實(shí)施方式中，培養(yǎng)基補(bǔ)充 有胎牛血清(FBS)、抗壞血酸和/或地塞米松。在某些情況下，營養(yǎng)劑、生長(zhǎng)因 子和/或藥物可位于支架中、第一容積中、第二容積中，或它們的組合。生長(zhǎng)因 子選自骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)， BMP-4， BMP-6， BMP-7，軟骨衍生 的形態(tài)發(fā)生蛋白(CDMP)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(3(TGF-(3)，胰島素生長(zhǎng)因子I(IGF-I)， 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)， FGF-2，血小 板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)，以及它們的混合物，在具體的實(shí)施方式中，藥物可 進(jìn)一步限定為一種或多種抗生素、抗真菌劑、或抗病毒劑。
在本發(fā)明的某些方面，所述結(jié)構(gòu)包括一個(gè)或多個(gè)管道和/或一個(gè)或多個(gè)導(dǎo) 管和/或一個(gè)或多個(gè)儲(chǔ)器。在具體的例子中，所述結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步限定為包括第一 管道、第二管道、任選的第一儲(chǔ)器、任選的第二儲(chǔ)器中的一種或多種。在具體 的實(shí)施方式中，第一和第二管道各自包括位于第二容積內(nèi)的第一末端，所述第 一和第二管道各自包括連接于第一和第二儲(chǔ)器或兩者的第二末端。第一和/或第 二管道由與第二膜相同的材料構(gòu)成，在一示例性的情況下，所述第一和/或第二 管道由硅酮橡膠構(gòu)成。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，提供了一種修復(fù)個(gè)體關(guān)節(jié)(例如椎間盤)中的 受損軟骨的方法，該方法包括將本發(fā)明的裝置遞送到個(gè)體的各個(gè)關(guān)節(jié)(例如椎 間盤)。在一個(gè)具體的方面，該方法還包括在合適的離體條件下制備細(xì)胞/支架 組合物。在本發(fā)明另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，制備細(xì)胞/支架組合物被定義為在 合適的條件下將一種或多種細(xì)胞暴露于(subjectto)支架。在本發(fā)明的某些方
17面，制備細(xì)胞/支架組合物持續(xù)不少于約2-3天。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，合 適的條件允許細(xì)胞增殖，例如，允許刺激軟骨形成分化。在示例性的實(shí)施方式
中，合適的條件可進(jìn)一步限定為高密度微量培養(yǎng)(micromass culture),低氧張力 下(約1.0%-7.5%)，機(jī)械應(yīng)力下，和/或給予補(bǔ)充有生長(zhǎng)因子、抗壞血酸和/或地 塞米松的培養(yǎng)基。
在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞/支架組合物經(jīng)受機(jī)械應(yīng)力，所述機(jī)械應(yīng) 力可以是流體靜壓、流體剪切應(yīng)力或其組合。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，機(jī)械 應(yīng)力是間歇性的。在具體的情況下，機(jī)械應(yīng)力是流體剪切應(yīng)力，支架是微射流 支架。
在其他具體的實(shí)施方式中，遞送步驟被限定為采用最小侵入性手術(shù)植入裝
置。在一示例性情況下，將裝置植入患者之后，使第二膜膨脹以填充關(guān)節(jié)(例 如椎間盤)中的空隙。在另一示例性情況下，在將裝置遞送至個(gè)體椎間盤之前， 從個(gè)體切除至少一部分內(nèi)源性椎間盤。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明所涉及的 關(guān)節(jié)可以是椎間盤、膝關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、或顳下頜關(guān)節(jié)等。
在本發(fā)明的某些方面，裝置結(jié)構(gòu)包括具有第一和第二端的第一管道，所 述第一管道的第一端位于第二容積內(nèi)；具有第一和第二端的第二管道，所述第 二管道的第一端位于第二容積內(nèi)；第一儲(chǔ)器；和第二儲(chǔ)器，其中，將裝置遞 送至個(gè)體椎間盤和使第二膜膨脹之后，所述第一和第二管道的第二端分別連接 于所述第一和第二儲(chǔ)器。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述第一和第二儲(chǔ)器位于 個(gè)體皮下。本發(fā)明方法還可包括密封第一膜、密封第二膜、或進(jìn)行上述兩者操
作。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，至少一部分第二容積發(fā)生交換。在一個(gè)示例性 的實(shí)施方式中，本發(fā)明方法還包括通過第一儲(chǔ)器去除至少一部分的第二容積。 在另一具體的方面，該方法包括去除來自第一或第二儲(chǔ)器的流體，將流體分別
遞送至第二或第一儲(chǔ)器，或在去除第一或第二儲(chǔ)器的流體的同時(shí)將流體分別遞 送至第二或第一儲(chǔ)器。
在某些情況下，將細(xì)胞/支架組合物插入第一膜，然后將裝置遞送至個(gè)體， 或者，將裝置遞送至個(gè)體之后將細(xì)胞/支架組合物插入第一膜。在一個(gè)具體的實(shí) 施方式中，將第一膜插入第二膜，然后將裝置遞送至個(gè)體，或者，將裝置遞送 至個(gè)體之后將第一膜插入第二膜。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種制備細(xì)胞/支架組合物的方法，
18其中，所述細(xì)胞是軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞，該方法包括將能夠分化形成 軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞提供給支架；使細(xì)胞經(jīng)受機(jī)械應(yīng)力；和任選地使細(xì)胞接
觸適合于軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的分化形成過程的一種或多種生長(zhǎng)因子。 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，機(jī)械應(yīng)力是間歇性的。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種試劑盒，其包括本發(fā)明的裝置， 所述裝置被容納在一種或多種合適的容器中。在具體的實(shí)施方式中，試劑盒還 包括細(xì)胞，所述細(xì)胞是軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞、或能夠分化形成軟骨細(xì)胞 或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種可植入的裝置，該裝置包括包封在膜 內(nèi)的細(xì)胞/支架組合物，所述膜具有內(nèi)側(cè)和外側(cè)；和用于交換至少一部分的膜內(nèi) 流體的結(jié)構(gòu)，所述膜具有一種或多種以下特征半滲透性；生物相容性；可生 物降解性；和可重吸收性。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種用于軟骨修復(fù)的混合構(gòu)建物，該構(gòu)建物 包括包含惰性材料的包封裝置；和包含軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的活體核，所述包封 裝置包封所述活體核。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了軟骨工程技術(shù)的體內(nèi)生物反應(yīng)器，其包括可 包封細(xì)胞的裝置，其中，所述細(xì)胞能夠分化形成軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞， 所述細(xì)胞包封提供了適合所述細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)和分化的條件，所述條件包括提供 在所述細(xì)胞上的生理學(xué)負(fù)荷狀況。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，生理學(xué)負(fù)荷狀況 包括來自個(gè)體脊柱的力。
上述內(nèi)容廣泛地列出了本發(fā)明的特征和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，因而能更好地理解下文 對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在后文中描述，這些特征和 優(yōu)點(diǎn)形成本發(fā)明權(quán)利要求書的內(nèi)容。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所述概念和具體 實(shí)施方式可方便地用作改進(jìn)和設(shè)計(jì)其他結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，用于執(zhí)行與本發(fā)明相同的 目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解，這些等價(jià)結(jié)構(gòu)也不背離所附權(quán)利要求書所述 的本發(fā)明的精神和范圍。結(jié)合附圖，參考以下描述，將更好地理解認(rèn)為是本發(fā) 明特征的新型特點(diǎn)，包括組成和操作方法方面，以及其他目的和優(yōu)點(diǎn)。然而， 應(yīng)清楚指出，每幅圖僅僅是為了闡述和說明的目的，而不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的 限制。本發(fā)明引用了許多參考文獻(xiàn)和文件，全部將其納入本文作為參考。附圖簡(jiǎn)要說明
為了更全面地理解本發(fā)明，現(xiàn)在將結(jié)合附圖參考以下說明。


圖1顯示了示例性的L4-L5椎間隙的剖面圖。
圖2顯示了椎間隙的后路途徑，包括示例性的脫出組織和變性盤組織。
圖3顯示了進(jìn)行盤切除的環(huán)缺損位置的示例性實(shí)施方式。
圖4顯示了本發(fā)明實(shí)施方式中的腹部截面和引流系統(tǒng)，包括示例性的中線
切口和示例性的HR儲(chǔ)器(Holter-Rickham reservoirs) (CS有限公司(Codman &
Srrartleff， Inc.); Raynham，馬塞諸塞州)。
發(fā)明詳述
如本說明書中所用，"一個(gè)(a)"或"這個(gè)(an)"可表示一個(gè)或多個(gè)。如 權(quán)利要求書中所用，當(dāng)與"包括"聯(lián)用時(shí)，詞語"一個(gè)"可表示一個(gè)或一個(gè)以上。 如本文所用"另一個(gè)"可表示至少第二個(gè)或更多個(gè)。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā) 明各方面可"基本上包括"或"包括"本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)序列。本發(fā)明的一些實(shí) 施方式可包括或基本上包括一種或多種元件、方法步驟和/或本發(fā)明的方法。認(rèn) 為本文所述的任何方法或組合物可參照本文所述的任何其他方法或組合物來 實(shí)施。
I.定義
本文所用的術(shù)語"生物反應(yīng)器"是指能夠?qū)崿F(xiàn)生物轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。在具體的實(shí) 施方式中，細(xì)胞以受控方式進(jìn)行培養(yǎng)并通過特異性反應(yīng)過程發(fā)生轉(zhuǎn)化。在本發(fā) 明的一些方面，生物反應(yīng)器能夠調(diào)節(jié)一種或多種以下參數(shù)溫度、介質(zhì)pH、 氣體交換、機(jī)械刺激、p02、 PC02和濕度。在具體的實(shí)施方式中，生物反應(yīng)器 中存在灌注系統(tǒng)(灌注-生物反應(yīng)器)，提供恒定的營養(yǎng)供給和有效去除廢棄產(chǎn) 物。機(jī)械應(yīng)力是軟骨細(xì)胞功能的重要因素。關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)期間間歇性地同時(shí)發(fā)生機(jī) 械應(yīng)力的組合，包括細(xì)胞和組織變形、壓縮力和剪切力、流體流動(dòng)以及流體靜 壓的變化。在某些方面，這些狀態(tài)由生物反應(yīng)器重現(xiàn)。
本文所用術(shù)語"導(dǎo)管"是指空心管道，可以是柔性或剛性，用于從體內(nèi)某區(qū)域引流流體。
