專利名稱：：活的減毒的產(chǎn)rtx巴斯德氏菌科細(xì)菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及活的減毒的產(chǎn)RTX巴斯德氏菌(Pasteurellaceae)科細(xì)菌、產(chǎn)生這種細(xì)菌的方法、包含這種細(xì)菌的疫苗、產(chǎn)生該疫苗的方法及保護(hù)人和動物免受用致病的產(chǎn)RTX巴斯德氏菌科細(xì)菌感染的方法。巴斯德氏菌科包括嗜血桿菌屬(Haemophilus)、放線桿菌屬(Actinobacillus)及巴斯德氏菌屬(Pasteurella)。該科細(xì)菌也經(jīng)常稱作HAP-類群(HAP-group)細(xì)菌。已知這些密切相關(guān)屬的幾個種表達(dá)同源鈣依賴性的孔道形成細(xì)胞毒素，即所謂的RTX毒素。(RTX代表毒素的重復(fù)(repeatintoxin))。該科的產(chǎn)RTX-毒素細(xì)菌是傳染病整個領(lǐng)域的原因所在，影響人和動物。已知其它與HAP-類群無關(guān)的屬，如埃希氏菌屬(Escherichia)和博德特氏菌屬(Bordetella)也有RTX-毒素。這些RTX-毒素在某些方面與HAP-類群的RTX-毒素相似。RTX-毒素由Braun等全面綜述過(微生物學(xué)中的關(guān)鍵性綜述18(2)115-158(1991)革蘭氏陰性細(xì)菌也由Welch，R.A在(分子微生物學(xué)5/3521-528(1991))和Welch等在(感染病原體和疾病4254-272(1995))中綜述過。正是由于在巴斯德氏菌科細(xì)菌產(chǎn)-RTX成員中RTX-毒素的存在才高度促成了這些細(xì)菌在人和動物中的病理特征。所有RTX-毒素都顯示某種細(xì)胞毒或細(xì)胞溶解活性。然而靶細(xì)胞和宿主特異性依毒素和?；牟煌煌?Mcwhinney等；細(xì)菌雜志(J.Bact.)174291-297(1992)和Hackett等；生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)27020250-20253(1995))。由于靶細(xì)胞的不同，各種RTX-毒素家族的毒素稱為如溶血素，細(xì)胞溶素或細(xì)胞毒素。盡管HAP-類群的許多產(chǎn)RTX成員已經(jīng)清楚，它們中的有些種類因它們造成的經(jīng)濟(jì)損失而臭名昭著。胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)產(chǎn)生對豬、馬、牛和人紅細(xì)胞、兔和豬的嗜中性細(xì)胞及豬肺泡的巨噬細(xì)胞有細(xì)胞毒/細(xì)胞溶解活性的RTX-毒素。(Rosendal等；美國獸醫(yī)研究雜志491053-1058(1988)，MaudsleyJ.R.和KadisS；加拿大微生物學(xué)雜志(Can.J.Microbiol.)32801-805(1986)，F(xiàn)rey.J和Nicolet.J；感染與免疫562570-2575(1988)，Bendixon等；感染與免疫33673-676(1981)，Kamp，E.M.和vanLeengoed，L.A.M.G.；臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)271187-1191(1989))。放線桿菌在豬中的感染會對養(yǎng)豬業(yè)導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因?yàn)樗鼤?dǎo)致幼豬嚴(yán)重死亡和較大豬的體重下降。溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahaemolytica)的RTX-毒素活性主要是針對反芻動物的嗜中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(Shewen和Wilie；感染與免疫(Inf.&amp;Immun.)35，91-94(1982)，Baluyut等；美國獸醫(yī)研究雜志421920-1926(1981)，Himmel等，美國獸醫(yī)研究雜志43764-767(1982))。巴斯德氏菌屬(Pasteurella)感染會導(dǎo)致反芻動物，尤其是牛和羊的嚴(yán)重問題。乳腺炎和肺炎既見于羊又見于牛中，而船熱(ShippingFever)會導(dǎo)致牛中的額外問題。由于巴斯德氏菌屬感染的經(jīng)濟(jì)損失是很大的。已知其它非-HAP類群細(xì)胞也產(chǎn)生RTX-毒素。大腸桿菌(E.coli)的溶血素對很多種不同動物的不同細(xì)胞是有毒的。它在接觸后的幾分鐘之內(nèi)裂解許多種動物的紅細(xì)胞。(Cavalieri，S.J.和Snyder.I.S.；感染與免疫37966-974(1982)，Gadeberg等；感染與免疫41358-364(1983)，Keane等；美國病理學(xué)雜志126305-357(1987)，Bhadki等；實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志169737-754(1989))。百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)溶血素也顯示出較寬的宿主細(xì)胞范圍。(Shattuck，R.L.和Storm，D.R.；生物化學(xué)246323-6328(1985)，Hewlett等，《蛋白質(zhì)細(xì)菌毒素》，Rappuoli，R.等(編)，Stuttgart，F(xiàn)isher-Verlag249-257(1990))。涉及革蘭氏-陰性細(xì)菌RTX毒素合成、激活和運(yùn)輸?shù)牟倏v子的遺傳結(jié)構(gòu)最近由Coote.J.G.加以綜述(FEMS微生物學(xué)綜述88137-162(1992))。一般地，RTX-操縱子含有4個基因?qū)嶋H的毒素-基因(A)、激活劑-基因(Activator-gene)(C)、和編碼參與毒素分泌到周圍介質(zhì)蛋白的兩個基因(B和D(以及在百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)中的E))。毒素-基因(A)的初級翻譯產(chǎn)物為無毒的蛋白。激活劑-基因(C)的作用是至關(guān)重要的因?yàn)樵摶蚓幋a的基因產(chǎn)物通過翻譯后的修飾而激活RTX-毒素的毒性。