專利名稱：生長(zhǎng)性和病蟲害抵抗性得到提高的植物及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生長(zhǎng)性和病蟲害抵抗性同時(shí)得到提高的植物及其制作 方法。
背景技術(shù)：
以往，農(nóng)作物的生產(chǎn)率提高一直是基于經(jīng)驗(yàn)的品種改良或通過使用 農(nóng)藥進(jìn)行病蟲害的驅(qū)除等來進(jìn)行的。然而，通過近年來的分子生物學(xué)的 快速發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)能夠通過轉(zhuǎn)化植物等分子育種的方法來進(jìn)行生產(chǎn)率 高的農(nóng)作物的開發(fā)。作為用于提高農(nóng)作物生產(chǎn)率的具體技術(shù)，可以列舉 生長(zhǎng)促進(jìn)(生長(zhǎng)性的提高)、賦予病蟲害抵抗性、賦予應(yīng)激抵抗性、賦 予矮性、開花時(shí)期的調(diào)節(jié)等，除此之外還遍及多個(gè)直接或間接與生產(chǎn)率 提高相關(guān)的技術(shù)范圍。
作為直接與生產(chǎn)率提高相關(guān)的技術(shù)，可以列舉植物的生長(zhǎng)促進(jìn)(生 長(zhǎng)性的提高)。例如，在非專利文獻(xiàn)1中，報(bào)告有使來源于藍(lán)細(xì)菌的果
糖-l， 6/景天庚酮糖-1， 7-雙磷酸酶過剩表達(dá)的煙草的生長(zhǎng)性提高。 此外，在非專利文獻(xiàn)2中，報(bào)告有導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子Dofl的擬南芥在低氮 環(huán)境下生長(zhǎng)性提高。
此外，通過對(duì)農(nóng)作物賦予病蟲害抵抗性，與遭受病蟲害的農(nóng)作物相 比，可以提高生產(chǎn)率。迄今為止報(bào)告有導(dǎo)入特定的基因而制作病蟲害抵 抗性植物的技術(shù)。例如，在專利文獻(xiàn)l中，公開有通過在正常的活性型 G蛋白o(hù)c亞單位基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化來制作對(duì)稻白葉枯病的耐病性被提高的 稻的制作方法。此外，在專利文獻(xiàn)2中，公開有在編碼防衛(wèi)素蛋白質(zhì)的 基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的稻顯示出對(duì)稻熱病和稻白葉枯病的抵抗性。
然而，賦予病蟲害抵抗性有時(shí)未必導(dǎo)致生產(chǎn)率的提高。例如，已知 在植物體構(gòu)成性地表達(dá)包含病蟲害抵抗性的應(yīng)激抵抗性基因時(shí)，有損植 物體的生長(zhǎng)性(參照非專利文獻(xiàn)3~5)，記載有為了確保生長(zhǎng)性而必需 某種努力。
專利文獻(xiàn)1 :特開2005—192496 (/>開日平成l 7年(2005年)7月21曰)
專利文獻(xiàn)2:4爭(zhēng)開2003—88379O開曰平成15年(2003年)3月25曰)
非專矛J文獻(xiàn)l :Miyagawa Y, 丁arooi M, Shigeoka S, Overexpression of a cyanobactwi
al"fructose-1,6-/sedoh印tulose-l'7—bisphosphatase in tobacco enhances photosynt
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發(fā)明內(nèi)容
如上所述，促進(jìn)植物生長(zhǎng)(提高生長(zhǎng)性)的技術(shù)和對(duì)植物賦予病蟲 害抵抗性的技術(shù)作為不同的技術(shù)而分別進(jìn)行研究。因此，為了對(duì)植物同 時(shí)賦予生長(zhǎng)性提高和病蟲害抵抗性，必須應(yīng)用2種不同的技術(shù)。具體而 言，例如為了通過轉(zhuǎn)化而同時(shí)賦予生長(zhǎng)性提高和病蟲害抵抗性，必須導(dǎo) 入2種不同的基因，然而在這種情況下，也會(huì)預(yù)想到與分別單獨(dú)導(dǎo)入時(shí) 同樣的表達(dá)型不同時(shí)表達(dá)的情形。
另 一方面，如果發(fā)現(xiàn)通過應(yīng)用 一種技術(shù)就能夠同時(shí)賦予生長(zhǎng)性提高 和病蟲害抵抗性的技術(shù)，則可以期待不會(huì)產(chǎn)生上述那樣的問題，對(duì)農(nóng)作
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物的生產(chǎn)率提高作出大的貢獻(xiàn)。然而，這樣的技術(shù)在過去并沒有報(bào)告。
本發(fā)明是鑒于上述問題而完成的，其目的在于提供生長(zhǎng)性和病蟲害 抵抗性同時(shí)提高的轉(zhuǎn)化植物，以及該轉(zhuǎn)化植物的制作方法。
本發(fā)明人等在研究植物生長(zhǎng)中的活性酶的控制機(jī)理的過程中，在擬 南芥的培養(yǎng)細(xì)胞和分離葉綠體中鑒定了谷胱甘肽結(jié)合性的質(zhì)體型果糖
- 1， 6 -雙磷酸醛縮酶。從野生型擬南芥中克隆了編碼該蛋白質(zhì)的基因， 在大腸桿菌中使重組蛋白質(zhì)表達(dá)，闡明其機(jī)理。此外，在該研究過程中 還發(fā)現(xiàn)，制作導(dǎo)入有上述谷胱甘肽結(jié)合性的質(zhì)體型果糖-1, 6-雙磷酸 醛縮酶基因的轉(zhuǎn)化擬南芥后，該轉(zhuǎn)化植物體與野生型植物體相比生長(zhǎng)性 提高。進(jìn)而，還發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化植物體的病蟲害抵抗性也同時(shí)提高，從而完 成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化植物，其特征在于，導(dǎo)入有編碼谷胱甘肽結(jié)合 性質(zhì)體型果糖-1,6-雙磷酸醛縮酶的DNA，生長(zhǎng)性和病蟲害抵抗性提高。
此外，本發(fā)明所述的生長(zhǎng)性和病蟲害抵抗性得到提高的植物的制作 方法，其特征在于，包含將編碼谷胱甘肽結(jié)合性質(zhì)體型果糖-1, 6-雙 磷酸醛縮酶的DNA導(dǎo)入植物的工序。
在本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化植物和本發(fā)明所述的生長(zhǎng)性和病蟲害抵抗性得 到提高的植物的制作方法中，優(yōu)選所述編碼谷胱甘肽結(jié)合性質(zhì)體型果糖 -l， 6-雙磷酸醛縮酶的DNA選自下述(a) ~ (d)。
(a) 編碼由序列號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的DNA;
(b) 編碼由如下氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的DNA,即在序列號(hào)l 所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列；
(c) 由序列號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA;
(d )與由序列號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格條件下進(jìn)行 雜交的DNA。
根據(jù)本發(fā)明，通過導(dǎo)入一個(gè)基因就能夠制作植物的生長(zhǎng)性和病蟲害 抵抗性同時(shí)得到提高的植物。因此，本發(fā)明發(fā)揮能夠?qū)μ岣咿r(nóng)作物的生 產(chǎn)率、提高生物質(zhì)量生產(chǎn)率作出大貢獻(xiàn)的效果。此外，還發(fā)揮能夠大幅 減少化學(xué)肥料、農(nóng)藥的使用的效果。