本文所用術(shù)語"軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞"是指不是原代軟骨細(xì)胞，而是由干細(xì)胞 (例如間充質(zhì)干細(xì)胞)衍生的細(xì)胞，或由其他細(xì)胞系(例如成纖維細(xì)胞)衍生的細(xì) 胞。軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞(軟骨的細(xì)胞)的表型。這表示它們不僅具 有軟骨細(xì)胞的形狀(例如，多角形和/或菱形細(xì)胞)，而且能夠聚集和產(chǎn)生軟骨基
質(zhì)組分，例如硫酸化蛋白聚糖或n型膠原。因此，軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的示例性標(biāo)
記物包括聚集蛋白聚糖(一種硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素蛋白聚糖)、n型膠原、
Sox-9蛋白質(zhì)、軟骨連接蛋白和基底膜蛋白多糖(一種硫酸類肝素蛋白多糖)中
的一種或多種。
本文所用術(shù)語"共聚物"是指包括兩種或多種不同單體的聚合物(聚合物 包含大分子的天然來源或合成的化合物，由一系列的重復(fù)簡(jiǎn)單單體連接形成)。
本文所用術(shù)語"去分化"是指專門化的細(xì)胞或組織退化到較簡(jiǎn)單、胚性程度 較高的非專門化形式。當(dāng)軟骨細(xì)胞離體單層生長(zhǎng)時(shí)，它們?nèi)狈w內(nèi)環(huán)境(尤其 是三維和機(jī)械應(yīng)力)，并經(jīng)歷稱為去分化的形態(tài)學(xué)和分子變化。該過程涉及形 態(tài)學(xué)改變，以及軟骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)改變?yōu)檎Ｇ闆r下成纖維細(xì)胞中基 因的表達(dá)。
本文所用術(shù)語"椎間盤切除術(shù)"是指通過環(huán)內(nèi)開窗術(shù)切除部分或所有變形 核的手術(shù)。它可采用手術(shù)顯微鏡通過最小侵入性方法進(jìn)行。該手術(shù)過程通過切 除壓縮的脫出(突出)核來緩解根部。它可通過環(huán)內(nèi)肌腱切斷( L)來切除變性的 剩余核。具體地說，椎間盤切除術(shù)實(shí)際上是切除變性核片段的疝切除術(shù)。
本文所用術(shù)語"包封"是指包封在邊界，例如膜囊內(nèi)。
本文所用術(shù)語"流體剪切應(yīng)力"是指流體在表面上的運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致剪切應(yīng)力的 產(chǎn)生。剪切應(yīng)力是應(yīng)力平行于表面時(shí)的應(yīng)力狀態(tài)。微射流支架允許流體在微通 道內(nèi)流動(dòng)。流體流動(dòng)在接種到支架中的細(xì)胞上誘導(dǎo)流體剪切應(yīng)力。
本文所用術(shù)語"密封"是指例如通過融合或封口，使不透液體。具體地說， 密封膜不允許內(nèi)部的液體從膜流出，雖然允許氧氣和二氧化碳通過膜(例如氧 氣進(jìn)入膜，二氧化碳離開膜)。
本文所用術(shù)語"流體靜壓"是指靜止時(shí)由液體(例如水)產(chǎn)生或傳遞的壓力。 椎間盤在不同的負(fù)荷運(yùn)動(dòng)期間暴露于寬范圍的盤內(nèi)流體靜壓，躺下或放松靜坐
21期間最小(約0.25MPa),彎腰提重物(lifting weights with a round back)時(shí)最大 (約2.5-5 MPa)。這些不同的負(fù)荷幅度根據(jù)其幅度，通過改變盤基質(zhì)周轉(zhuǎn)而影響 椎間盤。進(jìn)行了許多研究來確定體外應(yīng)用于細(xì)胞以在體外誘導(dǎo)細(xì)胞軟骨形成分 化的間歇性流體靜壓(IHP)的最佳方案。測(cè)試了不同的方案。在這些研究中，應(yīng) 用的IHP在0.5Mpa-5Mpa的振幅范圍內(nèi)，頻率范圍0.01-1 Hz。在具體的實(shí)施 方式中，包封裝置被設(shè)計(jì)成能夠在體內(nèi)將流體靜壓傳遞至細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建物。在 不同的負(fù)荷運(yùn)動(dòng)期間，填充了液體(介質(zhì))的外部包封被壓縮；在這種壓縮下， 一些液體介質(zhì)擴(kuò)散通過半滲透內(nèi)膜，從而灌溉細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物并在細(xì)胞-基質(zhì) 構(gòu)建物內(nèi)產(chǎn)生流體靜壓。在該系統(tǒng)中，將合適的生理學(xué)流體靜壓應(yīng)用于細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物，有利于細(xì)胞的軟骨形成分化。
本文所用術(shù)語"低氧"是指缺乏氧氣。在具體的方面，指氧張力小與約20%。 本文所用術(shù)語"關(guān)節(jié)"是指骨骼的兩根骨頭聯(lián)結(jié)的體內(nèi)區(qū)域。 本文所用術(shù)語"膜"是指柔軟材料層，其分割不同類型和/或區(qū)域的生物材 料。它可由天然和/或合成材料構(gòu)成，例如，可能能夠滲透溶液中的物質(zhì)。 本文所用術(shù)語"微射流支架"是指包括微通道系統(tǒng)的材料。 本文所用術(shù)語"最小侵入性外科手術(shù)"是指通過個(gè)體中的一個(gè)或多個(gè)小切 口進(jìn)行的外科手術(shù)。例如，在某些方面，最小侵入性外科手術(shù)采用專門的技術(shù)， 帶顯微鏡的袖珍照相機(jī)，小型光纖信號(hào)燈和/或高清晰度監(jiān)視器。對(duì)于個(gè)體來說， 最小侵入性外科手術(shù)是指與常規(guī)開放式手術(shù)相比，對(duì)身體的創(chuàng)傷較小、失血較 少、手術(shù)疤痕較小以及對(duì)鎮(zhèn)痛藥的需要較少。相對(duì)于常規(guī)開放式手術(shù)，最小侵 入性手術(shù)后個(gè)體能更快離開醫(yī)療機(jī)構(gòu)，更快回到正常生活。
本文所用術(shù)語"儲(chǔ)器"是指用作注射室的裝置。在具體的實(shí)施方式中，儲(chǔ)器 類型可以是本領(lǐng)域常規(guī)用于將藥物(例如，在腦膜炎或室炎的情況下，抗生素) 遞送到腦室系統(tǒng)(因而稱為"腦室造瘺術(shù)")，遞送到靜脈內(nèi)(腫瘤學(xué)目的的化療)、 或遞送到蛛網(wǎng)膜下脊柱間隙內(nèi)(嗎啡以緩解疼痛)的類型。在具體的方面，考慮 了一種藥物遞送系統(tǒng)。它包括幾個(gè)部分l)硅酮基(稱為"硅橡膠")材料頂層， 允許重復(fù)穿孔而不喪失其防水特征；2)不銹鋼基質(zhì)，避免針損傷下層組織；3) 連接導(dǎo)管的硅橡膠末端。導(dǎo)管也可由硅橡膠構(gòu)成。其遠(yuǎn)端可進(jìn)入目標(biāo)部位切割 成適當(dāng)?shù)某叽?，而其近端則連接于儲(chǔ)器末端。示例性的系統(tǒng)具有l(wèi)-2cm3的腔室，
22因而稱為"儲(chǔ)器"(儲(chǔ)罐)。
本文所用術(shù)語"支架"是指例如支持細(xì)胞生長(zhǎng)和/或遷移的多孔可生物降解 的聚合物構(gòu)建物。
本文所用術(shù)語"接種"是指將細(xì)胞植入支架中。細(xì)胞將粘附于支架，然后在 支架中生長(zhǎng)分化。
n.本發(fā)明的一般實(shí)施方式
在本發(fā)明的一般實(shí)施方式中，提供了一種裝置及其使用方法，所述裝置包 括包封在多層膜內(nèi)的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物。雖然至少部分地通 過本發(fā)明方法可修復(fù)任何組織，包括任何軟骨組織，但是在具體的實(shí)施方式中， 修復(fù)椎間盤軟骨或關(guān)節(jié)。本發(fā)明示例性方法采用活體核和惰性核或結(jié)構(gòu)的組 合，從而提供混合結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的具體方面，活體核包括軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞(例
如來自HDF的細(xì)胞)的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物，惰性結(jié)構(gòu)包括活體核，采用最小侵入
性外科手術(shù)植入患者體內(nèi)。
本發(fā)明提供了采用自體人表皮成纖維細(xì)胞(HDF)作為細(xì)胞源進(jìn)行軟骨生
物學(xué)修復(fù)的方法。本發(fā)明還提供了一種裝置，該裝置包括包封在多層膜內(nèi)的細(xì) 胞(例如軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞)的細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉 及采用特殊裝置實(shí)現(xiàn)細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)與分化。通過機(jī)械應(yīng)力，在具體的方面，間 歇性流體靜壓(IHP)和/或流體剪切應(yīng)力，誘導(dǎo)軟骨形成分化。在本發(fā)明的一般 實(shí)施方式中，采用HDF作為細(xì)胞源，工程構(gòu)建新的椎間盤軟骨，因?yàn)檫@些細(xì) 胞容易收集和生長(zhǎng)。想法是誘導(dǎo)這些細(xì)胞分化形成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。已存在一 些HDF軟骨分化形成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的例子。然而，這些研究?jī)H在體外進(jìn)行， 使細(xì)胞分化的技術(shù)基于使用特異性生長(zhǎng)因子，低氧或特定的基質(zhì)如聚集蛋白聚 糖。
因?yàn)槠湓O(shè)計(jì)，該裝置允許一種或多種以下過程l)營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣擴(kuò)散至 活細(xì)胞；和/或2)負(fù)荷轉(zhuǎn)移到細(xì)胞上。機(jī)械力，尤其是IHP是成纖維細(xì)胞軟骨 形成分化的關(guān)鍵。已知IHP是誘導(dǎo)和維持軟骨細(xì)胞表型的最強(qiáng)效刺激。當(dāng)從軟 骨收集軟骨細(xì)胞用于體外工程構(gòu)建新的軟骨時(shí)，這些細(xì)胞需要擴(kuò)增，但這可導(dǎo) 致軟骨細(xì)胞去分化。已表明IHP可使細(xì)胞重新分化形成軟骨細(xì)胞。采用軟骨細(xì)胞在體外工程構(gòu)建軟骨的人常常采用機(jī)械應(yīng)變，尤其是IHP作為分化誘導(dǎo)劑。
然而，沒有文獻(xiàn)報(bào)道IHP對(duì)HDF軟骨形成分化的作用。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述裝置至少包括兩個(gè)部件l)細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建
物，其中，所述細(xì)胞(例如HDF)被接種到支架中(可沖走沒有粘附于支架的細(xì) 胞)；2)包封裝置。在具體的實(shí)施方式中，體內(nèi)包封裝置包括兩種同心膜。1) 內(nèi)膜是半透膜，包裹細(xì)胞-支架構(gòu)建物(這種半透膜可滲透小分子，因而允許營 養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的擴(kuò)散以及廢物的消除，但不可滲透大分子如膠原和葡萄糖胺聚 糖；這些形成天然細(xì)胞外基質(zhì)的大分子被保留在支架內(nèi)；和2)外膜是不可滲透 流體但可滲透氧氣，它可擴(kuò)張和膨脹以通過最小侵入性后路外科手術(shù)植入(在 具體的實(shí)施方式中， 一旦膨脹將充滿椎間盤切除術(shù)的空腔，例如準(zhǔn)確匹配該空 腔)。外膜充滿滋養(yǎng)細(xì)胞的介質(zhì)。外殼內(nèi)包封的流體形成將IHP轉(zhuǎn)移至活細(xì)胞 的流體環(huán)境。大約在手術(shù)后個(gè)體能夠站立并開始重新行走的這一天，他對(duì)脊柱 施加一定的負(fù)荷，尤其是對(duì)器械化的脊柱高度(instrumented level)施加負(fù)荷。 因此，活體核在生理學(xué)負(fù)荷下通過充滿介質(zhì)的包殼接受正確的周期性流體靜壓 狀況，這有利于HDF的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化。因此，在某些方面，患者植入裝置后大 約l天內(nèi)即可行走，植入裝置后約2天、約3天、約4天、約5天或約更多天 的時(shí)間內(nèi)即可行走。
在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，充滿介質(zhì)的外膜連接引流系統(tǒng)以有規(guī)律地更換 介質(zhì)。通過機(jī)械應(yīng)力，尤其是間歇性流體靜壓(IHP)和/或流體剪切應(yīng)力在體外， 然后在體內(nèi)誘導(dǎo)HDF軟骨形成分化。示例性的共培養(yǎng)條件如下所述高密度 微量培養(yǎng)、補(bǔ)充BMP-2、抗壞血酸、以及低氧。