該激活導(dǎo)致毒素的結(jié)構(gòu)改變。如在百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)中，RTX-毒素的翻譯后修飾是由酰胺連接的十六烷?；?palmitoylation)賴氨酸殘基所致(Hackett等；科學(xué)266433-435(1994)。大腸桿菌(E.coli)的RTX-毒素可在體外通過從?；d體蛋白向溶血素原轉(zhuǎn)移一個脂肪酰基基團(tuán)而被激活(lssartel等；自然351759-761(1991))。已知(參見如Coote，J.G.；FEMS微生物學(xué)綜述88137-162(1992))，RTX-毒素是巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)細(xì)菌中重要的毒性因子。這已由Tascon等(分子微生物學(xué).14207-216(1994))和Jansen等(感染與免疫6327-37(1995))在如胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)中加以證實(shí)。已知毒性因子是插入疫苗的主要目標(biāo)。因此，已進(jìn)行過幾種用RTX-毒素作為亞單位-疫苗的嘗試。體內(nèi)合成的HAP-類群RTX-毒素本質(zhì)上是在RTX-激活劑蛋白存在下產(chǎn)生的。因此，RTX-毒素總是翻譯后修飾成高度有毒的蛋白。如果它們高度有毒，很明顯RTX毒素在用作疫苗成份之前必需被解毒。根據(jù)體外合成的喪失毒性的胸膜肺炎放線桿菌(A.pleuropneumoniae)RTX-毒素的亞單位疫苗較早已在如歐洲專利EPNo.0.354.628中加以描述，其中公開了根據(jù)胸膜肺炎放線桿菌溶血素和細(xì)胞毒素的亞單位疫苗，并且在歐洲專利EPNo0.453.024中公開了根據(jù)溶血素、細(xì)胞毒素和外膜蛋白的胸膜肺炎放線桿菌亞單位疫苗。根據(jù)溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahaemolytica)RTX毒素的亞單位疫苗也已被公開，如在美國專利No.5,055,400,加拿大專利申請CA2,014,033及加拿大專利申請CA2,081,950中。用作疫苗亞單位的RTX-毒素容易從野生型菌株細(xì)菌培養(yǎng)物上清中獲得。另一種獲得RTX-毒素作為亞單位的方法在加拿大專利申請CA2,045,950中被提出，其中描述了在異源菌株大腸桿菌(E.coli)中異源表達(dá)編碼胸膜肺炎放線桿菌RTX-蛋白的基因。然而，用這樣獲得的RTX-毒素的疫苗實(shí)驗(yàn)未被說明過。亞單位疫苗產(chǎn)生的類似方法在歐洲專利EP0.500.736中提出。在該專利中，公開了RTX毒素-基因(A)和激活劑-基因(C)的序列。也公開了在激活劑-基因C存在或不存在情況下毒素基因A表達(dá)的異源表達(dá)系統(tǒng)。然而用毒素亞單位的種痘實(shí)驗(yàn)未描述過。然而所有RTX-毒素亞單位疫苗有三大缺陷·為了充分激發(fā)免疫系統(tǒng)需要很大量的抗原物質(zhì)?！ねǔ?，僅B-細(xì)胞免疫性被激發(fā)?！せ畹牟≡哂性S多重要的免疫原性分子，如外膜蛋白和莢膜多糖，所有都具有重要的保護(hù)功能。因此，為了產(chǎn)生有效的亞單位疫苗，人們必須額外地包含進(jìn)盡可能多的其它免疫原性上重要的抗原。緊接著第一點(diǎn)和第二點(diǎn)，尤其是第三點(diǎn)提及的明顯問題是難以生產(chǎn)有效的亞單位疫苗。這可通過，如在上面提及的歐洲專利EPNo0.453.024中公開的胸膜肺炎放線桿菌亞單位疫苗加以說明，其中4個不同的亞單位(3個RTX-毒素和1個外膜蛋白)結(jié)合于一個疫苗中。很明顯，為了克服抗巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)-感染的亞單位疫苗的缺陷，活的減毒的疫苗將是高度必要的。活的減毒的疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)·它可用低劑量施用(它自我復(fù)制)·它密切模仿自然/野生型感染·它在同一時間內(nèi)提供所有可能的免疫學(xué)上重要的抗原。然而，盡管有明顯優(yōu)點(diǎn)，在本發(fā)明之前還沒有得到根據(jù)產(chǎn)生具有較少活性RTX-毒素的HAP-類群細(xì)菌的活的疫苗。缺乏活的減毒的疫苗的原因由下面的反論清楚地加以說明·活的減毒的疫苗菌株的第一個特征是它不應(yīng)該產(chǎn)生活性的RTX毒素，因?yàn)槿缟纤?，正是這種RTX-毒素才使HAP-類群菌株如此劇毒?！と欢ㄟ^喪失表達(dá)RTX-毒素的能力而毒性減弱的活的減毒細(xì)菌將實(shí)質(zhì)上缺乏最重要的毒性因子，即RTX-毒素，且因而將不會激發(fā)對該毒素的免疫反應(yīng)。因此，如果RTX-基因從HAP-類群菌株刪除且這種減毒菌株用作抗由毒性HAP-類群野生型菌株所致疾病疫苗的基礎(chǔ)，僅獲得部分的保護(hù)人們將不會獲得抵抗這些野生型菌株最重要的毒性因子，即RTX-毒素的保護(hù)免疫性。因此，不能期望基于RTX-毒素缺失細(xì)菌的疫苗在野生型菌株感染后提供對RTX-毒素?fù)p傷效應(yīng)的保護(hù)。缺乏apxI-操縱子的菌株由Reimer等制備(微生物病理(MicrobialPathog.)18197-209(1995)，它們?nèi)笔Я怂性谛啬し窝追啪€桿菌ApxI毒素合成和運(yùn)輸中起作用的基因。這樣的菌株正如預(yù)期的一樣是無毒的，因?yàn)樗鼈儾辉俜置谧钪匾亩拘砸蜃?；因此，RTX-毒素沒有抗體，更不用說保護(hù)性抗體，將被誘導(dǎo)以抵抗RTX-毒素。本發(fā)明首次提供活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素的巴斯德氏菌科(familyPasteurellaceae)細(xì)菌，它們的確產(chǎn)生RTX-A毒素，但是是非-活性形式。這些細(xì)菌具有異常的特征一方面毒性減弱，而另一方面，它們?nèi)阅軌虍a(chǎn)生RTX-毒素。這可通過以這樣的方式修飾細(xì)菌而完成即，使它們不產(chǎn)生功能性RTX-激活劑蛋白。然而，RTX-A毒素的表達(dá)不受影響。