專利名稱：環(huán)腺苷酸－特異性磷酸二酯酶抑制劑的制作方法
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本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及一系列為有效和選擇性環(huán)腺苷酸特異性磷酸二酯酶(cAMP特異性PDE)抑制劑的化合物。本發(fā)明尤其涉及一系列用于抑制(cAMP特異性PDE)功能，尤其是PDE4功能的新的吲唑化合物以及制備它們的方法、含有它們的藥用組合物和它們作為例如治療炎性疾病和其它涉及細(xì)胞因子和促炎介質(zhì)水平升高的疾病的治療藥的用途。
本發(fā)明背景慢性炎癥為一種多因素并發(fā)癥，其特征為激活多種類型的炎性細(xì)胞，尤其是淋巴系細(xì)胞(包括T淋巴細(xì)胞)和骨髓系細(xì)胞(包括有粒白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞)。包括細(xì)胞因子例如腫瘤壞死因子(TNF)和白介素-1(IL-1)的促炎介質(zhì)由這些激活的細(xì)胞產(chǎn)生。因此，抑制這些細(xì)胞的激活或抑制它們產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子的藥物將用于治療性治療炎性疾病和其它涉及細(xì)胞因子水平升高的疾病。
環(huán)腺苷酸(cAMP)為一種介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)于廣泛的胞外刺激的生物應(yīng)答的第二信使。當(dāng)合適的激動(dòng)劑與特異性細(xì)胞表面受體結(jié)合時(shí)，激活腺苷酸環(huán)化酶，使腺苷三磷酸(ATP)轉(zhuǎn)化為cAMP。理論上在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)cAMP作用的所述激動(dòng)劑主要由cAMP-依賴性蛋白激酶的作用介導(dǎo)。cAMP的細(xì)胞內(nèi)作用由該核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的外部或由環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(PDEs)的酶促裂解作用所中止，PDEs水解3’-磷酸二酯鍵以形成5’-腺苷酸(5’-AMP)。5’-AMP為一種失活的代謝物。以下說明cAMP和5’-AMP的結(jié)構(gòu)。 在人骨髓系細(xì)胞和淋巴系細(xì)胞中cAMP水平的升高與抑制細(xì)胞激活有關(guān)。因此，細(xì)胞內(nèi)PDEs酶家族調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平。PDE4為這些細(xì)胞中的主要的PDE同種型并且主要影響cAMP降解。因此，抑制PDE的功能將防止cAMP轉(zhuǎn)化為失活的代謝物5’-AMP，從而維持較高的cAMP水平，因而抑制細(xì)胞激活(參見Beavo等，“CyclicNucleotide PhosphodiesterasesStructure，Regulation and Drug Action，”Wiley and Sons，Chichester，第3-14頁(1990))；Torphy等，Drug News andPerspectives，6，第203-214頁(1993)；Giembycz等，Clin.Exp.Allergy，22，第337-344頁(1992))。
尤其是，已證明PDE4抑制劑例如咯利普蘭抑制TNFα的產(chǎn)生并且部分抑制單核細(xì)胞釋放IL-1β(參見Semmler等，Int.J.Immunopharmacol.，15，第409-413頁(1993)；Molnar-Kimber等，Mediators of Inflammation，1，第411-417頁(1992))。還證明了PDE4抑制劑抑制由人多形核白細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物自由基(參見Verghese等，J.Mol.Cell.Cardiol.，21(增補(bǔ)2)，S61(1989)；Nielson等，J.AllergyImmunol.，86，第801-808頁(1990))；抑制血管活性胺和前列腺素類由人嗜堿性粒細(xì)胞的釋放(參見Peachell等，J.Immunol.，148，第2503-2510頁(1992))；抑制嗜酸性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)(參見Dent等，J.Pharmacol.，103，第1339-1346頁(1991))；以及抑制人T-淋巴細(xì)胞的激活(參見Robicsek等，Biochem.Pharmacol.，42，第869-877頁(1991))。
炎性細(xì)胞的激活和過量的或非調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子(例如TNFα和IL-1β)的產(chǎn)生與以下變應(yīng)性、自身免疫和炎性疾病有關(guān)如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、與甲狀腺有關(guān)的眼病、貝赫切特病、膿毒病、敗血癥性休克、內(nèi)毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒病、革蘭氏陽性膿毒病、中毒性休克綜合征、哮喘、慢性支氣管炎、成人呼吸窘迫綜合征、慢性肺炎例如慢性阻塞性肺炎、硅肺、肺結(jié)節(jié)病、心肌、腦和肢端再灌注損傷、纖維變性、胰囊性纖維變性、瘢痕疙瘩形成、疤痕形成、動(dòng)脈粥樣硬化、移植排斥反應(yīng)例如移植物抗宿主的反應(yīng)和同種移植排斥反應(yīng)、慢性腎小球性腎炎、紅斑狼瘡、炎性腸疾病例如局限性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎、增生性淋巴細(xì)胞疾病例如白血病以及炎性皮膚疾病例如特應(yīng)性皮炎、牛皮癬和蕁麻疹。
特征在于細(xì)胞因子水平升高的其它疾病包括由于中度的外傷引起的腦損傷(參見Dhillon等，J.Neurotrauma，12，第1035-1043頁(1995)；Suttorp等，J.Clin.Invest.，91，第1421-1428頁(1993))、心肌病例如充血性心力衰竭(參見Bristow等，Circulation，97，第1340-1341頁(1998))、惡病質(zhì)、感染或惡性腫瘤繼發(fā)的惡病質(zhì)、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)繼發(fā)惡病質(zhì)、ARC(AIDS相關(guān)復(fù)癥)繼發(fā)的惡病質(zhì)、由于感染引起的發(fā)燒和肌痛、腦型瘧、骨質(zhì)疏松和骨吸收疾病、瘢痕疙瘩形成、疤痕形成和發(fā)熱。
尤其是，已經(jīng)證實(shí)TNFα對(duì)于人獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)具有作用。AIDS是由于T-淋巴細(xì)胞感染人免疫缺陷病毒(HIV)引起的。盡管HIV也感染并存在于骨髓系細(xì)胞中，已經(jīng)證實(shí)TNF上調(diào)T-淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中的HIV感染(參見Poli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，第782-785頁(1990))。
TNFα的幾種性質(zhì)例如刺激膠原酶、刺激體內(nèi)血管生成、刺激骨吸收和能夠增加腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮的附著的性質(zhì)與TNF對(duì)腫瘤在宿主體內(nèi)形成和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的作用是一致的。最近報(bào)道，TNFα直接參與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移(參見Orosz等，J.Exp.Med.，177，第1391-1398(1993))。
PDE4具有廣泛的組織分布。對(duì)于PDE4具有至少4種基因，來自任一給定基因的PDE4的多種轉(zhuǎn)錄物能夠產(chǎn)生共有相同催化位點(diǎn)的幾種不同的蛋白。在4種可能的催化位點(diǎn)之間氨基酸的同一性大于85％。它們對(duì)抑制劑的同樣敏感性和它們的動(dòng)力學(xué)相似性反映了這個(gè)水平的氨基酸的同一性的功能方面作用。推測(cè)這些可變表達(dá)的PDE4蛋白的作用在于細(xì)胞通過這種作用可以區(qū)別性細(xì)胞內(nèi)定位這些酶和/或通過翻譯后修飾調(diào)節(jié)所述催化效率。表達(dá)PDE4酶的任一給定的細(xì)胞類型通常表達(dá)編碼這些蛋白的4種可能的基因中的至少一種。
研究者已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)使用PDE4抑制劑作為抗炎藥物的極大興趣。早期的證據(jù)顯示抑制PDE4對(duì)于各種炎性細(xì)胞例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、所述Th-1系的T-細(xì)胞和有粒白細(xì)胞具有有益的作用。許多促炎介質(zhì)例如細(xì)胞因子、脂質(zhì)介質(zhì)、超氧化物和生物胺例如組胺的合成和/或釋放通過PDE4抑制劑的作用在這些細(xì)胞中已經(jīng)減弱。PDE4抑制劑也影響其它細(xì)胞功能包括T-細(xì)胞增殖、有粒白細(xì)胞對(duì)于化學(xué)毒性物質(zhì)反應(yīng)的移行和微管結(jié)構(gòu)內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞連接的完整性。
已經(jīng)報(bào)告了各種PDE4抑制劑的設(shè)計(jì)、合成和篩選。甲基黃嘌呤例如咖啡因、茶堿是最初被發(fā)現(xiàn)的PDE抑制劑，但是，這些化合物對(duì)于被抑制的PDE是非特異性的。藥物咯利普蘭(抗抑郁藥)是最初報(bào)道的特異性PDE4抑制劑之一。已經(jīng)報(bào)道，具有以下結(jié)構(gòu)式的咯利普蘭具有對(duì)于抑制重組人PDE4的約200nM(納摩爾)的50％抑制濃度(IC50)。 咯利普蘭研究者一直在繼續(xù)尋找PDE4抑制劑，它們對(duì)于抑制PDE4更有效，它們具有比咯利普蘭更低的IC50值，它們避免了與給予咯利普蘭有關(guān)的不需要中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的副作用例如干嘔、嘔吐和鎮(zhèn)靜作用。在Feldman等的美國專利號(hào)5,665,754中公開了一類化合物。其中所公開的化合物為具有與咯利普蘭結(jié)構(gòu)類似的取代的吡咯烷。一種具有下面結(jié)構(gòu)式的具體的化合物具有對(duì)于人重組PDE4的IC50為約2nM。由于觀察到可有利地將催吐副作用與效果分開，這些化合物沒有顯示降低不需要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用。
此外，有幾家公司正在進(jìn)行其它PDE4抑制劑的臨床試驗(yàn)。然而，涉及效果和不利的副作用例如嘔吐和中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的問題仍未解決。
因此，選擇性抑制PDE4并降低或消除與在先的PDE4抑制劑有關(guān)的不利的中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用的化合物將用于治療變應(yīng)性和炎性疾病以及其它與細(xì)胞因子例如TNF過度或未控制產(chǎn)生有關(guān)的疾病。此外，選擇性PDE4抑制劑將用于治療與在具體靶組織中升高的cAMP水平或PDE4功能有關(guān)的疾病。
本發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于治療其中抑制PDE4活性是非常有益的疾病和病癥的有效和選擇性PDE4抑制劑。本發(fā)明的PDE4抑制劑出人意料地降低或消除與在先的PDE4抑制劑有關(guān)的不利的中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用。
本發(fā)明尤其涉及具有結(jié)構(gòu)式(I)或(II)的吡咯化合物
其中R1選自任選取代的芳基、烷基、環(huán)烷基、雜芳基、烷芳基、芳烷基、雜芳烷基和雜烷芳基；R2為烷基或氫；R3選自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、芳基、雜芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、鹵代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和鹵代烷基；R4和R5獨(dú)立為氫或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳環(huán)或雜環(huán)；和n為0到3。
本發(fā)明也涉及含有一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)式(I)或(II)的化合物的藥用組合物，涉及所述化合物和含有所述化合物的組合物在治療疾病或紊亂中的用途，并涉及制備所述化合物以及與合成結(jié)構(gòu)式(I)和(II)的化合物有關(guān)的中間體的方法。
附圖簡述

圖1為血清中TNFα濃度(pg/ml)對(duì)PDE4抑制劑濃度所繪制的圖。
優(yōu)選的實(shí)施方案詳述本發(fā)明涉及具有結(jié)構(gòu)式(I)或(II)的化合物 其中R1選自任選取代的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷芳基、芳烷基、雜芳烷基和雜烷芳基；R2為烷基或氫；R3選自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、芳基、雜芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、鹵代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和鹵代烷基；R4和R5獨(dú)立為氫或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳環(huán)或雜環(huán)；和n為0到3。
如在此所使用的，術(shù)語“烷基”，單獨(dú)或者結(jié)合，定義為包括直鏈和支鏈、以及橋連的、含1-16個(gè)碳原子的飽和烴基。術(shù)語“低級(jí)烷基”此處定義為具有1-6個(gè)碳原子的烷基(C1-C6)。低級(jí)烷基的實(shí)例包括，但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、異丁基、正丁基、新戊基、正己基等。
術(shù)語“橋連的烷基”此處定義為C6-C16的雙環(huán)或多環(huán)烴基，例如降冰片基、金剛烷基、雙環(huán)[2.2.2]辛基、雙環(huán)[2.2.1]庚基、雙環(huán)[3.2.1]辛基或十氫萘基。
術(shù)語“環(huán)烷基”此處定義為包括環(huán)C3-C7烴基。環(huán)烷基的實(shí)例包括，但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)己基和環(huán)戊基。
術(shù)語“鹵代烷基”此處定義為被一個(gè)或更多個(gè)鹵代取代基例如氟代基、氯代基、溴代基、碘代基或者其組合取代的烷基。類似地，“鹵代環(huán)烷基”定義為具有一個(gè)或更多個(gè)鹵代取代基的環(huán)烷基。
術(shù)語“芳基”，單獨(dú)或結(jié)合，此處定義為單環(huán)或多環(huán)的芳族基團(tuán)，優(yōu)選單環(huán)或雙環(huán)的芳族基團(tuán)，例如苯基或萘基，它們可以為未取代的或者例如被一個(gè)或更多個(gè)，尤其一個(gè)或三個(gè)選自以下的取代基取代鹵代基、烷基、羥基、羥基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、鹵代烷基、硝基、氨基、烷基氨基、?；被⑼榱蚧?、烷基亞磺酰基和烷基磺?；?。實(shí)例性的芳基包括苯基、萘基、四氫萘基、2-氯代苯基、3-氯代苯基、4-氯代苯基、2-甲基苯基、4-甲氧基苯基、3-三氟甲基苯基、4-硝基苯基等。
術(shù)語“雜芳基”此處定義為含有一個(gè)或者兩個(gè)芳族環(huán)并且在芳環(huán)上含有至少一個(gè)氮、氧或硫原子的單環(huán)或雙環(huán)系，該環(huán)系可以為未取代的或者例如被一個(gè)或更多個(gè)，尤其1-3個(gè)如下的取代基取代鹵代基、烷基、羥基、羥基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、鹵代烷基、硝基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、烷硫基、烷基亞磺?；屯榛酋；?。雜芳基的實(shí)例包括噻吩基、呋喃基、吡啶基、噁唑基、喹啉基、異喹啉基、吲哚基、三唑基、異噻唑基、異噁唑基、咪唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基。