本發(fā)明解決了該領(lǐng)域中的許多問題。營養(yǎng)劑和生長(zhǎng)因子通過原位介質(zhì)提供 給細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物。這可避免營養(yǎng)劑從周圍天然組織(終板)的擴(kuò)散問題，這種 擴(kuò)散常因?yàn)檫@些結(jié)構(gòu)的變性而不充分。將對(duì)HDF的軟骨形成分化重要的生長(zhǎng) 因子加入到介質(zhì)中。在具體的實(shí)施方式中，采用HDF而無需使用收集軟骨細(xì) 胞的侵入性技術(shù)。在體外使HDF或任何其他細(xì)胞預(yù)先分化一段時(shí)間，然后在 體內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)和分化。外部包殼中充滿流體的包封裝置將提供適合HDF軟骨 形成分化的生理學(xué)負(fù)荷和壓縮力。
24III.混合構(gòu)建物
本發(fā)明采用混合構(gòu)建物來修復(fù)關(guān)節(jié)(例如椎間盤)中的軟骨?；旌蠘?gòu)建物的 示例性實(shí)施方式如本文所述，在某些方面，混合構(gòu)建物是可植入的裝置，用于 植入哺乳動(dòng)物，例如人、狗、貓、馬、豬、綿羊、山羊等。在具體的方面，混 合構(gòu)建物至少包括活體核和惰性結(jié)構(gòu)，所述活體核包含細(xì)胞和支架。
A,細(xì)胞/支架組合物
活體核也稱為細(xì)胞/支架組合物，它是一種細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物，包括接種在 支架(也可稱為基質(zhì))中的細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，支架包括藻酸鹽珠；
微射流支架(微射流支架可由任何可生物降解的生物聚合物構(gòu)成有機(jī)可生物 降解的聚合物，例如聚(L-乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚乳酸-共-乙醇酸 (PLGA);天然水凝膠，例如膠原、HA、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖、膠原/HA 組合、殼聚糖/GAG組合、膠原/GAG組合；和/或合成水凝膠，例如聚(環(huán)氧乙 烷)(PEO)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(反丁烯二酸丙烯酯-共-乙二醇)(P(PF-co-EG))。在具體的實(shí)施方式中，使用細(xì)胞粘附配體如肽或多糖。 肽序列能夠結(jié)合細(xì)胞受體。這些肽包括示例性的氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天 冬氨酸(RGD)、精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸(REDV)、酪氨酸-異亮氨酸-甘 氨酸-絲氨酸-精氨酸(YIGSR)、或異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸 (IKVAV)，它們可附連于支架，其中可加入配體和/或生長(zhǎng)因子以調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)。 事實(shí)上，生長(zhǎng)因子可結(jié)合在支架內(nèi)或包含在外膜的介質(zhì)中。支架材料是可生物 降解的，生物降解的速率是可操縱的。
根據(jù)本發(fā)明，如上所述，機(jī)械應(yīng)力下HDF在體外或在體內(nèi)或者先在體外 再在體內(nèi)分化形成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。如上所述，重要的共培養(yǎng)條件包括高細(xì)胞 密度培養(yǎng)；生長(zhǎng)因子(BMP-2);和/或抗壞血酸。低氧張力并在含胰島素生長(zhǎng)因 子I(IGF-I)的聚集蛋白聚糖上培養(yǎng)的條件下，HDF也可分化形成軟骨細(xì)胞樣細(xì) 胞。如上所述，使用生物反應(yīng)器在體外誘導(dǎo)HDF增殖和分化。在本發(fā)明的具 體方面，使用本發(fā)明的惰性結(jié)構(gòu)在體外誘導(dǎo)分化。在本發(fā)明具體的實(shí)施方式中， 藻酸鹽珠中的HDF或接種在微射流支架中的HDF或接種在任何其他聚合物支 架中的HDF被包封在半透膜中，半透膜是惰性結(jié)構(gòu)的一部分。半透膜的作用是包封軟骨細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物以濃縮ECM蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。該膜允許例如氧氣、
營養(yǎng)劑/廢物和二氧化碳通過。
在具體的實(shí)施方式中，支架是指支持細(xì)胞生長(zhǎng)和/或遷移的可生物降解的 多孔聚合物構(gòu)建物。在具體的實(shí)施方式中，這種材料是無毒、生物相容且可生 物降解的。
在示例性的實(shí)施方式中，支架采用藻酸鹽。藻酸鹽是一種從海藻分離的天
然多糖。它是由D-甘露糖醛酸和L-葡萄糖醛酸(guluronate)單體組成的多糖。 當(dāng)與鈣離子交聯(lián)時(shí)，形成可生物相容的、可生物降解的凝膠。藻酸鹽是一種公 知的組織再生療法的基質(zhì)材料。其比其他水凝膠更廣泛地用于評(píng)價(jià)水凝膠支架 用于軟骨工程的體內(nèi)潛力。本發(fā)明可使用藻酸鹽巨珠(l-3mm大小)或藻酸鹽微 珠(250-50(Him)。優(yōu)選藻酸鹽微珠。這些較小的珠具有較高的表面-體積比，允 許必需營養(yǎng)物質(zhì)的良好轉(zhuǎn)運(yùn)，它們的脆性也較低。藻酸鹽是生物相容的，由美 國食品藥品管理局批準(zhǔn)用于人體。
HDF可接種在藻酸鹽巨珠(如下所述)或優(yōu)選地藻酸鹽微珠中。本領(lǐng)域已知 各種技術(shù)來產(chǎn)生藻酸鹽微珠。通常由靜電液滴產(chǎn)生方法制備。例如，HDF可按 照下述方法接種到藻酸鹽微珠中。將藻酸鹽粉末(西格瑪，圣路易斯，密蘇里 州)以2.2%w/w的濃度溶解到WFI水中，然后與HDF在培養(yǎng)介質(zhì)中的混懸液 混合，獲得最終濃度1.5Mw/w藻酸鹽和107細(xì)胞/毫升。然后通過靜電液滴產(chǎn) 生方法制備藻酸鹽微珠。簡(jiǎn)言之，通過注射泵使細(xì)胞/藻酸鹽懸液以14,0 ml/h 的恒定流速擠壓通過帶正電荷的鈍不銹鋼針，在膠凝浴(gellingbath) (1.5 w/v CaCl2)中收集液滴。隨著鈉離子與鈣離子發(fā)生交換，藻酸鹽液滴硬化并與包封 的細(xì)胞形成不溶性微珠。微珠在膠凝浴中保留30分鐘以完成膠凝作用。
在具體的實(shí)施方式中，也可采用微射流支架。它們是具有微米級(jí)分辨率的 復(fù)雜支架。這些支架提供微通道網(wǎng)絡(luò)，允許流體在支架內(nèi)流動(dòng)。該微通道網(wǎng)絡(luò) 有助于向支架的不同部分提供營養(yǎng)物質(zhì)和可溶因子。這些支架可由不同的生物 聚合物構(gòu)成。它們可以是合成聚合物，例如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚 乳酸-共-乙醇酸(PLGA);合成水凝膠，例如聚(環(huán)氧乙垸)(PEO)、聚(乙烯 醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(反丁烯二酸丙烯酯-共-乙二醇)(P(PF-co-EG))， 或可生物降解的彈性體聚(甘油-癸二酸酯)(PGS)。本發(fā)明中，用半透膜包封
26微射流支架。半透膜允許含營養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子的介質(zhì)灌注到支架內(nèi)。通過在 微通道網(wǎng)絡(luò)內(nèi)循環(huán)，介質(zhì)在接種到支架中的細(xì)胞上施加流體剪切應(yīng)力。機(jī)械力 是HDF軟骨形成分化的關(guān)鍵。
B.惰性結(jié)構(gòu)
在本發(fā)明中，混合構(gòu)建物采用惰性結(jié)構(gòu)作為其組成的一部分。惰性結(jié)構(gòu)的 作用可以是生物學(xué)上的(遞送營養(yǎng)物質(zhì)和/或生長(zhǎng)因子)和/或機(jī)械上的(將機(jī)械力 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞/支架組合物上；該力可包括IHP和/或流體剪切應(yīng)力)。通過轉(zhuǎn)移機(jī) 械應(yīng)變和向細(xì)胞/支架組合物提供介質(zhì)(通過半透膜灌注)，惰性結(jié)構(gòu)可用作"體 內(nèi)生物反應(yīng)器"。
在某些實(shí)施方式中，惰性結(jié)構(gòu)的作用包括以下一種或多種l)密封包裹活 體核；2)用作半透膜，在一定生理-化學(xué)條件下(例如，流體靜壓、滲透濃度、 溫度等)允許某些分子(例如營養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子等)擴(kuò)散通過，有時(shí)專門稱為"易 化擴(kuò)散"；3)向活體腔室轉(zhuǎn)移負(fù)荷和分享動(dòng)態(tài)機(jī)械應(yīng)力(流體靜壓)，用于誘導(dǎo)細(xì) 胞分化；和/或4)用作體內(nèi)生物反應(yīng)器。
在具體的實(shí)施方式中，可認(rèn)為惰性結(jié)構(gòu)是包封裝置。在某些實(shí)施方式中， 它被設(shè)計(jì)成將機(jī)械應(yīng)力施加到接種在三維支架組合物中的細(xì)胞上。包封裝置的 外膜充滿流體(介質(zhì))。包封在包殼內(nèi)的流體形成將循環(huán)的流體靜壓轉(zhuǎn)移至活細(xì) 胞的流體環(huán)境。當(dāng)患者站立時(shí)，他對(duì)其脊柱施加一定負(fù)荷，通過充滿流體的外 部包殼將負(fù)荷轉(zhuǎn)移到活細(xì)胞。該膜提供適合細(xì)胞(例如HDF)軟骨形成分化的生 理學(xué)負(fù)荷和壓縮力。在細(xì)胞嵌入微射流支架的情況下，微通道內(nèi)循環(huán)的介質(zhì)也 對(duì)細(xì)胞施加流體剪切應(yīng)力。流體剪切應(yīng)力是誘導(dǎo)細(xì)胞軟骨形成分化的另一種 力。
在具體的實(shí)施方式中，膜通常為球囊形，在其他實(shí)施方式中，膜通常相互 同心。在其他具體的實(shí)施方式中，惰性結(jié)構(gòu)包括兩種可膨脹的球囊樣生物聚合 物，即外球囊"E"和包封在外球囊內(nèi)的內(nèi)球囊'T，。因此，惰性結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)能 夠相繼膨脹并具有膨脹活性的同心包殼。在某些方面，裝置可采用數(shù)量為X的 膜，其中，X是大于O的任意整數(shù)。即，X個(gè)球囊可以像洋蔥那樣層狀同心安 裝，每一層限定具有特定功能的空間(例如，用于廢棄物、介質(zhì)、氧氣和/或用于連接移植物與天然組織)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，外球囊、層或包殼"E"包括可生物相容的彈性、可膨
脹、密封、可擴(kuò)張、和/或可重吸收(時(shí)間Tp其中T,是"E"完全吸收所需的時(shí) 間)的材料， 一旦安裝到空腔內(nèi)可密封。在具體的實(shí)施方式中，外球囊"E"可具
有或具有一種或多種以下活性l)接受包封細(xì)胞的第二內(nèi)球囊或?qū)踊虬鼩?br> T(以細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物、或細(xì)胞溶液或移植物的形式)；2訴介質(zhì)(例如液體)膨 脹或擴(kuò)張其壁(例如通過溶脹(swelling))以填充椎間盤切除術(shù)導(dǎo)致的空腔；和
3)閉合環(huán)缺損以防止構(gòu)建物受力時(shí)它從肌腱切斷切口從軀體間空間"脫出"或伸 出。
在一個(gè)實(shí)施方式中，內(nèi)球囊或?qū)?T'包括可生物相容的、彈性、可膨脹、 半滲透性、和/或可重吸收(時(shí)間T2<TP其中T2是'T'完全吸收所需的時(shí)間J)的 材料， 一旦安裝到外層內(nèi)可密封活體核。內(nèi)球囊(包殼、膜或?qū)?'T，可具有或具 有以下活性l)密封包裹活體核；2)用作半透膜，在一定生理-化學(xué)條件下(例 如，流體靜壓、滲透濃度、溫度等)允許某些分子(例如營養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子等) 擴(kuò)散通過(有時(shí)專門稱作"易化擴(kuò)散")；和3)將負(fù)荷轉(zhuǎn)移到活體核，與其共享 動(dòng)態(tài)機(jī)械應(yīng)變，因此用作細(xì)胞分化的誘導(dǎo)劑。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，外部腔室介質(zhì)(例如液體)或溶脹壁(例如水合水凝 膠)"E"和內(nèi)部半滲透包殼提供了能供養(yǎng)(feed)內(nèi)部活體核的營養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng) 因子的遞送系統(tǒng)。這些包殼也可將機(jī)械力，包括流體靜壓轉(zhuǎn)移至活體核。