進(jìn)而，如果作為原料導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)闹参镏?，則可以期待在植物中進(jìn) 行目前在成本方面依賴于原油的各種工業(yè)原料、能量的生產(chǎn)。
本發(fā)明的另外的目的、特征以及優(yōu)點(diǎn)通過如下的描述可充分明了 。 此外，本發(fā)明的益處在參照附圖的如下說明中明了。


圖1是表示在FBA1基因的克隆中使用的引物和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) 的圖。
圖2是表示導(dǎo)入了 FBA1基因的轉(zhuǎn)化植物的FBAlmRNA的 RT-PCR結(jié)果的電泳圖像。
圖3是表示FBA1基因的T-DNA插入突變體(049B07 )的T-DNA 插入位置的圖。
圖4是接種了炭疽病菌(Colltotricum higginsianum)孢子的擬南 芥(Col-0， 35S畫FBA1/Col國0， cad2-l， 35S-FBAl/cad2-l, 049B07)葉 子的照片(上部)和實(shí)施錐蟲藍(lán)染色后的葉子的照片(下部)。
圖5是表示在接種了炭疽病菌(Colltotricum higginsianum)孢子 的擬南芥(Col-0， 35S誦FBA1/Col國0， cad2-l， 35S-FBAl/cad2-l， 049B07 ) 葉子中，能夠侵入的菌數(shù)的圖表。
圖6是對(duì)接種了炭疽病菌(Colltotricum higginsianum)孢子的擬 南芥(Col國O, 35S國FBA1/Col國0， cad2國l， 35S-FBAl/cad2國l， 049B07) 葉子實(shí)施錐蟲藍(lán)染色，觀察侵入菌絲而得的顯微鏡照片。
圖7是接種了炭疽病菌(Colltotricum higginsianum)孢子的擬南 芥(Col國0， 35S誦FBA1/Col國0， cad2-l， 35S-FBAl/cad2-l, 049B07)接 種后第24天的植物體的照片。
圖8是接種了西紅棉斑葉細(xì)菌(Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000) 孢子的擬南芥(Col-0， 35S-FBA1/Col-0， cad2-l， 35S-FBAl/cad2-l, 049B07)接種后第5天的植物體的照片。
圖9 (a)是表示經(jīng)水楊酸處理的擬南芥(Col-0, 35S-FBA1/Col-0，
cad2畫l， 35S-FBAl/cad2-l， 049B07 )的PRlmRNA的RT-PCR結(jié)果的 電泳圖像。
圖9 (b)是表示經(jīng)水楊酸處理的擬南芥(Cal-0， 35S-FBA1/Col-0， cad2-l, 35S-FBAl/cad2-l, 049B07 )的PR1的相對(duì)mRNA量的圖表。
圖10( a)是表示經(jīng)茉莉酮酸處理的擬南芥(Col-0，35S-FBAl/Col-0， cad2-l， 35S-FBAl/cad2-l， 049B07 )的PDF1.2mRNA的RT國PCR結(jié)果 的電泳圖像。
圖10( b )是表示經(jīng)茉莉酮酸處理的擬南芥(Col-0， 35S-FBA1/Col-0， cad2國l， 35S-FBAl/cad2-l， 049B07 )的PDF1.2的相對(duì)mRNA量的圖 表。
圖ll是野生型擬南芥(Col-l)和導(dǎo)入了 FBA1基因的轉(zhuǎn)化擬南芥 (35S-FBA1/Col-0 )播種后第42天的植物體的照片。
圖12是野生型擬南芥(Col-l )、 FBA1基因的T-DNA插入突變體 (049B07)、導(dǎo)入了 FBA1基因的轉(zhuǎn)化擬南芥(35S-FBA1/Col-0 )以及 分別導(dǎo)入以FBA1的半胱氨酸殘基被取代為丙氨酸殘基的方式導(dǎo)入突變 的4種FBA1基因的轉(zhuǎn)化擬南芥播種后第30天的植物體的照片。
圖13是在野生型擬南芥(Col-l )、 FBA1基因的T-DNA插入突變 體(049B07)、導(dǎo)入了 FBA1基因的轉(zhuǎn)化擬南芥(35S-FBA1/Col-0 )以 及分別導(dǎo)入以FBA1的半胱氨酸殘基被取代為丙氨酸殘基的方式導(dǎo)入突 變的4種FBA1基因的轉(zhuǎn)化擬南芥中，比較各植物的蓮座葉的濕重和總 蓮座葉數(shù)而得到的圖表。
圖14是使野生型擬南芥(Col-0)和導(dǎo)入了 FBA1基因的轉(zhuǎn)化擬南 芥(35S-FBA1)在與大氣相同的C02條件以及高C02條件下生長(zhǎng)時(shí)播 種后第25天的植物體的照片。
圖15是使野生型擬南芥(Col-0)和導(dǎo)入了 FBA1基因的轉(zhuǎn)化擬南 芥(35S-FBA1)在與大氣相同的C02條件以及高C02條件下生長(zhǎng)時(shí)分 別比較蓮座葉的濕重和蓮座葉數(shù)而得到的圖表。
具體實(shí)施例方式
首先，簡(jiǎn)單說明本發(fā)明完成的背景。
本發(fā)明人等示出，在植物中適當(dāng)濃度的活性酶不僅作為生物合成的 基質(zhì)而且作為在植物發(fā)育中的控制因子是必需的，而且可以通過用適當(dāng) 濃度的活性酶處理種子、植物體、葉、根等來改善植物的生長(zhǎng)。進(jìn)而， 還示出活性酶的生長(zhǎng)改善效果與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽相關(guān)。作為這種研究
中的一環(huán)，本發(fā)明人等克隆擬南芥(Arabidopsis thaliana)培養(yǎng)細(xì)胞中 的谷胱甘肽結(jié)合性蛋白質(zhì)，鑒定了其中推定為質(zhì)體型果糖-1， 6-雙磷 酸醛縮酶的蛋白質(zhì)(Ito， H., Iwabuchi, M. and Ogawa, K. (2003) Plant Cell Physiol. 44， 655-660.)。
然后，由野生型擬南芥克隆編碼該蛋白質(zhì)的cDNA,在大腸桿菌中 使重組蛋白質(zhì)表達(dá)，嘗試使用精制后的該重組蛋白質(zhì)闡明其機(jī)理。
在此，擬南芥至少有7個(gè)被認(rèn)為是編碼果糖-1， 6-雙磷酸醛縮酶 (以下記為"FBA，，)的基因，預(yù)想其中3個(gè)以質(zhì)體為靶。本發(fā)明人等 對(duì)于這3個(gè)FBA，將上述谷胱甘肽結(jié)合性的FBA命名為"FBA1"、將 其他2個(gè)命名為"FBA2"和"FBA3"來進(jìn)行試驗(yàn)。其結(jié)果闡明1) 重組FBA1具有FBA的活性；2 )重組FBA1被谷胱甘肽控制；3 )FBA1、 FBA2和FBA3都,皮二石克蘇糖醇或還原型石危氧還蛋白(Trx)抑制，只有 FBA1被谷胱甘肽再活化等。此外，由于從FBA1基因的T-DNA插入突 變體分離的葉綠體喪失FBA1活性，因此表示FBA1實(shí)際上存在于葉綠 體中 (Ogawa, K. Matsumoto， M. and Ito, H.， (2005) Vol.l， Photosynthesis: Fundamental Aspects to Global Perspectives, edited by Van der Est A and Bruce D. Lawrence, Allen Press, Inc., 468-469.,松本 雅好，小川健一，第23次日本植物細(xì)胞分子生物學(xué)會(huì)大會(huì)-討論會(huì)紀(jì) 要集，2005年8月4日發(fā)行)。
本發(fā)明人等為了進(jìn)一步研究，在野生型擬南芥中導(dǎo)入FBAl基因， 制作轉(zhuǎn)化植物。于是發(fā)現(xiàn)，用該FBAl轉(zhuǎn)化的擬南芥的生長(zhǎng)性提高而且 病蟲害抵抗性提高。
以下，對(duì)于本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化植物及其制作方法進(jìn)行詳細(xì)說明。 本發(fā)明提供導(dǎo)入有編碼谷胱甘肽結(jié)合性質(zhì)體型果糖-1, 6 -雙磷酸 醛縮酶(FBA1)的DNA、生長(zhǎng)性和病蟲害抵抗性提高的轉(zhuǎn)化植物及其 制作方法。
