專利名稱：一種巴斯德畢赤酵母重組菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域中的一種巴斯德畢赤酵母重組菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
e-葡聚糖是大麥中的主要抗營養(yǎng)因子，存在于糊粉內(nèi)胚層的細胞壁中，不能 被非反芻動物體內(nèi)消化酶所降解。水溶性P-葡聚糖具有形成膠狀物質(zhì)的特性，能 增加胃腸道中食糜黏性，降低消化酶與底物的接觸，增加消化道黏膜上不流動的水 層厚度，進而抑制營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，降低動物生產(chǎn)性能。同時，所形成的黏 性排泄物造成了養(yǎng)殖場的環(huán)境污染。另外，在釀酒工業(yè)中，高比例的大麥e
-1，3-1,4-葡聚糖會增加麥芽汁黏，降低過濾速度，進而在啤酒發(fā)酵過程會引起沉 淀，若葡聚糖含量過高，則會在啤酒成品中也出現(xiàn)沉淀。
能夠降解葡聚糖的內(nèi)切葡聚糖酶可以分為三類， 一是特異性0 -1, 3-1, 4-葡聚 糖酶(EC3.2. 1.73)，水解與e-l，3糖苷鍵相連的0-l，4糖苷鍵；二是內(nèi)切e-1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，又稱纖維素酶，水解P-1，4糖苷鍵；三是6-1,3-葡聚 糖酶(EC 3.2.1.39)，又稱昆布多糖酶。
特異性e-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)又稱地衣酶，是一種內(nèi)源P-葡 聚糖酶，嚴格水解大麥e-葡聚糖(e-glucan from barley )和地衣多糖(lichenan) 中的與P-1，3糖苷鍵相連的e-1，4糖苷鍵，主要水解產(chǎn)物是纖維二糖、三糖和四 糖等多種寡糖，而對羧甲基纖維素(CMC, 1，4葡聚糖)和昆布多糖(laminarin， P-l，3-葡聚糖)沒有降解作用。但是真核與原核來源的e-l，3-l，4-葡聚糖酶對底 物作用后的產(chǎn)物也不盡相同。
在麥類飼料中添加e -1， 3-1， 4-葡聚糖酶是解決e -葡聚糖抗營養(yǎng)作用的主要
手段。Li等(1996)分別在無殼大麥一豆粕型和小麥一豆粕型日糧中添加2%的0-葡聚糖酶，試驗結(jié)果表明，在無殼大麥一豆粕型日糧中添加與不添加相比，添加6 -葡聚糖酶能增加總能、粗蛋白質(zhì)、葡聚糖和所測定的多數(shù)氨基酸回腸消化率， 能增加糞中總能、粗蛋白質(zhì)和所有所測定的氨基酸消化率。在小麥一豆粕型日糧中 添加e-葡聚糖與不添加相比，添加P-葡聚糖能增加糞中總能消化率。
Mathlouthi等在肉雞小麥和大麥基礎(chǔ)日糧中同時添加木聚糖酶和P -葡聚糖
酶，顯著降低了小腸內(nèi)容物的黏性，改善了肉雞的日增重、詞料采食量和飼料轉(zhuǎn)化 率。在沒有改變PH條件下，小腸內(nèi)容物養(yǎng)分消化率、表觀代謝能也得到增加。同 時，盲腸內(nèi)容物中總兼性厭氧菌和大腸桿菌數(shù)量顯著降低。因此推測，添加此酶制 劑改善消化率，可能是通過減少小腸內(nèi)容物黏性和阻止總兼性厭氧菌和大腸桿菌生 長而發(fā)揮作用的。
Yu等在肉雞日糧中用大麥替代傳統(tǒng)型的玉米-豆粕型日糧中的玉米，同時添加 e-葡聚糖酶，結(jié)果降低了肉雞胃腸道相對重量，增加了生長階段脂肪消化率和后 期盲腸總揮發(fā)性脂肪酸含量，而對生長性能沒有顯著影響。
Ravindran等在使用四個品種大麥的肉雞日糧中添加P -葡聚糖酶，改善了氮校 正表觀代謝能(AMEn)，改善了蛋白質(zhì)和所有氨基酸的回腸表觀消化率，18種氨基 酸回腸表觀消化率從5. 1%提高至18. 1%。
另外，在啤酒工業(yè)中，用內(nèi)源e-1，3-1,4-葡聚糖酶代替麥芽酶，能夠?qū)⑽唇?jīng) 發(fā)芽處理的谷類物質(zhì)作為原料，而且還能通過降低麥芽汁黏性而減少濾過時間。
由此可見，葡聚糖酶在飼料添加及釀酒等工業(yè)中正發(fā)揮著很重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種巴斯德畢赤酵母重組菌，該重組菌能生產(chǎn)0
-1,3-1，4-葡聚糖酶。