惰性結(jié)構(gòu)是旨在包裹、供養(yǎng)和分化由細(xì)胞(例如HDF)組成的活體核的包封 裝置。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，惰性結(jié)構(gòu)包括兩種可擴(kuò)張的球囊樣生物聚合物膜， 即外膜"E"和包封在外膜中的內(nèi)膜'T'。因此，惰性結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)旨在相繼膨脹 的同心包殼。在靜止位置，兩個(gè)包殼T和"E"為扁平(flat)、可變形、成形 (shaped)和相互匹配。 一旦植入它們都可密封。在具體的實(shí)施方式中，可通 過選擇組織工程系統(tǒng)來確定惰性結(jié)構(gòu)組成。
外部包殼"E"包括的材料是可膨脹的(以通過最小侵入性后路途徑平面植 入，然后填裝活體核，然后用介質(zhì)溶液膨脹)；彈性(將負(fù)荷共享轉(zhuǎn)移到活體核); 可擴(kuò)張(允許其擴(kuò)張和填充椎間盤切除術(shù)導(dǎo)致的空腔)；可滲透氧氣但不可滲透
28流體相對(duì)低氧是HDF轉(zhuǎn)化的有利參數(shù)，只是天然盤內(nèi)的氧氣張力適當(dāng)較低； 可生物降解的(允許移植物與剩余的天然盤重新連接)；可生物相容(以盡可能減 少炎癥反應(yīng))；可重吸收的(時(shí)間Ti);或它們的組合。
在具體的實(shí)施方式中，"E"可位于關(guān)節(jié)內(nèi)，例如，在一對(duì)相鄰椎骨之間、 剩余的盤組織內(nèi)的軀干間空間刮除術(shù)產(chǎn)生的空腔內(nèi)。其也可機(jī)械維持負(fù)荷下的 盤高度。在其他實(shí)施方式中，"E"接納包裹活體核的第二內(nèi)部球囊"I"。 "E"可用 流體溶液(例如介質(zhì))膨脹以在腔室(由錐間盤切除術(shù)產(chǎn)生的空腔)中向外周延 伸至剩余的盤組織并充滿空腔。"E"被構(gòu)造成允許例如在等壓方案下更換介質(zhì) (例如，去除代謝廢物和/或補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)和/或生長(zhǎng)因子)。在某些方面，"E"通 過在循環(huán)流體靜壓下(有利于細(xì)胞分化形成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞)將共享負(fù)荷轉(zhuǎn)移到 活體核上，用作體內(nèi)生物反應(yīng)器。在具體的實(shí)施方式中，"E"的構(gòu)型由于其特 征而導(dǎo)致相對(duì)低氧(低氧或低氧模擬劑，如乳酸鹽，誘導(dǎo)HDF轉(zhuǎn)化形成軟骨細(xì) 胞樣細(xì)胞)。"E"還可閉合環(huán)缺損(肌腱切斷開口)，以防止構(gòu)建物在負(fù)荷下通過 肌腱切斷切口從軀體間空間"脫出"或伸出。
在本發(fā)明的某些方面，內(nèi)膜'T，具有以下性質(zhì)生物相容性；彈性；可膨
脹性(在消耗介質(zhì)的同時(shí)，活體核生長(zhǎng)并擴(kuò)張至外膜內(nèi)壁)；半滲透性(營養(yǎng)物質(zhì)、 生長(zhǎng)因子等的受控釋放)；可生物降解性(因而不會(huì)干擾已修復(fù)組織的長(zhǎng)期性 能)；和可重吸收性(時(shí)間T2〈T,)。 "E"必須在'T，之后重吸收，以避免當(dāng)活體核 尚未成熟時(shí)的介質(zhì)滲漏和損失，而且使脆性的"I"遠(yuǎn)離任何直接的機(jī)械應(yīng)變。在 其他方面，"r密封包裹活體核；用作營養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子的遞送系統(tǒng)，能夠在
一定物理化學(xué)條件下(例如，流體靜壓、滲透濃度、溫度等)，通過半透膜允許 某些分子(例如，營養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子等)擴(kuò)散通過(有時(shí)專門稱作"易化擴(kuò)散")， 來供養(yǎng)內(nèi)部的活體核。
這兩個(gè)膜("E"和"r)限定兩個(gè)容積Ve和^。這兩個(gè)獨(dú)立的容積可具有不同
的形狀(球形、圓柱形、錐形等)，取決于椎體間空腔的外形和共享負(fù)荷。在具 體的實(shí)施方式中，裝置符合空腔形狀。
容積VE可限定為分離膜"E"和膜"r的空間。在具體的實(shí)施方式中，它包
含將要例如通過半透膜'T'遞送至細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子(介質(zhì))。它還可用
作負(fù)荷支承結(jié)構(gòu)，能夠?qū)C(jī)械應(yīng)變，例如循環(huán)的流體靜壓狀況或高流體剪切應(yīng)
29力(由于其高水分含量)轉(zhuǎn)移至活體核(誘導(dǎo)細(xì)胞如HDF軟骨形成分化)。
容積V,可定義為由內(nèi)部半透膜'T'向外限定的空間，包括由軟骨細(xì)胞樣細(xì) 胞，例如從HDF衍生的細(xì)胞構(gòu)成的活體核。
直到活體核有活力(例如，能夠自我維持)，有規(guī)律地更換包封在Ve中的 介質(zhì)以除去代謝導(dǎo)致蓄積的任何有毒廢物(例如自由基和/或乳酸)以及細(xì)胞生 長(zhǎng)產(chǎn)生的其他細(xì)胞碎屑或碎片。更換介質(zhì)允許補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)和/或生長(zhǎng)因子。在 具體的實(shí)施方式中，該過程周期性進(jìn)行，例如每周或每月一次或多次，例如， 每周至少一次，例如每周兩次。在其他具體的實(shí)施方式中，需要為"E"配制其 他特征以引流VE。在某些方面，引流系統(tǒng)可由一根或多根管道和一個(gè)或多個(gè) 儲(chǔ)器組成，在具體的實(shí)施方式中，引流系統(tǒng)包括兩根管道和兩個(gè)儲(chǔ)器。第一根 管道用于去除用過的介質(zhì)，第二根管道用于注入新的介質(zhì)。每根管道(或?qū)Ч? 包括密封連接于ve的近端和連接于儲(chǔ)器的遠(yuǎn)端。這些導(dǎo)管可由與"E"相同的材 料構(gòu)成或由硅酮橡膠構(gòu)成。其長(zhǎng)度可以是任何合適的長(zhǎng)度，只要它們能夠從儲(chǔ) 器連接至裝置。它們可約為10-15厘米，根據(jù)手術(shù)部位的深度和解剖學(xué)數(shù)據(jù)(患 者形態(tài)學(xué))以合適的長(zhǎng)度切割其遠(yuǎn)端進(jìn)行術(shù)前設(shè)置。其外徑可以是任何合適的 長(zhǎng)度，但在具體的實(shí)施方式中，外徑約為2.5毫米，因而足夠小以從肌腱切斷 孔伸出，不會(huì)壓制或損傷相鄰的根部，內(nèi)徑1.2毫米。
導(dǎo)管可在椎間盤切除術(shù)結(jié)束時(shí)植入，植入后，使生物反應(yīng)器膨脹和密封， 然后進(jìn)行皮膚縫合。它們可連接于各個(gè)管道(導(dǎo)管)的遠(yuǎn)端。然后，皮下放置各 儲(chǔ)器，使其由通過皮膚的針(經(jīng)皮穿刺)觸及。
在一個(gè)實(shí)施方式中，可用'T'預(yù)先包封工程化活體核，然后滑入"E"。在消 耗介質(zhì)的同時(shí)，活體核擴(kuò)張至包殼"E"的內(nèi)壁。包殼"E"重吸收，移植物與剩余 的天然盤重新連接。
1.內(nèi)部半透膜
內(nèi)部包殼包括活體核，包括受控釋放系統(tǒng)(以通過其半滲透性用介質(zhì)供養(yǎng) 活體核)，是可擴(kuò)張的(消耗介質(zhì)的同時(shí)，活體核擴(kuò)張至外膜內(nèi)壁)，和/或是可生 物降解的(從而不會(huì)干擾修復(fù)組織的長(zhǎng)期性質(zhì))。
在具體的實(shí)施方式中，內(nèi)膜是包裹細(xì)胞-支架組合物的半透膜。該半透膜可滲透小分子，因此允許營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣擴(kuò)散以及廢物的消除；但該膜不可滲 透大分子如膠原和葡萄糖胺聚糖。因此，這些形成天然細(xì)胞外基質(zhì)的大分子被 保留在支架內(nèi)。該膜還將細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物與宿主環(huán)境隔離，保護(hù)宿主免于針 對(duì)生物聚合物支架的炎癥和免疫反應(yīng)。
可使用各種聚合物和聚合物摻混物來制造該膜，包括但不限于聚丙烯酸酯 (包括丙烯酸共聚物)、聚偏乙烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚酰 胺、醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚砜(包括聚醚砜)、聚磷腈、聚丙烯腈、聚(丙
烯腈/共氯化乙烯)、PTFE以及它們的衍生物、共聚物或混合物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，半透膜由聚電解質(zhì)絡(luò)合產(chǎn)生聚陰離子(PA)和聚陽離 子(PC)通過帶相反電荷的聚合物間的相互作用形成聚電解質(zhì)絡(luò)合物(PEC)。陰 離子組分可以是生物相容性聚合物，例如但不限于海藻酸鈉、硫酸纖維素、
羧甲基纖維素或透明質(zhì)酸，陽離子組分可由聚合物，例如但不限于殼聚糖、聚
(L-賴氨酸)、聚(L-鳥氨酸)、聚(亞甲基-共-胍)、聚(乙烯胺)、聚(乙撐亞胺)、聚 (DADMAC)或聚(N-乙烯吡咯烷酮)構(gòu)成。
為了實(shí)現(xiàn)用半滲透性PEC膜對(duì)細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物的包封，先將細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu) 建物浸漬到陰離子溶液中，然后再到陽離子溶液中。反應(yīng)一段時(shí)間(該時(shí)間根 據(jù)陰離子和陽離子組分的性質(zhì)而變化)后，形成機(jī)械穩(wěn)定的半透膜。根據(jù)反應(yīng) 條件(聚合物濃度、反應(yīng)時(shí)間)，支架緊密包裹在膜內(nèi)或由間隙與膜隔離。
容積V,可定義為其外部由內(nèi)部半透膜"T"限定的空間，包括例如從HDF 衍生的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞構(gòu)成的活體核。
2.外膜
外膜是可擴(kuò)張的，彈性和/或可膨脹的，以通過最小侵入性后路外科手術(shù) 植入，然后膨脹至精確匹配椎間盤切除術(shù)的空腔。該膜不滲透流體但可滲透氧 氣，可填充向細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子的介質(zhì)。包殼內(nèi)包封的流體形成將 IHP轉(zhuǎn)移至活細(xì)胞的流體環(huán)境。當(dāng)患者站立時(shí)，他對(duì)其脊柱施加一定負(fù)荷，該 負(fù)荷通過充滿流體的膜將負(fù)荷轉(zhuǎn)移到活細(xì)胞。該膜機(jī)械堅(jiān)固以支撐負(fù)荷。
外膜可由生物相容性、可生物降解的聚合物構(gòu)成?？捎糜谥圃煸撃さ母鞣N 聚合物包括但不限于聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-共-乙醇酸
31(PLGA)、聚-s-己內(nèi)酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚二氧六環(huán)酮(PDO)、聚乙烯、聚(甘 油癸二酸酯)(PGS)以及它們的衍生物、共聚物或混合物。在一個(gè)實(shí)施方式中， 該膜由可擴(kuò)張的、生物相容的、可生物降解的聚氨酯構(gòu)成。
該膜與宿主周圍組織直接接觸，具有生物相容性以避免宿主炎癥反應(yīng)?？?采用各種技術(shù)來改善該膜的生物相容性，例如用透明質(zhì)酸涂覆膜。
IV.本發(fā)明采用的細(xì)胞
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，可采用任何細(xì)胞，只要這些細(xì)胞能夠分化形 成軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。在具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞事實(shí)上是軟骨細(xì)胞， 雖然也可由干細(xì)胞(例如間充質(zhì)干細(xì)胞)或成纖維細(xì)胞(例如皮膚成纖維細(xì)胞、腱 成纖維細(xì)胞、韌帶成纖維細(xì)胞或滑液成纖維細(xì)胞)衍生獲得?？刹捎米泽w細(xì)胞， 雖然在可選的實(shí)施方式中，也可采用同種異體細(xì)胞；在具體的實(shí)施方式中，檢 測(cè)了同種異體細(xì)胞是否會(huì)引起疾病(assayed for disease)，并被認(rèn)為適合人體 傳播。在本發(fā)明的某些方面，細(xì)胞是自體細(xì)胞，雖然在可選的實(shí)施方式中，細(xì) 胞也可以是同種異體細(xì)胞。在細(xì)胞不是自體細(xì)胞的情況下，在本發(fā)明中使用之 前，可先通過本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法處理細(xì)胞以除去潛在的危險(xiǎn)物質(zhì)、病原體等。在 具體的方面，可用一種或多種核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，例如用生長(zhǎng)因子，包括BMP-2、 -4、 -6和/或-7轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