根據(jù)本發(fā)明的活的減毒菌株優(yōu)于亞單位疫苗及RTX-毒素基因缺失的活菌株的優(yōu)點(diǎn)在于·它們的確產(chǎn)生RTX-毒素以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗該毒素的保護(hù)性抗體·不過它們的毒性被減弱因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生非-毒性形式的RTX-毒素·它們額外擁有所有其它抗原，這些抗原與RTX-毒素相鄰，對獲得有效的免疫反應(yīng)是必需的。非活性形式的RTX-A毒素被認(rèn)為是無毒的，即沒有與活性毒素相同的毒性效應(yīng)。如上面提及的，可通過不產(chǎn)生功能性RTX-激活劑蛋白的方式修飾細(xì)菌而獲得。而RTX-A毒素的表達(dá)不受影響。功能性RTX-激活劑蛋白被認(rèn)為具有在野生型細(xì)菌中表達(dá)的RTX-激活劑蛋白的所有特征，且以野生型水平表達(dá)。因此，非功能性RTX-激活劑蛋白被認(rèn)為缺乏一些或所有在野生型細(xì)菌中表達(dá)的RTX-激活劑蛋白的特征，和/或以不足以獲得野生型活性RTX-毒素水平的水平表達(dá)。這里必須強(qiáng)調(diào)以下內(nèi)容如果非功能性RTX-激活劑蛋白缺乏如在野生型細(xì)菌中表達(dá)的RTX-激活劑蛋白的所有特征，該細(xì)菌將根本不產(chǎn)生活性的RTX-毒素。然而，如果非功能性RTX-激活劑蛋白僅缺乏如在野生型細(xì)菌中表達(dá)的RTX-激活劑蛋白的部分特征，該細(xì)菌可以產(chǎn)生部分活性形式的RTX-毒素和部分非活性形式的RTX-毒素。例如如果是由于突變而表達(dá)激活劑蛋白就是這種情況，但激活劑蛋白的激活效率下降。激活速度是激活劑蛋白激活RTX-毒素的速度，即，轉(zhuǎn)換RTX-毒素非活性形式至其活性形式的速度。因此不用說，產(chǎn)生部分非活性形式RTX-毒素和部分活性形式RTX-毒素的細(xì)菌也包括在本發(fā)明之內(nèi)。喪失達(dá)到野生型活性RTX-毒素水平的能力也許是由于RTX-激活劑蛋白活性降低的結(jié)果。這也可能是RTX-激活劑-蛋白表達(dá)水平下降的結(jié)果，或者兩種可能性都有。因此，活性下降和/或表達(dá)水平降低的RTX-激活劑-蛋白在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。另外，修飾RTX-激活劑蛋白的靶位點(diǎn)(即，RTX-毒素的?；?位點(diǎn))是可能的。如果該位點(diǎn)被修飾成?；某潭冉档突驘o酰化的程度，這也導(dǎo)致非-活性形式RTX-毒素的產(chǎn)生。?；?位點(diǎn)可用重組DNA技術(shù)容易地突變。突變也可通過如缺乏包括?；?位點(diǎn)的限制性片段或通過?；?位點(diǎn)的定點(diǎn)誘變而獲得。具有非功能性RTX-激活劑蛋白的活的減毒細(xì)菌可用幾種方法獲得。一種可能性是在編碼RTX-激活劑蛋白的基因中導(dǎo)入突變，優(yōu)選利用重組DNA技術(shù)。突變理解為上面提及區(qū)域的遺傳信息相對于存在于野生型細(xì)菌基因組該區(qū)域遺傳信息的改變。例如，突變是導(dǎo)致不產(chǎn)生功能性RTX-激活劑-蛋白的核酸取代、缺失、插入或倒位或其幾種的組合。當(dāng)前已知道許多有關(guān)HAP-類群產(chǎn)RTX-毒素菌株的RTX-激活劑基因的定位(location)、限制性圖譜和常常甚至是核苷酸序列。該信息可在如Coote，J.G的綜述(FEMS微生物學(xué)綜述88137-162(1992))中找到，他給出了不同RTX-毒素間結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的整體觀點(diǎn)。關(guān)于具體RTX-毒素的非常詳細(xì)的信息可在如涉及溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahaemolytica)RTX-基因的美國專利5,055,400，和Frey等；遺傳微生物學(xué)雜志1391723-1728(1993)和Frey等；1994愛德伯格(Edinburgh)英國，關(guān)于所有在胸膜肺炎放線桿菌(A.pleuropneumoniae)RTX-毒素的合成和運(yùn)輸中起作用基因的HAP-大會會議錄中找到。編碼RTX-激活劑蛋白基因或涉及該基因轉(zhuǎn)錄/翻譯序列的突變可用幾種方法獲得。一種可能性是在載體中克隆RTX-激活劑基因的相關(guān)序列，用限制性酶切除部分或全部的RTX-序列并以突變的序列替代野生型RTX-毒素基因。這樣的替代如通過眾所周知的同源重組技術(shù)而完成。另一種可能性是用定點(diǎn)誘變獲得所需的突變。這些標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)由如Sambrook等在《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)中描述。因此，在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌在編碼RTX-激活劑蛋白的基因中具有突變。該突變根據(jù)其大小和特征可導(dǎo)致活性減少或完全喪失活性的RTX-激活劑蛋白。在一個更為優(yōu)選的形式中，編碼RTX-激活劑蛋白的基因的突變是缺失。缺失的大小高度可變它可少到如一個核苷酸，從而導(dǎo)致移碼突變。另一方面，編碼RTX-激活劑蛋白的整個基因可被缺失。另一種可能性是保持編碼RTX-激活劑蛋白的基因完整，但降低RTX-激活劑蛋白的表達(dá)水平。由于毒素基因和激活劑-基因從多順反子信使RNA的同一個啟動子轉(zhuǎn)錄，故降低轉(zhuǎn)錄水平的同時不降低RTX-毒素的表達(dá)水平是不可能的。然而，RTX-激活劑蛋白表達(dá)水平的改變可通過向編碼RTX-激活劑蛋白基因上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)入突變而獲得，優(yōu)選通過用重組DNA技術(shù)。因此，在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌在控制RTX-激活劑的mRNA翻譯的區(qū)域，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)具有突變。這樣的突變影響編碼RTX-激活劑蛋白RNA的翻譯效率。根據(jù)它們的共有特征序列(Consensus-motive)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)與起始密碼子之間相對距離約5-6個核苷酸，核糖體結(jié)合位點(diǎn)一般容易檢測到。