本發(fā)明所提供的巴斯德畢赤酵母重組菌，是將e -1， 3-1， 4-葡聚糖酶基因?qū)?br> 巴斯德畢赤酵母得到的。
其中，所述P -1， 3-1， 4-葡聚糖酶的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。 所述e -1， 3-1， 4-葡聚糖酶基因的核苷酸序列是根據(jù)巴斯德酵母菌的密碼子偏
好性，優(yōu)化枯草芽孢桿菌中e-l，3-1，4-葡聚糖酶基因核苷酸序列得到的，其核苷
酸序列如序列表中的序列1所示。
所述3 -1， 3-1， 4-葡聚糖酶基因是通過重組表達載體pPIC-glu-opt導(dǎo)入所述巴
斯德畢赤酵母中的，其中，所述pPIC-glu-opt是將所述e-1，3-1，4-葡聚糖酶基因
插入pPICz a A的多克隆位點得到的。
所述巴斯德畢赤酵母具體為巴斯德畢赤酵母X-33。 本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)0 -1， 3-1， 4-葡聚糖酶的方法。 本發(fā)明所提供的生產(chǎn)0 -1, 3-1, 4-葡聚糖酶的方法，是發(fā)酵上述巴斯德畢赤酵
母重組菌得到P -1， 3-1， 4-葡聚糖酶。
其中，所述發(fā)酵的溫度可為28 — 3(TC;所述發(fā)酵中發(fā)酵液的pH可為5. 0 — 5. 5。 所述發(fā)酵過程中流加甲醇，具體按照以下的方法流加從開始發(fā)酵起算， 41h-43h為菌的饑餓期，主要是為了消耗掉殘存的甘油；44h開始誘導(dǎo)，44-46h按 照0. 3%初始發(fā)酵液體積/小時的流速流加甲醇；47h到48h按照0. 57%初始發(fā)酵液體 積/小時的流速流加甲醇；49h至發(fā)酵結(jié)束按照0. 71%初始發(fā)酵液體積/小時的流速 流加甲醇。
在上述發(fā)酵過程中還可進行攪拌，攪拌速度可為300 — 600轉(zhuǎn)/分鐘。
本發(fā)明所提供的巴斯德畢赤酵母重組菌能高效生產(chǎn)p-葡聚糖酶，用IO升全自
動發(fā)酵罐發(fā)酵本發(fā)明的巴斯德畢赤酵母重組菌，結(jié)果表明由該重組菌分泌表達的葡 聚糖酶的酶活可達15000U/mL。而且由該重組菌生產(chǎn)的e-1， 3-1， 4-葡聚糖酶具 有活性高、酸穩(wěn)定性好、催化pH值范圍廣等優(yōu)點，其最適催化溫度為4(TC，最適 催化pH為6.4。因此，由本發(fā)明重組菌生產(chǎn)的P-1， 3-1， 4-葡聚糖酶適于用作豬、 雞等單胃動物的飼料添加劑，也適于釀酒工業(yè)中，以提高釀酒效率，提高產(chǎn)品質(zhì)量 和降低成本。


圖1為酵母重組菌X-33 / pPIC-glu-opt傳代培養(yǎng)過程中每代e -1， 3-1， 4-葡聚
糖酶編碼基因的PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
泳道M: Marker;泳道1、 3、 5-20:分別是1、 3、 5-20代培養(yǎng)物的PCR產(chǎn)物。 圖2為酵母重組菌X-33 / pPIC-glu-opt在發(fā)酵過程中的菌體生長曲線及酶活曲線。
圖3為酵母重組菌X-33 / pPIC-glu-opt在發(fā)酵過程中發(fā)酵液中3 -1， 3-1， 4-葡聚糖酶的表達量的SDS-PAGE圖。
泳道M:蛋白質(zhì)Marker;泳道l-8:分別誘導(dǎo)12、 24、 36、 48、 60、 72、 84、 96小時的蛋白表達量；泳道9:空白對照。
圖4為P -1， 3-1， 4-葡聚糖酶的最適PH及PH穩(wěn)定性的檢測。
圖5為P -1， 3-1， 4-葡聚糖酶的最適催化溫度的測定。
圖6為0 -1， 3-1， 4-葡聚糖酶的溫度穩(wěn)定性的檢測。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。
實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下
YPDS培養(yǎng)基的組成為1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂，其 余為水；所述YPDS培養(yǎng)基的pH為6.0。