在具體的方面，采用一種或多種以下方法有利于人表皮成纖維細(xì)胞的軟骨
細(xì)胞樣分化將細(xì)胞接種到藻酸鹽中；將細(xì)胞接種到細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如聚集蛋 白聚糖或基底膜蛋白聚糖中，低含氧量條件(例如低氧或一種或多種低氧模擬 劑，例如乳酸鹽、甲磺酸去鐵胺(DFX)、氯化鈷(COCl2)、或鎳)；高密度微量 培養(yǎng)；存在一種或多種生長(zhǎng)因子(包括例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，至少包括 BMP-2;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P(TGF-P);胰島素生長(zhǎng)因子I(IGF-I);和成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子(FGF)，尤其是基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和FGF-2，血小板衍生 的生長(zhǎng)因子(PDGF)，軟骨衍生的形態(tài)發(fā)生蛋白(CDMP);存在抗壞血酸、地塞 米松、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)，刺猬蛋白聲波刺猬(sonichedgehog, SHH)和印度刺猬(Indianhedgehog, IHH))?？刹捎迷跈C(jī)械應(yīng)力下培養(yǎng)。高密度 微量培養(yǎng)是模擬肢體形成過程中軟骨形成開始的過程中發(fā)生的細(xì)胞濃集階段的培養(yǎng)技術(shù)。
在本發(fā)明的具體方面，采用人表皮成纖維細(xì)胞，至少因?yàn)樗鼈兛杀环乔秩?br> 性獲得，例如從直徑僅約3mm(在具體的實(shí)施方式中)的皮膚穿刺活檢(例如環(huán) 形活檢皮膚樣本)獲取。并且，人表皮成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)中容易擴(kuò)增并在特定 培養(yǎng)條件下分化形成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，從患者皮膚組織(6mm)穿刺活檢收集自體HDF。在實(shí)驗(yàn)室中， 用剪刀剝離皮下脂肪和深度真皮。將剩余的組織切碎并在4'C、 0.25%胰蛋白 酶下培養(yǎng)過夜。然后，機(jī)械分離皮膚和表皮片段。切碎活檢皮膚片段，用該碎 片啟動(dòng)外植體培養(yǎng)。將從外植體收集的成纖維細(xì)胞在補(bǔ)充有10%小牛血清的杜 爾貝科氏MEM培養(yǎng)基(Dulbecco'sMEM， DMEM)中，37°C、 8%<:02下培養(yǎng)。 在具體的方面，這些細(xì)胞擴(kuò)增，然后分化形成軟骨細(xì)胞。
一些方面可采用市售HDF，例如從實(shí)驗(yàn)室(例如級(jí)聯(lián)生物學(xué)(Cascade Biologies)購買的HDF。細(xì)胞可以是成熟HDF或新生HDF。例如，新生包皮成 纖維細(xì)胞是非常方便的細(xì)胞來源。這些細(xì)胞可商業(yè)使用，便于獲得且容易生長(zhǎng)。
V.細(xì)胞生長(zhǎng)和分化形成軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞
機(jī)械應(yīng)力和/或應(yīng)變是軟骨形成的重要因素。本發(fā)明方法采用一種或多種 機(jī)械應(yīng)力，在具體的實(shí)施方式中，采用間歇性流體靜壓(IHP)作為軟骨形成分化 的誘導(dǎo)劑。已知IHP是誘導(dǎo)和維持軟骨細(xì)胞表型的強(qiáng)效刺激。近來的研究表明， IHP刺激與BMP-2 —起培養(yǎng)的鼠胚胎成纖維細(xì)胞的軟骨誘導(dǎo)。IHP也可誘導(dǎo) HDF的軟骨形成分化。已知HDF在低氧張力下可分化形成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，機(jī)械應(yīng)力，尤其是IHP和流體剪切應(yīng)力誘 導(dǎo)在三維基質(zhì)和低氧張力中培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的軟骨形成分化。
機(jī)械應(yīng)力可體外、體內(nèi)、離體、先體外后體內(nèi)進(jìn)行，或它們的組合。在一 個(gè)實(shí)施方式中，分化在體外開始，然后接種在基質(zhì)中的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞體內(nèi)植 入后繼續(xù)生長(zhǎng)和分化。在本發(fā)明的具體方面，惰性結(jié)構(gòu)旨在提供生理學(xué)負(fù)荷狀 況以誘導(dǎo)HDF體內(nèi)分化。
在本發(fā)明具體的方面，誘導(dǎo)細(xì)胞分化形成軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。這
種分化可在體內(nèi)遞送之前發(fā)生，例如在支架上進(jìn)行，或者在體內(nèi)遞送之后進(jìn)行。在具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞經(jīng)歷有利于分化形成軟骨細(xì)胞的條件。在另一個(gè)具 體的實(shí)施方式中，條件包括機(jī)械應(yīng)力。對(duì)明顯受到高流體剪切或壓力負(fù)荷的血 管內(nèi)皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的機(jī)械應(yīng)力基因調(diào)節(jié)進(jìn)行了廣泛的研究。在本發(fā)明具體
的實(shí)施方式中，機(jī)械應(yīng)力刺激HDF軟骨形成分化。這種機(jī)械應(yīng)力可以是任何 類型，雖然在具體的實(shí)施方式中，它包括流體靜壓和/或流體剪切應(yīng)力。在其他 具體的實(shí)施方式中，應(yīng)力是恒定的或間歇性的。
在本發(fā)明中，機(jī)械應(yīng)力，尤其是循環(huán)流體靜壓和流體剪切應(yīng)力可誘導(dǎo)接種 在三維基質(zhì)中的成纖維細(xì)胞的軟骨形成分化。剌激HDF軟骨形成分化的共培 養(yǎng)條件的選擇建立在本領(lǐng)域已知數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上。已知多種示例性因素，例如高 密度細(xì)胞培養(yǎng)、用BMP-2和抗壞血酸培養(yǎng)、低氧張力培養(yǎng)可刺激軟骨形成， 在本發(fā)明中僅僅用作除機(jī)械應(yīng)力外的輔助因素的例子。
椎間盤軟骨細(xì)胞難以收集。因?yàn)樽泽w細(xì)胞是從患者椎間盤獲取的，所以需 要侵入性手術(shù)(背部外科手術(shù))進(jìn)行活組織檢查。如果從健康盤獲取細(xì)胞，則危 害正常盤的功能。如果在椎間盤切除術(shù)期間從受損盤獲取細(xì)胞，則提供了來自 變性組織的異常細(xì)胞。而且，軟骨細(xì)胞因?yàn)槿シ只y以培養(yǎng)擴(kuò)張。其他軟骨 來源(例如耳部彈性軟骨)的軟骨細(xì)胞容易收集，但只是產(chǎn)生透明軟骨而不是盤 中的纖維軟骨。常用于組織工程的干細(xì)胞也存在一些缺點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冃枰M(jìn)行 骨髓活組織檢查。組織工程技術(shù)需要大量的細(xì)胞，卻難以獲取足夠量的成人干 細(xì)胞。
采用自體HDF作為細(xì)胞來源方式的原理如下所述l)例如，從直徑僅 3.0mm的環(huán)形皮膚樣本的穿刺活檢中非侵入性地獲取HDF; 2)不存在被另一供 體污染的風(fēng)險(xiǎn)(例如乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布 病等)；和3)HDF容易培養(yǎng)擴(kuò)增并在特定培養(yǎng)條件下分化形成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。 也可采用其他成纖維細(xì)胞群，例如肌腱或韌帶。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選自體
成纖維細(xì)胞。
刺激HDF軟骨形成分化的共培養(yǎng)條件的選擇建立在本領(lǐng)域已知數(shù)據(jù)的基 礎(chǔ)上。不同的因素支持軟骨形成，例如包括高細(xì)胞密度培養(yǎng)，與生長(zhǎng)因子BMP-2 和抗壞血酸培養(yǎng)，和接種到藻酸鹽基質(zhì)中。體內(nèi)應(yīng)用之前，細(xì)胞/支架組合物中 的細(xì)胞在體外生長(zhǎng)和/或分化至少兩天或更多天。在某些情況下，可檢査或監(jiān)測(cè)細(xì)胞以確保至少一些細(xì)胞發(fā)生分裂。除去未分裂和/或未直接或間接粘附與支架 的細(xì)胞。
在其他實(shí)施方式中，HDF嵌在水凝膠中，在具體的實(shí)施方式中，水凝膠
是天然水凝膠，例如膠原、透明質(zhì)酸(HA)、膠原/HA的組合、藻酸鹽、殼聚糖； 合成水凝膠，例如合成水凝膠，例聚(環(huán)氧乙垸)(PEO)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙 烯酸)(PAA)、聚(反丁烯二酸丙烯酯-共-乙二醇)(P(PF-共-EG))、多肽或其他可 生物降解的聚合物如聚(L-乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚乳酸-共-乙醇酸 (PLGA);或上述聚合物的任意組合。然后采用任何本領(lǐng)域中合適的體外生物反 應(yīng)器施加循環(huán)流體靜壓。
VI.修復(fù)受損軟骨的方法
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括修復(fù)任何受損軟骨的方法，雖然在具體的 方面，所述軟骨是椎間盤或任何關(guān)節(jié)中的軟骨。通常，在盤實(shí)施方式中，如果 必須切除兩個(gè)相鄰椎骨間的椎間盤(例如腰椎中)，從患者背部后路進(jìn)行外科手 術(shù)的侵入性較小。該最小侵入性手術(shù)能夠通過環(huán)內(nèi)小孔(肌腱切斷術(shù))進(jìn)行軀體 間空間的刮除術(shù)，切除盤核變性片段。因?yàn)榄h(huán)開口較小，本發(fā)明提供的椎間構(gòu) 建物可滑過上述切口，然后擴(kuò)張到在軀體間空間內(nèi)進(jìn)行核切除所形成的空間 內(nèi)。切除受損盤和安裝構(gòu)建物可以相同的后路途徑進(jìn)行。
如上所述，惰性結(jié)構(gòu)由兩個(gè)可擴(kuò)張的球囊"r和"E"構(gòu)成。在靜止位置，兩
個(gè)球囊'T，和"E"為扁平、可變形、成形或相互匹配。 一旦球囊'T，位于球囊"E" 內(nèi)，它們兩個(gè)通過環(huán)孔被安裝到椎間隙內(nèi)，然后相繼膨脹形成兩個(gè)獨(dú)立容積 (Ve>Vi)，其形狀(球形、圓柱形、錐形等)取決于椎體間空腔的外形和共享負(fù)荷。
在具體的方面，待填充的第一球囊是內(nèi)球囊"r，無論剩余空腔的容積如 何。容積v,代表接收和容納活體核的構(gòu)建物的核。 一旦填充了活體核，球囊"I" 被密封。g卩， 一旦包殼"r位于包殼"E"內(nèi)，兩者都通過環(huán)孔而被設(shè)置到椎間隙
內(nèi)，然后相繼膨脹。'T'是首先通過植入活體核來進(jìn)行操作(instrumented)然 后密封的。然后，用介質(zhì)溶液膨脹外球囊"E"直到其容積VE形成符合或遵循天 然盤刮除后剩余部分內(nèi)表面的外形。剩余盤的內(nèi)表面可以是核組織的剩余部分 或天然環(huán)的內(nèi)壁，取決于刮除程度。在安裝椎間構(gòu)建物的第二個(gè)實(shí)施方式中，"E"位于椎間隙內(nèi)，然后將'T'置
于"E"內(nèi)，如上所述被相繼填充。在第三個(gè)實(shí)施方式中，"E"位于椎間盤切除術(shù) 空腔內(nèi)，然后將預(yù)先包封的活體核置于"E"內(nèi)，再用介質(zhì)填充"E"。
可在外球囊"E"安裝之前評(píng)價(jià)椎間盤切除術(shù)導(dǎo)致的空腔容積，從而選擇和
注入合適的流體容積?？涨蝗莘e的測(cè)定包括將流體(例如水)引入其中直到空
腔充滿，然后通過注射器從空腔抽出流體，從而基本上準(zhǔn)確地計(jì)算空腔容積。 在某些方面，惰性結(jié)構(gòu)組成取決于組織工程系統(tǒng)的選擇，取決于制造材料、 孔特征、吸收性和機(jī)械性質(zhì)，例如非降解性聚合物、可降解的聚合物或天然衍 生的水凝膠(例如，膠原、纖維蛋白、瓊脂糖、藻酸鹽等)。