在本發(fā)明中，"生長(zhǎng)性提高"是指，將導(dǎo)入有編碼FBA1的DNA的 植物與沒有導(dǎo)入的植物相比較時(shí)，導(dǎo)入有編碼FBA1的DNA的植物生 長(zhǎng)量多，或者生長(zhǎng)速度快，更具體而言，是指自然重量或干重重，種子、 果實(shí)的產(chǎn)量多或干重重，葉的片數(shù)多等。
此外，在本發(fā)明中，"病蟲害抵抗性提高"是指，將導(dǎo)入有編碼FBA1 的DNA的植物與沒有導(dǎo)入的植物相比較時(shí)，導(dǎo)入有編碼FBA1的DNA 的植物對(duì)病原真菌、病原細(xì)菌延遲或者減輕其病情進(jìn)展，以及延遲或減 輕害蟲的蟲害。在此，蟲害抵抗性是指，產(chǎn)生害蟲忌避物質(zhì)所帶來的忌 避效果以及產(chǎn)生引誘天敵的物質(zhì)或?qū)οx有毒的物質(zhì)所導(dǎo)致的害蟲的 驅(qū)除或增殖抑制效果。
本發(fā)明中所使用的編碼谷胱甘肽結(jié)合性質(zhì)體型果糖-1， 6 -雙磷酸 醛縮酶(以下記作"FBA1")的DNA,只要是具有FBA活性、存在于 葉綠體等的質(zhì)體中、被谷胱甘肽抑制活性的DNA即可，其來源的植物 沒有特別限制。作為葉綠體的FBA活性一直以來用生物化學(xué)的方法測(cè) 定，已知與擬南芥的FBA1同樣地顯示pH依賴性，此外，在葉綠體基 質(zhì)內(nèi)進(jìn)行光合成時(shí)起作用的酶的最佳pH可以容易地預(yù)想到是適于進(jìn)行 光合成時(shí)的pH8，因此以往暗示在多數(shù)植物中存在FBA1。應(yīng)說明的是， FBA活性是指，可逆地催化將果糖-1, 6-雙磷酸轉(zhuǎn)換為磷酸二羥丙酮 和甘油醛-3 —磷酸的反應(yīng)的活性。
作為本發(fā)明中所用的編碼FBA1的DNA，可以列舉來源于擬南芥的 FBA1基因。來源于擬南芥的FBA1由序列號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成， 編碼其的基因(全長(zhǎng)cDNA)由序列號(hào)3所示的堿基序列構(gòu)成。在序列 號(hào)3所示的堿基序列中，第145位~第147位是起始密碼子，第1318 位~第1320位是終止密碼子。即，擬南芥FBA1基因在序列號(hào)3所示 的堿基序列中具有第145位~第1320位作為可讀框(ORF)。序列號(hào)2 所示的堿基序列是擬南芥FBA1基因的ORF堿基序列。應(yīng)說明的是， 作為與擬南芥FBA1基因的堿基序列具有同源性的基因，可以列舉在稻 的基因組上發(fā)現(xiàn)的基因(dbj|BAB55475.1 )。
此外，由在序列號(hào)l所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加l或多
個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且編碼具有FBA1活性的蛋白質(zhì)的DNA 也可以很好地用于本發(fā)明。如后述的實(shí)施例所示，本發(fā)明人等證實(shí)導(dǎo)入 有如下DNA的擬南芥與導(dǎo)入了編碼沒有突變的FBA1的DNA的擬南芥 同樣，生長(zhǎng)性提高，即，編碼在擬南芥FBA1的氨基酸序列(序列號(hào)l) 中將第72位的半胱氨酸取代為其他氨基酸(在實(shí)施例中為丙氨酸)而 得到的突變FBAl的DNA,或者編碼將第187位的半胱氨酸取代為其 他氨基酸(在實(shí)施例中為丙氨酸)而得到的突變FBA1的DNA。
在此，"缺失、取代或添加1或多個(gè)氨基酸"是指，可以通過部位 特異性的突然變異誘發(fā)法等公知的突變肽制作法來缺失、取代或添加程 度的個(gè)數(shù)(優(yōu)選10個(gè)以下，更優(yōu)選7個(gè)以下，進(jìn)一步優(yōu)選5個(gè)以下) 的氨基酸缺失、取代或添加。這種突變蛋白質(zhì)不限于具有通過公知的突 變多肽制作法而人為地導(dǎo)入的突變的蛋白質(zhì)，還可以是將天然存在的蛋 白質(zhì)分離精制而得到的蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的幾個(gè)氨基酸，可以不顯著影響該蛋白質(zhì)的 結(jié)構(gòu)或功能而容易地被改變，這在該領(lǐng)域中是眾所周知的。進(jìn)而，不僅 是人為改變的蛋白質(zhì)，而且在天然的蛋白質(zhì)中也存在不會(huì)顯著改變?cè)摰?白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能的突變體，這也是眾所周知的。
優(yōu)選的突變體，具有保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。 優(yōu)選沉默取代、添加和缺失，特別優(yōu)選保守性取代。它們不會(huì)改變本發(fā) 明所述的多肽的活性。
被看作代表性的保守性取代的是，脂肪族氨基酸Ala、 Val、 Leu及 lie中的一個(gè)氨基酸取代成別的氨基酸，羥基殘基Ser與Thr的交換， 酸性殘基Asp與Glu的交換，酰胺殘基Asn與Gin之間的取代，堿性 殘基Lys與Arg的交換，以及芳香族殘基Phe、 Tyr之間的取代。
此外，在本發(fā)明中，只要是能夠編碼具有FBA1活性的蛋白質(zhì)，也可 以使用與由序列號(hào)2所示的^序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格務(wù)fr下進(jìn)行雜交 的DNA。在這種DNA中，包括例如編碼由在序列號(hào)1所示的M酸序列 中缺失、取代或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的 DNA。
在本發(fā)明中，"嚴(yán)格條件"是指，僅在序列之間存在至少卯％的同
源性、優(yōu)選至少95%的同源性、最優(yōu)選至少97%的同源性時(shí)發(fā)生雜交。 具體而言，例如，可以舉出在雜交溶液(含有50%甲酰胺、5xSSC (150mM的NaCl、 15mM的檸檬酸三鈉)、50mM的磷酸鈉(pH7.6 )、 5xDenhardt液、10%硫酸葡聚糖以及20jig/ml的變性剪切鮭魚精子 DNA)中在42匸孵育一晚，然后在約65X:在0.1xSSC中洗滌過濾器的 條件。
雜交可以通過在Sambrook等、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (2001)中記栽的方法 等眾所周知的方法來進(jìn)行。通常，溫度越高、鹽濃度越低就變得越嚴(yán)格 (變得難以雜交)，可以獲得同源性更高的DNA。
氨基酸序列、堿基序列的同源性可以采用Karlin和Altschul的算法 BLAST( Karlin S， AUschul SF, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268 (1990); Karlin S， Altschul SF， Proc. Natl. Acad Sci. USA，卯5873-5877 (1993))來確定。開發(fā)出被稱為基于BLAST的算法的BLASTN或 BLASTX的程序(Altschul SF， et at" J. Mol. Biol" 215:403 (1990))。
本發(fā)明中所使用的編碼FBA1的DNA可以來源于基因組DNA，也 可以來源于cDNA,還可以是化學(xué)合成的DNA。
作為獲得本發(fā)明中所^^吏用的編碼FBA1的DNA的方法，可以列舉 通過公知技術(shù)將編碼FBA1的DNA片段分離后進(jìn)行克隆的方法。例如， 制備與編碼擬南芥FBA1的DNA的堿基序列的一部分進(jìn)行特異性雜交 的探針，篩選基因組DNA文庫、cDNA文庫即可。