術(shù)語“芳基烷基”此處定義為在先定義的烷基，其中所述烷基的氫原子之一被如此處定義的芳基例如任選具有一個(gè)或更多個(gè)取代基例如鹵代基、烷基、烷氧基等的苯基置換。芳基烷基的實(shí)例是芐基。
術(shù)語“烷基芳基”此處定義為在先定義的芳基，其中所述芳基的氫原子之一被烷基、環(huán)烷基、鹵代烷基或鹵代環(huán)烷基置換。
術(shù)語“雜芳基烷基”和“雜烷基芳基”類似如術(shù)語“芳基烷基”和“烷基芳基”所定義，然而，所述芳基被如在先定義的雜芳基置換。
術(shù)語“雜環(huán)基”或“雜環(huán)基環(huán)”定義為具有一個(gè)或更多個(gè)存在于環(huán)中的選自氧、氮和硫原子的雜原子的5-或6-元非芳族環(huán)。非限制性的實(shí)例包括四氫呋喃、哌啶、哌嗪、環(huán)丁砜、嗎啉、四氫吡喃、二氧六環(huán)等?！疤辑h(huán)基環(huán)”具有類似的定義，但所述環(huán)上只含有碳原子。
術(shù)語“鹵素”或“鹵代基”此處定義為包括氟、氯、溴和碘。
術(shù)語“烷氧基”、“芳基氧基”和“芳基烷氧基”分別定義為-OR，其中R為烷基、芳基和芳基烷基。
術(shù)語“烷氧基烷基”定義為連接烷基的烷氧基。術(shù)語“芳基氧基烷基”和“芳基烷氧基烷基”類似地定義為連接烷基的芳基氧基或芳基烷氧基。
術(shù)語“羥基”定義為-OH。
術(shù)語“羥基烷基”定義為連接烷基的羥基。
術(shù)語“氨基”定義為-NH2。
術(shù)語“烷基氨基”定義為-NR2，其中至少一個(gè)R為烷基，第二個(gè)R為烷基或氫。
術(shù)語“?；被倍x為RC(＝O)NH，其中R為烷基或芳基。
術(shù)語“硝基”定義為-NO2。
術(shù)語“烷硫基”定義為-SR，其中R為烷基。
術(shù)語“烷基亞磺?；倍x為R-S(O)2，其中R為烷基。
術(shù)語“烷基磺?；倍x為R-S(O)3，其中R為烷基。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1選自芳基、雜芳基、烷芳基、芳烷基和環(huán)烷基；R2選自氫和低級(jí)烷基。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1為芳基、雜芳基、環(huán)烷基或芳烷基，所述基團(tuán)任選由一個(gè)或多個(gè)以下基團(tuán)取代NR4R5、鹵代基、烷基、C(＝O)烷基、SO2(烷基)、C(＝O)NR4R5、SO3H、NO2、CO2H、C(＝O)O烷基和三氟甲基；R2為氫或C1-2烷基，而R3為氫。R1典型為任選取代的苯基或吡啶基，而R2為氫或乙基。
本發(fā)明包括結(jié)構(gòu)式(I)和(II)化合物的所有可能的立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體，并且不僅包括外消旋化合物而且也包括光學(xué)活性異構(gòu)體。當(dāng)需要結(jié)構(gòu)式(I)和(II)化合物的單一的對(duì)映體時(shí)，通過拆分終產(chǎn)物或者通過由異構(gòu)體純的原料或者使用手性輔助劑(例如參見Z.Ma等，TetrahedronAsymmetry，8(6)，第883-888頁(1997))立體有擇合成可以得到該單一的對(duì)映體。終產(chǎn)物、中間體或者原料的拆分可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法完成。此外，在其中結(jié)構(gòu)式(I)和(II)化合物的互變異構(gòu)體可能存在的情況下，本發(fā)明意欲包括所述化合物的所有互變異構(gòu)形式。如此后所證明的，特定的立體異構(gòu)體顯示抑制PDE4的優(yōu)越的能力，并且不顯示通常與PDE4抑制劑有關(guān)的不利的中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用。
含有酸性基團(tuán)的結(jié)構(gòu)式(I)和(II)化合物可以與合適的陽離子形成藥學(xué)上可接受的鹽。合適的藥學(xué)上可接受的陽離子包括堿金屬(例如鈉或鉀)和堿土金屬(例如鈣或鎂)陽離子。含有堿性中心的結(jié)構(gòu)式(I)和(II)化合物的藥學(xué)上可接受的鹽為與藥學(xué)上可接受的酸形成的酸加成鹽。實(shí)例為鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽或硫酸氫鹽、磷酸鹽或磷酸氫鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、葡糖酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽和對(duì)甲苯磺酸鹽。根據(jù)前文所述，任何本文中提到的本發(fā)明化合物意欲包括結(jié)構(gòu)式(I)和(II)化合物以及其藥學(xué)上可接受的鹽和溶劑合物。
本發(fā)明的化合物可以作為純的化學(xué)品在治療上給藥，但是優(yōu)選作為藥用組合物或制劑給予結(jié)構(gòu)式(I)和(II)化合物。因此，本發(fā)明還提供含有結(jié)構(gòu)式(I)和/或(II)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽以及一種或更多種藥學(xué)上可接受的載體并任選其它治療和/或預(yù)防成分的藥用制劑。所述載體在與所述制劑中的其它成分相容并且不損害其接受者的意義上為“可接受的”。
尤其是，本發(fā)明的選擇性PDE4抑制劑可以單獨(dú)使用或與第二種抗炎治療藥聯(lián)合使用，例如所述第二種抗炎治療藥為用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的靶向TNFα的治療藥如ENBREL或REMICADE。同樣，IL-1的拮抗作用的治療用途在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型中也已經(jīng)得到證明。因此，想象IL-1的拮抗作用與減弱TNFα的PDE4抑制作用結(jié)合將是有效的。
本發(fā)明的PDE4抑制劑用于治療各種變應(yīng)性、自身免疫和炎性疾病。
術(shù)語“治療”包括預(yù)防、降低、阻止或逆轉(zhuǎn)所治療疾病或癥狀嚴(yán)重的進(jìn)程。如此，術(shù)語“治療”包括適當(dāng)?shù)蒯t(yī)學(xué)治療和/或預(yù)防給藥。
炎癥尤其是一種局部、保護(hù)性反應(yīng)，它是由組織的損傷或破壞引起的，它可以破壞、稀釋或隔絕(即隔離)有害物質(zhì)和受損的組織。如此處所用的術(shù)語“炎性疾病”，指任何其中過量或非調(diào)節(jié)性炎性反應(yīng)導(dǎo)致過量的炎性癥狀、宿主組織損傷或喪失組織功能的疾病。此外，如此處所用的術(shù)語“自身免疫疾病”指任何種類的其中組織損傷與對(duì)于身體自身成分的體液或細(xì)胞調(diào)節(jié)反應(yīng)有關(guān)的疾病。如此處所用的術(shù)語“變應(yīng)性疾病”指由變態(tài)反應(yīng)產(chǎn)生的任何癥狀、組織損傷或組織功能喪失。如此處所用的術(shù)語“關(guān)節(jié)疾病”指特征在于各種病因引起的關(guān)節(jié)炎性損傷的一大類疾病。如此處所用的術(shù)語“皮炎”指特征在于各種病因引起的皮膚炎癥的一大類皮膚疾病。如此處所用的術(shù)語“移植排斥”指特征在于移植組織和周圍的組織功能喪失、疼痛、腫脹、白細(xì)胞增多和血小板減少的直接針對(duì)移植組織(包括器官和細(xì)胞(例如骨髓))的任何免疫反應(yīng)。
本發(fā)明也提供調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物體內(nèi)cAMP水平的方法以及治療特征為細(xì)胞因子水平升高的疾病的方法。
如此處所用的術(shù)語“細(xì)胞因子”指任何分泌的多肽，該多肽影響其它細(xì)胞的功能并調(diào)節(jié)所述免疫或炎性反應(yīng)中細(xì)胞之間的相互作用。細(xì)胞因子包括，但不限于單核因子、淋巴因子和趨化因子而不管是那些細(xì)胞產(chǎn)生它們。例如，單核因子通常指由單核細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的因子，然而，許多其它細(xì)胞產(chǎn)生單核因子例如天然殺傷細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腦星形膠質(zhì)細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、表皮角質(zhì)細(xì)胞和B-淋巴細(xì)胞。淋巴因子通常指由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的因子。細(xì)胞因子的實(shí)例包括，但不限于白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNFα)和腫瘤壞死因子β(TNFβ)。
本發(fā)明還提供降低哺乳動(dòng)物體內(nèi)TNF水平的方法，該方法包括給予所述哺乳動(dòng)物有效量的結(jié)構(gòu)式(II)的化合物。如此處所用的術(shù)語“降低TNF水平”指以下情況之一a)通過抑制所有細(xì)胞包括，但不限于單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞體內(nèi)釋放TNF，降低哺乳動(dòng)物體內(nèi)過量的TNF水平到正常水平或者低于正常水平；或b)在翻譯或轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物體內(nèi)過量TNF水平下調(diào)到正常水平或者低于正常水平；或c)通過抑制作為翻譯后事件的直接合成TNF誘導(dǎo)下調(diào)。
此外，本發(fā)明化合物用于抑制炎性細(xì)胞激活。如此處所用的術(shù)語“炎性細(xì)胞激活”指由刺激(包括，但不限于細(xì)胞因子、抗原或自身抗體)誘導(dǎo)的增殖性細(xì)胞反應(yīng)，產(chǎn)生可溶性的介質(zhì)(包括，但不限于細(xì)胞因子、氧自由基、酶、前列腺素類或血管活性胺)或者在炎性細(xì)胞(包括但不限于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、有粒白細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)中，新的或增加數(shù)量的介質(zhì)(包括，但不限于主要組織相容性抗原或細(xì)胞粘著分子)的細(xì)胞表面表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解這些細(xì)胞的這類表型中的一種或其組合的激活可引起炎癥的發(fā)生、延長或惡化。
本發(fā)明化合物也用于引起氣道平滑肌松弛、支氣管擴(kuò)張和防止支氣管收縮。
因此，本發(fā)明化合物用于治療以下疾病例如關(guān)節(jié)疾病(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、與甲狀腺有關(guān)的眼病、貝赫切特病、膿毒病、敗血癥性休克、內(nèi)毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒病、革蘭氏陽性膿毒病、中毒性休克綜合征、哮喘、慢性支氣管炎、變應(yīng)性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、春季結(jié)膜炎、朗格斯細(xì)胞肉芽腫病、成人(急性)呼吸窘迫綜合征(ARDS)、慢性肺炎(例如慢性阻塞性肺炎)、硅肺、肺結(jié)節(jié)病、心肌、腦或肢端再灌注損傷、由于輕度外傷引起的腦或脊柱損傷、包括胰囊性纖維變性的纖維變性、瘢痕疙瘩形成、疤痕形成、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和移植排斥反應(yīng)(例如移植物抗宿主(GvH)的反應(yīng)和同種移植排斥反應(yīng))、慢性腎小球性腎炎、炎性腸疾病例如局限性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎、增生性淋巴細(xì)胞疾病如白血病(例如慢性淋巴細(xì)胞白血??；CLL)(參見Mentz等，Blood 88，第2172-2182(1996))以及炎性皮膚疾病例如特應(yīng)性皮炎、牛皮癬或蕁麻疹。
這類疾病或有關(guān)癥狀的其它實(shí)例包括心肌病例如充血生心力衰竭、發(fā)熱、惡病質(zhì)、感染或惡性腫瘤繼發(fā)的惡病質(zhì)、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)繼發(fā)惡病質(zhì)、ARC(AIDS相關(guān)復(fù)癥)、腦型瘧、骨質(zhì)疏松和骨吸收疾病以及由于感染引起的發(fā)燒和肌痛。此外本發(fā)明化合物用于治療尿崩癥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如抑郁癥和多梗死性癡呆。
本發(fā)明化合物也具有通常稱作治療藥以外的用途。例如，本發(fā)明化合物也可以用作器官移植的保存劑(參見Pinsky等，J.Clin.Invest.，92，第2994-3002頁(1993))。
選擇性PDE4抑制劑也可以用于治療尿崩癥(Kidney Int.，37，第362頁，(1990)；Kidney Int.，35，第494頁，(1989))和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如多梗死性癡呆(Nicholson，Psychopharmacology，101，第147頁(1990))、抑郁癥(Eckman等，Curr.Ther.Res.，43，第291頁(1988))、焦慮癥和應(yīng)激反應(yīng)(Neuropharmacology，38，第1831頁(1991))、腦局部缺血(Eur.J.Pharmacol.，272，第107頁(1995))、遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙(J.Clin.Pharmocol.，16，第304頁(1976))、帕金森氏病(參見Neurology，25，第722頁(1975)；Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.，26，第421頁(1999))和經(jīng)前綜合征。對(duì)于抑郁癥而言，PDE4選擇性抑制劑在各種抑郁癥的動(dòng)物模型例如“行為絕望”或Porsolt試驗(yàn)(Eur.J.Pharmacol.，47，第379頁(1978)；Eur.J.Pharmacol.，57，第431頁(1979)；Antidepressantsneurochemical，behavioral and clinical prospectives，Enna，Malick，andRichelson，eds.，Raven Press，第121頁(1981))和“尾懸浮試驗(yàn)”(Psychopharmacology，85，第367頁(1985))中顯示有效。最新的研究成果顯示通過各種抗抑郁藥長期體內(nèi)治療增加PDE4的腦性表達(dá)(J.Neuroscience，19，第610頁(1999))。因此，選擇性PDE4抑制劑可以單獨(dú)使用或者與第二種治療結(jié)合使用，四種主要的抗抑郁治療為電驚厥方法、單胺氧化酶抑制劑和5-羥色胺或去甲腎上腺素的選擇性重?cái)z取抑制劑。選擇性PDE4抑制劑也可以用于借助直接作用于支氣管平滑肌細(xì)胞來調(diào)節(jié)支氣管擴(kuò)張活性用于治療哮喘。
適用于本發(fā)明中的化合物和藥用組合物包括其中所述活性成分以有效量給予，以便達(dá)到其預(yù)定治療目的的化合物和藥用組合物。更準(zhǔn)確地說，“治療有效量”指有效防止所治療患者已有癥狀發(fā)展或者緩解該癥狀的量。該有效量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)(特別是參照本發(fā)明所公開的細(xì)節(jié))。
“治療有效劑量”指達(dá)到所需的作用的所述化合物的量。這類化合物的毒性和治療效果可以在細(xì)胞培養(yǎng)中或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法確定，例如確定LD50(群體的50％致死的劑量)和ED50(群體的50％治療有效劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比例為治療指數(shù)，它表示為LD50和ED50間的比值。優(yōu)選顯示高的治療指數(shù)的化合物。由這類數(shù)據(jù)得出的資料可以用于計(jì)算用于人的劑量范圍。這類化合物的劑量優(yōu)選在包括幾乎沒有或者沒有毒性的ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。根據(jù)所使用的劑型和所用的給藥途徑，所述劑量可以在該范圍內(nèi)變化。