活體核或腔室(VO由從自體人表皮成纖維細(xì)胞(HDF)衍生的軟骨細(xì)胞樣細(xì) 胞構(gòu)成，例如，從患者皮膚收集并接種到支架(例如藻酸鹽珠、或微射流支架、 或任何其他聚合物支架)中，并從支撐性腔室(VE)供給。混合構(gòu)建物結(jié)合了惰性 生物材料和活細(xì)胞，生物材料用作營養(yǎng)遞送系統(tǒng)，活細(xì)胞可方便地從皮膚收集， 該混合構(gòu)建物的優(yōu)點(diǎn)在于，能夠自我維持或重塑并可采用最小侵入性后路外科 手術(shù)恢復(fù)盤功能。體積VE可限定為分隔層"E"和層T的空間，其包含將要遞送 至細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子(介質(zhì))(遞送系統(tǒng))。該容積可以是液體介質(zhì)填充 產(chǎn)生的結(jié)果，或者是水合后壁溶脹(擴(kuò)張型親水生物材料如水凝膠)導(dǎo)致的結(jié)果 (介質(zhì)由高比率的水構(gòu)成)。
生長(zhǎng)因子可遞送通過半滲透性內(nèi)膜'T'。生長(zhǎng)因子的例子包括例如軟骨 衍生的形態(tài)發(fā)生蛋白(CDMP)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 卩(TGF-p)、和胰島素生長(zhǎng)因子I(IGF-I)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血小板衍 生的生長(zhǎng)因子(PDGF)。
機(jī)械應(yīng)變，例如高流體剪切和/或壓力負(fù)荷，被轉(zhuǎn)移到內(nèi)層"I"上，因此通 過外層"E"和外部容積Ve恃逮到Vt上。
然后安裝引流系統(tǒng)，各導(dǎo)管通過肌腱切斷孔從椎間隙伸出，小心保持其離 開相鄰的根部，或者至少沿根部定位而沒有任何有害沖突。
從手術(shù)部位插管(introducer)到離開皮膚開孔的皮下位置，創(chuàng)建貫穿肌肉 的路徑。各管道"隧穿"到上述肌肉路徑內(nèi)，然后連接于相應(yīng)的儲(chǔ)器。兩個(gè)儲(chǔ)器 遠(yuǎn)離中間的皮膚切口，離開中線2或3厘米，皮下定位使其容易觸及和鑒別。閉合各個(gè)皮膚切口。
通常，進(jìn)行這種最小侵入性后路途徑之后，要求患者在術(shù)后能夠走動(dòng)的時(shí) 候盡早站立。因此，植入物接受生理學(xué)負(fù)荷下正確的循環(huán)流體靜壓狀況，這對(duì)
于HDF生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化是關(guān)鍵的。
周期性地更換介質(zhì)，例如每周或每月一次或多次。引流系統(tǒng)允許提供容積
VE，容積VE具有適當(dāng)量的新介質(zhì)以繼續(xù)供應(yīng)活體核，而且維持足夠的容積，
既而維持正確的壓力狀況?；颊呙嫦蛳绿上?。用針同時(shí)剌穿各個(gè)儲(chǔ)器。在每個(gè)
針塞上注射器，向下推動(dòng)活塞緩慢注入新的介質(zhì)，同時(shí)相同量的流體通過抽吸
從另一注射器吸出，使得內(nèi)壓保持幾乎相同，并避免容積VE陷落，或者相反
向容積^遞送過高的壓力，導(dǎo)致活體核不可逆的損傷。當(dāng)流出液體的顏色和
性質(zhì)與流入液體相同時(shí)停止該過程。將取出的用過的介質(zhì)樣品用于細(xì)菌學(xué)、病 理學(xué)和化學(xué)目的的分析。
當(dāng)活體核能夠自我維持并填充椎間盤切除術(shù)的腔室時(shí)，取出管道和儲(chǔ)器。 或者，在局部麻醉下僅取出一個(gè)或兩個(gè)儲(chǔ)器，管道則在其遠(yuǎn)端打結(jié)。在另一可 選的實(shí)施方式中，儲(chǔ)器和管道都留在原位。
在具體的實(shí)施方式中，進(jìn)行隨訪(follow-up) MRI，例如手術(shù)后幾周或幾 個(gè)月內(nèi)(例如，手術(shù)后約6周)，以評(píng)價(jià)移植物生長(zhǎng)和記錄盤治愈。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，工程化活體核被預(yù)先包封，如上所述釋放。
上述這些功能通過本發(fā)明惰性結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)，惰性結(jié)構(gòu)依賴于具有兩種不同性 能的兩個(gè)同心膜。外部包殼能夠機(jī)械維持負(fù)荷下的盤高度；是可膨脹的(以通 過最小侵入性后路途徑植入和接納介質(zhì)溶液)；具彈性(以將共享負(fù)荷轉(zhuǎn)移到移 植物上)；是可擴(kuò)張的(允許其溶脹和填充椎間盤切除術(shù)導(dǎo)致的空腔)；是密封的 (以避免任何介質(zhì)滲漏、瘢痕組織擠壓進(jìn)入髓管內(nèi)、或通過環(huán)缺損-肌腱切斷-的脫出復(fù)發(fā))；是可生物降解的(包殼發(fā)生吸收以使移植物重新連接于剩余的天 然盤組織)；并且具有生物相容性(盡可能降低炎癥反應(yīng))。外科手術(shù)結(jié)束時(shí)，可 用連接于一個(gè)或幾個(gè)Rickham儲(chǔ)器的一根或多根導(dǎo)管進(jìn)行引流，所述儲(chǔ)器在外 科手術(shù)結(jié)束時(shí)皮下插入。
這些儲(chǔ)器旨在去除代謝蓄積的任何毒性廢物(例如，自由基或乳酸)以及細(xì)
胞生長(zhǎng)產(chǎn)生的任何其他細(xì)胞碎屑。它們還為容積VE提供了適當(dāng)量的新介質(zhì)以連續(xù)供應(yīng)活體核，而且維持足夠的容積，既而維持正確的壓力狀況。當(dāng)活體核 能夠自我維持并填充椎間盤切除術(shù)的腔室時(shí)，將它們?nèi)〕觥?br> 應(yīng)理解，混合構(gòu)建物的各個(gè)部件和特征以及修復(fù)受損軟骨的方法和使
HDF生長(zhǎng)形成上述軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的方法可以各種方式進(jìn)行組合，以提供在本 發(fā)明范圍內(nèi)的其他實(shí)施方式。
VII.本發(fā)明的可選實(shí)施方式
在另一個(gè)實(shí)施方式中，裝置不是具有(例如)兩個(gè)大致球形的同心包殼，而 是由唯一的(unique)外部包殼"E"構(gòu)成，同樣具有上述特征(尤其是可擴(kuò)張性 和/或可膨脹性)，接納未包裹的活體核(未被膜包封或包裹)。事實(shí)上，在該實(shí)施 方式中，活體核是細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建物，直接位于"E"內(nèi)。然后，用介質(zhì)液體溶液
擴(kuò)張容積VE直到匹配空腔。
這樣，在另一個(gè)實(shí)施方式中，裝置不是具有兩個(gè)"同心"球囊，而是由唯一 的外部球囊"E"構(gòu)成，同樣具有上述特征(尤其是可擴(kuò)張性和/或可膨脹性)，用 于容納工程化的活體核。 一旦活體核在膜"E"內(nèi)釋放，用介質(zhì)液體溶液擴(kuò)張容 積VE直到膜"E"到達(dá)空腔邊界。既沒有屏障也沒有膜包裹移植物。消耗介質(zhì)的 同時(shí)，活體核擴(kuò)張至球囊/層/膜"E"的內(nèi)壁。包殼重吸收，移植物與剩余的天然 盤重新連接。"
實(shí)施例
本實(shí)施例中描述了本發(fā)明中使用的材料和方法的示例性實(shí)施方式。本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)理解，本實(shí)施例中所述的技術(shù)代表發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可很好地用于實(shí)施本 發(fā)明的的技術(shù)，因而認(rèn)為構(gòu)成優(yōu)選的實(shí)施方式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解， 根據(jù)本發(fā)明，在所述具體的實(shí)施方式中可進(jìn)行許多改變，仍然獲得類似的結(jié)果 而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
實(shí)施例1示例性材料和方法
本實(shí)施例中描述了本發(fā)明中使用的材料和方法的示例性實(shí)施方式。 細(xì)胞培養(yǎng)采用從患者收集的自體HDF構(gòu)建植入物，采用新生兒(neonatal)包皮成 纖維細(xì)胞進(jìn)行臨床前研究，因?yàn)檫@是實(shí)現(xiàn)試驗(yàn)?zāi)康妮^方便的細(xì)胞來源。采用從 患者收集的自體細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的研究表明，這些細(xì)胞作用良好。
新生兒包皮HDF從級(jí)聯(lián)生物學(xué)公司(Cascade Biologies,波特蘭，奧勒岡 州)購得，在體外用含10% FBS(英吉利公司)和抗生素的DMEM(英吉利公司 (Invitrogen， Carlsbad,美國加利福尼亞州)進(jìn)行擴(kuò)增。將HDF懸浮液接種到 海藻酸鹽中或單層培養(yǎng)介質(zhì)中，如下所述。
為產(chǎn)生藻酸鹽凝膠培養(yǎng)物，將細(xì)胞以高密度(107個(gè)細(xì)胞/毫升)懸浮在2% (重量/體積)中等粘度的藻酸鹽(西格瑪公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯St. Louis，密蘇里州)中，25毫升液滴在100mMCaCl2、 0.9%NaCl溶液中發(fā)生交 聯(lián)。然后用含10。/。FBS和抗生素的DMEM徹底沖洗所得藻酸鹽珠。將藻酸鹽 珠浸漬到補(bǔ)充有100 ng/ml重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)和50 mg抗壞血酸 的含10%FBS和抗生素的DMEM中。條件如下選擇高細(xì)胞密度以及與BMP-2 和抗壞血酸一起培養(yǎng)，因?yàn)橐阎鼈兡軌虼碳ぼ浌钦T導(dǎo)形成((Watt， 1988; Dozin 等，1992; Sullivan等，1994; Denker等，1999; ZurNieden等，2005; Zhou 等，2004)。
為了產(chǎn)生單層培養(yǎng)物，將HDF接種到氧含量20%、含10%FBS但沒有 BMP-2和抗壞血酸的DMEM塑料瓶中。這些細(xì)胞用作對(duì)照。 5%和20%O2下培養(yǎng)
將嵌有細(xì)胞的藻酸鹽珠在5%02、 5。/。C02和90。/。N2的環(huán)境下在02-/C02-調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱(低氧張力)中培養(yǎng)，或者在20%02、 5%(:02和75MN2下在C02-調(diào) 節(jié)的培養(yǎng)箱中(大氣氧張力)中培養(yǎng)，持續(xù)3周。然后，進(jìn)行軟骨形成分化的評(píng) 價(jià)(例如，參見實(shí)施例3)。
流體靜壓
將嵌有細(xì)胞的藻酸鹽珠分成加壓組和對(duì)照組，將各組分別置于可滲透氧氣 和二氧化碳的各個(gè)柔性聚乙烯/尼龍袋中。用15毫升介質(zhì)填充袋，熱密封以排 出所有空氣。
將加壓組尼龍袋置于設(shè)計(jì)用于施加循環(huán)流體靜壓的新開發(fā)的裝置內(nèi)(Elder 等，2005)。該裝置允許比較在相同的三維培養(yǎng)條件下比較寬生理學(xué)范圍的負(fù)荷狀況。該裝置包括大圓柱形不銹鋼基殼(base)，通過壓縮干涉(intervening)O 形環(huán)的螺栓連接于蓋。液壓缸焊接于蓋，使其內(nèi)部與腔室內(nèi)部連通。液壓缸 和腔室完全充滿水，因而通過對(duì)液壓缸活塞施加一定的力(MTS伺服液壓控制 測(cè)試儀產(chǎn)生)可實(shí)現(xiàn)快速流體靜壓。通過將腔室浸漬到溫度調(diào)節(jié)循環(huán)水浴中維 持穩(wěn)定的37°C。將對(duì)照組的尼龍袋置于相同水浴的獨(dú)立的充滿水的不銹鋼腔 室中。
選擇施加壓力的幅度和頻率在生理學(xué)范圍內(nèi)(Mow等，1992)，過去已證實(shí) 能夠刺激多功能間充質(zhì)細(xì)胞的軟骨形成分化(Elder等，2005)和去分化的軟骨 細(xì)胞重新分化(Domm等，2000)。測(cè)試短時(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間加壓，通過定量和定性 評(píng)價(jià)軟骨形成測(cè)定短時(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間流體加壓之間成功的軟骨誘導(dǎo)流體靜壓模 式。
示例性狀況包括-
l.OHz正弦流體靜壓波形，施加的最小壓力0.3Mpa，最大5.0Mpa。對(duì)于 短時(shí)間加壓，每天l小時(shí)加壓細(xì)胞，持續(xù)7天。對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間加壓，每天4小時(shí) 加壓細(xì)胞，持續(xù)7天。每天，完成負(fù)荷后立即將培養(yǎng)物從加壓容器中取出，返 回組織培養(yǎng)箱內(nèi)的水浴中。