在許多情況下，例如對于幾個胸膜肺炎放線桿菌(A.pleuropneumoniae)的RTX-激活劑基因它們已被公開(Frey等，基因14297-102(1994))。在該實(shí)施方案的更為優(yōu)選的形式中，在控制RTX-激活劑mRNA翻譯區(qū)域的突變?yōu)槿笔?。例如，缺失可以包括缺失核糖體結(jié)合位點(diǎn)一個或更多個核苷酸。另外一個獲得具有非功能性RTX-激活劑蛋白的活的減毒細(xì)菌的可能性是增加編碼反義RNA的核酸序列，它可結(jié)合到編碼激活劑蛋白的信使RNA上。由此，這樣序列的表達(dá)導(dǎo)致激活劑蛋白水平的下降。反義RNA是具有與信使RNA(mRNA)序列部分或全部互補(bǔ)序列的RNA，相對于mRNA是反義的。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的活的減毒的細(xì)菌為胸膜肺炎放線桿菌。本發(fā)明也涉及保護(hù)動物免受用產(chǎn)RTX-毒素的巴斯德氏菌科細(xì)菌感染的疫苗。這樣的疫苗基于根據(jù)本發(fā)明的活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素細(xì)菌和藥物上可接受的載體。這些疫苗包括至少免疫有效量的根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)RTX-毒素的活的減毒的細(xì)菌。免疫有效意指接種施用的活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素的細(xì)菌量足以誘導(dǎo)宿主對產(chǎn)RTX-毒素細(xì)菌的毒性形式的有效免疫反應(yīng)。所施用的有用劑量將根據(jù)年齡、體重和接種的哺乳動物、施用方式及接種所要抵抗的病原體的類型而變化。疫苗可以包括足以引發(fā)免疫反應(yīng)的任何劑量的細(xì)菌。例如，在103與1010個細(xì)菌范圍的劑量是很合適的劑量。除了上述免疫有效量的活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素細(xì)菌外，根據(jù)本發(fā)明的疫苗也包含藥物上可接受的載體。這樣的載體可以為簡單的如水，但也可以包括如培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)液。另一種合適的載體是例如生理鹽濃度的溶液。其它藥物上可接受的用于本發(fā)明的載體或稀釋劑的實(shí)例包括穩(wěn)定劑如SPGA，碳水化合物(如，山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，葡萄糖，葡聚糖)，清蛋白或酪蛋白之類的蛋白，牛血清或脫脂乳之類的含蛋白的試劑及緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖液)。具有輔助活性的一種或更多種化合物可添加進(jìn)可不添加進(jìn)疫苗中。佐劑為非特異性的免疫系統(tǒng)刺激劑。它們增強(qiáng)宿主對入侵病原體的免疫反應(yīng)。本領(lǐng)域已知的佐劑的例子有弗氏完全或不完全佐劑、維生素E，非離子嵌段聚合物，胞壁酰二肽、ISCOMS(免疫刺激復(fù)合物，參看如歐洲專利EP109942)，皂角苷，礦物油，植物油及Carbopol(一種均聚物)。尤其適于粘膜使用的佐劑有如大腸桿菌(E.coli)不耐熱的毒素(LT)或霍亂毒素(CT)。其它合適的佐劑如氫氧化鋁，磷酸鹽或氧化物，油性-乳液(如BayolF(R)或Marcol52(R)，皂角苷或維生素E加溶物。因此，在優(yōu)選的形式中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗包括佐劑。關(guān)于施用于動物，根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以鼻內(nèi)，皮內(nèi)，皮下，噴劑或肌內(nèi)方式給藥。在更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗額外包括選自其它病原微生物或病毒的一個或更多個抗原。這樣的疫苗可通過向活的減毒的根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)RTX-毒素的細(xì)菌和上述藥物上可接受的載體中添加選自其它病原菌或病毒的一個或更多個抗原而獲得。當(dāng)然，不僅添加一個或更多個抗原，而且添加一個或更多個失活或活性形式的整個病原體也是可能的。另外，這也可用已知的重組DNA技術(shù)，通過向活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素細(xì)菌中克隆編碼選自其它病原微生物或病毒的一個或更多個抗原的遺傳信息而獲得。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌很適合作為這樣的遺傳信息的載體，因?yàn)樗鼈兙哂袦p毒的特征。根據(jù)本發(fā)明的額外帶有編碼選自其它病原微生物或病毒一個或更多個抗原遺傳信息細(xì)菌的疫苗可同時對兩種或更多種疾病產(chǎn)生免疫。無論從醫(yī)學(xué)或身體角度考慮，對于要接種的動物來說要比分別接種每種病原體當(dāng)然要輕松得多。在一更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗包括胸膜肺炎放線桿菌屬活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素的細(xì)菌。在一尤其更為優(yōu)選的形式中，這些抗原選自，但不限于由豬生殖呼吸綜合癥(PRRS)病毒，假狂犬病毒，豬流感病毒，豬細(xì)小病毒，可傳播胃腸炎病毒，旋轉(zhuǎn)病毒，大腸桿菌，Erysipelothrixrhusiopathiae，多殺巴斯德氏菌，支氣管炎博德特氏菌，副豬嗜血菌和豬鏈球菌組成的組。在另一個更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗包括溶血巴斯德氏菌屬活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素細(xì)菌。