精確的處方、給藥途徑和劑量可以由每個(gè)醫(yī)生根據(jù)患者的病情來選擇?？梢詡€(gè)別調(diào)整劑量和間隔時(shí)間以便提供足以維持治療效果的活性部分的血藥濃度。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的，此處所述的治療可以延伸到預(yù)防以及治療已確診的疾病或者癥狀。還可以理解，所需用于治療的本發(fā)明的化合物的量根據(jù)所治療疾病的性質(zhì)、患者的年齡和狀況而變化，并且最終由主治醫(yī)生或獸醫(yī)決定。然而，一般來說用于成人治療的常用劑量在每日0.001mg/kg至約100mg/kg。所需劑量可以方便地以單一劑量給予或以合適的間隔時(shí)間，以多劑量給予，例如每日兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)亞劑量給予。在實(shí)踐當(dāng)中，醫(yī)生決定最適合于每個(gè)患者的實(shí)際給藥方案，所述劑量根據(jù)具體患者的年齡、體重和反應(yīng)而改變。以上劑量為平均情況下的實(shí)例，但可能有個(gè)別情況，其中需要較高或較低的劑量，這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的制劑可以以用于治療所指定疾病的標(biāo)準(zhǔn)方式給予，例如口服、非腸道、經(jīng)粘膜(例如舌下或者口含給藥)、局部、經(jīng)皮、直腸、經(jīng)吸入(例如鼻或者肺深部吸入)。非腸道給藥包括，但不限于靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、鞘內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi)。胃腸外給藥也可以使用高壓技術(shù)象POWDERJECTTM完成。
對(duì)于口含給藥而言，所述組合物可以是以常規(guī)方式配制的片劑或者錠劑形式。例如，用于口服給予的片劑和膠囊可以含有常規(guī)的賦形劑例如粘合劑(例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨糖醇、黃蓍膠、淀粉漿或者聚乙烯吡咯烷酮)、填充劑(例如乳糖、蔗糖、微晶纖維素、纖維素、玉米淀粉、磷酸鈣或者山梨糖醇)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石、聚乙二醇或者二氧化硅)、崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或者羥基乙酸淀粉鈉)或者潤濕劑(例如月桂基硫酸鈉)?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域熟知的方法將所述片劑包糖衣。
或者，本發(fā)明的化合物可以摻入口服液體制劑例如水性或者油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿或者酏劑中。而且，含有這些化合物的制劑可以作為用水或者其它合適的溶媒在使用前構(gòu)成的干燥產(chǎn)品提供。這類液體制劑可以含有常規(guī)的添加劑例如懸浮劑，如山梨糖醇糖漿、甲基纖維素、葡萄糖/蔗糖糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠和氫化食用脂肪；乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨糖醇單油酸酯或者阿拉伯膠；非水性溶媒(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分級(jí)椰子油、油性酯、丙二醇和乙醇；和防腐劑，例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或者丙酯和山梨酸。
這類制劑也可以配制為栓劑，例如含有常規(guī)的栓劑基質(zhì)如可可脂或者其它甘油酯。用于吸入的組合物一般可以以溶液、懸浮液或者乳液的形式提供，它們可以以干粉或者以使用常規(guī)拋射劑(例如二氯二氟甲烷或者三氯氟甲烷)的氣溶膠的形式給予。典型的局部和經(jīng)皮制劑含有常規(guī)含水或者非水介質(zhì)，例如為滴眼劑、霜?jiǎng)?、軟膏、洗劑和糊劑或者為加藥的膏藥、貼劑或者膜劑的形式。
此外，本發(fā)明的組合物可以配制用于經(jīng)注射或者連續(xù)輸注非腸道給予。注射劑可以是在油性或者水性溶媒中的懸浮劑、溶液劑或者乳劑形式并且可以含有組方劑例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，所述活性成分可以是在使用前用合適的溶媒(例如無菌、無熱源水)構(gòu)成的粉末形式。
本發(fā)明的組合物也可以配制為儲(chǔ)庫型制劑。這類長效制劑可以植入給予(例如皮下或者經(jīng)粘膜)或者通過肌內(nèi)注射給予。因此，本發(fā)明的化合物可以與合適的聚合物或者疏水性物質(zhì)(例如在可接受的油中的乳劑)、離子交換樹脂一起或者作為微溶的衍生物(例如微溶的鹽)配制。
對(duì)于獸醫(yī)使用而言，式(I)或(II)化合物或其非毒性鹽作為根據(jù)常規(guī)獸醫(yī)實(shí)踐的可合適接受的制劑給予。獸醫(yī)可以容易地確定最適合具體動(dòng)物的給藥方案和給藥途徑。
因此，本發(fā)明另一方面提供含有式(I)或(II)化合物以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或者載體的藥用組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供制備含有式(I)或(II)化合物的藥用組合物的方法，該方法包括將式(I)或(II)化合物與藥學(xué)上可接受的稀釋劑或者載體混合。
以下提供結(jié)構(gòu)式(I)和(II)化合物的具體的、非限制性實(shí)施例，其合成根據(jù)以下給出的方法進(jìn)行。
一般而言，結(jié)構(gòu)式(I)和(II)的化合物可以根據(jù)以下合成方案制備。在下述方案中，本領(lǐng)域內(nèi)可以理解，當(dāng)需要時(shí)，根據(jù)合成化學(xué)的一般原理可以使用保護(hù)基團(tuán)。這些保護(hù)基團(tuán)在合成的最終步驟中可以在堿性、酸性或者本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的氫解條件下除去。通過使用合適地處理和保護(hù)任何化學(xué)官能團(tuán)，未在本文中專門提到的結(jié)構(gòu)式(I)和(II)的化合物的合成可以通過與以下提出的方案類似的方法完成。
除非另外指出，所有的原料均從供應(yīng)商處獲得并且未經(jīng)進(jìn)一步純化而使用。所有反應(yīng)物和層析流分通過薄層層析，在250mm硅膠板上分析，用UV(紫外)光或者I2(碘)染色目測(cè)觀察。用Biotage 40M硅膠(230-400目)進(jìn)行快速柱層析。產(chǎn)物和中間體經(jīng)快速層析或者反相HPLC純化。
按照以下闡述，結(jié)構(gòu)通式(I)的化合物通過下述方法制備，使具有下式的化合物 與金屬鈉反應(yīng)產(chǎn)生一種負(fù)碳離子，然后該負(fù)碳離子與一種具有下式的化合物反應(yīng) 其中Hal為一個(gè)鹵代基、典型的為溴，產(chǎn)生一種具有下式的中間體化合物 然后使該中間體化合物與一種具有式R1NH2的伯胺反應(yīng)，以提供一種結(jié)構(gòu)式(I)的化合物。
結(jié)構(gòu)式(II)化合物通過下述方法制備，使具有下式的化合物 與氯丙酮反應(yīng)產(chǎn)生一種具有下式的中間體化合物。 然后使該中間體化合物與一種具有式R1NH2的伯胺反應(yīng)，以提供一種結(jié)構(gòu)式(II)的化合物。中間體1制備3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯 在氮?dú)庀?，將金屬鈉(60mmol，1.4g)懸浮在80ml(毫升)甲苯中。滴加乙酸乙酯(88mmol(毫摩爾)，11.4g)，并攪拌所產(chǎn)生的混合物直到所有的鈉消耗。然后在冰浴(0-5℃)中冷卻該反應(yīng)混合物并滴加在140ml甲苯中的2-溴苯乙酮(60mmol，12g)。攪拌該反應(yīng)物過夜同時(shí)逐漸地溫?zé)嶂潦覝?。通過GC和TLC分析該反應(yīng)混合物，顯示該反應(yīng)完成。然后用200ml水洗滌該反應(yīng)混合物，然后分離有機(jī)層和水層。用MgSO4(硫酸鎂)干燥該有機(jī)層。在真空下從該有機(jī)層中除去甲苯，以便提供一種黃色的油狀物，用Kugelrohr蒸餾純化該油狀物(在0.35Torr.b.p.135-145℃)。中間體2制備2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯 將碳酸鉀(200mmol，27.6g)加入到苯甲?；宜嵋阴?100mmol，19.2g)和碘化鉀(20mmol，3.3g)的無水丙酮(100ml)溶液中。回流所產(chǎn)生的溶液并滴加氯丙酮(110mmol，10.7g)。通過GC/MS分析該反應(yīng)混合物，表明存在中間體2。從該反應(yīng)混合物中過濾固體物質(zhì)，然后用200ml丙酮洗滌。在真空下濃縮所產(chǎn)生的濾液、在乙醚中再溶解，然后用水(100ml)洗滌3次。使有機(jī)層與水層分離，并用MgSO4干燥。分離固體并在真空下除去有機(jī)溶劑，產(chǎn)生一種黃色/橙色的油狀物。用Kugelrohr蒸餾純化該粗油狀物(在0.65Torr.b.p.175-185℃)。實(shí)施例1制備1-(3-二甲基氨基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 在乙醇(25ml)中混合N，N-二甲基-1，3-苯二胺二鹽酸鹽(5mmol，1.0g)、三乙基胺(10mmol，1.4ml)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)，然后在回流下加熱(12小時(shí))。在真空下除去溶劑，將所產(chǎn)生的油狀物再溶解于二氯甲烷中，然后上硅膠柱。收集該純化的產(chǎn)物，為一種半透明的油狀物。該題述的化合物通過1H-NMR(CDCl3，ppm)鑒別1.28t(3H)、2.35s(3H)、2.77s(6H)、4.2q(2H)、6.3-6.7m(4H)和7.0-7.3m(5H)。實(shí)施例2制備1-(3-氯苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間氯苯胺(5mmol，0.6g)、2-苯甲?；?4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混合，然后在回流下加熱。一俟反應(yīng)完成，使該粗制固體在乙醇中重結(jié)晶，提供題述的產(chǎn)物(m.p.93.2℃-94.6℃)。實(shí)施例3制備1-(3-氯苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間氯苯胺(5mmol，0.6g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混合，然后在回流下加熱。一俟反應(yīng)完成，使該粗制固體在乙醇中重結(jié)晶，得到所需產(chǎn)物(m.p.99.6℃-100.5℃)。實(shí)施例4制備5-甲基-2-苯基-1-間甲苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間甲苯胺(5mmol，0.5g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將所產(chǎn)生的油狀物重新懸浮在二氯甲烷中，然后用水、5％碳酸氫鈉和鹽水洗滌。用Na2SO4(硫酸鈉)干燥有機(jī)層，分離該固體，并在真空下蒸發(fā)溶劑。從乙醇中重結(jié)晶該粗產(chǎn)物，得到題述的產(chǎn)物(m.p.92.5℃-94.0℃)。實(shí)施例5制備2-甲基-5-苯基-1-間甲苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間甲苯胺(5mmol，0.5g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將所產(chǎn)生的油狀物重新懸浮在二氯甲烷中，然后用水、5％碳酸氫鈉和鹽水洗滌。用Na2SO4干燥該有機(jī)層，分離該固體，并在真空下蒸發(fā)溶劑。用乙醇重結(jié)晶該粗產(chǎn)物，得到標(biāo)題產(chǎn)物(m.p.103℃-104.5℃)。實(shí)施例6制備1-(3-溴苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間溴苯胺(5mmol，0.9g)、2-苯甲?；?4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將所產(chǎn)生的油狀物重新懸浮在二氯甲烷中，然后用水、5％碳酸氫鈉和鹽水洗滌。用MgSO4干燥該有機(jī)層，然后分離所述固體并在真空下蒸發(fā)溶劑。用乙醇重結(jié)晶該粗產(chǎn)物，得到標(biāo)題產(chǎn)物(m.p.117.5℃-119.2℃)。實(shí)施例7制備1-(3-乙?；交?-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將3′-氨基-苯乙酮(5mmol，0.7g)、2-苯甲?；?4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。在硅膠上純化殘余的油狀物，得到標(biāo)題產(chǎn)物(m.p.100℃-102℃)。實(shí)施例8制備1-(3-乙?；交?-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將3′-氨基-苯乙酮(5mmol，0.7g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。在硅膠上純化生成的油狀物，得到標(biāo)題產(chǎn)物，為一種固體(m.p.102℃-104℃)。實(shí)施例9制備1-(3-甲磺?；交?-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將3-甲磺?；桨符}酸鹽(5.8mmol，1.2g)、2-苯甲?；?4-氧代-戊酸乙酯(5.8mmol，1.44g)、三乙胺(5.8mmol，0.61g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將所產(chǎn)生的油狀物重新懸浮在氯仿中，然后用水、5％碳酸氫鈉和鹽水洗滌。用Na2SO4干燥該有機(jī)層，分離所述固體，并在真空下蒸發(fā)溶劑。在硅膠上純化粗品物質(zhì)，得到標(biāo)題產(chǎn)物(m.p.131℃-133℃)。實(shí)施例10制備1-(3-甲磺?；交?-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將3-甲磺?；桨?1.4mmol，0.3g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(1.4mmol，0.35g)、三乙胺(1.4mmol，0.14g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將所產(chǎn)生的油狀物重新懸浮在氯仿中，然后用水、5％碳酸氫鈉和鹽水洗滌。用Na2SO4干燥該有機(jī)層，分離所述固體，并在真空下蒸發(fā)溶劑。在硅膠上化該粗品物質(zhì)，得到標(biāo)題產(chǎn)物，為一種油狀物。該化合物的結(jié)構(gòu)用1H-NMR(CDCl3，ppm)驗(yàn)證1.36t(3H)、2.45s(3H)、2.82s(3H)、4.3q(2H)和6.8-7.2m(9H)。實(shí)施例11制備1-(3-氨基甲酰基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
將3-氨基苯甲酰胺(5mmol，1.0g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。從該混合物中過濾所產(chǎn)生的沉淀物，然后用乙醇洗滌。該白色的固體產(chǎn)物無須進(jìn)一步純化而直接使用(m.p.237.8℃-238.8℃)。實(shí)施例12制備1-(3-氨基甲?；交?-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將3-氨基苯甲酰胺(5mmol，1.0g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。從該反應(yīng)混合物中過濾所產(chǎn)生的沉淀物，然后用乙醇洗滌。該棕褐色的固體產(chǎn)物無須進(jìn)一步純化而直接使用(m.p.208.9℃-210.3℃)。實(shí)施例13制備1-(3-二甲基氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
將N，N-二甲基-1，3-苯二胺二鹽酸鹽(5mmol，1.0g)、2-苯甲?；?4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)、三乙胺(10mmol，1.0g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將所產(chǎn)生的油狀物重新懸浮在二氯甲烷中，然后用水、5％碳酸氫鈉和鹽水洗滌。用Na2SO4干燥有機(jī)層，然后分離該固體，并在真空下移去溶劑。在硅膠上純化該粗產(chǎn)物，得到標(biāo)題產(chǎn)物(m.p.111.7℃-114℃)。實(shí)施例14制備1-(3-碘苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間碘苯胺(5mmol，1.1g)、2-苯甲?；?4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將殘留的油狀物重新懸浮在二氯甲烷中，然后用水、5％碳酸氫鈉和鹽水洗滌。分離該固體，并在真空下除去溶劑。使所產(chǎn)生的固體在乙醇中重結(jié)晶。一部分物質(zhì)未溶解，并通過過濾分離。重結(jié)晶和過濾物質(zhì)，得到標(biāo)題產(chǎn)物(m.p.142.6℃-144℃)。實(shí)施例15制備2-甲基-5-苯基-1-(3-磺苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