或者，作為獲得本發(fā)明中所使用的編碼FBA1的DNA的方法，可 以列舉采用PCR等擴(kuò)增手段的方法。例如，在編碼擬南芥FBAl的cDNA 中，從5，側(cè)和3，側(cè)的序列(或其互補(bǔ)序列)中分別制備引物，使用這些 引物以基因組DNA (或cDNA)為模板進(jìn)行PCR等，將夾于兩引物之 間的DNA區(qū)域擴(kuò)增，由此可以大量地得到本發(fā)明中所使用的編碼FBA1 的DNA片段。
本發(fā)明中所使用的DNA ，可以以適當(dāng)植物的組織或細(xì)胞作為供給源
來獲得。作為植物沒有特別限制，例如，可以列舉與擬南芥近親的其他 十字花科的植物、稻、煙草、油椰子、白楊等。另外，如上所述，暗示
多數(shù)植物中存在具有FBA1活性的蛋白質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地 預(yù)想到在擬南芥以外的植物中也存在編碼FBA1的DNA。
在本發(fā)明中，作為將編碼FBA1的DNA導(dǎo)入到植物中的方法，可 以優(yōu)選使用構(gòu)筑重組表達(dá)載體而將其導(dǎo)入到植物中的方法，所述重組表 達(dá)載體是將在編碼FBA1的DNA的上游連結(jié)在植物細(xì)胞中起作用的啟 動(dòng)子、在下游連結(jié)在植物細(xì)胞中起作用的終止子而得到的。
在后述的實(shí)施例中，作為在植物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子，使用構(gòu)成 性表達(dá)的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子，但并不限于此。作為花椰菜花葉 病毒35S啟動(dòng)子以外的構(gòu)成性啟動(dòng)子，可以列舉稻的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、 玉米的泛蛋白啟動(dòng)子等，這些啟動(dòng)子也可以很好地用于本發(fā)明中。
作為構(gòu)成性啟動(dòng)子以外的啟動(dòng)子，可以列舉rbcS啟動(dòng)子、Cab啟 動(dòng)子等綠葉組織特異性的啟動(dòng)子或HSP70啟動(dòng)子等誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，但 并不限于此。此外，直接插入葉綠體的基因組時(shí)的啟動(dòng)子可以列舉rbcL 啟動(dòng)子等，但只要是在葉綠體內(nèi)起作用的啟動(dòng)子就不限于此。
作為在植物細(xì)胞中起作用的終止子，可以列舉來源于一氧化氮合成 酶(NOS)基因的終止子、來源于花椰菜花葉病毒的終止子等。
在植物轉(zhuǎn)化中使用的重組表達(dá)載體，只要是在植物細(xì)胞內(nèi)能夠使插 入基因表達(dá)的就沒有特別限制。特別是，向植物體導(dǎo)入載體的方法是使 用農(nóng)桿菌時(shí)，優(yōu)選使用pBI系等雙元載體。作為雙元載體，可以列舉 pBIG、 pBIN19、 pBI101、 pBI121、 pBI221等。
在本發(fā)明中，成為轉(zhuǎn)化對(duì)象的植物，是指植物體整體、植物器官(例 如葉、花瓣、莖、根、種子等)、植物組織(例如表皮、韌皮部、軟組 織、木質(zhì)部、維管束、柵狀組織、海綿狀組織等)或植物培養(yǎng)細(xì)胞、或 者各種形態(tài)的植物細(xì)胞(例如懸浮培養(yǎng)細(xì)胞)、原生質(zhì)體、葉的切片、 愈合組織等中的任一種。作為轉(zhuǎn)化中所使用的植物，沒有特別限制，適 當(dāng)選擇能夠表達(dá)所用的編碼FBA1的DNA的植物即可。
在此，使用編碼擬南芥FBA1的DNA時(shí)，成為轉(zhuǎn)化對(duì)象的植物，
優(yōu)選與擬南芥為近親的十字花科的植物，但并不限于此。例如，報(bào)告有
煙草、白楊、檸檬等能夠用擬南芥的基因制作出轉(zhuǎn)化植物。(FrankeR, McMichael CM, Meyer K, Shirley AM, Cusumano JC， Chappie C (2000) Modified lignin in tobacco and poplar plants over-expressing the Arabidopsis gene encoding ferulate 5-hydroxylase. Plant J. 22: 223-234; Pena L， Martin-Trillo， M， Juarez J, Pina, JA， Navarro L, Martinez畫Zapater JM. (2001) . Constitutive, expression of Arabidopsis LEAFY or APETALA1 genes in citrus reduces their generation time, Nat. Biotechnol. 19， 263-267 )。因此，認(rèn)為如果將編碼擬南芥FBA1的 DNA導(dǎo)入到上述那樣的植物中，則可以制作出生長(zhǎng)性和病蟲害抵抗性 得到提高的各種轉(zhuǎn)化植物。
向植物細(xì)胞導(dǎo)入重組表達(dá)載體時(shí)，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的轉(zhuǎn)化 方法(例如農(nóng)桿菌法、基因槍法、聚乙二醇法、電穿孔法等)。例如， 使用農(nóng)桿菌法時(shí)，將構(gòu)筑的植物用表達(dá)載體導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)霓r(nóng)桿菌(例如 才艮癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens ))中，根據(jù)葉片圓盤法(內(nèi) 宮博文著，植物基因操作手冊(cè)，19卯，27-31pp， Koudansha Scientific, 東京)等使此林感染于無菌培養(yǎng)葉片，可以得到轉(zhuǎn)化植物。
此外，使用基因槍法時(shí)，可以直接使用植物體、植物器官、植物組 織自身，還可以制備切片后使用，還可以制備原生質(zhì)體后使用?？梢杂?基因?qū)胙b置(例如PDS-1000 (BIO-RAD公司)等)處理如此制備得 到的樣品。處理?xiàng)l件根據(jù)植物或樣品而異，通常在450 2000psi左右的 壓力、4 12cm左右的距離進(jìn)行。
導(dǎo)入有目標(biāo)DNA的細(xì)胞或植物組織首先用卡那霉素耐受性、潮霉 素耐受性等藥物耐受性標(biāo)記選擇，接著通過常規(guī)方法再生于植物體中。 從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物體可以根據(jù)植物細(xì)胞種類、通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公 知的方法進(jìn)行。
確i^是否在植物中導(dǎo)入有目標(biāo)DNA可以通過PCR法、Southern雜 交法、Northern雜交法等進(jìn)行。例如，從轉(zhuǎn)化植物制備DNA，對(duì)導(dǎo)入 的DNA設(shè)計(jì)特異性的引物，進(jìn)行PCR。然后，對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂 凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳等，通過溴化乙錠等進(jìn)行 染色，檢測(cè)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物，由此可以確i人被轉(zhuǎn)化。
一旦獲得在基因組中導(dǎo)入有編碼FBA1的DNA的轉(zhuǎn)化植物體，就 可以由該植物體通過有性生殖或無性生殖而獲得后代。此外，還可以從 該植物體、其后代或克隆得到繁殖材料(例如種子、原生質(zhì)體等)，以 它們?yōu)榛A(chǔ)來批量生產(chǎn)目標(biāo)植物體。