在該實(shí)施方案更為優(yōu)選的形式中，選自其它病原微生物或病毒的抗原選自由牛病原體組成的組，所述病原體包括牛旋轉(zhuǎn)病毒、牛病毒性腹瀉病毒、副流感3型病毒、牛副粘病毒、口啼疫病毒、多殺巴斯德氏菌、Haemophilussomnus、流產(chǎn)布魯氏菌、金黃色葡萄球菌、Streptococcusspp.，Mycoplasmaspp.和牛呼吸多核病毒。有好幾種貯存活的有機(jī)體的方法。例如貯存于冰箱是眾所周知的方法。在含有甘油的緩沖液中-70℃保存也是常用的。細(xì)菌也可于液氮中保存。冷凍干燥是另一種保存方法。冷凍干燥的細(xì)菌可被保存并維持存活數(shù)年。冷凍干燥的細(xì)菌的貯存溫度可大大高于零度而不影響其存活。冷凍-干燥可根據(jù)眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)冷凍-干燥方法完成。任選的有用的添加劑，如脫脂乳，海藻糖，明膠或牛血清白蛋白可在冷凍-干燥過程中加入。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，疫苗是凍干的形式。本發(fā)明也涉及用根據(jù)本發(fā)明的疫苗保護(hù)易感動物免受巴斯德氏菌科細(xì)菌的感染。在優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗用于保護(hù)易感動物免受胸膜肺炎放線桿菌的感染。本發(fā)明也涉及制備活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素巴斯德氏菌科細(xì)菌的方法。所述的方法包括在編碼RTX-激活劑蛋白基因中導(dǎo)入突變。在該方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，要導(dǎo)入的突變是RTX-激活劑蛋白基因中的缺失。最后，本發(fā)明涉及制備保護(hù)動物免受產(chǎn)RTX-毒素巴斯德氏菌科細(xì)菌感染的疫苗的方法。一種方法包括將根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌與上述藥物上可接受的載體混合。實(shí)施例實(shí)施例1活的減毒的胸膜肺炎放線桿菌菌株的制備。pApxI-D11的構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的活的減毒的細(xì)菌的可行性通過胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)△apxIC突變體的構(gòu)建加以說明。為了獲得該突變體，首先制備包括RTX-激活劑基因中缺失的質(zhì)粒。構(gòu)建綱要見于圖1。胸膜肺炎放線桿菌apxI操縱子序列保藏于GenBank，保藏號為X52899。從pJFF750(Gygi等；感染免疫603059-3064，1992)，apxIC和apxIA基因及啟動子區(qū)域被切成4481bp的BglII/PstI片段且克隆進(jìn)入質(zhì)粒pGEM3Z(PromegaCo.，LeidenNL)，以BamHI和PstI消化。得到的質(zhì)粒命名為pApxI-D1。用限制性酶XhoI消化切下包括大多數(shù)ApxIC編碼區(qū)的407bp的DNA片段，然后以限制酶Sspl部分消化。突出的粘性末端以S1-核酸酶將其轉(zhuǎn)變?yōu)槠蕉饲覐沫傊悄z中分離出約6800bp的片段且重新連接。得到的質(zhì)粒命名為pApxI-D2。橫跨XhoI/SspI缺失連接的序列通過核苷酸序列分析加以確證。隨后，大多數(shù)ApxIA的編碼區(qū)通過AfIII/SmaI消化，用S1-核酸酶補(bǔ)平和重新連接而被缺失。用限制酶PstI和SacI從pApxI-D3中切下1454bp的用于等位替代的交換卡式盒(exchangecassette)并克隆入以相同酶消化的載體pJQ200KS(Quandt等；基因12715-21，1993)中。得到的質(zhì)粒命名為pApxI-D4。pApxI-D4中sacB基因3’端通過HpaI消化而去除并以從pAP13中切下rpsL基因的540bp的EcoRV片段替代。得到的質(zhì)粒命名為pApxI-D11。結(jié)果得到質(zhì)粒pApxI-D11的結(jié)構(gòu)通過各種限制酶消化核查。消化圖譜表明的確獲得所需的質(zhì)粒。該質(zhì)粒進(jìn)一步用于△apxIC突變體的構(gòu)建。從胸膜肺炎放線桿菌HV211菌株構(gòu)建△apxIC突變體。質(zhì)粒pApxI-D11用于等位替代。為了此目的，通過用標(biāo)準(zhǔn)的濾膜配對(filtermating)技術(shù)(DeLorenzo和Timmis，酶學(xué)方法235386-405，1994)與大腸桿菌(E.coli)接合而將其導(dǎo)入胸膜肺炎放線桿菌。名為MBHPP101的大腸桿菌供體通過以質(zhì)粒pApxI-D11轉(zhuǎn)化SM10λpir菌株(Miller和Mekalanos，細(xì)菌學(xué)雜志1702575-25831988)而構(gòu)建。在鏈霉素存在下及后來鏈霉素和萘啶酮酸(菌株R)都存在下培養(yǎng)血清型10區(qū)分離物HV211(Serotype10fieldisolateHV211)(由Beck等測試的菌株之一，臨床微生物學(xué)雜志322749-2754，1994)后分離胸膜肺炎放線桿菌受體菌株MBHPP105。接合以后，經(jīng)固體培養(yǎng)基篩選，獲得對萘啶酮酸和慶大霉毒抗性的胸膜肺炎放線桿菌外接合體(exconjugant)。Southern印跡分析表明，得到的菌株(I)含有既作為環(huán)狀質(zhì)粒又整合進(jìn)ApxI操縱子的pApxI-D11DNA。這可從圖2的左邊組中看出，其中指示菌株DNA雜交到pApxI-D11的1.478KB的SalI/SacI片段上。在萘啶酮酸存在下進(jìn)一步培養(yǎng)后，菌株平板接種于含萘啶酮酸的血液瓊脂上且鑒定出無溶血帶胸膜肺炎放線桿菌菌落。結(jié)果通過Southern印跡分析確證得到的命名為MBHPP113的菌株為胸膜肺炎放線桿菌血清型10的ApxIC陰性突變體(見圖2)。正如預(yù)期，在SspI消化的MBHPP113菌株的染色體DNA中，僅一條帶與缺失區(qū)域兩側(cè)探針雜交(圖2，左邊組)。帶的大小(約4.4KB)相應(yīng)于親本菌株染色體DNA兩個雜交帶的總和，減去407bp的缺失。此外，已表明在MBHPP113中質(zhì)粒主鏈已不再存在(圖2，中間組)。