將間胺酸(5mmol，0.9g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)、氫氧化鈉(5mmol，0.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。在冰上沉淀未反應(yīng)的間胺酸并從反應(yīng)混合物中過濾。蒸發(fā)該濾液，得到一種油，在硅膠上純化該油狀物。放置后，指定的產(chǎn)物固化為紫色結(jié)晶(m.p.94℃-96℃)。實(shí)施例16制備5-甲基-2-苯基-1-(3-磺苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間胺酸(5mmol，0.2g)、2-苯甲?；?4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)、氫氧化鈉(5mmol，0.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。在0℃到5℃用HCl(鹽酸)處理所產(chǎn)生的油狀物，使未反應(yīng)的間胺酸沉淀。在真空下濃縮殘留的物質(zhì)并在硅膠上純化。收集指定的產(chǎn)物，為棕色的結(jié)晶(m.p.91℃-92.5℃)。實(shí)施例17制備1-(3-氟苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
將間氟苯胺(5mmol，0.6g)、2-苯甲?；?4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將所產(chǎn)生的油狀物重新懸浮在氯仿中，然后用水、5％碳酸氫鈉和鹽水洗滌。用Na2SO4干燥有機(jī)層，然后過濾出該固體，并在真空下除去溶劑。在乙醇中重結(jié)晶指定的產(chǎn)物。(m.p.100℃-101℃)。實(shí)施例18制備1-(3-氟苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間氟苯胺(5mmol，0.6g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將所產(chǎn)生的固體重新懸浮在氯仿中，然后用水、5％碳酸氫鈉和鹽水洗滌。用Na2SO4干燥有機(jī)層，然后分離該固體，并在真空下除去溶劑。在乙醇中重結(jié)晶指定的產(chǎn)物(m.p.96.3℃-98.0℃)。實(shí)施例19制備2-甲基-5-苯基-1-吡啶-3-基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
將3-氨基吡啶(5mmol，0.5g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將所產(chǎn)生的油狀物重新懸浮在乙醚中，然后用水和鹽水洗滌。用MgSO4干燥有機(jī)層，然后分離該固體并在真空下除去溶劑。在硅膠上純化該指定的產(chǎn)物并用1H-NMR(CDCl3，ppm)分析1.35t(3H)、2.40s(3H)、4.3q(2H)、6.78s(1H)、7.03-7.39m(7H)、8.4sd(1H)和約8.6dd(1H)。實(shí)施例20制備1-環(huán)己基-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將環(huán)己基胺(5mmol，0.5g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將所產(chǎn)生的殘余物重新懸浮在乙醚中，然后用水和鹽水洗滌。用MgSO4干燥有機(jī)層，然后分離該固體并在真空下除去溶劑。純化該油狀物得到標(biāo)題產(chǎn)物，1H-NMR(CDCl3，ppm)1.0bm(2H)、1.23t(3H)、1.6-1.7bm(8H)、2.66s(3H)、4.16q(2H)、6.39s(1H)、和7.25bm(5H).實(shí)施例21制備5-甲基-1，2-二苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將苯胺(10mmol，0.9g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(10mmol，2.5g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。從乙醇中重結(jié)晶指定的產(chǎn)物(m.p.130℃-131.7℃)。實(shí)施例22制備2-甲基-1-(3-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間硝基苯胺(10mmol，1.4g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(10mmol，2.5g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。從乙醇中重結(jié)晶指定的產(chǎn)物(m.p.143℃-145℃)。實(shí)施例23制備5-甲基-1-(5-硝基吡啶-2-基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將5-硝基-2-氨基吡啶(5mmol，0.7g)、2-苯甲?；?4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。用氯仿研磨所產(chǎn)生的固體，并從該反應(yīng)混合物中過濾出不溶物。在硅膠上純化該濾液，得到標(biāo)題產(chǎn)物(m.p.146.6℃-148.6℃)。實(shí)施例24制備1-(3-羧基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將3-氨基苯甲酸(10mmol，1.4g)、2-苯甲?；?4-氧代-戊酸乙酯(10mmol，2.5g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將所產(chǎn)生的油狀物重新懸浮在氯仿-乙醚中，然后從該反應(yīng)產(chǎn)物中過濾出不溶物。在硅膠上純化該可溶物，得到標(biāo)題產(chǎn)物(m.p.161.0℃-162.7℃)。實(shí)施例25制備1-(3-甲氧基羧基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將3-氨基苯甲酸甲酯(10mmol，1.4g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(10mmol，2.5g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。在硅膠上純化該指定的產(chǎn)物并放置結(jié)晶，1H-NMR(CDCl3，ppm)1.15t(3H)、2.08s(3H)、3.88s(3H)、4.05q(2H)、6.56s(1H)、7.15-7.33bm(7H)、7.79-7.97bm(2H)。實(shí)施例26制備1-(3-溴苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間溴苯胺(5mmol，0.9g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。從乙醇中重結(jié)晶指定的產(chǎn)物(m.p.111℃-112.7℃)。實(shí)施例27制備1-(3-碘苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間碘苯胺(5mmol，1.1g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。從乙醇中重結(jié)晶指定的產(chǎn)物(m.p.111℃-112.9℃)。實(shí)施例28制備2-甲基-5-苯基-1-(3-三氟甲基苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間三氟甲基苯胺(5mmol，0.8g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將該粗制物重新懸浮在氯仿中并用水和鹽水先后洗滌。用Na2SO4干燥該有機(jī)層。分離該固體并在真空下除去溶劑。在硅膠上純化所產(chǎn)生的油狀物，得到標(biāo)題產(chǎn)物，1H-NMR(CDCl3，ppm)1.37t(3H)、2.42s(3H)、4.32q(2H)、6.80s(1H)、7.0-7.6bm(9H)。實(shí)施例29制備5-甲基-2-苯基-1-(3-三氟甲基苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間三氟甲基苯胺(5mmol，0.8g)、2-苯甲?；?4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將該粗制物重新懸浮在氯仿中，用水和鹽水先后洗滌。用Na2SO4干燥該有機(jī)層。分離該固體并在真空下除去溶劑。在硅膠上純化所產(chǎn)生的油狀物，得到標(biāo)題產(chǎn)物，1H-NMR(CDCl3，ppm)1.01t(3H)、1.98b(3H)、4.00q(2H)、6.48s(1H)、7.00-7.33bm(9H)。實(shí)施例30制備2-甲基-1-(3-硝基芐基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間硝基芐基胺鹽酸鹽(3g)懸浮在飽和碳酸氫鈉水溶液(30ml)中，然后用氯仿提取。用MgSO4干燥該有機(jī)層，然后分離該固體并在真空下移去溶劑，得到該游離堿。將如上制備的間硝基芐基胺(5mmol，0.8g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosicacid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將該殘余物重新懸浮在乙醚中并從該混合物中過濾芐胺tosic acid鹽。在真空下濃縮該濾液并在硅膠上純化所產(chǎn)生的油狀物，得到標(biāo)題產(chǎn)物，1H-NMR(CDCl3，ppm)1.24t(3H)、2.36s(3H)、4.07-4.30q(2H)、5.11s(2H)、6.58s(1H)、6.98-7.44bm(7H)、7.69bs(1H)、7.97bd(1H).實(shí)施例31制備5-甲基-1-(3-硝基芐基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將間硝基芐基胺鹽酸鹽(3g)懸浮在飽和碳酸氫鈉水溶液(30ml)中，然后用氯仿提取。用MgSO4干燥該有機(jī)層，然后分離該固體并在真空下移去溶劑，得到游離堿。將如上制備的間硝基芐基胺(5mmol，0.8g)、2-苯甲?；?4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid在乙醇中混和，然后在回流下加熱。在硅膠上純化所產(chǎn)生的殘余物，得到標(biāo)題產(chǎn)物，1H-NMR(CDCl3，ppm)1.10t(3H)、3.16s(3H)、4.08q(2H)、5.04s(2H)、6.55s(1H)、7.07-7.53bm(7H)、7.72bs(1H)、8.04bd(1H).實(shí)施例32制備5-甲基-2-苯基-1-吡啶-3-基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將3-氨基吡啶(5mmol，0.5g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。將所產(chǎn)生的油狀物在硅膠上純化，但還含有污染物。在己烷中研磨該物質(zhì)，通過過濾分離該固體。用苯洗滌該固體兩次，得到標(biāo)題產(chǎn)物(m.p.102℃-103℃)。實(shí)施例33制備2-甲基-1-(4-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將對(duì)硝基苯胺(5mmol，0.7g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.25g)和tosic acid在乙醇中混和，然后在回流下加熱。在冰(0-5℃)上冷卻該反應(yīng)混合物，從反應(yīng)化合物中過濾沉淀物。1H-NMR分析證實(shí)該沉淀物為指定的產(chǎn)物，(CDCl3，ppm)1.38t(3H)、2.45s(3H)、4.20q(2H)、6.80s(1H)、6.97-7.35bm(7H)、8.25d(2H)。實(shí)施例34制備2-甲基-1-(2-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將鄰硝基苯胺(15mmol，2.1g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(15mmol，3.7g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。在三根硅膠柱上純化所產(chǎn)生的油狀物，得到標(biāo)題產(chǎn)物。1H-NMR(CDCl3，ppm)1.36t(3H)、2.36s(3H)、4.31q(2H)、6.80s(1H)、7.03-7.66bm(6H)、7.68dt(2H)、7.97dd(1H)。實(shí)施例35制備2-甲基-1-(5-硝基吡啶-2-基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將5-硝基-吡啶-2-基胺(5mmol，0.7g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。用氯仿研磨所產(chǎn)生的固體，在硅膠上進(jìn)一步純化該濾液，得到標(biāo)題產(chǎn)物。1H-NMR(CDCl3，ppm)1.35t(3H)、2.54s(3H)、4.30q(2H)、6.78s(1H)、6.96-7.25bm(6H)、8.33dd(1H)、9.39sd(1H)。實(shí)施例36制備5-甲基-1-(4-硝基苯基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將對(duì)-硝基苯胺(10mmol，1.4g)、2-苯甲?；?4-氧代-戊酸乙酯(10mmol，2.5g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加熱。過濾該反應(yīng)混合物并用乙醇洗滌該固體。測(cè)定該收集的固體為所指定的產(chǎn)物(m.p.190℃-192℃)。實(shí)施例37制備1-(4-氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將實(shí)施例36的5-甲基-1-(4-硝基苯基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(4mmol，1.5g)溶解于乙醇中并用5％pd/C(0.15g)處理。在45psi下用H2(g)氫化該混合物。一俟反應(yīng)完成，通過硅藻土過濾該混合物，并在真空下除去溶劑。分析產(chǎn)生的固體，顯示其為指定產(chǎn)物(m.p.181℃-183℃)。實(shí)施例38制備1-(4-氨基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將實(shí)施例33的2-甲基-1-(4-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(2mmol，0.8g)溶解于50％乙酸乙酯的乙醇溶液中并用pd/C(0.088g)處理。在45psi下用H2(g)氫化該混合物。一俟反應(yīng)完成，通過硅藻土過濾該混合物，并在真空下移去溶劑。在硅膠上純化該物質(zhì)，得到標(biāo)題產(chǎn)物。實(shí)施例39制備1-(3-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 從Maybridge Chemical Co.，Ltd.，Cornwall，UK購得指定的產(chǎn)物，無須進(jìn)一步純化而使用。實(shí)施例40制備1-(3-氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 將實(shí)施例39的化合物(0.86mmol，0.3g)溶解于甲醇中并用氯化鎳(NiCl2)和氫硼化鈉(NaBH4)(17.2mmol)處理。除去甲醇，然后將該反應(yīng)混合物重新懸浮在水中，接著用乙酸乙酯提取。用MgSO4干燥該反應(yīng)混合物、過濾并濃縮。在硅膠上純化指定的產(chǎn)物。1H-NMR(CDCl3，ppm)1.37t(3H)、2.41s(3H)、3.73s(2H)、4.31q(2H)、6.43s(1H)、6.54d(1H)、6.67dd(1H)、6.78s(1H)、7.11-7.18m(5H)。實(shí)施例41制備1-(3-氨基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 采用實(shí)施例40闡述的步驟，將實(shí)施例22的化合物(0.86mmol，0.3g)溶解于甲醇中并用NiCl2和NaBH4(17.2mmol)處理。在硅膠上純化指定的產(chǎn)物(m.p.142℃-143℃)。實(shí)施例42制備1-(2，3-二氯苯其)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 從Maybrige Chemical Co.，Ltd.，購得指定的產(chǎn)物，無須進(jìn)一步純化而使用。實(shí)施例43制備5-甲基-1-(3-硝基苯基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸 將實(shí)施例39的化合物(0.29mmol，0.1g)溶解于50％二噁烷和水中，然后用氫氧化鋰(LiOH，0.87mmol，0.0363g)處理并加熱到至少50℃。除去溶劑并用乙酸乙酯提取所述堿。酸化該水層到pH＜2并用乙酸乙酯提取。用MgSO4干燥該有機(jī)層，過濾該固體并在真空下除去溶劑。無須一步純化而使用該指定的產(chǎn)物。1H-NMR(CDCl3，ppm)2.48s(3H)、6.88s(1H)、7.03dd(2H)、7.18m(3H)、7.47dd(1H)、7.6t(1H)、8.08st(1H)、8.27dd(1H)。實(shí)施例44制備5-甲基-1，2-二苯基-1H-吡咯-3-羧酸 用與實(shí)施例43所述相同的方法水解實(shí)施例21的化合物(0.33mmol，0.1g)，得到指定產(chǎn)物，1H-NMR(CDCl3，ppm)2.44s(3H)、6.87s(1H)、7.06m(2H)、7.15m(5H)、7.40m(3H)。實(shí)施例451-(3，5-雙三氟甲基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 從Maybridge Chemical Co.，Ltd.，購得指定的產(chǎn)物，無須進(jìn)一步純化而使用。實(shí)施例46制備1-(3-乙氧基羰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 除了用3-氨基苯甲酸乙酯作為原料外，用與實(shí)施例25化合物相同的方法形成所述化合物。該指定產(chǎn)物具有108℃-l10℃的熔點(diǎn)。