期待如上得到的轉(zhuǎn)化植物與野生型植物相比生長(zhǎng)性和病蟲害抵抗 性提高。生長(zhǎng)性的提高可以通過比較同時(shí)播種的野生型植物與植物體的 大小、重量等來確認(rèn)。此外，病蟲害抵抗性的提高例如后述的實(shí)施例所 記載的那樣，可以通過與野生型植物比較炭疽病菌(Colltotricum higginsianum )接種后的病情來確i人。
本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化植物的生長(zhǎng)性，擬南芥的情況，即使是極低照度 (太陽光的50分之一左右)也可看到10~15%以上的增加，如果將照 度成倍提高，則預(yù)計(jì)增加30~40%左右以上，在太陽光的20分之3左 右的光下，預(yù)計(jì)增加70~80%左右以上。此外，升高C02濃度時(shí)，與 通常的植物相比，顯示2 ~ 3倍以上的生長(zhǎng)性，在優(yōu)選的條件下顯示10 ~ 20倍以上的生長(zhǎng)性。如此制作出的植物，即使是只有森林地表等的照度 的場(chǎng)所也能夠生長(zhǎng)，可以使植物能生長(zhǎng)的面積增加。此外，在高照度下 可以大大改善生長(zhǎng)性，因此可以期待在田地等開放地中飛躍性地提高農(nóng) 作物的生產(chǎn)率。另一方面，導(dǎo)入到作為工業(yè)及能源原料而受關(guān)注的植物 中時(shí)，可以期待大幅降低生產(chǎn)成本，將這些植物作為石油的替代原料。 如果導(dǎo)入到紙漿用的樹木、例如白楊中，則期待可以有效地植林和育林， 可以抑制新的森林欲伐。導(dǎo)入到干燥地的植物中時(shí)，可期待可以提高干 燥地的植物生產(chǎn)率，可以有助于促進(jìn)綠化或抑制沙漠化的進(jìn)行。
本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化植物的病蟲害抵抗性不僅具有對(duì)真菌、而且延及 對(duì)細(xì)菌和害蟲的廣泛的生物鐠。水楊酸、茉莉酮酸是感染病原菌時(shí)制成 的對(duì)病害抵抗性非常重要的信號(hào)物質(zhì)。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化植物具有以往 所沒有的如下顯著特征水楊酸引起的病害抵抗性應(yīng)答和茉莉酮酸引起 的病害抵抗性應(yīng)答都得到增強(qiáng)。此外，已知茉莉酮酸是與蟲害抵抗性有 關(guān)的物質(zhì)(Ozawa， R.， Arimura, G" Takabayashi, J., Shimoda, T.， and Nishioka, T. (2000) Involvement of jasmonate國and salicylate-related signaling pathways for the production of specific herbivore-induced volatiles in plants: Plant Cell Physiol. 41: 391—398.,高林純示編集
(2003)蛋白質(zhì)核酸酶Vo148 ( 13) 2003年10月號(hào))。因此，本領(lǐng)域技 術(shù)人員容易理解本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化植物對(duì)蟲害的抵抗性也提高。
以下，用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于這 些實(shí)施例。
(1)使用植物
野生型擬南芥4吏用Columbia ( Col-0 )。內(nèi)生谷胱甘肽的量減少的 突變體cad2國l (Howden, R.， Andersen, C.R.， Goldsbrough, P.B. and Cobbett， C.S. (1995) A cadmium-sensitive, glutathione-deficient mutant of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 107:1067-1073.)使用由Dr. Christopher S. Cobbett (The University of Melbourne, Parkville, Australia)提供的。
植物播種于如下得到的土壤中，即，在正方形的塑料罐(6.5x6.5 x5cm)中從底部開始以2: 2: 1的比例裝入蛭石(旭工業(yè)，岡山)、吳 羽培養(yǎng)土 (吳羽園藝培養(yǎng)土、吳羽化學(xué)、東京)、蛭石而得到的三層土 壤，在生長(zhǎng)溫度22t:、長(zhǎng)日照(16-h明/8-h暗)或短日照(10-h 明/14-h暗)的條件下使其生長(zhǎng)。
(2 ) FBA1基因的克隆、突變FBA1基因的制作及FBA1過剩表達(dá) 轉(zhuǎn)化植物的制作
從4周齡的擬南芥野生型Columbia ( Col-0 )中分離出總RNA,使 用Prostar first strand RT-PCR試劑盒(Stratagene, La Jolla， CA, U.S.A)進(jìn)行RT-PCR (模板RNA量5力ng )，制作cDNA。
如圖1所示，使用基于FBA1的cDNA序列(序列號(hào)3)設(shè)計(jì)的下 述特異性引物，將全長(zhǎng)cDNA作為2個(gè)片段通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，將各 片段TA-克隆到pGEM-T載體(Promega, Madison, WI, USA )。
1F-1: 5,-GGATCC丁ATGGCGTCTGCTAG-3，(序列號(hào)4 ) 1R-1: 5'-ATCTGCAACGGTCTCGGGAGA-3'(序歹'J號(hào)5 ) IF—2: 5'-GTGTGGTCCGAGGTGTTCTTCT—3，(序歹'J號(hào)6 )
15
1R-2: 5，-GAGCTCGAGTAGGTGTAACCCTTG-3，(序列號(hào)7 )
將2個(gè)片段在Bstpl位點(diǎn)融合，構(gòu)建含有全長(zhǎng)cDNA的載體 (pGEM-FBAl )。為了制作轉(zhuǎn)化植物，用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sac I處理pGEM-FBAl后，將片段導(dǎo)入到pBI121載體中。
此外，還制作用于使將存在于FBA1蛋白質(zhì)中的4個(gè)半胱氨酸殘基 分別取代為丙氨酸殘基的突變型FBA1蛋白質(zhì)(fbalC72A， fbalC128A, fbalC156A， fbalC187A)表達(dá)的構(gòu)造體。在用于制作上述pGEM-FBAl 的2個(gè)cDNA片段中含有BamH I -Bstp I片段的構(gòu)造體中，4個(gè)半胱氨 酸殘基都被編碼。于是，首先，用引物pGEM-del-Apa I與引物SP6的 組合進(jìn)行PCR,將pGEM載體失去多克隆位點(diǎn)的片段進(jìn)行擴(kuò)增。另一 方面，用引物Ald-C72A、 Ald國C128A、 Ald-C156A或Ald誦C187A與引 物T7的組合進(jìn)行PCR，得到導(dǎo)入了部位特異性變異的片段。PCR在如 下條件下進(jìn)行95*C 5分鐘一次循環(huán)，30秒、60"C 1分鐘、72 r l分鐘30次循環(huán)。
T7: 5'-CCGCTGAGCAATAACTAGC-3'(序列號(hào)8)
SP6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAT-3'(序列號(hào)9)
pGEM—de卜Apa I : 5'—TCACTATAGGGCGAATTGGTACCGA—3'(序列號(hào)10)
AW-C72A : 5，-AATGCAACCGCTGGGAAGAGG-3'(序列號(hào)11)
Aid-C128A: 5'-TTTGTCGATGCCTTGCGCGATG-3，(序列號(hào)12)
Ald-C156A: 5'-GTCTTGGGCCCAAGGCTTGG—3'(序列號(hào)13)