采用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評(píng)價(jià)循環(huán)流體靜壓下以及特定條件下(例如低氧、軟 骨形成介質(zhì)、高細(xì)胞密度)培養(yǎng)的HDF的細(xì)胞存活率和軟骨形成分化。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過循環(huán)流體靜壓和剪切應(yīng)力誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化 形成軟骨細(xì)胞。在該情況下，將細(xì)胞接種到微射流支架中。
進(jìn)行軟骨形成分化的評(píng)價(jià)(例如，參見實(shí)施例3)。
實(shí)施例2
HDF在藻酸鹽珠中的細(xì)胞存活率的評(píng)價(jià)
在本發(fā)明具體的方面，通過光學(xué)顯微鏡和/或存活率測(cè)試評(píng)價(jià)軟骨形成介 質(zhì)中培養(yǎng)的HDF在藻酸鹽珠中的存活率。采用光學(xué)顯微鏡研究HDF的形態(tài)和 增殖。在示例性的存活率測(cè)試中，將藻酸鹽珠溶解在溶解緩沖液(0.55 M擰檬 酸鈉、1.5MNaCl和0.5MEDTA)中，離心細(xì)胞并用膠原酶處理團(tuán)粒1小時(shí)。 將細(xì)胞重新懸浮在DMEM中，采用Neubauer室和臺(tái)盼藍(lán)排斥方法測(cè)定存活率。實(shí)施例3
軟骨形成分化的評(píng)價(jià)
在具體的實(shí)施方式中，通過I型、III型和V型膠原的產(chǎn)生來鑒定HDF，
通過n型、ix型、xi型膠原和硫酸化蛋白聚糖的產(chǎn)生來鑒定軟骨細(xì)胞。
通過蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定硫酸化葡胺聚糖(sGAG)含量以及I型和II型膠原 的產(chǎn)生，評(píng)價(jià)軟骨形成分化。膠原合成速率通過摻入^H]-脯氨酸進(jìn)行測(cè)定。
總的DNA和sGAG含量
采用55mM擰檬酸鈉、0.9。/。NaCl溶液從藻酸鹽回收藻酸鹽珠中的細(xì)胞。 然后使細(xì)胞在300 pi 0.5% v/v諾乃(Nonidet)P-40緩沖液(50mM Tris-Cl， 100 mMNaCl， 5 mMMgCl。中裂解。將細(xì)胞溶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到微量離心管中，離心， 采用Hoescht染料方法(DNA定量試劑盒，西格瑪公司(Sigma，圣路易斯，密 蘇里州)，以小牛胸腺DNA為標(biāo)準(zhǔn)品，在100nl上清液等分試樣中測(cè)定DNA。 除去多余的細(xì)胞裂解緩沖液，使sGAG在100 |il 2y。v/v木瓜蛋白酶中消化，60。C 下20 mM乙酸鈉(pH 6)中過夜。然后釆用從牛氣管中純化得到的4-硫酸軟骨素 作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過二甲基亞甲藍(lán)沉淀方法測(cè)定總的sGAG含量(布萊肯甘油氨 基聚糖力、豐斤法(Blyscan GIycoaminoglycan Assay),生物色采-有限公司(Biocolor， Ltd.》。
I型和II型膠原的蛋白質(zhì)印跡
將各樣品的5個(gè)珠溶解在400 ml緩沖液(55mM檸檬酸鈉，150 mMNaCl) 中。為實(shí)現(xiàn)膠原溶解，加入100 ^ 0.25 M乙酸和100 pi胃蛋白酶溶液(lmg/ml 50 mM乙酸:P-6887，西格瑪公司)，并將混合液在4°C下保持24小時(shí)。然后，加 入100 pl 10x儲(chǔ)備液TBS (1 M Tris， 2M NaCl和50 mM CaCl2， pH 8)和100 ml 胰彈性蛋白酶(lmg/mlTBS;西格瑪E-6883)，樣品在37。C下孵育30分鐘。將 樣品在9000xg下離心IO分鐘。收集上清液。將25 pl牛I型膠原、牛II型膠 原(西格瑪)或樣品(各自總蛋白含量為5 mg;用Bio-Rad蛋白分析法定量)與6 pl 樣品緩沖液混合，95'C下變性5分鐘，并加載到7%丙烯酰胺凝膠上。進(jìn)行電泳。將凝膠轉(zhuǎn)移到印跡膜上。膜在封閉緩沖液(配制在TBST緩沖液中的10% 的奶粉)中封閉過夜，然后與鼠單抗抗-I型膠原抗體(COL-l， ab6308，艾碧公 司(Abeamlnc))或鼠單抗抗-II型膠原抗體(5B2.5, ab3092，艾碧公司)在4°C下 孵育過夜。用TBST緩沖液沖洗膜。加入羊抗鼠生物素結(jié)合的第二抗體(1:500)1 小時(shí)，然后以1:1000的稀釋度加入抗生物素蛋白鏈菌素-HRPl小時(shí)。用艾瑪 西亞公司(Amersham)的ECL進(jìn)行印跡顯影。
卩H-脯氨酸摻入的測(cè)定
在測(cè)定膠原產(chǎn)生速率的藻酸鹽珠中，除去介質(zhì)并更換補(bǔ)充有10%FBS、抗 生素、25mg抗壞血酸、[3印脯氨酸(10 ^Ci/ml)、和100嗎/ml P-氨基-丙腈(P-APN) 的DMEM以抑制膠原交聯(lián)的形成。孵育24小時(shí)后，測(cè)定摻入膠原的[3印脯氨 酸。將珠在lml木瓜蛋白酶溶液
中65'C下消化過夜。200ml的各樣品加入到 2ml閃爍液中，用閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行測(cè)定。
將500 W的各樣品與500plPBS混合，用于測(cè)定DNA含量。用超聲束處 理樣品和空白(含ml PBS) 15秒。加入0.5 ml RNAse和0.5 ml鏈霉蛋白酶，37。C 下孵育30分鐘。然后，加入0.5ml溴化乙錠，樣品孵育30分鐘，用熒光計(jì)進(jìn) 行測(cè)定。
相對(duì)于總的DNA含量，將[3司-脯氨酸的摻入標(biāo)準(zhǔn)化。 實(shí)施例4
研究的示例性設(shè)計(jì)
在本發(fā)明的具體方面，在三維藻酸鹽珠培養(yǎng)物中測(cè)定接種的HDF的細(xì)胞 存活率和軟骨形成分化。具體地說，采用上述示例性方法，將接種在藻酸鹽珠 中、20% 02下軟骨形成介質(zhì)(補(bǔ)充有BMP-2和抗壞血酸的介質(zhì))中培養(yǎng)的HDF 的細(xì)胞存活率和軟骨形成分化與20% 02下、補(bǔ)充有10% FBS的DMEM中單 層培養(yǎng)的HDF進(jìn)行比較。
在本發(fā)明的另一方面，測(cè)定氧張力對(duì)藻酸鹽珠中培養(yǎng)的HDF分化的作用。 在2種不同的氧張力下，使接種在藻酸鹽珠中的HDF在軟骨形成介質(zhì)中培養(yǎng)3周1)5%02、 5%002和90。/。N2的低氧張力，在02-/0)2-調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱中；和2) 20%O2、 5%(:02和75%]乂2的大氣氧張力，在COr調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱中。 采用上述示例性方法比較軟骨形成分化。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，測(cè)定流體靜壓對(duì)藻酸鹽珠中培養(yǎng)的HDF分 化的影響。軟骨形成介質(zhì)中接種在藻酸鹽珠中的HDF經(jīng)受不同的刺激l)每 天1小時(shí)流體靜壓，持續(xù)7天(l.O Hz正弦流體靜壓，最小0.3 Mpa，最大5.0 Mpa) 和20%O2; 2)每天4小時(shí)流體靜壓，持續(xù)7天(l.OHz正弦流體靜壓，最小0.3 Mpa， 最大5.0 Mpa)和20%O2; 3)每天1小時(shí)流體靜壓，持續(xù)7天(l.O Hz正弦流體靜 壓，最小0.3 Mpa，最大5.0 Mpa)和5°/002;每天4小時(shí)流體靜壓，持續(xù)7天(l.O Hz正弦流體靜壓，最小0.3Mpa，最大5.0Mpa)和5%02。
采用上述示例性方法評(píng)價(jià)軟骨形成分化。
參考文獻(xiàn)
說明書中提及的所有專利和出版物代表本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的水 平。所有專利和出版物的內(nèi)容在相同的程度上以參考的方式結(jié)合在本文中，如 同各個(gè)出版物具體且單獨(dú)地以參考的方式結(jié)合在本文中。
專利
美國專利6,489,165 美國專利6，627,422
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雖然詳細(xì)描述了本發(fā)明及其優(yōu)點(diǎn)，但應(yīng)理解可進(jìn)行各種改變、替代和變更 而不背離所附權(quán)利要求書限定的精神和范圍。而且，本發(fā)明的范圍不是由說明 書中描述的過程、機(jī)器、制造、物質(zhì)組成、方式、方法和步驟的具體實(shí)施方式
所限定的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員由本發(fā)明的描述應(yīng)理解，根據(jù)本發(fā)明可采用目 前現(xiàn)有或?qū)黹_發(fā)的能夠基本上實(shí)現(xiàn)與本文所述的對(duì)應(yīng)實(shí)施方式相同的功能 或?qū)崿F(xiàn)基本相同結(jié)果的過程、機(jī)器、制造、物質(zhì)組成、方式、方法或步驟。因 此，所附權(quán)利要求旨在將這些過程、機(jī)器、制造、物質(zhì)組成、方式、方法或步 驟包括在其范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種可植入的裝置，所述裝置包括細(xì)胞/支架組合物；和包封裝置，其包括具有內(nèi)側(cè)和外側(cè)的第一膜；具有內(nèi)側(cè)和外側(cè)的第二膜，所述第一膜被包封在所述第二膜內(nèi)側(cè)；位于第一膜內(nèi)側(cè)的第一容積；位于第一膜外側(cè)、第二膜內(nèi)側(cè)的第二容積；以及向第二容積添加流體、從第二容積去除流體、或?qū)崿F(xiàn)這兩種作用的結(jié)構(gòu)，其中，所述細(xì)胞/支架組合物位于第一膜內(nèi)側(cè)，所述第一膜具有以下一種或多種特征半滲透性；生物相容性；可生物降解性；和可重吸收性；所述第二膜具有以下一種或多種特征生物相容性；流體不可透過性；氧氣可滲透性；可重吸收性；可生物降解性；和可擴(kuò)張性。
2. 如權(quán)利要求1所述的可植入裝置，其特征在于，所述支架由合成聚合物、天然水凝膠或合成水凝膠構(gòu)成。
3. 如權(quán)利要求2所述的可植入裝置，其特征在于，所述合成聚合物是聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸-共-乙醇酸、聚-s-己內(nèi)酯或聚(甘油-癸二酸酉旨)(PGS)。
4. 如權(quán)利要求2所述的可植入裝置，其特征在于，所述合成聚合物是聚磷腈、聚酐或聚原酸酯。
5. 如權(quán)利要求2所述的可植入裝置，其特征在于，所述天然水凝膠包括膠原、透明質(zhì)酸、海藻酸、瓊脂糖、殼聚糖、纖維蛋白、明膠或它們的共聚物。
6. 如權(quán)利要求2所述的可植入裝置，其特征在于，所述合成水凝膠包括聚(環(huán)氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(乳酸)、聚(反丁烯二酸丙烯酯-共-乙二醇)或它們的共聚物。
7. 如權(quán)利要求1所述的可植入裝置，其特征在于，所述細(xì)胞是軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。
8. 如權(quán)利要求1所述的可植入裝置，其特征在于，所述軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞分泌選自下組的分子聚集蛋白聚糖、II型膠原、S0X-9蛋白、軟骨連接蛋白和基底膜蛋白多糖。
9. 如權(quán)利要求1所述的可植入裝置，其特征在于，所述細(xì)胞由成纖維細(xì)胞和/或干細(xì)胞分化。
10. 如權(quán)利要求9所述的可植入裝置，其特征在于，所述成纖維細(xì)胞是表皮成纖維細(xì)胞、腱成纖維細(xì)胞、韌帶成纖維細(xì)胞、滑液成纖維細(xì)胞、包皮成纖維細(xì)胞或它們的混合物。
11. 如權(quán)利要求1所述的可植入裝置，其特征在于，所述第一膜由可生物降解的、生物相容的、和可重吸收的聚合物構(gòu)成。
12. 如權(quán)利要求1所述的可植入裝置，其特征在于，所述第一膜由聚丙烯酸酯、聚偏乙烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚酰胺、醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚砜、聚磷腈、聚丙烯腈、聚(丙烯腈/共氯化乙烯)或它們的衍生物、共聚物或混合物構(gòu)成。
13. 如權(quán)利要求1所述的可植入裝置，其特征在于，所述第一膜由聚電解質(zhì)絡(luò)合產(chǎn)生。
14. 如權(quán)利要求1所述的可植入裝置，其特征在于，所述第二膜由聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚-s-己內(nèi)酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚二氧六環(huán)酮(PDO)、聚乙烯、聚(甘油癸二酸酯)(PGS)或它們的衍生物、共聚物或混合物構(gòu)成。
15. 如權(quán)利要求l所述的可植入裝置，其特征在于，所述第二膜的重吸收速率比第一膜的重吸收速率慢。