測(cè)試了結(jié)構(gòu)式式(I)和(II)化合物抑制PDE4的能力。一種化合物抑制PDE4活性的能力與該化合物的IC50值即抑制50％的酶活性所需抑制劑的濃度有關(guān)。使用重組人PDE4測(cè)定結(jié)構(gòu)式式(I)和(II)化合物的IC50值。
本發(fā)明化合物一般顯示抑制重組人PDE4的IC50值為低于約100μM，優(yōu)選低于約50μM，更優(yōu)選低于約約25μM。本發(fā)明化合物一般顯示抑制重組人PDE4的IC50值為低于約10μM，優(yōu)選低于約1μM。為充分體現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的PDE4抑制劑具有的IC50值為約0.005μM-約25μM。
由一般使用在0.1pM-500μM范圍內(nèi)的濃度的濃度-反應(yīng)曲線，確定所述化合物的IC50值。使用如Loughney等，J.Biol.Chem.，271，第796-806頁(1996)中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法的針對(duì)其它PDE酶的試驗(yàn)也表明本發(fā)明的化合物對(duì)于cAMP特異性PDE4酶具有高度選擇性。
具體地說，本發(fā)明的一種化合物，即實(shí)施例22，對(duì)人重組PDE4B具有0.15μM的IC50值，對(duì)PDE1A具有35.5μM的IC50值，對(duì)PDE1B具有21.0μM的IC50值，對(duì)PDE1C具有21.8μM的IC50值，對(duì)PDE2具有4.5μM的IC50值，對(duì)PDE3A具有89μM的IC50值，對(duì)PDE5具有12.5μM的IC50值，而對(duì)PDE7具有10.6μM的IC50值。這闡明了本發(fā)明化合物對(duì)于抑制PDE4的選擇性。
也測(cè)試了結(jié)構(gòu)式(I)或(II)化合物在人外周血液淋巴細(xì)胞中減少TNFα分泌的能力。減少TNFα分泌的能力與EC50值有關(guān)(即能夠抑制50％的總TNFα的該化合物的有效濃度)。
本發(fā)明化合物一般顯示低于約100μM的EC50值，優(yōu)選低于約50μM，更優(yōu)選低于約15μM。本發(fā)明的化合物優(yōu)選顯示低于約10μM的PBL/TNFαEC50值，而經(jīng)常低于約7μM。為了充分體現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)，一種本發(fā)明的PDE4抑制劑具有大約1μM到20μM的EC50值。
人重組PDEs的制備和IC50與EC50的測(cè)定可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法完成。例證性方法描述如下人P人PDEs的表達(dá)在桿狀病毒感染的草地貪夜蛾(Spodoptera fugiperda)(Sf9)細(xì)胞中的表達(dá)使用pBlueBacIII(Invitrogen)或者pFastBac(BRL-Gibco)構(gòu)建桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。通過跨越所述載體接點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序并且通過對(duì)由PCR產(chǎn)生的所有區(qū)進(jìn)行完全測(cè)序，證實(shí)所有質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒pBB-PDE1A3/6在pBlueBacIII中含有PDE1A3的完整的可讀框(Loughney等，J.Biol.Chem.，271，第796-806頁(1996))。質(zhì)粒Hcam3aBB在pBlueBacIII中含有PDE1C3的完整的可讀框(Loughney等(1996))。質(zhì)粒pBB-PDE3A在pBlueBacIII中含有PDE3A的完整的可讀框(Meacci等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89，第3721-3725頁(1992))。
根據(jù)制造商的方案，使用MaxBac系統(tǒng)(Invitrogen)或者FastBac系統(tǒng)(Gibco-BRL)產(chǎn)生重組病毒原液。在這兩種情況下，在所得到的病毒中重組人PDEs的表達(dá)由病毒多角體啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。當(dāng)使用MaxBac系統(tǒng)時(shí)，為了確保在制劑中不污染有野生型(occ+)病毒，將病毒噬斑純化兩次。如下進(jìn)行蛋白表達(dá)。使Sf9細(xì)胞于27℃下在補(bǔ)充如下成分的Grace’s昆蟲培養(yǎng)基(Gibco-BRL)中生長10％胎牛血清、0.33％TCyeastolate、0.33％水解乳白蛋白、4.2mM的碳酸氫鈉、10μg/ml慶大霉素、100單位/ml的青霉素和100μg/ml鏈霉素。以每個(gè)細(xì)胞大約2-3病毒顆粒的感染復(fù)數(shù)感染指數(shù)生長的細(xì)胞并且孵育48小時(shí)。通過離心收集所述細(xì)胞，用未經(jīng)補(bǔ)充的Grace’s培養(yǎng)基洗滌并且快速冷凍保存。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(酵母)中的表達(dá)人PDE1B、PDE2、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE5和PDE7的重組產(chǎn)生類似于美國專利第5,702,936號(hào)(在此結(jié)合到本發(fā)明中作為參考)的實(shí)施例7中所述進(jìn)行，除了使用酵母轉(zhuǎn)化載體，該酵母轉(zhuǎn)化載體衍生自Price等Methods in Enzymology，185，第308-318頁(1990)介紹的基本ADH2質(zhì)粒，該質(zhì)粒中加入酵母ADH2啟動(dòng)子和終止子序列，所述釀酒酵母宿主為蛋白酶缺陷性菌株BJ2-54，BJ2-54于1998年8月31日保藏在美國典型培養(yǎng)物中心(Manassas，Virginia)，保藏號(hào)為ATCC74465。使轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞在2X SC-leu培養(yǎng)基(pH6.2，含有微量金屬和維生素)中生長。24小時(shí)后，加入含有甘油的YEP培養(yǎng)基到終濃度為2x YET/3％甘油。大約24小時(shí)后，收獲細(xì)胞，洗滌并且于-70℃下保存。鈣調(diào)蛋白純化基本按照Dedman等，Methods.in Enzymology，102，1-8頁(1983)所述，采用Pharmacia Phenyl-Sepharose方法從牛睪丸中純化用于激活PDE1酶的鈣調(diào)蛋白。鈣調(diào)蛋白在瓊脂糖上的固定按照生產(chǎn)商的使用說明書將鈣調(diào)蛋白固定在BioRad AffiGel15上。人磷酸二酯酶制劑磷酸二酯酶活性的測(cè)定如下測(cè)定所述制劑的磷酸二酯酶活性。利用活性炭分離技術(shù)的PDE測(cè)試基本如Loughney等(1996)所述進(jìn)行。在該測(cè)試中，按照存在的PDE活性的量的比例，PDE活性將[32P]cAMP或者[32P]cGMP轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的[32P]5’-AMP或者[32P]5’GMP。然后，[32P]5’-AMP或者[32P]5’-GMP通過蛇毒5’-核苷酸酶的作用被定量地轉(zhuǎn)化為游離的[32P]磷酸和未標(biāo)記的腺苷或者鳥苷。因此，釋放的[32P]磷酸的量與酶活性成正比。該測(cè)試于30℃下，在含有(終濃度)40mM Tris HCl(pH8.0)、1μM硫酸鋅、5mM氯化鎂和0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的100μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行?；蛘撸谠u(píng)估PDE1-比活性的測(cè)試中，孵育混合物還包括使用0.1mM氯化鈣和10μg/ml鈣調(diào)蛋白。PDE酶以產(chǎn)生＜30％總的底物水解的量存在(線性測(cè)試條件)。通過加入底物(1mM[32P]cAMP或者cGMP)引發(fā)所述測(cè)試，將該混合物孵育12分鐘。然后，加入75μg大響尾蛇(Crotalus atrox)毒素，繼續(xù)孵育3分鐘(總共15分鐘)。通過加入200μl活性炭(在每毫升0.1M磷酸二氫鈉的懸浮液(pH4)中25毫克)終止反應(yīng)。離心(750Xg3分鐘)沉淀所述活性炭后，取出上清液樣品用于在閃爍計(jì)數(shù)器中的放射活性的測(cè)定并且計(jì)算PDE活性。
類似于Loughney等，J.Biol.Chem.，271，第796-806頁(1996)所述的方法進(jìn)行抑制劑的分析，只是同時(shí)使用cGMP和cAMP，底物濃度保持在低于32nM，該值遠(yuǎn)低于所測(cè)試PDE5的Km。從SF9細(xì)胞中純化PDE1A3在室溫下將細(xì)胞沉淀(5g)與10ml裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.5、2mM二硫蘇糖醇(DTT)、2mM芐脒鹽酸鹽、5μM硫酸鋅、0.1mM氯化鈣、20μg/ml鈣蛋白酶抑制劑I和II和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)混合。通過一個(gè)French壓碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments，Inc.，Rochester NY)使所述細(xì)胞溶解。在一個(gè)采用T180型轉(zhuǎn)子的Beckman超高速離心機(jī)中以45,000rpm離心產(chǎn)生的溶胞產(chǎn)物1小時(shí)?；厥丈锨逡翰⑼ㄟ^一個(gè)0.2μm濾器過濾。將該濾液上樣到一根在柱緩沖液A(含有100mM NaCl和2mM MgCl2的裂解緩沖液)中平衡后的2.6×90cm的SEPHACRYLS-300柱上。調(diào)節(jié)該柱流速到1ml/分鐘并收集7ml的流分。合并活性流分并用0.16mg的鈣調(diào)蛋白補(bǔ)充。按照Hansen等，Methods in Enzymology 159，453-557頁(1988)所述，以0.2ml/min的流速將所述酶上樣到一根ACC-1瓊脂糖免疫親和力柱上過夜。用5個(gè)體積的柱緩沖液B(沒有NaCl的柱緩沖液A)，隨后用5個(gè)體積的柱緩沖液C(含有250mM NaCl的柱緩沖液A)洗滌該柱。通過采用一個(gè)柱體積的柱緩沖液D(50mMMOPS pH7.5，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，1mM芐脒HCl，100mM NaCl，20μg/ml鈣蛋白酶抑制劑I和II，和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)，以0.1ml/min洗脫該柱，停止流動(dòng)1小時(shí)，然后以同樣的流速繼續(xù)洗脫。收集0.5ml的流分。合并呈現(xiàn)活性的流分，首先針對(duì)含有25mM MOPS pH7.5、100mM NaCl、10μM ZnSO4、1mM CaCl2、1mM DTT、1mM芐脒HCl的透析緩沖液透析。隨后針對(duì)含有50％甘油的透析緩沖液進(jìn)行透析，然后用干冰迅速冷凍該樣品并于-70℃下保存。所產(chǎn)生的制品純度大約為10到15％(經(jīng)SDS-PAGE)。這些制品具有每毫克蛋白每分鐘水解大約5到20μmol cAMP的比活性。從釀酒酵母(S.cerevisiae)中純化PDE1B在室溫下通過與100ml玻璃珠(0.5mM酸洗滌的)和200ml緩沖液A混合解凍酵母細(xì)胞(50g)。緩沖液A由50mM MOPS pH7.5、1mMDTT、2mM芐脒HCl、0.01mM ZnSO4、5mM MgCl2、20μg/ml鈣蛋白酶抑制劑I和II，和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽組成。將該混合物冷卻到4℃，轉(zhuǎn)移到一個(gè)Bead-Beater中并通過迅速混合6個(gè)周期使細(xì)胞溶解，每周期30秒。在一個(gè)采用JA-10轉(zhuǎn)子的Beckman J2-21M離心機(jī)中以9,000rpm在4℃離心該勻漿15分鐘。回收該上清液并在一個(gè)采用T145轉(zhuǎn)子的Beckman XL-80超高速離心機(jī)中于4℃以36,000rpm離心45分鐘。回收上清液并通過加入固體硫酸銨(0.33g/ml上清液)使PDE1B沉淀，同時(shí)在一個(gè)冰浴中攪拌并維持pH在7.0和7.5之間。然后用一個(gè)JA-10轉(zhuǎn)子的Beckman J2離心機(jī)中以9,000rpm(12,000Xg)離心該混合物22分鐘。棄去該上清液并將該沉淀溶解于100ml緩沖液B(50mM MOPS pH7.5、1mM DTT、1mM芐脒HCl、0.01mM ZnSO4、2mM MgCl2、2mM CaCl2，和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)中。將其分別校正pH和電導(dǎo)率為7.5和15-20毫西門子(mS)。將該溶液上樣到一根20ml的調(diào)鈣蛋白-瓊脂糖柱上，所述柱已經(jīng)用10個(gè)柱體積的緩沖液B以1ml/min的速率平衡。將流過的溶液(flow-through)反復(fù)上樣到所述柱上至少5次。用5個(gè)體積的緩沖液B、5個(gè)體積含250mM NaCl的緩沖液B洗滌所述柱，并再用2個(gè)體積的不含NaCl的緩沖液B洗滌。以0.33ml/min的速率用一個(gè)體積的緩沖液C(50mM MOPS pH7.5、1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，1mM芐脒HCl)完成洗脫，然后在繼續(xù)洗脫前停止流動(dòng)1小時(shí)。收集大約4ml的流分并測(cè)試PDE活性。合并活性流分并濃縮到5ml體積，用一個(gè)Amicon超濾系統(tǒng)。將該濃縮物上樣到一根320ml SephacrylS-300柱(1.6×150cm)上，所述柱已經(jīng)用至少2個(gè)體積的緩沖液D(25mM MOPS pH7.5，1mM DTT，1mM芐脒HCl，0.01mM ZnSO4，2mM CaCl2和100mM NaCl)平衡。以1ml/min的速率(11cm/小時(shí))洗柱，收集5ml的流分。合并活性峰并對(duì)含又50％甘油的緩沖液D透析過夜。在干冰上冷凍純化的酶并于-70℃下保存。該產(chǎn)生的制品具有大約＞90％的純度(經(jīng)SDS-PAGE)。這些制品具有每毫克蛋白每分鐘水解大約10到30μmol cGMP的比活性。從SF9細(xì)胞中純化PDE1C3在冰上用20ml裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.4、10μM硫酸鋅、0.1mM氯化鈣、1mM DTT、2mM芐脒鹽酸鹽和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)將細(xì)胞沉淀(5g)解凍。通過一個(gè)French壓碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments)使所述細(xì)胞溶解，同時(shí)維持溫度在10℃以下。于4℃，在一個(gè)采用TI45型轉(zhuǎn)子的Beckman超高速離心機(jī)中以36,000rpm離心產(chǎn)生的細(xì)胞勻漿45分鐘。棄去上清液并使用一個(gè)帶有小管的VibraCell調(diào)諧器，通過超聲3×30秒用40ml增溶緩沖液(含有1M NaCl、0.1M MgCl2、1mM CaCl2、20μg/ml鈣調(diào)蛋白和1％Sulfobetaine SB12(Z3-12)的裂解緩沖液)將產(chǎn)生的沉淀重新懸浮。為了冷卻，在碎冰/鹽混合物中進(jìn)行該過程。在超聲后，在4℃緩慢地混合該混合物30分鐘使膜結(jié)合蛋白完全溶解。在一個(gè)采用TI45型轉(zhuǎn)子的Beckman超高速離心機(jī)中以36,000rpm離心該混合物45分鐘。用含有10μg/ml鈣蛋白酶抑制劑I和II的裂解緩沖液稀釋該上清液。在一個(gè)Beckman JA-10轉(zhuǎn)子中以9,000rpm離心該沉淀的蛋白質(zhì)20分鐘。然后將該回收的上清液經(jīng)Mimetic BlueAP瓊脂糖色譜層析。