BMGY培養(yǎng)基的組成為1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34% YNB， 4X10—5%生 物素，1%甘油，100mM p服.O磷酸鹽緩沖液，其余為水；所述BMGY培養(yǎng)基的pH 為6.0。
BMMY培養(yǎng)基的組成為1%酵母提取物，2%蛋白胨，0. lmol/L p朋.0磷酸緩沖 液，1.34。/。YNB, 4X10、生物素，其余為水；所述BMMY培養(yǎng)基的pH為6. 0。
其中，酵母提取物購自0X0ID (Hampshire, England)公司，其貨號為LP0021; 蛋白胨購自0X0ID (Hampshire, England)公司，其貨號為LP0037; YNB是由Difco 公司生產(chǎn)，經(jīng)綠生源生物技術(shù)公司分裝，100g包裝；生物素由日本產(chǎn)，經(jīng)綠生源生 物技術(shù)公司分裝，lg包裝。
以上YPDS、 BMGY和BMMY培養(yǎng)基中各物質(zhì)的百分含量均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、巴斯德畢赤酵母重組菌X-33 / pPIC-glu-opt的制備
一、 0-1，3-1，4-葡聚糖酶基因序列的優(yōu)化設(shè)計
根據(jù)GenBank Accession Number EU082110公開的0-1， 3-1, 4-葡聚糖酶基因 序列，根據(jù)巴斯德畢赤酵母密碼子偏好性，以高使用頻率的密碼子替代低使用頻率 密碼子，重新設(shè)計P-1， 3-1,4-葡聚糖酶基因序列，并保持成熟蛋白的氨基酸序列 不變。為了方便克隆，在序列的5，和3，末端分別設(shè)計EcoRI和XbaI酶切位點。 設(shè)計好的序列由上海生工生物工程有限公司進行全合成。優(yōu)化后的序列如序列表中 序列1所示，由該核苷酸序列編碼的氨基酸序列如序列表序列2所示。
二、 巴斯德畢赤酵母表達載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和重組菌的篩選 用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xbetl對步驟一中合成的基因序列進行雙酶切，然后
將其連入經(jīng)相同酶切的載體pPICzaA (Invitrogen， USA)中a因子序列的下游， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，用含有25 ii g/mL抗生素Zeocin的LB 抗性平板篩選出陽性克隆，提取質(zhì)粒并進行測序，測序結(jié)果表明序列正確。將含有 上述優(yōu)化后的3 -1， 3-1， 4-葡聚糖酶基因序列的巴斯德畢赤酵母表達載體命名為 pPIC-glu-opt。
取10uL巴斯德畢赤酵母表達載體pPIC-glu-opt，將其用限制性內(nèi)切酶Sac I 在37。C下酶切24h，然后將酶切產(chǎn)物用無水乙醇沉淀，溶于10uL滅菌水中。加入 80uL巴斯德畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞，混勻，置于O. 2cm電擊杯中，冰浴5min，
在2000伏電壓(25 wF)條件下電擊，迅速加入lmL lmol/L山梨醇，置于28。C靜 止培養(yǎng)2h。然后將培養(yǎng)物涂布于含抗生素Zeocin (100 y g/mL)的YPDS平板上， 28'C培養(yǎng)3-4d，直至長出清晰的菌落。
挑取陽性重組子，將其接種于含30mL BMGY培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在2『C、 250-300rptn的條件下培養(yǎng)至0De。。為2-6，然后室溫下離心收集菌體，用BMMY液體 培養(yǎng)基重懸菌體，使其0D6。。為l.O，再用終濃度為0.5% (V/V)的甲醇為唯一碳 源進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)48h，通過SDS-PAGE及酶活性測定篩選P-1，3-1，4-葡聚糖 酶的表達量高且酶活較高的重組菌株，將其中一株取名為X-33 / pPIC-glu-opt。