最為重要的是，已表明包括apxIC基因的SspI/XhoI片段在MBHPP113中不復(fù)存在(圖2，右邊組)。實(shí)施例2△apxIC突變體MBHPP113RTX-毒素表達(dá)、分泌和溶血活性缺失的測試。胸膜肺炎放線桿菌△apxIC突變體MBHPP113溶血活性的缺失。為了證明MBHPP113中△apxIC的缺失效應(yīng)，經(jīng)血液平板培養(yǎng)后比較△apxIC菌株MBHPP113和野生型親本菌株的溶血活性。屬于血清型7(僅產(chǎn)ApxII)的胸膜肺炎放線桿菌參照菌株也被收入作為比較。由于ApxII具有中等的溶血活性，故該菌株顯示中度的溶血水平。用無菌牙簽將單個菌落轉(zhuǎn)移至含(0.1％NAD和2％羊紅血細(xì)胞的Columbia瓊脂板上。結(jié)果如從圖3中可以看出，經(jīng)37℃培養(yǎng)8小時后。HV211(野生型)，MBHPP105(R，即抗性菌株)和質(zhì)粒的整合突變體(I)如預(yù)期被溶血帶所包圍。血清型7(僅產(chǎn)ApxII)的胸膜肺炎放線桿菌參照菌株顯示出中度的溶血水平。也如預(yù)期的，△apxIC菌株MBHPP113(圖3中記作△)周圍未能檢測到溶血帶。該實(shí)驗(yàn)清晰顯示，△apxIC菌株MBHPP113的確不產(chǎn)生活性的Apx-毒素。△aPxIC菌株MBHPP113對apxIA的表達(dá)和分泌。根據(jù)本發(fā)明的△apxIC菌株預(yù)想是表達(dá)和分泌RTX-毒素，但是以非溶血的形式。表達(dá)和分泌在該實(shí)驗(yàn)中得到測試。通過來自各種胸膜肺炎放線桿菌菌株的濃縮培養(yǎng)上清液與所述的單特異性抗-ApxlA(Beck等，臨床微生物學(xué)雜志，32；2749-2754，1994)之間的反應(yīng)研究ApxIA蛋白的分泌?？?ApxIIA血清和其它血清型的野生型菌株主要用作比較。從巧克力瓊脂平板接種胸膜肺炎放線桿菌至5ml含0.1％NAD的ColumbiaBroth培養(yǎng)基，且在37℃培養(yǎng)6小時，同時以200rpm震搖。以10,000×g離心30分鐘后收集無細(xì)胞培養(yǎng)上清液。ApxIA蛋白根據(jù)制造商的操作指南用Centricon-100(MilliporeCo.，Etten-Leur，NL)濃縮濾膜濃縮20倍。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，蛋白與單特異性抗-ApxIA血清和抗-ApxIIA血清雜交和反應(yīng)。巧克力瓊脂板含KH2PO4(1g)，K2HPO4(4g)，NaCl(5g)，ProteosepeptoneNo3(15g)，淀粉(1g)，Bacto瓊脂(15g)，無菌水(至1000ml總體積)，羊血(100ml)，馬血清(100ml)及Isovitalex溶液(12ml)。結(jié)果濃縮的培養(yǎng)上清液在平行的聚丙烯酰胺凝膠上電泳并電印跡至Immobilon-P上，如圖4所示。得到的印跡在A組與單特異性抗-ApxIA血清反應(yīng)，且在B組與單特異性抗-ApxIIA血清反應(yīng)。測試的菌株為HV211(野生型)，MBHPP105(R，即抗性菌株)，質(zhì)粒整合突變體(I)，MBHPP113(△)(見從胸膜肺炎放線桿菌菌株HV211△ApxIC突變體的構(gòu)建)和血清型6，5a和5b的野生型參照菌株。血清型6的野生型參照菌株產(chǎn)ApxIIA，但無ApxIA。從圖4A中WT，R，I和△道的105KD-帶，很明顯，WT菌株以及R-菌株，I-菌株和MBHPP113菌株產(chǎn)生和向外輸出ApxlA蛋白。實(shí)施例2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，胸膜肺炎放線桿菌MBHPP113菌株的確能夠表達(dá)和向外輸出非活性形式的RTX-毒素。實(shí)施例3從胸膜肺炎放線桿菌菌株4074構(gòu)建△apxIC△apxIIC突變體菌株4074中的△apxIC突變的構(gòu)建按實(shí)施例1中所述完成。在鏈霉素存在下及隨后在鏈霉素和萘啶酮酸都存在下培養(yǎng)血清型1參照菌株(Frey和Nicolet，臨床微生物學(xué)雜志28232-236，1990)后分離胸膜肺炎放線桿菌受體菌株MBHPP104。MBHPP104與MBHP101(實(shí)施例1中所述)接合以后，獲得對萘啶酮酸和慶大霉素抗性的胸膜肺炎放線桿菌。將該菌株平板接種于含2％羊紅細(xì)胞，0.1％NAD和萘啶酮酸的CBM平板以后，鑒定出幾個具有較小溶血帶的菌落。通過Southern印跡分析，證明這其中的一個命名為MBHPP111的菌落為胸膜肺炎放線桿菌(A.pleuropneumoniae)菌株4074的apxIC陰性突變體。用接合供體菌株MBHPP142中的pApxII-D2構(gòu)建體(代替pApxI-D11)，以與apxIC缺失類似的方式將apxIIC缺失導(dǎo)入MBHPP111菌株。pApxII-D2的構(gòu)建示于圖5。簡言之，質(zhì)粒pJFFapxIICU15通過插入載體λZAPExpress(Stratagene公司)中含apxIIC和apxIIA基因(通過部分Sau3AI消化菌株4074染色體DNA獲得)的4.3kb的片段和用輔助噬菌體切成載體pBK-CMV(StratageneCo.)構(gòu)建。apxIIC編碼區(qū)的框內(nèi)缺失用pJFFapxIICU15為模板以寡APXIIC-OL(5’-CAATACCTTAAGATCATTTTTTAGCATCATCCC)和APXIIC-OR(5’-ACATTTCTTAAGTATGAGCAAGAGTTAATAACAGC)的PCR擴(kuò)增而完成。得到的8.5Kb的PCR片段以AflII消化并被重新連接。得到的質(zhì)粒命名為pApxII-D1且橫跨缺失位點(diǎn)的序列通過序列分析確證。pApxII-D1插入子切成SpeI/BglII片段且連接到以XbaI和BamHI消化的pAppEX-KG1中。得到的質(zhì)粒命名為pApxII-D2且轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E.coli)S17-1λpir(Simon等，生物技術(shù)1；784-791，1983)。該接合供體菌株命名為MBHPP142。MBHPP111與MBHP142接合以后，獲得萘啶酮酸和慶大霉素抗性的胸膜肺炎放線桿菌外接合體(exconjugant)，平板接種于含0.1％NAD，2％羊紅細(xì)胞及20μg/ml萘啶酮酸的CBM瓊脂平板上?？