Ald-C187A: 5'—AGTGTTCCCGCCGGTCCTTCA-3'(序列號(hào)14)
混合2個(gè)PCR產(chǎn)物各0.5ji1，熱變性后進(jìn)行慢冷(94匸IO分鐘、 37 n 15分鐘、4"C 35分鐘)，加入LA-Taq ( TAKARA BIO Inc., Tokyo, Japan) 0.5[il,在72"C處理3分鐘。進(jìn)而，加入引物T7 ( IO^iM )和引 物SP6(10jiM)，進(jìn)行94匸30秒、57" 1分鐘、72匸1分鐘10次循 環(huán)的PCR。用限制性內(nèi)切酶Aap I和BamH I消化后，在pBluscript SK 載體上進(jìn)行亞克隆。亞克隆后，將BamHl和BstpI的消化片段與另一 方的cDNA片段(Bstp I -Sac I片段)融合，導(dǎo)入到pBI121的表達(dá)載 體中。
使用農(nóng)桿菌法(Clough, S.J. and Bent, A.F. (1998) Floral dip: A
simpli打ed method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16:725-743.),將由上述制成的各pBI121 表達(dá)載體導(dǎo)入Col-0和cad2-l,制作轉(zhuǎn)化植物。
具體而言，用作為選拔標(biāo)記的含有卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)基(1/2倍 濃度的MS培養(yǎng)基)反復(fù)選拔，從所有種子在裝有卡那霉素的培養(yǎng)基上 能夠生長(zhǎng)的階段(性狀不再分離的后代)開始，通過RT-PCR解析來確 認(rèn)導(dǎo)入基因的表達(dá)量，確認(rèn)轉(zhuǎn)化植物的制作。RT-PCR是如下進(jìn)行的， 即,用RN朋sy Plant Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)從3片4周齡轉(zhuǎn)4匕擬南芥 的熟葉中提取總RNA，用Pro3ter iirst Strand RT—PCR Kit ( Stratagene， La, jolla， CA， USA )進(jìn)行cDNA的制作，然后在premix EX-taq ( TaKaRa， Otsu, Shiga, Japan ) 7.5nl、 FBA1-F引物(1.33nM) 2fil、 FBA1-R引物
(1.33nM) 2jil、 cDNA模板(0.025jig) 2fil、 H20 1.5fil的反應(yīng)液中進(jìn) 行26次循環(huán)(94" 30秒、58"C 60秒、60秒)。作為對(duì)照，使 用可看到構(gòu)成性表達(dá)的Tubulin基因。Tubulin的RT-PCR是如下進(jìn)行 的，使用Tublin-F和Tublin-R的引物對(duì)，反應(yīng)液與上述相同，進(jìn)行22 次循環(huán)(94X: 30秒、58t: 60秒、721C 60秒)。通過1.2%瓊脂糖凝 膠電泳確i人PCR產(chǎn)物，用 Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer
(Agilent Technologies, Hachioji, Japan )進(jìn)行定量。
FBAl—F: 5'-TCTGCTAGCTTGGTTAAGCCTAAC-3'(序列號(hào)15) FBA1—R: 5'-GGCATCGCGCAAGCAATCGACAAA-3'(序列號(hào)16) Tubulin-F: 5'-GTCCAGTGTCTGTGATATTGCAC-3'(序列號(hào)17) Tubulin-R: 5'-GCTTACGAATCCGAGGGTGC—3,(序列號(hào)18)
將電泳結(jié)果示于圖2中。Tubulin是在本生長(zhǎng)條件下可看到構(gòu)成性 表達(dá)的對(duì)照基因。由圖2可知，35S-FBA1 、 35S-fbalC72A 、 35S畫fbalC128A、 35S-fbalC156A和35S國fbalC187A與野生型(Col國0 ) 相比，F(xiàn)BAl mRNA的量增加。同樣地，可確認(rèn)35S-FBA1/ cad2-l與 cad2-l相比，F(xiàn)BAl mRNA的量增加。
應(yīng)說明的是，在本實(shí)施例中使用cDNA構(gòu)建表達(dá)載體，但是本領(lǐng)域 技術(shù)人員容易理解如下內(nèi)容即使從基因組DNA克隆含有內(nèi)含子的 FBA1基因，構(gòu)建表達(dá)載體，導(dǎo)入到植物中也可以獲得轉(zhuǎn)化植物體。
(3 ) FBA1基因的T-DNA插入突變體
從GABI-Kat ( Germany http:〃雨.gabi-kai;.de/db )購入在擬南芥的FBA1 基因中插入有T-DNA的突變體(GK Line ID 049B07)的種子(異種狀 態(tài))。將T-DNA的插入位置示于圖3。如圖3所示，對(duì)T-DNA和FBA1 設(shè)計(jì)下述的特異性引物，通過以基因組DNA為模板的PCR來選拔同種 的突變體。
T-l: 5，—CTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAA-3，(序列號(hào)19)
F-l: 5'-GGGGAATAAAATGGTAAAGAGAAGGAGGC-3'(序列號(hào)20)
F-2: 5'"GCAATAATCAGAGAATCTCACTCT—3'(序列號(hào)21)
具體順序如下。
將上述從GABI-Kat購入的種子播種，切取播種2周后的葉2片， 放入1.5ml的eppentube中用乳缽研磨。裝入lOOjd的DNA提取液 (200mMTris/HClpH7.5， 250mMNaCl， 2.5mM EDTA pH8.0， 0.5% SDS )，充分?jǐn)嚢?。?0080 x g離心10分鐘后，將80jd上清裝入新的 1.5ml的eppentube中，加入60jil的異丙醇后進(jìn)行攪杯。以10080 x g 離心10分斗后，廢棄上清，加入200^1的70%乙醇，充分?jǐn)嚢琛Ｒ?0080 xg離心5分鐘后，廢棄上清，進(jìn)行真空干燥(TOMY Micro Vac) 15 分鐘。用20jd的TE溶解，以10080 xg離心10分鐘后，將上清用于 PCR的模板。PCR反應(yīng)液的組成為25mM MgCl2 2jU、 10xpCR緩沖 液2jd、 10mMdNTP0.5nl、 Sigma Taq DNA聚合酶0.15nl、模板DNA 溶液1.0nl、 1.0fil的引物l、 1.0nl的引物2、 H20 12.35jil，進(jìn)行25次循 環(huán)(94"C 30秒、60秒、72^ 120秒)。引物的組合用F-l與F-2 以及F-1與T-l兩種來進(jìn)行。PCR后，采用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳， 將僅在引物F-l與T-l的組合看到帶的個(gè)體作為同種的FBA1的T-DNA 插入突變體而獲得。應(yīng)說明的是，該FBA1的T-DNA插入突變體以下 記作"049B07"。
(4)炭疽病菌(Colltotricum higginsianum)的接種實(shí)驗(yàn)l
作為供試菌使用以十字花科植物為宿主的炭疽病菌Colltotricum higginsianum。將菌在PDA斜面培養(yǎng)基上于22t:培養(yǎng)10天后，用接種
環(huán)刮取孢子，用滅菌水進(jìn)行懸浮并調(diào)整濃度到1 x I05spore/ml。
對(duì)于每一片4周齡的擬南芥(Col-0， 35S-FBA1/Col-0， cad2-l， 35S-FBAl/cad2-l， 049B07)葉子，在兩處滴加孢子懸浮液lOfil。將瓶 置于托盤中，為了保持充分的濕度而用透明的塑料制覆蓋物蓋上蓋，在 22匸、長(zhǎng)日照的條件下孵育6天。