將上述巴斯德畢赤酵母重組菌X-33 / pPIC-glu-opt傳代培養(yǎng)20代，每代生長 至對數(shù)生長期時提取總DNA，以5' -GGATTGTTTATGAGTTTGT-3， 和 5， -TTATTTTTTTSTATAGCGCA-3，為引物進行PCR擴增，鑒定外源基因的穩(wěn)定性。擴 增條件為94°C lmin，40。C 30 s, 72°C 1. 5 min， 40個循環(huán)。實驗重復(fù)3次，結(jié)果 如圖1所示。結(jié)果表明傳代培養(yǎng)中每代PCR擴增都能得到目的片段，說明被導(dǎo)入 的P -1， 3-1， 4-葡聚糖酶基因在各代中都穩(wěn)定存在。
實施例2、利用巴斯德畢赤酵母重組菌X-33 / pPIC-glu-叩t生產(chǎn)e -1， 3-1， 4-葡聚糖酶
在無菌條件下，將上述巴斯德畢赤酵母重組菌X-33 / pPIC-glu-opt接種于裝 有200mL BMGY培養(yǎng)基的3 L搖瓶中，在28-30°C、 280rpm下振搖12-24小時，得 到OD,為3. 0的種子培養(yǎng)液。然后配制4L BMGY培養(yǎng)基，裝入10L自動控制發(fā)酵罐 中，在121。C下滅菌后，冷卻至28.5。C，加入200raL上述種子培養(yǎng)液，用氨水和磷 酸調(diào)節(jié)pH至5.5，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和空氣流量控制溶氧大于20%。經(jīng)測定，接入種 子液23 h后，甘油消耗完全(溶氧標記為100%)，進入流加25% (25g/100ml) 甘油階段，流速為60mL/h。流加17h后，停止流加甘油，3h后，甘油消耗完全(溶 氧標記為100%)，進入甲醇流加階段，流速為12mL/h，同時控制相對溶氧量為 20%以上。3 h后，將甲醇流速調(diào)到24 mL/h，再過2 h，將流速調(diào)到30 mL/h，并 保持到最后。制作發(fā)酵過程中菌體的生長曲線并測定酶活。采集誘導(dǎo)不同時間的發(fā) 酵液，通過SDS-PAGE檢測其中表達蛋白的量。
酶活的測定方法為取lmL發(fā)酵液，離心收集得到0.5mL上清液。取lul上 清液用Na2HP04-檸檬酸緩沖液稀釋20萬倍，取lraL稀釋液與等體積底物(質(zhì)量百分 含量為0.8%的葡聚糖溶液)混合置于4(TC水浴中反應(yīng)30 min，加入2. 5mL DNS終
止液，沸水浴煮5min，定容至12.5mL，測定酶反應(yīng)液的540nra吸光度值(OD54。)。 酶活單位(U)定義為在4(TC、 pH值為6.4的條件下，每分鐘從質(zhì)量百分含量
為0. 8%的葡聚糖溶液中釋放1 pmol還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位。 其中，酶活和0D54。的換算關(guān)系如下 E= (0D54。X0. 85X1000X200000) / (180X30)
其中，E: lml發(fā)酵液酶活，單位是U;
0D54。酶反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液的540nm吸光度值；
0.85:是OD，和葡萄糖濃度(mg/mL)的標準曲線斜率；
180:葡萄糖的分子量；
30:反應(yīng)時間，單位是分鐘。 實驗設(shè)三次重復(fù)，發(fā)酵過程中的菌體生長曲線及酶活曲線見圖2。結(jié)果表明 隨著誘導(dǎo)時間的增加，所獲得的e-1，3-1,4-葡聚糖酶的酶活逐漸增強。檢測誘導(dǎo) %h即發(fā)酵140h時發(fā)酵液的酶活時，所測得的OD，為0. 476±0. 01 (平均值士標準 差)，經(jīng)換算得到此時每毫升發(fā)酵液中的酶活為15000U士330U(平均值土標準差)。 圖2中的相對酶活是將誘導(dǎo)96 h (即發(fā)酵140h)的酶活計作100%。 SDS-PAGE的具體實驗方法為
分別采集誘導(dǎo)表達12h、 24h、 36h、 48h、 60h、 72h、 84h、 96h的發(fā)酵液。取 發(fā)酵液，離心取上清液，將上清液直接用12. 5% SDS-PAGE分離。用考馬斯亮藍R-250 染色過夜后，經(jīng)脫色液(5。/。乙醇，l(m冰醋酸)脫色至條帶清晰。用試劑盒BCA Protein Assay Kit (PIERCE, Lot# GB93715A)對蛋白質(zhì)進行定量分析。