设b定出非溶血的胸膜肺炎放線桿菌菌落。通過Soutnern印跡分析確證其中一個命名為MBHPP147的菌落為胸膜肺炎放線桿菌菌株4074的apxICapxIIC缺失突變體。結(jié)果構(gòu)建步驟導(dǎo)致在apxIC和apxIIC基因中均具缺失的菌株MBHPP147。胸膜肺炎放線桿菌血清型1△apxC突變體的溶血活性培養(yǎng)于血液平板(如實(shí)施例2中所述)后比較△apxIC菌株MBHPP111，△apxIC△apxIIC雙缺失突變體MBHPP147和野生型親本菌株MBHPP104的溶血活性。單個菌落用無菌牙簽轉(zhuǎn)移至含0.1％NAD和2％羊紅血細(xì)胞的CBM平板上。經(jīng)37℃8小時培養(yǎng)后野生型菌株MBHPP104被2mm的β-溶血帶所包圍。仍產(chǎn)活性ApxIIA的MBHPP111菌株產(chǎn)生約1mm的更為擴(kuò)散的溶血帶(相當(dāng)于包圍已知僅產(chǎn)生ApxII的胸膜肺炎放線桿菌參照菌株血清型7和12的溶血帶)。MBHPP147雙缺失突變體為非溶血性的。結(jié)果apxIC缺失導(dǎo)致強(qiáng)溶血活性(ApxI溶血素典型特征)的喪失。隨后的apxIIC缺失導(dǎo)致溶血活性的完全喪失。結(jié)果總結(jié)于表1。表1菌株血液瓊脂上的溶血帶(mm)Western印跡反應(yīng)抗-ApxIA抗體抗-ApxIIA抗體MBHPP1042++MBHPP1111(d)++MBHPP1470++血清型102+-血清型121(d)-+</table></tables>表1溶血和Western印跡結(jié)果小結(jié)。溶血帶以mm表示且“(d)”表示擴(kuò)散性溶血。A“+”表示抗體與約105KDa的抗原在Western印跡中的反應(yīng)。A“-”表明缺乏這樣的反應(yīng)。從血清型1菌株4074獲得的△apxC菌株對ApxIA和ApxIIA的表達(dá)和分泌。通過各種胸膜肺炎放線桿菌菌株濃縮的培養(yǎng)上清液與單特異性抗-ApxIA和抗-ApxIIA血清在所述的Western印跡方法(Beck等，臨床微生物學(xué)雜志，32；2749-2754，1994和實(shí)施例2)中的反應(yīng)研究ApxIA蛋白的分泌。結(jié)果所有血清型1菌株(MBHPP104，MBHPP111和MBHPP147)顯示出仍然表達(dá)和分泌ApxIA及ApxIIA。作為對照，收入了血清型10菌株(僅表達(dá)ApxI)和血清型12菌株(僅表達(dá)ApxII)的濃縮上清液。結(jié)果總結(jié)于表1。實(shí)施例4在小鼠中△apxC突變對胸膜肺炎放線桿菌毒性的影響為了測定apxIC和/或apxIIC缺失對胸膜肺炎放線桿菌毒性的影響，7只小鼠(6-7周齡)為一組通過腹膜內(nèi)注射三種不同劑量的5種不同菌株感染(見表2)。菌株在含0.1％NAD的CBM培養(yǎng)基中新鮮培養(yǎng)且以0.9％(W/V)的NaCl溶液洗一次且重懸于相同的緩沖液至0.8OD600(相當(dāng)于約3.109cfu/ml)。然后用相同的緩沖液作10和100倍稀釋。每組小鼠腹膜內(nèi)注射0.5ml的其中一種菌株的一種稀釋液。剩余的感染培養(yǎng)物的系列稀釋液鋪板于含0.1％NAD的CMB平板上且計(jì)算感染培養(yǎng)物的真正cfu含量。結(jié)果從數(shù)據(jù)可斷定菌株HV211的LD50通過apxIC缺失至少增加20倍。對于菌株4074，單個△apxIC缺失導(dǎo)致10多倍LD50的增加。額外的△apxIIC突變又導(dǎo)致另外9倍的增加，加起來毒性總共至少90倍的降低。結(jié)果給于表2中。表2</tables>表2通過apxC基因缺失所致的胸膜肺炎放線桿菌的毒性減弱。菌株MBHPP105為萘啶酮酸和鏈霉素抗性的血清型10區(qū)分離物HV211(serotype10fieldisolateHV211)的衍生物；MBHPP113為源自MBHPP105的apxIC缺失突變體；MBHPP104為萘啶酮酸和鏈霉素抗性的血清型1參照菌株4074的衍生物；MBHPP111為源自MBHPP104的apxIC缺失突變體；MBHPP147為源自MBHPP111的apxICapxIIC雙缺失突變體。用活的MBHPP147作為疫苗保護(hù)小鼠免受胸膜肺炎放線桿菌感染用10只小鼠為1組共4組(見表3)。兩個組在7周齡時腹膜內(nèi)注射含1.5108細(xì)胞的MBHPP147菌株而被接種。4周后這些小鼠再用類似的注射強(qiáng)化。強(qiáng)化后2周，以腹膜內(nèi)注射108cfuMBHPP104菌株(毒性的血清型1菌株，MBHPP147衍生于此)感染一個接種過的組和一個未接種過的組。其它兩個組以106cfuMBHPP105菌株(一種毒性的血清型10菌株)感染。結(jié)果在對照組中所有小鼠死亡而10個接種小鼠中的9個抵御以血清型1菌株MBHPP104(p＝0.0001Fisherexacttest)的同源感染(homologouschallenge)，且10個接種小鼠中的4個被保護(hù)免受血清型10菌株MBHP105(p＝0.0433Fisherexacttest)的異源感染(heterolagouschallenge)。菌株MBHPP147可用作提供顯著同源和異源保護(hù)的活疫苗。結(jié)果顯示于表3。表3表3以MBHPP147接種后保護(hù)小鼠免受毒性血清型1(MBHPP104)和血清型10菌株(MBHPP105)的感染。附圖描述圖1pApxI-D11的構(gòu)建(見文中解釋)。標(biāo)出了所用質(zhì)粒的主要遺傳特征及所用的所有限制性位點(diǎn)。以前加入的XhoI和SspI限制位點(diǎn)處標(biāo)為“X/S”，由Frey等，基因142；97-102(1994)測定的ApxI操縱子的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)標(biāo)為“tsp”。圖2HV211野生型菌株(Wt)，衍生的鏈霉素和萘啶酮酸抗性菌株MBHPP105(R)，中度整合(I)和最終缺失構(gòu)建體MBHPP113(D)SspI消化的染色體DNA的Southern印跡分析。為了比較也收入了pApxI-D1(D1)和pApxI-D11(D11)質(zhì)粒。在左邊組，印跡與來自pApxI-D11的1.487KBSalI/SacI片段(含缺失兩側(cè)區(qū)域)雜交。在中間組，印跡與pApxI-D11載體骨架(分離為5004bp的SalI/SacI片段)雜交。