為了通過(run)Mimetic BlueAP瓊脂糖柱，首先用10個(gè)床體積的1％聚乙烯吡咯酮(即40000的MW)阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)保護(hù)(shielded)該樹脂。通過用10個(gè)床體積的2M NaCl和10mM pH34的檸檬酸鈉洗滌移去松散地結(jié)合的PVP-40。在臨加入溶解的PCE1C3樣品前，用5個(gè)床體積的柱緩沖液A(50mM MOPS pH7.4，10μM硫酸鋅、5mM MgCl2、0.1mM CaCl2、1mM DTT、2mM芐脒鹽酸鹽)平衡該柱。
以2ml/min的流速將該溶解的樣品上樣到該柱上，如此循環(huán)以使總樣品在12小時(shí)內(nèi)上樣4到5次。在完成載樣后，用10個(gè)柱體積的柱緩沖液A，隨后用5個(gè)柱體積的緩沖液B(含有20mM 5′-AMP的柱緩沖液A)和5個(gè)柱體積的柱緩沖液C(50mM MOPS pH7.4，10μM硫酸鋅、0.1mM CaCl2、1mM DTT和2mM芐脒鹽酸鹽)先后洗滌所述柱。所述酶被洗脫到三份連續(xù)合并液(pool)中。第一份合并液含有來自于用含有1mM cAMP的柱緩沖液C洗脫的5個(gè)-床體積洗液的酶。第二份合并液含有來自于用含有1M NaCl的柱緩沖液C洗脫的10個(gè)-床體積洗液的酶。最后一份合并液含有來自于用含有1M NaCl和20mM cAMP的柱緩沖液C洗脫的5個(gè)-床體積洗液的酶。
收集酶的活性合并液并經(jīng)常規(guī)的凝膠過濾色譜法或在羥基磷灰石樹脂上的色譜法移去環(huán)核苷酸。在移去環(huán)核苷酸后，將該酶的合并液對(duì)含有25mM MOPS pH7.4，10μM硫酸鋅、500mM NaCl、1mMCaCl2、1mM DTT和1mM芐脒鹽酸鹽的透析緩沖液透析，隨后對(duì)含有50％甘油的透析緩沖液透析。借助于干冰迅速冷凍所述酶并于-70℃保存。
該產(chǎn)生的制品具有大約＞90％的純度(經(jīng)SDS-PAGE)。這些制品具有每毫克蛋白每分鐘水解大約0.1到1.0μmol cAMP的比活性。從釀酒酵母中純化PDE2在冰上、在25ml裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.2、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1mM DTT、0.1mM 4-(2-氨基-乙基)苯磺酰基氟(AEBSF)、各1μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽、抑蛋白酶肽、鈣蛋白酶抑制劑I和II、和2mM芐脒)中，讓來自于YI34菌株的冷凍酵母細(xì)胞沉淀(10g，在-70℃下保存)解凍。使細(xì)胞通過過一個(gè)French壓碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments)三次使之溶解。于4℃在一個(gè)45Ti型的Beckman超高速離心機(jī)轉(zhuǎn)子中以36,000rpm離心溶解產(chǎn)物60分鐘。使上清液與沉淀分離并在4℃使上清液以約0.5ml/min的速率通過15ml Epoxy-cGMP Sepharos樹脂2次。隨后用45ml洗滌緩沖液1(50mM MOPS pH7.2、0.1mM EDTA、0.1mM DTT)洗滌該柱。在這次洗滌后，用45ml洗滌緩沖液2(含有0.5M NaCl的洗滌緩沖液1)洗滌該柱。在洗滌所述鹽后，用15ml洗滌緩沖液3(含有0.25M NaCl的洗滌緩沖液1)洗滌該柱。將所述柱轉(zhuǎn)移至室溫環(huán)境下并讓其溫?zé)?。將約25ml的洗脫緩沖液(含有10mM cGMP的洗滌緩沖液3)上到該柱上并按照每份2ml流分收集流出液。用含有5mM MgCl2的PBS將每個(gè)流分的少量等份樣品稀釋20倍，使競爭性配體水解并有助于檢測(cè)PDE2活性。使活性流分通過一個(gè)Pharmacia PD-10凝膠體濾柱以便交換到洗滌緩沖液3中。該交換的合并液用80％無菌甘油稀釋50％v/v并在-20℃下保存。經(jīng)SDS-PAGE判定所產(chǎn)生的制品純度大于85％，隨后通過Coomassie R-250使蛋白染色。這些制品具有每毫克蛋白每分鐘水解大約150到250μmol cGMP的比活性。由Sf9細(xì)胞制備PDE3A將細(xì)胞(2×1010)懸浮在裂解緩沖液中，該裂解緩沖液含有50mMMOPS pH7.5、2mM DTT、2mM芐脒鹽酸鹽、5μM硫酸鋅、0.1mM氯化鈣、20μg/ml鈣蛋白酶抑制劑I和II，和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽。超聲處理該混合物兩次(30秒鐘)并于4℃，在一個(gè)French壓碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments)中使所述細(xì)胞溶解。該溶胞產(chǎn)物經(jīng)100,000xg離心45分鐘。用裂解緩沖液洗滌該沉淀一次并用Dounce均漿器將其懸浮在46ml裂解緩沖液中。將等分試樣在-70℃下保存。這些制品具有每毫克蛋白每分鐘水解大約1到2nmol cAMP的比活性。人PDE4A、4B、4C、4D制劑由釀酒酵母制備PDE4A通過與50ml的裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.5，10μM硫酸鋅，2mM氯化鎂，14.2mM 2-巰基乙醇，各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽，各20μg/ml的鈣蛋白酶抑制劑I和II，以及2mM芐脒鹽酸鹽)混合，于室溫下，解凍酵母細(xì)胞(50g帶有HDUN1.46的酵母菌株YI26)。于10℃，將細(xì)胞在French壓碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments)中溶解。于4℃，在Beckman JA-10轉(zhuǎn)子中，以9000rpm將所述提取物離心22分鐘。轉(zhuǎn)移上清液并且在Beckman TI45轉(zhuǎn)子中，以36000rpm，于4℃，離心45分鐘。
通過加入固體硫酸銨(0.26g/ml上清液)，同時(shí)在冰浴中攪拌并且維持pH在7.0-7.5之間，由高速上清液沉淀PDE4A。經(jīng)在BeckmanJA-10轉(zhuǎn)子中，以9000rpm離心22分鐘，收集沉淀的含有PDE4A的蛋白。將所述沉淀再次懸浮在50ml緩沖液G(50mM MOPS pH7.5，10μM硫酸鋅，5mM氯化鎂，100mM氯化鈉，14.2mM 2-巰基乙醇，2mM芐脒鹽酸鹽，各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽、抑蛋白酶肽，以及各20μg/ml的鈣蛋白酶抑制劑I和II)中并且通過0.45μm濾膜。
將所述懸浮樣品(50-100ml)上樣到在緩沖液G中平衡后的5×100cm的Pharmacia SEPHACRYLS-300柱中。以2ml/min的流速洗脫酶活性并且收集以供以后分離。
將經(jīng)凝膠過濾層析分離的PDE4A上樣到在緩沖液A(50mMMOPS pH7.5，10μM硫酸鋅，5mM氯化鎂，14.2mM 2-巰基乙醇以及100mM芐脒鹽酸鹽)中平衡后的1.6×20cm的Sigma Cibacron BlueAgarose-300型(10ml)柱中。連續(xù)用50-100ml緩沖液A、20-30ml含有20mM 5’-AMP的緩沖液A、50-100ml含有1.5M氯化鈉的緩沖液A和10-20ml緩沖液C(50mM Tris HCl pH8，10μM硫酸鋅，14.2mM 2-巰基乙醇以及2mM芐脒鹽酸鹽)洗滌柱。用20-30ml含有20mM cAMP的緩沖液C洗脫所述酶。
收集PDE活性峰并且用硫酸銨沉淀(0.33g/ml酶收集液)以便除去過量的環(huán)核苷酸。將沉淀的蛋白再懸浮在緩沖液X(25mM MOPS pH7.5，5μM硫酸鋅，50mM氯化鈉，1mM DTT以及1mM芐脒鹽酸鹽)中，并且按照制造商的指示，經(jīng)在Pharmacia PD-10柱上凝膠過濾脫鹽。將所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷凍并且于-70℃保存。
所得的制劑為約＞80％純度(經(jīng)SDS-PAGE)。這些制劑具有每分鐘每毫克蛋白水解的約10-40μmol cAMP的比活性。由釀酒酵母制備PDE4B于室溫下，通過與100ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml的裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.2，2mM EDTA，2mM EGTA，1mM DTT，2mM芐脒鹽酸鹽，以及各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、鈣蛋白酶抑制劑I和II)混合，解凍酵母細(xì)胞(150g帶有HDUN2.32的酵母菌株YI23)。將所述混合物冷卻到4℃，轉(zhuǎn)移至Bead-Beater中并且快速混合6個(gè)周期(每個(gè)周期30秒)溶解所述細(xì)胞。于4℃，在BeckmanJ2-21M離心機(jī)中，使用JA-10轉(zhuǎn)子，以9000rpm將所述勻漿離心22分鐘?；厥丈锨逡翰⑶矣?℃，在Beckman XL-80超速離心機(jī)中，使用TI45轉(zhuǎn)子，以36000rpm離心45分鐘?；厥丈锨逡翰⑶彝ㄟ^加入固體硫酸銨(0.26g/ml上清液)，同時(shí)在冰浴中攪拌并且維持pH在7.0-7.5的范圍內(nèi)，沉淀PDE4B。然后，在Beckman J2離心機(jī)中，使用JA-10轉(zhuǎn)子，以9000rpm(12000Xg)將該混合物離心22分鐘。棄去上清液，將沉淀溶于200ml緩沖液A(50mM MOPS pH7.5，5mM氯化鎂，1mMDTT，2mM芐脒鹽酸鹽，以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)中。將其pH和電導(dǎo)率分別校正為7.5和15-20mS。
將所述再懸浮的樣品上樣到在緩沖液A中平衡后的1.6×200cmSigma Cibacron Blue Agarose-300型(25ml)柱中。將所述樣品在12個(gè)小時(shí)內(nèi)，循環(huán)通過所述柱4-6次。將所述柱連續(xù)用125-250ml緩沖液A、125-250ml含有1.5M氯化鈉的緩沖液A和25-50ml緩沖液A洗滌。用50-75ml緩沖液E(50mM Tris HCl pH8，2mM EDTA，2mM EGTA，1mM DTT，1mM芐脒鹽酸鹽，以及20mM cAMP)和50-75ml含有1M氯化鈉的緩沖液E洗脫所述酶。收集PDE活性峰并且用硫酸銨(0.4g/ml酶收集液)沉淀以便除去過量的環(huán)核苷酸。將沉淀的蛋白再懸浮在緩沖液X(25mM MOPS pH7.5，5μM硫酸鋅，50mM氯化鈉，1mM DTT以及1mM芐脒鹽酸鹽)中，并且按照制造商的指示，經(jīng)在PharmaciaPD-10柱上凝膠過濾脫鹽。將該酶收集液對(duì)含有50％甘油的緩沖液X透析過夜。將所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷凍并且于-70℃保存。
所得的制劑為約＞90％純度(經(jīng)SDS-PAGE)。這些制劑具有每分鐘每毫克蛋白水解的約10-50μmol cAMP的比活性。由釀酒酵母制備PDE4C于室溫下，通過與100ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml的裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.2，2mM EDTA，2mM EGTA，1mM DTT，2mM芐脒鹽酸鹽，以及各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、鈣蛋白酶抑制劑I和II)混合，解凍酵母細(xì)胞(150g帶有HDUN3.48的酵母菌株YI30)。將所述混合物冷卻到4℃，轉(zhuǎn)移至BEAD-BEATER中并且快速混合6個(gè)周期(每個(gè)周期30秒)溶解所述細(xì)胞。于4℃，在Beckman J2-21M離心機(jī)中，使用JA-10轉(zhuǎn)子，以9000rpm將所述勻漿離心22分鐘。回收上清液并且于4℃，在Beckman XL-80超速離心機(jī)中，使用TI45轉(zhuǎn)子，以36000rpm離心45分鐘。
回收上清液并且通過加入固體硫酸銨(0.26g/ml上清液)，同時(shí)在冰浴中攪拌并且維持pH在7.0-7.5的范圍內(nèi)，沉淀PDE4C。30分鐘后，在Beckman J2離心機(jī)中，使用JA-10轉(zhuǎn)子，以9000rpm(12000Xg)將該混合物離心22分鐘。棄去上清液，將沉淀溶于200ml緩沖液A(50mM MOPS pH7.5，5mM氯化鎂，1mM DTT，2mM芐脒鹽酸鹽，以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)中。將其pH和電導(dǎo)率分別校正為7.5和15-20mS。
將所述再懸浮的樣品上樣到在緩沖液A中平衡后的1.6×20cmSigma Cibacron Blue Agarose-300型(25ml)柱中。將所述樣品在12個(gè)小時(shí)內(nèi)，循環(huán)通過所述柱4-6次。將所述柱連續(xù)用125-250ml緩沖液A、125-250ml含有1.5M氯化鈉的緩沖液A和25-50ml緩沖液A洗滌。用50-75ml緩沖液E(50mM Tris HCl pH8，2mM EDTA，2mM EGTA，1mM DTT，2mM芐脒鹽酸鹽，以及20mM cAMP)和50-75ml含有1M氯化鈉的緩沖液E洗脫所述酶。收集PDE4C活性峰并且用硫酸銨(0.4g/ml酶收集液)沉淀以便除去過量的環(huán)核苷酸。將沉淀的蛋白再懸浮在緩沖液X(25mM MOPS pH7.2，5μM硫酸鋅，50mM氯化鈉，1mMDTT以及1mM芐脒鹽酸鹽)中，并且按照制造商的指示，經(jīng)在Pharmacia PD-10柱上凝膠過濾脫鹽。將該酶收集液對(duì)含有50％甘油的緩沖液X透析過夜。將所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷凍并且于-70℃保存。
所得的制劑為約＞80％純度(經(jīng)SDS-PAGE)。這些制劑具有每分鐘每毫克蛋白水解的約10-20μmol cAMP的比活性。由釀酒酵母制備PDE4D于室溫下，通過與150ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml的裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.2，10μM硫酸鋅，2mM氯化鎂，14.2mM 2-巰基乙醇，2mM芐脒鹽酸鹽，各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、鈣蛋白酶抑制劑I和II)混合，解凍酵母細(xì)胞(100g帶有HDUN4.11的酵母菌株YI29)。將所述混合物冷卻到4℃，轉(zhuǎn)移至Bead-Beater中并且快速混合6個(gè)周期(每個(gè)周期30秒)溶解所述細(xì)胞。于4℃，在Beckman J2-21M離心機(jī)中，使用JA-10轉(zhuǎn)子，以9000rpm將所述勻漿離心22分鐘。回收上清液并且于4℃，在Beckman XL-80超速離心機(jī)中，使用TI45轉(zhuǎn)子，以36000rpm離心45分鐘。回收上清液并且通過加入固體硫酸銨(0.33g/ml上清液)，同時(shí)在冰浴中攪拌并且維持pH在7.0-7.5的范圍內(nèi)，沉淀PDE4D。30分鐘后，在Beckman J2離心機(jī)中，使用JA-10轉(zhuǎn)子，以9000rpm(12000Xg)將該混合物離心22分鐘。棄去上清液，將沉淀溶于100ml緩沖液A(50mMMOPS pH7.5，10μM硫酸鋅，5mM氯化鎂，14.2mM 2-巰基乙醇，100mM芐脒鹽酸鹽，以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽、鈣蛋白酶抑制劑I和II)中。將其pH和電導(dǎo)率分別校正為7.5和15-20mS。