實驗設(shè)三次重復(fù)，檢測結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明甲醇誘導(dǎo)重組菌進行表達， 獲得了約30 kDa的重組蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符，且誘導(dǎo)表達96 h時的蛋白表達量 最高，達到5 mg/mL發(fā)酵液。
實施例3、 e-l，3-l,4-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析
一、最適pH值和pH穩(wěn)定性研究
最適pH值的確定分別用pH值為4.0、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 9.0、 10.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制葡聚糖底物，于4(TC反應(yīng)溫度下測定 酶活力，確定該酶的最適pH值。酶活測定方法同實施例2。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果 如圖4所示。結(jié)果表明此酶的催化pH范圍比較廣，從5.4至7.4，其中6.4為此 酶的最適pH。圖4中的相對酶活是將p朋.4條件下的酶活計作100%。
pH值穩(wěn)定性的確定將P-1， 3-1,4-葡聚糖酶分別用pH值為4.0、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸的緩沖液和pH值為9. 0、 10. 0的
甘氨酸-NaOH的緩沖液處理60分鐘后，于4(TC反應(yīng)溫度下測定殘留的酶活力，測 定方法同上。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明酶蛋白在pH4-IO的 緩沖液中處理60分鐘后，酶活性有不同程度的下降，但相對活性均在58%以上。酶 蛋白在pH為6的條件下最穩(wěn)定。
二、 最適溫度和溫度穩(wěn)定性研究
最適溫度的確定用lOOraM醋酸鈉緩沖液配制葡聚糖底物，在pH值6.5的條 件下分別測定2(TC-8(TC內(nèi)不同溫度下的酶活力，確定其最適反應(yīng)溫度，測定方法 同上。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明此酶在30-5(TC的溫度范圍 內(nèi)都有比較高的活性，其最適反應(yīng)溫度為4(TC。圖5中的相對酶活是將4(TC的酶 活計作100%。
溫度穩(wěn)定性的確定將P-1，3-1，4-葡聚糖酶分別在4(TC、 5CTC、 6(TC、 70°C、 8(TC保溫不同時間，然后放入冰水中冷卻，于4(TC和pH值6.5的條件下測定酶活 力，測定方法同上。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明在40。C、 50 。C的溫度下，此酶的穩(wěn)定性比較高。圖6中的相對酶活是將4(TC處理0分鐘的酶活 計作100°/0。
三、 金屬離子和螯合劑(EDTA)對酶活力的影響
在磷酸氫二鈉-檸檬酸鹽緩沖液(最適pH值)中加入10 mM的不同化合物(MgCh、 FeS04、 KI 、 MnS04、 Na2Mo04、 CuS04、 ZnCl2、 CaCl2、 KC1 、 NaCl、 EDTA、精氨酸、 蔗糖)。1，3-1，4-葡聚糖酶在上述溶液中處理30min后，在最適溫度4(TC和最 適pH值6.4的條件下測定酶活力，測定方法同上，以不添加金屬離子和螯合劑等 為空白對照。每個實驗重復(fù)3次，結(jié)果如表l所示。結(jié)果表明FeS04、 KI、 NaCl、 KC1、精氨酸(Arginine)明顯增加酶的活力;而CuS04、 MnS04、 Na2Mo04、 EDTA明 顯抑制酶的活力，其中CuS04完全抑制酶的活性；ZnS04、 MgCU、 Na2Se03、 CaCl2和 蔗糖(sucrose)對酶的活力基本無影響(與空白對照相比較，酶活性變化在5%以 內(nèi)的為基本無影響，提高5%以上的為明顯增加酶活力，降低5%以上的為抑制酶活 力)。表l中的相對酶活是將空白對照的酶活計作100%。 表1金M離T和化？試劑對P-U-1，4,聚糖酶活件.的影響
試劑相對酶活a(%)
none100
FeS04106.34 ±4.28