16. 如權(quán)利要求1所述的可植入裝置，其特征在于，所述可植入裝置包含一種或多種營養(yǎng)劑、生長(zhǎng)因子和/或藥物。
17. 如權(quán)利要求16所述的可植入裝置，其特征在于，所述可植入裝置可進(jìn)一步限定為包含含有一種或多種營養(yǎng)劑、生長(zhǎng)因子和/或藥物的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)。
18. 如權(quán)利要求17所述的可植入裝置，其特征在于，所述介質(zhì)補(bǔ)充有胎牛血清(FBS)、抗壞血酸和/或地塞米松。
19. 如權(quán)利要求16所述的可植入裝置，其特征在于，所述營養(yǎng)劑、生長(zhǎng)因子和/或藥物存在于支架中、第一容積中、第二容積中，或它們的組合。
20. 如權(quán)利要求16所述的可植入裝置，其特征在于，所述生長(zhǎng)因子選自骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (BMP-2)、 BMP-4、 BMP-6、 BMP-7、軟骨衍生的形態(tài)發(fā)生蛋白(CDMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子卩(TGF-(3)、胰島素生長(zhǎng)因子I(IGF-I)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、 FGF-2、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)、或它們的混合物。
21. 如權(quán)利要求16所述的可植入裝置，其特征在于，所述藥物可進(jìn)一步限定為抗生素、抗真菌劑、或抗病毒劑中的一種或多種。
22. 如權(quán)利要求1所述的可植入裝置，其特征在于，所述結(jié)構(gòu)包括一根或多根管道。
23. 如權(quán)利要求1所述的可植入裝置，其特征在于，所述結(jié)構(gòu)包括一根或多根導(dǎo)管和/或一個(gè)或多個(gè)儲(chǔ)器。
24. 如權(quán)利要求1所述的可植入裝置，其特征在于，所述結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步限定為包括以下一種或多種第一管道；第二管道；任選的第一儲(chǔ)器；和任選的第二儲(chǔ)器。
25. 如權(quán)利要求24所述的可植入裝置，其特征在于，所述第一和第二管道各自包括位于第二容積內(nèi)的第一末端，所述第一和第二管道各自包括連接于第一和第二儲(chǔ)器或兩者的第二末端。
26. 如權(quán)利要求24所述的可植入裝置，其特征在于，所述第一和/或第二管道由與所述第二膜相同的材料構(gòu)成。
27. 如權(quán)利要求24所述的可植入裝置，其特征在于，所述第一和/或第二管道由硅酮橡膠構(gòu)成。
28. —種修復(fù)個(gè)體關(guān)節(jié)中的受損軟骨的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1所述的裝置遞送到個(gè)體的各個(gè)關(guān)節(jié)。
29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在合適的離體條件下制備細(xì)胞/支架組合物。
30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述制備細(xì)胞/支架組合物定義為在合適的條件下使一種或多種細(xì)胞暴露于支架。
31. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述方法還包括制備所述細(xì)胞/支架組合物不少于約2-3天。
32. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述合適的條件允許細(xì)胞增殖。
33. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述合適的條件允許刺激軟骨形成分化。
34. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是從成纖維細(xì)胞或干細(xì)胞衍生的軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。
35. 如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述成纖維細(xì)胞是表皮成纖維細(xì)胞、腱成纖維細(xì)胞、韌帶成纖維細(xì)胞、滑液成纖維細(xì)胞或包皮成纖維細(xì)胞。
36. 如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述成纖維細(xì)胞是表皮成纖維細(xì)胞。
37. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述合適的條件可進(jìn)一步限定為高密度微量培養(yǎng)，低氧張力(約1.0%-7.5%)下，機(jī)械應(yīng)力下，和/或給予補(bǔ)充有生長(zhǎng)因子、抗壞血酸和/或地塞米松的培養(yǎng)介質(zhì)。
38. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞/支架組合物經(jīng)歷機(jī)械應(yīng)力。
39. 如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述機(jī)械應(yīng)力定義為流體 靜壓、流體剪切力或其組合。
40. 如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述機(jī)械應(yīng)力是間歇性的。
41. 如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述機(jī)械應(yīng)力是流體剪切 力，所述支架是微射流支架。
42. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述遞送步驟限定為采用 最小侵入性手術(shù)植入所述裝置。
43. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，將裝置植入個(gè)體體內(nèi)后， 第二膜膨脹以填充關(guān)節(jié)中的空隙。
44. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述關(guān)節(jié)是椎間盤，在將 裝置遞送至個(gè)體椎間盤之前，從個(gè)體切除至少一部分的內(nèi)源性椎間盤。
45. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述關(guān)節(jié)是椎間盤、膝關(guān) 節(jié)、肩關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)或顳下頜關(guān)節(jié)。
46. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述第二容積的至少一部 分發(fā)生交換。
47. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述裝置的結(jié)構(gòu)包括 具有第一和第二端的第一管道，所述第一管道的第一端位于第二容積內(nèi)；具有第一和第二端的第二管道，所述第二管道的第一端位于第二容積內(nèi)；第一儲(chǔ)器；和第二儲(chǔ)器，其中，將裝置遞送至個(gè)體椎間盤之后并且所述第二膜膨脹之后，所述第一 和第二管道的第二端分別連接于所述第一和第二儲(chǔ)器。
48. 如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述第一和第二儲(chǔ)器位于 個(gè)體皮下。
49. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述方法還包括密封第一 膜、密封第二膜、或進(jìn)行上述兩種操作。
50. 如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述方法還包括通過第一 儲(chǔ)器去除第二容積的至少一部分。
51. 如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述方法還包括取出第一或第二儲(chǔ)器的流體，將流體分別遞送至第二或第一儲(chǔ)器，或在取出第一或第二 儲(chǔ)器的流體的同時(shí)將流體分別遞送至第二或第一儲(chǔ)器。
52. 如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，在將裝置遞送至個(gè)體之前將細(xì)胞/支架組合物插入第一膜，或者，將裝置遞送至個(gè)體之后將細(xì)胞/支架組 合物插入第一膜。
53. 如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，在將裝置遞送至個(gè)體之前 將第一膜插入第二膜，或者，將裝置遞送至個(gè)體之后將第一膜插入第二膜。
54. —種制備細(xì)胞/支架組合物的方法，其中，所述細(xì)胞是軟骨細(xì)胞或軟骨 細(xì)胞樣細(xì)胞，所述方法包括將能夠分化形成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞提供給支架； 使細(xì)胞經(jīng)受機(jī)械應(yīng)力；和任選地使細(xì)胞接觸適合于軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的分化形成過程的 一種或多種生長(zhǎng)因子。
55. 如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述機(jī)械應(yīng)力是間歇性的。
56. —種包含權(quán)利要求1所述裝置的試劑盒，其特征在于，所述裝置容納 在一種或多種合適的容器中。
57. 如權(quán)利要求56所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含細(xì)胞， 所述細(xì)胞是軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞、或能夠分化形成軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞 樣細(xì)胞的細(xì)胞。
58. —種可植入的裝置，所述裝置包括 包封在膜內(nèi)的細(xì)胞/支架組合物，所述膜具有內(nèi)側(cè)和外側(cè)；和 用于更換至少一部分膜內(nèi)側(cè)流體的結(jié)構(gòu)，其中，所述膜具有一種或多種以下特征.-半滲透性；生物相容性；可生物降解性；和可重吸收性。
59. —種用于軟骨修復(fù)的混合構(gòu)建物，其包括 包含惰性材料的包封裝置；和包含軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的活體核，其中，所述包封裝置包封所述活體核。
60. —種用于軟骨工程的體內(nèi)生物反應(yīng)器，其包括包封細(xì)胞的裝置，其中， 所述細(xì)胞能夠分化形成軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞，所述細(xì)胞的包封提供了適 合所述細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)和分化的條件，所述條件包括在所述細(xì)胞上提供生理學(xué)負(fù) 荷狀況。
61. 如權(quán)利要求60所述的生物反應(yīng)器，其特征在于，所述生理學(xué)負(fù)荷狀 況包括來自個(gè)體脊柱的力。
全文摘要
描述了采用結(jié)合惰性結(jié)構(gòu)和活體核的混合構(gòu)建物來生物修復(fù)軟骨的方法和組合物。所述惰性結(jié)構(gòu)不僅用作遞送系統(tǒng)以供養(yǎng)活體核組分并使其生長(zhǎng)，而且用作細(xì)胞分化的誘導(dǎo)物。惰性結(jié)構(gòu)包括可膨脹/可擴(kuò)張的球囊樣生物聚合物同心內(nèi)外結(jié)構(gòu)?；铙w核包括細(xì)胞-基質(zhì)構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包括例如接種在支架中的HDF。該方法包括外科切除患者受損軟骨，和將混合構(gòu)建物插入上述外科手術(shù)干預(yù)造成的空腔內(nèi)。靶區(qū)域，例如關(guān)節(jié)內(nèi)，惰性結(jié)構(gòu)球囊相繼(successively)膨脹。本文還描述了通過機(jī)械應(yīng)變使人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和分化形成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12N5/077GK101500512SQ200780004506
公開日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2007年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月7日
發(fā)明者L·C·瑟弗蘭, S·Y·弗迪爾-瑟弗蘭 申請(qǐng)人:脊柱賽特有限公司