接種后第6天對(duì)接種了菌的葉子拍照，為了將通過感染而壞死的細(xì) 胞染色，才艮據(jù)Koch and Slusarenko的方'法(Koch, E. and Slusarenko, A. (1990) Arabido psis is susceptible to infection by a downy mildew fiingus- Plant Cell 2' 437-445)進(jìn)行維蟲藍(lán)
染色。即，將接種有菌的葉子沉淀于用乙醇稀釋1/2的LactophenoH:rypane blue溶液(在10ml水中加入10ml乳酸、10ml甘油、10g苯酚、10mg 錐蟲藍(lán))，沸騰3分鐘。然后，用2.5g/ml的水合氯醛(Wako, Tokyo'J叩an)進(jìn)
行洗滌。
結(jié)果示于圖4中。圖4的上部是接種了菌的葉子的照片，下部是接 種了菌的葉子錐蟲藍(lán)染色后的照片。箭頭表示接種部位。由圖4可知， Col-0 (野生型)的接種部位壞死(通過錐蟲藍(lán)染色被染色成深藍(lán)色)， 而在FBA1的轉(zhuǎn)化植物(35S-FBA1/Col-0 )中幾乎沒有看到壞死。另一 方面，對(duì)于在cad2-l中導(dǎo)入了 FBA1的35S-FBAl/cad2-l來說，沒有 導(dǎo)入35S-FBA1的效果，在接種部位看到壞死。
進(jìn)行上述的錐蟲藍(lán)染色后，用光學(xué)顯微鏡計(jì)算孢子數(shù)和有侵入菌絲 的孢子數(shù)。結(jié)果示于圖5中?？芍?，35S-FBA1/Col-0與其他系統(tǒng)相比侵 入菌絲的數(shù)量少。
進(jìn)而，進(jìn)行上述的錐蟲藍(lán)染色后，用光學(xué)顯微鏡(x250)拍攝侵 入菌絲。其圖像示于圖6中?？芍?，35S-FBA1/Col-0與其他系統(tǒng)相比侵 入菌絲短且少。
(5)炭疽病菌(Colltotricum higginsianum)的接種實(shí)驗(yàn)2
用與上述(4)相同的順序，制備炭疽病菌Colltotricum higginsianum的孢子懸浮液(濃度1 x 102spore/ml )。
對(duì)4周齡的擬南芥(Col國O, 35S-FBA1/Col-0, cad2國l， 35S-FBA1/
cad2-l, 049B07)進(jìn)行噴霧接種。將瓶置于托盤中，為了保持充分的濕 度而用透明的塑料制覆蓋物蓋上蓋，在22X:、長(zhǎng)日照條件下孵育24天。
圖7表示接種后第24天各系統(tǒng)的植物體的照片。由圖7可知，在 35S-FBA1/Col-0中，只有開始用噴霧進(jìn)行感染的葉子出現(xiàn)壞死，但是新 的葉子形成而并沒有發(fā)生進(jìn)一步的感染。另一方面確認(rèn)，在其他系統(tǒng)的 植物體中，幾乎全部葉子出現(xiàn)壞死，感染也擴(kuò)展到新形成的葉子。
(6 )西紅神斑葉細(xì)菌(Pseudomo咖syringae pv. tomato strain DC3D00)的接種實(shí)
驗(yàn)
作為植物病原細(xì)菌，使用已知感染于擬南芥的西紅柿斑葉細(xì)菌病菌 (Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000),研究對(duì)于植物病原細(xì)菌的抵抗'性。
從甘油貯存菌(-80匸)劃線到KB瓊脂培養(yǎng)基(示蛋白胨No.3 20g; K2HP041.4g; MgS04 7H20 0.4g;甘油10ml/L )，在28"C培養(yǎng)2天，
用細(xì)胞刮器(Asahi Techno Glass, Funahashi， Chiba， .fapan)刮取菌,用適量的10mM MgCl2溶液進(jìn)行懸浮，將濃度調(diào)整為108cfu/ml。用該懸浮液對(duì)4周齡的 擬南芥(Col國0， 35S-FBA1/Col-0， cad2畫l， 35S-FBA1/cad2畫l， 049B07 ) 進(jìn)行噴霧接種。在22匸、長(zhǎng)日照條件下進(jìn)行孵育。
結(jié)果示于圖8中。由圖8可知，35S-FBA1/Col-0與其他系統(tǒng)相比， 壞死的葉子明顯少。對(duì)于被導(dǎo)入的植物方面(宿主植物)，與導(dǎo)入于Col-0 的情況相比，導(dǎo)入于cad2-l的情況的效果弱，因此可以說導(dǎo)入于谷胱 甘肽合成能力高的系統(tǒng)的植物的情況，其FBA1的導(dǎo)入效果高。
(7)水楊酸處理
對(duì)4周齡的擬南芥(Col-0， 35S-FBA1/Col-0， cad2-l， 35S-FBA1/ cad2-l， 049B07)噴霧處理lmM的水楊酸，為了保持濕度而用透明的 塑料制覆蓋物蓋上蓋。在此，水楊酸是病原菌(特別是細(xì)菌)感染于植 物時(shí)在植物體內(nèi)合成的用于病害抵抗反應(yīng)的信號(hào)物質(zhì)，PR-1是通過水 楊酸的信號(hào)而抑制表達(dá)的抗細(xì)菌性蛋白質(zhì)。
噴霧處理后，在第6小時(shí)、第12小時(shí)、第24小時(shí)從各植物體采取 3片葉，用液氮固定。精制總RNA，統(tǒng)一18SrRNA的量，制作cDNA， 然后制備premix EX國taq ( TaKaRa, Shiga, Japan) 7.5jil、 PR1-F引物(1.33nM) 2jd、 PR1畫R引物(1.33fiM) 2fU、 cDNA模板(0.025fig ) 2^1、 H20 1.5nl的反應(yīng)液，以30次循環(huán)(94"C 30秒、58匸60秒、72"C 60 秒)進(jìn)行RT-PCR。
所用的引物如下所示。
PR1-F: 5'-CAGCCCCAAGACTACTTCAATGC-3'(序列號(hào)22) PR1—R: 5'-GGTCGTTCAATAAGAATGACAGACG—3'(序列號(hào)23)
將PCR產(chǎn)物供于采用1.2%瓊脂糖凝膠的電泳，用Bio-Analyzer (Agilent Technologies, Germany)進(jìn)行定量。結(jié)果示于圖9 (a)和圖 9(b)中。圖9(a)表示電泳的結(jié)果，圖9(b)表示PRl的相對(duì)mRNA 量。由圖9 (a)和圖9(b)可知，35S-FBA1/Col-0與其他系統(tǒng)相比， 即使經(jīng)水楊酸處理24小時(shí)后，仍然高度維持PR-1基因的表達(dá)。對(duì)于被 導(dǎo)入的植物方面(宿主植物)，與導(dǎo)入于Col-0的情況相比，導(dǎo)入于cad2-l 的情況的效果弱，因此可以說導(dǎo)入于谷胱甘肽合成能力高的系統(tǒng)的植物 的情況，其FBA1的導(dǎo)入效果高。
(8)茉莉酮酸處理
對(duì)4周齡的擬南芥(Col-0， 35S國FBA1/Col畫0， cad2畫l， 35S-FBA1/ cad2-l， 049B07)噴霧處理50fiM的水茉莉酮酸，為了保持濕度而用透 明的塑料制覆蓋物蓋上蓋。在此，茉莉酮酸作為病原菌(特別是真菌) 感染于植物或者遭受昆蟲的蟲害時(shí)在植物體內(nèi)合成的用于病蟲害抵抗 反應(yīng)的信號(hào)物質(zhì)是已知的，PDF1.2是通過茉莉酮酸的信號(hào)而抑制表達(dá) 的抗菌蛋白質(zhì)。
噴霧處理后，在第6小時(shí)、第12小時(shí)、第24小時(shí)從各植物體上采 取3片葉，用液氮固定。精制RNA，統(tǒng)一 18SrRNA的量，制作cDNA, 然后制備premix EX-taq ( TaKaRa, Shiga, Japan ) 7.5ji1、 PDF1.2國F引 物(1.33nM) 2fil、 .PDF1.2-R引物(1.33fiM) 2jd、 cDNA模板(0.025fig) 2^1、 H;j0 1.5nl的反應(yīng)液，以27次循環(huán)(94"C 30秒、58"C 60秒、72 n 60秒)進(jìn)行RT-PCR。
用于PDF1.2擴(kuò)增的引物如下所示。
PDF1,2-F: 5'-TAAGTTTGCTTCCATCATCACCC-3'(序列號(hào)24〉 PDFL2-R: 5，—GTGCTGGGAAGACATAGTTGCAT—3'(序列號(hào)25)