CuS040
MnSOi39.22 ±3.64
ZnS0496.08 ±0.86
KI107.14 ±2.99
Na2Se03102.52 ±2.14
Na2M0()488.56 ±3.66
NaCl113.73 ±2.28
KC1114.43 ±3.38
MgCI2101.82 ±2.53
CaCI2101.26 ±2.25
EDTA85.15±3.57
Arginine108.68 ±2.43
sucrose99.02 ± 1.73
a:平均ffi土標準刀(n=3)。所"反應(yīng)均重W三次。
序列表
<160〉2
<210>1 <211〉657 <212〉職 <213〉人工序列
<220> <223〉
<400〉1
gaattccaaactggtggttccttcttcgag ccattcaactcctacaactccggtttctgg60
c犯aaggctaacggttactccaacggtgac atgttcaactgcacttggag3gCt犯C犯C120
gtttccgttacttcctccggtgagatgaga ttggctttgacttccccatc180
ttcgactgcggtg卿3C3gatccgctcaa acttacggttacggtttgtaCg3ggtt卿240
atgaagccsgctaagaacactggtatcgtt tcctccttcttcacttacactggtccaact300
gacggtactccatgggacgagatcgacatc gagttcttgggtaaggEicactactaaggtt360
caattcaactactacactaacggtgctggt犯ccacgag3鄉(xiāng)ttgctg3cttgggtttc420
gacgctgctaacgcttaccacacttacgct ttcgactggc3gccaaactccatcaagtgg480
tacgttgacggtcaattgaagcacactgct acttcccaaatcccaactactccaggtaag540
attatg3tg38Cttgtgg犯cggtatcggt gttgacgactggttgggttcctacaacggt600
gttaacccattgtacgctcactacgactgg gttagatacactaaga_3gta657
〈210〉2
<211>214
<212>PRT
〈213〉枯草芽孢桿菌(丑3c^/7t/s suZ)^7A) 〈400>2
Gin Thr Gly Gly Ser Phe Phe Glu Pro Phe Asn Ser Tyr Asn Ser Gly 15 10 15
Phe Trp Gin Lys Ala Asn Gly Tyr Ser Asn Gly Asp Met Phe Asn Cys 20 25 30
Thr Trp Arg Ala Asn Asn Val Ser Val Thr Ser Ser Gly Glu Met Arg 35 40 45
Leu Ala Leu Thr Ser Pro Ser Tyr Asn Lys Phe Asp Cys Gly Glu Asn 50 55 60
Arg Ser Ala Gin Thr Tyr Gly Tyr Gly Leu Tyr Glu Val Arg Met Lys 65 70 75 80
Pro Ala Lys Asn Thr Gly lie Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly 85 90 95
Pro Thr Asp Gly Thr Pro Trp Asp Glu lie Asp lie Glu Phe Leu Gly 100 105 110
Lys Asp Thr Thr Lys Val Gin Phe Asn Tyr Tyr Thr Asn Gly Ala Gly 115 120 125
Asn His Glu Lys Val Ala Asp Leu Gly Phe Asp Ala Ala Asn Ala Tyr 130 135 140
His Thr Tyr Ala Phe Asp Trp Gin Pro Asn Ser lie Lys Trp Tyr Val 145 150 155 160
Asp Gly Gin Leu Lys His Thr Ala Thr Ser Gin lie Pro Thr Thr Pro 165 170 175Gly Lys lie Met Met Asn Leu Trp Asn Gly lie Gly Val Asp Asp Trp 180 185 190