在右邊組，印跡與位于apxIC缺失區(qū)內(nèi)的369bp片段(用PCR擴(kuò)增產(chǎn)生)雜交。圖3溶血平板分析。各種菌株用無菌牙簽挑到含0.1％NAD和2％羊紅血細(xì)胞的Columbia瓊脂平板上。平板然后于37℃培養(yǎng)8小時。從左至右，為接種的野生型HV211菌株(Wt)，萘啶酮酸及鏈霉素抗性菌株MBHPP105(R)，插入突變體(I)，缺失突變體MBHPP113(D)、及胸膜肺炎放線桿菌血清型7參照菌株。圖4ApxIA和ApxIIA的表達(dá)。濃縮的培養(yǎng)物上清液于平行聚丙烯酰胺凝膠上電泳且電印跡至Immobilon-P。得到的印跡在A組中與單-特異性的抗-ApxIA血清反應(yīng)，且在B組中與單-特異性的抗-ApxIIA血清反應(yīng)。測試的菌株為HV211(WT)，MBHPP105(R)，質(zhì)粒整合突變體(I)，MBHPP113(D)和血清型6，5a和5b野生型參照菌株。血清型6野生型參照菌株產(chǎn)生ApxIIA，但不產(chǎn)生ApxIA。圖5pApxII-D2的構(gòu)建。標(biāo)出所用質(zhì)粒的主要遺傳特征以及所用的所有限制位點(diǎn)。權(quán)利要求1)活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素的巴斯德氏菌(Pasteurellaceae)科細(xì)菌，其特征在于所述的細(xì)菌產(chǎn)生非活性形式的RTX-毒素。2)根據(jù)權(quán)利要求1的活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素的細(xì)菌，其特征在于其在編碼RTX-激活劑蛋白的基因中具有突變。3)根據(jù)權(quán)利要求1或2的活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素的細(xì)菌，其特征在于其在控制RTX-激活劑mRNA翻譯的區(qū)域具有突變。4)根據(jù)權(quán)利要求1-3的活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素的細(xì)菌，其特征在于所述的突變?yōu)槿笔А?)根據(jù)權(quán)利要求1-4的活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素的細(xì)菌，其特征在于所述的細(xì)菌為胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)。6)根據(jù)權(quán)利要求1-4的活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素的細(xì)菌，其特征在于所述的細(xì)菌為溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahaemolytica)。7)保護(hù)動物免受產(chǎn)RTX-毒素巴斯德氏菌(Pasteurellaceae)科細(xì)菌感染的疫苗，其特征在于所述的疫苗包含根據(jù)權(quán)利要求1-4的活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素的細(xì)菌和藥物上可接受的載體。8)根據(jù)權(quán)利要求7的疫苗，其特征在于其包含佐劑。9)根據(jù)權(quán)利要求7或8的疫苗，其特征在于所述疫苗為凍干形式。10)根據(jù)權(quán)利要求7-9的疫苗，其特征在于所述的活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素的細(xì)菌屬于胸膜肺炎放線桿菌屬(genusActinobacilluspleuropneumoniae)11)根據(jù)權(quán)利要求10的疫苗，其特征在于其額外包含選自由豬生殖呼吸綜合癥(PRRS)病毒，假狂犬病毒，豬流感病毒，豬細(xì)小病毒，可傳播的胃腸炎病毒，旋轉(zhuǎn)病毒，大腸桿菌，Erysipelothrixrhusiopathiae，多殺巴斯德氏菌，支氣管炎博德特氏菌，副豬嗜血菌和豬鏈球菌組成的組的一個或更多個抗原。12)根據(jù)權(quán)利要求7-9的疫苗，其特征在于所述的活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素的細(xì)菌屬于溶血巴斯德氏菌屬(genusPasteurellahaemolytica)。13)根據(jù)權(quán)利要求12的疫苗，其特征在于其額外包含選自由牛病原體組成的組的一種或多種抗原，所述病原體包括牛旋轉(zhuǎn)病毒、牛病毒性腹瀉病毒、副流感3型病毒、牛副粘病毒、口蹄疫病毒、多殺巴斯德氏菌、Haemophilussomus、流產(chǎn)布魯氏菌、金黃色葡萄球菌、Streptococcusspp.，Mycoplasmaspp.，和牛呼吸多核病毒。14)保護(hù)易感動物免受胸膜肺炎放線桿菌感染的方法，所述的方法包括施用根據(jù)權(quán)利要求10或11的疫苗。15)保護(hù)易感動物免受溶血巴斯德氏菌感染的方法，所述的方法包括施用根據(jù)權(quán)利要求12或13的疫苗。16)產(chǎn)生非活性形式RTX毒素的巴斯德氏菌科活的減毒的產(chǎn)RTX-毒素的細(xì)菌的制備方法，其特征在于所述的方法包括在編碼RTX-激活劑蛋白的基因中導(dǎo)入突變。17)根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其特征在于所述的突變通過導(dǎo)入缺失而獲得。18)保護(hù)動物免受巴斯德氏菌科產(chǎn)RTX-毒素的細(xì)菌感染之疫苗的制備方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1-6的細(xì)菌與藥學(xué)上可接受的載體混合。全文摘要本發(fā)明涉及活的減毒的巴斯德氏菌科產(chǎn)RTX－毒素的細(xì)菌,其中所說的減毒是由于它們產(chǎn)生非活性形式的RTX毒素。本發(fā)明也涉及保護(hù)哺乳動物使其免受巴斯德氏菌科產(chǎn)RTX－毒素之細(xì)菌感染的疫苗,以及所述活的減毒的細(xì)菌及疫苗的制備方法。文檔編號A61K39/39GK1173540SQ9711499公開日1998年2月18日申請日期1997年5月30日優(yōu)先權(quán)日1996年5月31日發(fā)明者R·P·A·M·塞格斯,J·F·博?！ね稹さ?J·弗雷申請人:阿克佐諾貝爾公司