與上述(5)相同，將PCR產(chǎn)物供于采用1.2%琮脂糖凝膠的電泳， 用Bio-Analyzer進(jìn)行定量。將結(jié)果示于圖10 ( a )和圖10 ( b )中。圖 10 (a)表示電泳的結(jié)果，圖10 (b)表示PR1的相對(duì)mRNA量。由圖 10 (a)和圖10 (b)可知，35S-FBA1/Col-0與其他系統(tǒng)相比，經(jīng)茉莉 酮酸處理24小時(shí)后的PDF1.2基因表達(dá)高。對(duì)于被導(dǎo)入的植物方面(宿 主植物)，與導(dǎo)入于Col-0的情況相比，導(dǎo)入于cad2-l的情況的效果弱， 因此可以說導(dǎo)入于谷胱甘肽合成能力高的系統(tǒng)的植物的情況，其FBA1 的導(dǎo)入效果高。
(9)植物體的生長(zhǎng)性
9-1轉(zhuǎn)化植物(35S-FBA1/Col-0 )與野生型植物(Col-0 )的比較
導(dǎo)入了 FBA1基因的轉(zhuǎn)化擬南芥(35S-FBA1/Col-0 )與野生型 (Col-0)相比，可觀察到生長(zhǎng)性大幅提高。
圖11是比較6周齡的Col-0和35S-FBA1/Col-0的照片。明顯可知 35S-FBA1/Col-0大。
9 - 2導(dǎo)入有氨基酸取代FBA1的轉(zhuǎn)化植物的生長(zhǎng)性
為了明確FBA1的氨基酸序列(序列號(hào)l)中的半胱氨酸殘基的重 要性，按上述(2)中記載的順序制作表達(dá)各半胱氨酸殘基取代為丙氨 酸的酶的擬南芥(35S-fbalC72A、 35S畫fbalC128A、 35S畫fbalC156A、 35S-fbalC187A)(例如，C72A表示導(dǎo)入了表達(dá)將序列號(hào)1的第72位 的半胱氨酸取代為丙氨酸而得到的FBA1酶的構(gòu)造體)。
圖12是播種后第30天的各植物體的照片。此外，在圖13中示出 比較各植物的蓮座葉的濕重和總蓮座葉數(shù)而得到的圖表。由圖12和圖 13可知，35S-fbalC72A和35S畫fbalC187A與35S-FBA1/Col-0相同， 與野生型(Col-0)相比，生長(zhǎng)性提高。另一方面，35S-fbalC128A和 35S-fbalC156A雖然根據(jù)生長(zhǎng)照度而效果不同，但是顯示與野生型 (Col-0)同等程度的生長(zhǎng)性。由該結(jié)果啟示，對(duì)FBA1功能發(fā)揮重要
作用的半胱氨酸可能是位于序列號(hào)1的第128位和第156位的半胱氨酸。 另一方面，第72位和第187位的半胱氨酸即使取代成其他氨基酸，也 使植物的生長(zhǎng)性提高。因此證實(shí)，即使在FBA1的氨基酸序列中導(dǎo)入編 碼原來的氨基酸被取代成其他氨基酸的突變FBA1的基因，也能夠使植 物的生長(zhǎng)性提高。
此外，由圖13可知，由于生長(zhǎng)性的提高伴隨著蓮座葉的片數(shù)增加， 因此顯示，通過導(dǎo)入FBA1基因，不僅生長(zhǎng)量增加，而且生長(zhǎng)速度也加 快。
9-3 C02固定能力提高的確認(rèn)
為了研究35S-FBA1植物潛在的C02固定能力是否提高，將C02濃 度控制在0.3%，與在大氣C02濃度生長(zhǎng)的情況相比較。結(jié)果示于圖14 和圖15中。如圖14和圖15所示，即4吏在野生型(Col-0)中也可看到 伴隨著C02濃度升高而生長(zhǎng)性提高，但是35S-FBA1植物可看到伴隨著 C02濃度升高而生長(zhǎng)性顯著提高。由該結(jié)果顯示，通過導(dǎo)入FBA1基因
可以顯著提高C02的固定能力。
應(yīng)說明的是，用于實(shí)施發(fā)明的具體實(shí)施方式
中進(jìn)行的具體實(shí)施方式
或?qū)嵤├K究是闡明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容的，不應(yīng)狹義地解釋為僅限于這 樣的具體例，可以在本發(fā)明的根本宗旨和所要求保護(hù)的范圍內(nèi)進(jìn)行各種 變更后實(shí)施。
此外，在本說明書中記載的學(xué)術(shù)文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)都是在本說明書中 作為參考而援引的。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性
本發(fā)明提供生長(zhǎng)性和病蟲害抵抗性同時(shí)得到提高的植物，期待在農(nóng)林 業(yè)中的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1、一種轉(zhuǎn)化植物，其特征在于，導(dǎo)入有編碼谷胱甘肽結(jié)合性質(zhì)體型果糖-1，6-雙磷酸醛縮酶的DNA，生長(zhǎng)性和病蟲害抵抗性提高。
2、 如權(quán)利要求l所述的轉(zhuǎn)化植物，其特征在于，所述編碼谷胱甘 肽結(jié)合性質(zhì)體型果糖-1， 6 -雙磷酸醛縮酶的DNA選自下述(a ) ~ ( d ):(a) 編碼由序列號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的DNA;(b) 編碼由如下氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的DNA,即在序列號(hào)l 所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列；(c) 由序列號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA;(d )與由序列號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格條件下進(jìn)行 雜交的DNA。
3、 一種生長(zhǎng)性和病蟲害抵抗性得到提高的植物的制作方法，其特 征在于，包含將編碼谷胱甘肽結(jié)合性質(zhì)體型果糖-1， 6-雙磷酸醛縮酶 的DNA導(dǎo)入植物的工序。
4、 如權(quán)利要求3所述的生長(zhǎng)性和病蟲害抵抗性得到提高的植物的 制作方法，其特征在于，所述編碼谷胱甘肽結(jié)合性質(zhì)體型果糖-1， 6-雙磷酸醛縮酶的DNA選自下述(a) ~ (d):(a) 編碼由序列號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的DNA;(b) 編碼由如下氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的DNA，即在序列號(hào)l 所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列；(c) 由序列號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA;(d )與由序列號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格條件下進(jìn)行 雜交的DNA。
全文摘要
本發(fā)明提供生長(zhǎng)性和病蟲害抵抗性同時(shí)得到提高的轉(zhuǎn)化植物，以及該轉(zhuǎn)化植物的制作方法。發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入有編碼谷胱甘肽結(jié)合性質(zhì)體型果糖-1，6-雙磷酸醛縮酶的DNA的轉(zhuǎn)化植物與野生型植物相比，生長(zhǎng)性和病蟲害抵抗性同時(shí)提高。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101378652SQ20078000492
公開日2009年3月4日 申請(qǐng)日期2007年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月9日
發(fā)明者小川健一, 松本雅好, 白石友紀(jì) 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu);岡山縣