Leu Gly Ser Tyr Asn Gly Val Asn Pro Leu Tyr Ala His Tyr Asp Trp 195 200 205
Val Arg Tyr Thr Lys Lys 210
權(quán)利要求
1、一種巴斯德畢赤酵母重組菌，是將β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因?qū)氚退沟庐叧嘟湍傅玫降摹?br> 2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的巴斯德畢赤酵母重組菌，其特征在于所述e-l， 3-1， 4-葡聚糖酶的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的巴斯德畢赤酵母重組菌，其特征在于所述0 -l， 3-1， 4-葡聚糖酶基因的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的巴斯德畢赤酵母重組菌，其特征在于所述巴斯德 畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母X-33。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l、 2、 3或4所述的巴斯德畢赤酵母重組菌，其特征在于 所述P -1， 3-1， 4-葡聚糖酶基因通過重組表達載體pPIC-glu-opt導(dǎo)入所述巴斯德畢 赤酵母中；所述pPIC-glu-opt是將所述e -1， 3-1， 4-葡聚糖酶基因插入pPICz a A 的多克隆位點得到的。
6、 一種生產(chǎn)0-1，3-1，4-葡聚糖酶的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求1至5中任一所述 巴斯德畢赤酵母重組菌得到0 -1， 3-1， 4-葡聚糖酶。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的溫度為28 — 3(TC; 所述發(fā)酵中發(fā)酵液的pH為5. 0 — 5. 5。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵過程中，從開始 發(fā)酵起算，44h到46h，按照0. 3%初始發(fā)酵液體積/小時的流速流加甲醇；47h到48h 按照0. 57%初始發(fā)酵液體積/小時的流速流加甲醇；49h至發(fā)酵結(jié)束按照0. 71%初始 發(fā)酵液體積/小時的流速流加甲醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了微生物領(lǐng)域中的一種巴斯德畢赤酵母重組菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的巴斯德畢赤酵母重組菌，是將β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因?qū)氚退沟庐叧嘟湍傅玫降?。用本發(fā)明的巴斯德畢赤酵母重組菌生產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶，效率高，而且生產(chǎn)得到的β-1，3-1，4-葡聚糖酶具有活性高、酸穩(wěn)定性好、催化pH值范圍廣等優(yōu)點，其最適催化溫度為40℃，最適催化pH為6.4。因此，由本發(fā)明重組菌生產(chǎn)的β-1，3-1，4-葡聚糖酶適于用作豬、雞等單胃動物的飼料添加劑，也適合應(yīng)用于釀酒工業(yè)中，以提高釀酒效率，提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低成本。
文檔編號C12N1/19GK101173226SQ20071017616
公開日2008年5月7日 申請日期2007年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月22日
發(fā)明者喬家運, 波 張, 曹云鶴, 李一航, 李德發(fā), 陸文清, 香 陳 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)