以0.67ml/min的流速，將所述再懸浮的樣品上樣到在緩沖液A中平衡后的1.6×20cm Sigma Cibacron Blue Agarose-300型(10ml)柱中。將所述柱連續(xù)用50-100ml緩沖液A、20-30ml含有20mM 5’-AMP的緩沖液A、50-100ml含有1.5M氯化鈉的緩沖液A和10-20ml緩沖液C(50mM Tris HCl pH8，10μM硫酸鋅，14.2mM 2-巰基乙醇，2mM芐脒鹽酸鹽)洗滌。用20-30ml含有20mM cAMP的緩沖液C洗脫所述酶。
收集PDE4D活性峰并且用硫酸銨(0.4g/ml酶收集液)沉淀以便除去過量的環(huán)核苷酸。將沉淀的蛋白再懸浮在緩沖液X(25mM MOPS pH7.2，5μM硫酸鋅，50mM氯化鈉，1mM DTT以及1mM芐脒鹽酸鹽)中，并且按照制造商的指示，經(jīng)在Pharmacia PD-10柱上凝膠過濾脫鹽。將該酶收集液對(duì)含有50％甘油的緩沖液X透析過夜。將所述酶的制劑在干冰/乙醇浴中快速冷凍并且于-70℃保存。
所得的制劑為約＞80％純度(經(jīng)SDS-PAGE)。這些制劑具有每分鐘每毫克蛋白水解的約20-50μmol cAMP的比活性。得自釀酒酵母的PDE5的純化在冰上用等體積的裂解緩沖液(25mM Tris HCl pH8，5mM氯化鎂，0.25mM DTT，1mM芐脒和10μM硫酸鋅)解凍細(xì)胞沉淀(29g)。在Microfluidizer(Microfluidics Corp)中，用20000psi氮?dú)庀氯芙饧?xì)胞。離心溶胞產(chǎn)物并通過一個(gè)一次性使用的0.45μm濾器過濾。將該濾液上樣到一根Q SEPHAROSEFastFlow (Pharmacia)的150ml柱上。用1.5個(gè)體積的緩沖液A(20mM Bis-Tris Propane，pH6.8，1mM氯化鎂，0.25mM DTT，10μM硫酸鋅)洗滌所述柱并用在緩沖液A中的125mM氯化鈉進(jìn)行階梯式梯度洗脫，隨后用在緩沖液A中的125-1000mM氯化鈉進(jìn)行線性梯度洗脫。將來自于線性梯度的活性流分上樣到在緩沖液B(20mM Bis-Tris Propane(pH6.8)，1mM氯化鎂，0.25mM DTT，10μM硫酸鋅和250mM氯化鉀)中的180ml羥基磷灰石柱上。上樣后，用2個(gè)體積的緩沖液B洗滌所述柱并用在緩沖液B中的0-125mM磷酸鉀的線性梯度液洗脫。合并活性流分，用60％硫酸銨沉淀，并再懸浮在緩沖液C(20mM Bis-Tris Propane，pH6.8，125mM氯化鈉，0.5mMDTT和10μM硫酸鋅)中。將合并的液體上樣到140ml SEPHACRYLS-300 HR柱上并用緩沖液C洗脫。將活性流分稀釋到50％甘油中并在-20℃保存。
所得的制劑具有約＞85％純度(經(jīng)SDS-PAGE)。這些制劑具有每分鐘每毫克蛋白水解約3μmol cGMP的比活性。由釀酒酵母制備PDE7在室溫下，約30分鐘，用等體積的裂解緩沖液(50mM Tris HCl pH8，1mM EDTA，1mM DTT，50mM氯化鈉，2mM芐脒鹽酸鹽和各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)解凍細(xì)胞沉淀(126g)并使之再懸浮。于0-4℃、在一個(gè)Bead-Beater(6×30秒周期)，借助于玻璃珠(125ml)溶解所述細(xì)胞。離心該溶胞產(chǎn)物并通過一個(gè)一次性使用的0.45μm濾器過濾。將過濾的提取液(178ml)分為4ml等份試樣，用干冰迅速冷凍并在一個(gè)冰箱中于-70℃保存。這些制劑對(duì)于幾個(gè)冷凍和解凍周期是穩(wěn)定的并具有每分鐘每毫克蛋白水解約50到100pmolcAMP的比活性。脂多糖-刺激的TNFα從人外周血液淋巴細(xì)胞中的釋放為了評(píng)價(jià)一種化合物減少人外周血液淋巴細(xì)胞(PBL)中TNFα分泌的能力，進(jìn)行以下試驗(yàn)。先前的研究已經(jīng)證明，將人PBL與升高cAMP的試劑，如前列腺素E21毛喉素、8-溴-cAMP或二丁基-cAMP一起孵育，當(dāng)用脂多糖(LPS，內(nèi)毒素)刺激時(shí)，可抑制細(xì)胞分泌TNFα。因此，初步試驗(yàn)已經(jīng)完成，證明選擇性PDE4抑制劑如咯利普蘭以劑量依賴方式抑制LPS誘導(dǎo)的人淋巴細(xì)胞分泌TNFα。因此，將人PBL分泌的TNFα用作化合物升高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度和/或抑制細(xì)胞內(nèi)PDE4活性的能力的標(biāo)準(zhǔn)。
抽自自愿者的肝素化血液(約30ml)與Dulbecco’s改良磷酸鹽緩沖鹽水以1∶1混合。該混合物與HISTOPAQUE1∶1混合并于室溫下，在Beckman型TJ6離心機(jī)的旋轉(zhuǎn)斗(swinging bucket)中以1500rpm不減速地離心。紅細(xì)胞被離心到試管的低部，血清仍在試管的表面。含有淋巴細(xì)胞的層沉降在血清和HISTOPAQUE層之間，并通過抽吸移到一個(gè)新試管中。對(duì)細(xì)胞定量并調(diào)節(jié)到3×106個(gè)細(xì)胞/ml，并將100ul等份試樣放置到96孔板的孔中。在加入細(xì)菌LPS(25mg/ml)前15分鐘，將試驗(yàn)化合物和RPMI媒介物(Gibco/BRL生命科學(xué))加入到每個(gè)孔中。于37℃，在一個(gè)潮濕的箱中孵育該混合物20小時(shí)。然后，在室溫下，通過以800rpm離心5分鐘分離該細(xì)胞。為了測(cè)定TNFα的濃度，將一等份180ul上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的平板中。用一種商業(yè)上可獲得的酶-聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑(ELISA)(來自Biosource International的CYTOSCREENImmunoassay Kit)測(cè)量在細(xì)胞上清液中的TNFα蛋白。
對(duì)于本發(fā)明的各種化合物，所述細(xì)胞-基礎(chǔ)測(cè)試提供了以下結(jié)果。EC50值(即化合物能夠抑制總TNFα的50％的有效濃度)說明本發(fā)明化合物抑制LPS-刺激的人PBL釋放TNFα的能力。
以下總結(jié)了對(duì)結(jié)構(gòu)式(I)和(II)化合物抑制人重組PDE4所測(cè)定的IC50值。在下表中，除非另外說明，否則R3為氫和n為1。

以上所列數(shù)據(jù)顯示，式(I)和(II)化合物是有效的和選擇性PDE4抑制劑，如所述化合物對(duì)人重組PDE4具有大約0.15到大約195μM的IC50值。作為一個(gè)另外的優(yōu)點(diǎn)，式(I)和(II)化合物減少或消除與先前的PDE4抑制劑有關(guān)的不利副作用，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用。詳細(xì)地說，在細(xì)胞-基礎(chǔ)測(cè)試中和動(dòng)物模型中測(cè)試式(I)和(II)化合物，以便闡述所述化合物在體外和體內(nèi)抑制PDE4的功效。
對(duì)本發(fā)明的各種吡咯化合物，所述細(xì)胞-基礎(chǔ)測(cè)試提供以下結(jié)果。所述EC50值(即化合物能夠抑制總TNFα50％的有效濃度)說明本發(fā)明化合物抑制LPS-刺激的人外周血液淋巴細(xì)胞釋放TNFα的能力。
上表和圖1說明式(I)和(II)化合物抑制PDE4活性和TNFα釋放的能力。優(yōu)選的化合物具有大約500nM或更低的PBL/TNFαEC50值，而優(yōu)選約200nM或更低。更優(yōu)選的化合物具有大約100nM或更低的PBL/TNFαEC50值。
為了體現(xiàn)本發(fā)明的全部優(yōu)點(diǎn)，所述化合物對(duì)人重組PDE4具有大約100nM或更低的IC50值和大約500nM或更低的PBL/TNFαEC50值。所述化合物更優(yōu)選具有大約50nM或更低的IC50值和大約100nM或更低的PBL/TNFαEC50值。動(dòng)物模型哺乳動(dòng)物的血清TNFα水平(小鼠/TNFαED50(mg/kg))抑制的測(cè)定為了評(píng)估一種化合物在哺乳動(dòng)物中降低血清TNFα水平的能力，采用以下方案。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員可以理解，從前的研究已經(jīng)證明，將LPS-激活的人單核細(xì)胞與可以升高cAMP的試劑，如PGE2、毛喉素和dbcAMP一起孵育會(huì)抑制TNFα的分泌。PDE4抑制劑如也可以升高cAMP的咯利普蘭已被發(fā)現(xiàn)可抑制血清TNFα。也發(fā)現(xiàn)咯利普蘭抑制LPS-激活的小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNFα。因此，通過對(duì)注射LPS的小鼠給予化合物并測(cè)量降低的血清TNFα水平顯示一種降低PDE4的化合物在體內(nèi)的功效。雌性C3H小鼠，20-25g體重，禁食過夜并在LPS注射前60分鐘腹膜內(nèi)給予在適宜溶媒中的試驗(yàn)化合物。然后將5μg LPS腹膜內(nèi)注射到小鼠中。LPS注射后90分鐘，使小鼠心臟流血。在4℃下讓血液凝結(jié)過夜。在一個(gè)小離心機(jī)中離心樣品10分鐘，移去血清并在-20℃下保存直到分析。隨后用商業(yè)上可獲得的ELISA試劑盒(Genzyme)，按照在試劑盒所附的方案測(cè)量TNFα的血清水平。相對(duì)于僅接受溶媒的對(duì)照小鼠的血清TNFα水平，確定由所述化合物引起的血清TNFα水平的抑制。該結(jié)果總結(jié)在圖1的繪圖中。組合的小鼠內(nèi)毒素刺激的TNFα釋放和運(yùn)動(dòng)活性測(cè)試本研究的目的是在一個(gè)LPC小鼠模型中測(cè)定PDE4抑制劑在體內(nèi)的功效與測(cè)定與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)有關(guān)的表現(xiàn)為自發(fā)性運(yùn)動(dòng)減少的副作用。
該試驗(yàn)動(dòng)物為平均體重約20g的雌性Balb/c小鼠。用30％CremophorEL配制的PDE4抑制劑以0.1、1.0、10.0和100mg/kg的劑量經(jīng)腹膜內(nèi)(i.p.)注射給藥。以測(cè)量的體重為基礎(chǔ)調(diào)節(jié)個(gè)體的劑量體積(約150ul)。一小時(shí)后，將5mg/kg的LPS以200ul的終體積經(jīng)尾部靜脈注射給每只動(dòng)物。在LPS處理后90分鐘，使所述動(dòng)物出血并且在于-70℃保存前收集樣品，直到分析。
為了功效測(cè)定，該血清樣品被稀釋兩倍并且用CYTOSCREEN免疫分析試劑盒(Biosource International)測(cè)定TNFα水平。對(duì)于每種試驗(yàn)化合物，該數(shù)據(jù)為在三份樣品間的平均值。
對(duì)于副作用簡述，在給予PDE4抑制劑后5分鐘和20分鐘采用一種主觀目測(cè)評(píng)分體系。將溶媒對(duì)照組動(dòng)物定為一個(gè)“+”并且將基本上不能移動(dòng)的和幾乎覺察不到伸展而接觸該籠子底部的動(dòng)物定為“++++”。或者，為了評(píng)估PDE4抑制劑對(duì)小鼠和/或大鼠的作用，使用了監(jiān)測(cè)運(yùn)動(dòng)的一種半自動(dòng)“開放區(qū)域”體系(如一個(gè)由San DiegoInstruments出售的光束活性測(cè)量系統(tǒng)(Photobeam Activity MeasurementSystem))。在這種情況下，可以在預(yù)先設(shè)置的時(shí)間間隔連續(xù)監(jiān)測(cè)受試者。
通過計(jì)算每單位時(shí)間“光束”穿過的次數(shù)對(duì)X-Y平面運(yùn)動(dòng)或抬起后腿進(jìn)行量化?；顒?dòng)事件次數(shù)的減少直接與所述動(dòng)物的移動(dòng)或不能移動(dòng)成比例。定量的分?jǐn)?shù)與上述的主觀測(cè)量密切有關(guān)。
1)反式-3-(3-環(huán)戊氧基-4-甲氧基苯基)-1-甲氧基羰基-4-甲基-4-(甲基羰基)吡咯烷，即Feldman等的美國專利號(hào)5,665,754的實(shí)施例12，通過引用結(jié)合到本文中。
以上所列數(shù)據(jù)顯示式(I)和(II)化合物是有效的和選擇性PDE4抑制劑。作為一個(gè)另外的重要的優(yōu)點(diǎn)，式(I)和(II)化合物也減少或消除與先前的PDE4抑制劑有關(guān)的不良CNS副作用。為了進(jìn)一步闡述所述化合物的功效，對(duì)式(I)和(II)化合物在動(dòng)物模型中的催吐(emetogenic)特性進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)。所述催吐試驗(yàn)的方法和結(jié)果闡述如下。
本發(fā)明的化合物用于選擇性地抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)PDE4的活性，而不顯示與在先PDE4抑制劑有關(guān)的不利的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用和催吐作用。
顯而易見，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以對(duì)此前提出的本發(fā)明內(nèi)容作各種修飾和改進(jìn)，因此，只有所附帶的權(quán)利要求書才是對(duì)本發(fā)明的唯一的限定。
權(quán)利要求
1.一種具有下式的化合物 或 其中R1選自任選取代的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷芳基、芳烷基、雜芳烷基和雜烷芳基；R2為烷基或氫；R3選自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、芳基、雜芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、鹵代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和鹵代烷基；R4和R5獨(dú)立為氫或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳環(huán)或雜環(huán)；和n為0到3，前提是當(dāng)R2為乙基，R1不同于3-硝基苯基、2，3-二氯苯基和3，5-雙三氟甲基苯基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1選自芳基、雜芳基、雜烷芳基、烷芳基和環(huán)烷基。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中R1選自芳基、雜芳基、環(huán)烷基和烷芳基，所述基團(tuán)任選由一個(gè)或多個(gè)如下基團(tuán)取代NR4R5、鹵代基、烷基、C(＝O)烷基、SO2(烷基)、C(＝O)NR5R6、SO3H、NO2、CO2H、C(＝O)O烷基和CF3。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中R1選自 和
5.權(quán)利要求1的組合物，其中R2選自氫和低級(jí)烷基。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中R1為任選取代的苯基、吡啶基或環(huán)己基；R2為氫或C1-2烷基；而n為0。
7.權(quán)利要求1的化合物，它選自1-(3-二甲基氨基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氯苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氯苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-2-苯基-1-間甲苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-5-苯基-1-間甲苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-溴苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-乙酰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-乙酰基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-甲磺酰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-甲磺?；交?-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氨基甲?；交?-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氨基甲?；交?-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-二甲基氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-碘苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-5-苯基-1-(3-磺苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-2-苯基-1-(3-磺苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氟苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氟苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-5-苯基-1-吡啶-3-基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-環(huán)己基-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-1，2-二苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-1-(3-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-1-(5-硝基吡啶-2-基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-羧基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-甲氧基羰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-溴苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-碘苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-5-苯基-1-(3-三氟甲基苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-2-苯基-1-(3-三氟甲基苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-1-(3-硝基芐基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-1-(3-硝基芐基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-2-苯基-1-吡啶-3-基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-1-(4-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-1-(2-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-1-(5-硝基吡啶-2-基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-1-(4-硝基苯基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(4-氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(4-氨基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氨基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-1-(3-硝基苯基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸；5-甲基-1，2-二苯基-1H-吡咯-3-羧酸；和1-(3-乙氧基羰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯。
8.權(quán)利要求1的化合物，它選自1-(3-氯苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-乙?；交?-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氨基甲酰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-二甲基氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氟苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-環(huán)己基-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-1，2-二苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；和2-甲基-1-(3-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯。
9.權(quán)利要求1的化合物，它選自1-(3-氯苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氨基甲?；交?-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-二甲基氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；和2-甲基-1-(3-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯。
10.權(quán)利要求1的化合物，它具有對(duì)人重組PDE4約0.5μM-約25μM的IC50值。
11.權(quán)利要求1的化合物，它具有約1μM-約20μM的PBL/TNFαEC50值。
12.權(quán)利要求1的化合物，它具有對(duì)人重組PDE4約0.5μM-約25μM的IC50值，以及約1μM-約20μM的PBL/TNFαEC50值。
13.權(quán)利要求1的化合物，它具有對(duì)人重組PDE4約100μM或更低的IC50值。
14.權(quán)利要求1的化合物，它具有對(duì)人重組PDE4約50μM或更低的IC50值。
15.權(quán)利要求1的化合物，它具有約500μM或更低的PBL/TNFαEC50值。
16.權(quán)利要求1的化合物，它具有約100μM或更低的PBL/TNFαEC50值。
17.權(quán)利要求1的化合物，它具有對(duì)人重組PDE4約100μM或更低的IC50值和約500μM或更低的PBL/TNFαEC50值。
18.一種藥用組合物，該組合物含有權(quán)利要求1的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
19.一種治療患有其中抑制cAMP-特異性PDE具有治療益處的疾病的哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的具有下式的化合物 或 其中R1選自任選取代的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷芳基、芳烷基、雜芳烷基和雜烷芳基；R2為烷基或氫；R3選自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、芳基、雜芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、鹵代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和鹵代烷基；R4和R5獨(dú)立為氫或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳環(huán)或雜環(huán)；和n為0到3。
20.一種在哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)cAMP水平的方法，該方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的下式化合物 或 其中R1選自任選取代的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷芳基、芳烷基、雜芳烷基和雜烷芳基；R2為烷基或氫；R3選自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、芳基、雜芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、鹵代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和鹵代烷基；R4和R5獨(dú)立為氫或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳環(huán)或雜環(huán)；和n為0到3。
21.一種治療患有其中抑制cAMP-特異性PDE具有治療益處的疾病的哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的的藥用組合物，所述藥用組合物包含具有下式的化合物、藥學(xué)上可接受的載體和任選的第二種抗炎治療劑 或 其中R1選自任選取代的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷芳基、芳烷基、雜芳烷基和雜烷芳基；R2為烷基或氫；R3選自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、芳基、雜芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、鹵代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和鹵代烷基；R4和R5獨(dú)立為氫或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳環(huán)或雜環(huán)；和n為0到3。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病為過敏性疾病、自體免疫性疾病、炎性疾病、關(guān)節(jié)炎疾病或皮炎。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎或脊椎炎。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病為與甲狀腺有關(guān)的眼病、貝赫切特病、膿毒病、敗血癥性休克、內(nèi)毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒病、革蘭氏陽性膿毒病、中毒性休克綜合征、過敏性結(jié)膜炎、春季結(jié)膜炎或朗格斯細(xì)胞肉芽腫病。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病為哮喘、慢性支氣管炎、變應(yīng)性鼻炎、成人呼吸窘迫綜合征、慢性肺炎、慢性阻塞性肺炎、硅肺或肺結(jié)節(jié)病哮喘、。
26.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病為由于腦或脊髓的輕微創(chuàng)傷引起的心肌、腦或肢端再灌注損傷。
27.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病為纖維變性、瘢痕疙瘩形成或疤痕形成。
28.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病為系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植排斥反應(yīng)疾病、移植物抗宿主反應(yīng)或同種移植排斥反應(yīng)。
29.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病為慢性腎小球性腎炎、炎性腸疾病、局限性回腸炎或潰瘍性結(jié)腸炎。
30.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病為增生性淋巴細(xì)胞疾病或白血病。
31.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病為炎性皮膚病、特應(yīng)性皮炎、牛皮癬或蕁麻疹。
32.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病為心肌病、充血性心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、發(fā)熱、惡病質(zhì)、感染或惡性腫瘤繼發(fā)的惡病質(zhì)、獲得性免疫缺陷綜合征繼發(fā)的惡病質(zhì)、ARC、腦型瘧、骨質(zhì)疏松、骨吸收疾病、由于感染引起的發(fā)燒和肌痛、尿崩癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、抑郁癥、多梗死性癡呆、焦慮癥或應(yīng)激反應(yīng)、腦局部缺血、遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙、帕金森氏病和經(jīng)前期綜合征。
33.權(quán)利要求21的方法，其中所述哺乳動(dòng)物表現(xiàn)出最小的催吐反應(yīng)。
34.權(quán)利要求21的方法，其中所述哺乳動(dòng)物沒有催吐反應(yīng)。
35.權(quán)利要求21的方法，其中所述哺乳動(dòng)物顯示最低的不利的中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用。
36.權(quán)利要求21的方法，其中所述哺乳動(dòng)物沒有不利的中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用。
37.權(quán)利要求21的方法，其中所述第二種抗炎治療劑能夠針對(duì)TNFα。
38.一種在哺乳動(dòng)物中降低TNF水平的方法，該方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的具有下式的化合物 或 其中R1選自任選取代的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷芳基、芳烷基、雜芳烷基和雜烷芳基；R2為烷基或氫；R3選自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、芳基、雜芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、鹵代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和鹵代烷基；R4和R5獨(dú)立為氫或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳環(huán)或雜環(huán)；和n為0到3。
39.一種抑制哺乳動(dòng)物炎性細(xì)胞激活的方法，該方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的具有下式的化合物 或 其中R1選自任選取代的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷芳基、芳烷基、雜芳烷基和雜烷芳基；R2為烷基或氫；R3選自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、芳基、雜芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、鹵代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和鹵代烷基；R4和R5獨(dú)立為氫或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳環(huán)或雜環(huán)；和n為0到3。
40.一種抑制哺乳動(dòng)物PDE4功能的方法，該方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的下式化合物 或 其中R1選自任選取代的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷芳基、芳烷基、雜芳烷基和雜烷芳基；R2為烷基或氫；R3選自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羥基、芳基、雜芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、鹵代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和鹵代烷基；R4和R5獨(dú)立為氫或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳環(huán)或雜環(huán)；而n為0到3。
全文摘要
公開具有結(jié)構(gòu)式(I)或(II)的吡咯化合物以及制備相同化合物的方法，所述化合物是有效的和選擇性PDE4抑制劑。也公開了所述化合物在治療炎性疾病和其它與細(xì)胞因子水平升高有關(guān)的疾病，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病中的用途。
文檔編號(hào)A61P29/00GK1434799SQ00819109
公開日2003年8月6日 申請(qǐng)日期2000年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月23日
發(fā)明者T·J·馬丁斯, K·W·福勒, A·奧利弗, C·C·赫特爾 申請(qǐng)人:艾科斯有限公司