專利名稱：一種生態(tài)安全型根瘤菌制劑生產(chǎn)工藝與方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，涉及根瘤菌分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域及其制劑的創(chuàng)制。
根瘤菌是能與豆科植物共生固氮的土壤微生物。在伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(第8版，1977)中，屬于根瘤菌科(Rhizobiaceae)的根瘤菌屬(Rhizobium)。近年來，隨著研究工作的深入，已進一步細(xì)分出根瘤菌屬、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、中生根瘤菌屬(Mesorhizobium)和固氮莖瘤菌屬(Azorhizobium)等5個屬，共17個種。
根瘤菌在培養(yǎng)條件下為革蘭氏染色負(fù)反應(yīng)(G)的桿菌，大小0.5-0.9×1.2-3.0μm，有單生、側(cè)生或周生鞭毛，能運動。由于含有折光性的多聚β-羥基丁酸顆粒性貯藏物質(zhì)使細(xì)胞染色不均勻而呈環(huán)節(jié)狀，細(xì)胞外多含有粘液性物質(zhì)而使菌落呈無色粘液狀。
根瘤菌在與植物共生的根瘤中多發(fā)育分化為膨大的棒狀、T形、Y形或X形等類菌體，利用豆科植物提供的碳源和能源發(fā)揮固氮作用，并以氨態(tài)、酰脲或酰胺態(tài)形式為植物提供氮素養(yǎng)料。
根瘤菌系化能異養(yǎng)微生物。一般能利用多種糖類、多元醇和有機酸，合適的碳源有葡萄糖、甘露醇、蔗糖和甘油等。能利用無機氮化物(NH4+和NO3-)，但加有機氮化物(如豆芽汁或酵母汁)時能更好生長。多數(shù)根瘤菌需要維生素類生長因子(如硫胺素、泛酸鈣、尼克酰胺和生物素等)。常用的根瘤菌培養(yǎng)基有甘露醇酵母汁培養(yǎng)基(YMA)、豆芽汁培養(yǎng)基(SSB)和基本培養(yǎng)基(SM)等。
根瘤菌屬于中溫性有機營養(yǎng)型微生物，其最適生長溫度為25-30℃，在35℃以上的高溫條件下多停止生長。
根瘤菌與豆科植物的共生關(guān)系具有專一性并表現(xiàn)為互接種族關(guān)系，即特定類群的根瘤菌只能感染一定種類的豆科植物，只有屬于同一互接種族的植物才能互相利用其根瘤菌結(jié)瘤固氮。
本發(fā)明所用的大豆根瘤菌為費氏中華根瘤菌(Sinorhizobium fredii)，抗萘啶酮酸和青霉素，世代時間為2.7小時。
必需基因或看家基因(housekeeping gene)系指生物生存必需的基因，它們一般參與控制生物的主要代謝過程，必需基因的突變或缺失將導(dǎo)致生物對該基因參與控制代謝產(chǎn)物的依賴，一旦環(huán)境或培養(yǎng)基中缺少該代謝產(chǎn)物，將導(dǎo)致突變生物的死亡。
Bertino和Stacey(1966)報道可以用氨基喋呤(aminopterin)或三甲氧芐二氨嘧啶(trimethoprim)與野生型大腸桿菌共培養(yǎng)來富集并篩選出嘧啶缺失突變株(J B Bertino and K A Stacey，1966，.Asuggested mechanism for the selective procedure for isolating thymine-requiring mutants of Escherichiacoli.Biochen J，10132-33。
Quandt和Hynes(1993)構(gòu)建成適用于G-細(xì)菌基因定位置換的自殺性重組質(zhì)粒pJQ200、pJQ210和pJQ254，特別適用于進行G-細(xì)菌必需基因的定位誘變以簡化突變株的篩選方法(Quandt，J andHynes M F.，1993，Versitile suicide vectors which allow selection for gene replacement in Gram-negativebacteria，Gene，12715-21)。
上述經(jīng)自發(fā)或誘發(fā)突變獲得的生活力下降的病原微生物已被長期用于動物或人的免疫預(yù)防接種。Straley等(1984)比較研究了具有代謝缺陷的鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)弱毒株的生存能力(S C Straley et al.，1984，Growth in mouse peritoneal macrophages of Yersinia pestis lackingestablished virulence determinants，Infection and Immunity，45(3)649-654)。
Noriega等(1994)用編碼芳香族氨基酸合成酶基因aroA缺失的志賀氏菌(Shigella sp.)突變株作免疫原接種，證實它們能與野生型菌株一樣誘發(fā)抗體的產(chǎn)生[4]。伯納得斯等(1993)向中國專利局提出了名為“一種含有偽狂犬病病毒突變株的疫苗”的專利申請(專利申請?zhí)枮?3108805)，該專利以病毒糖蛋白gp50突變株生產(chǎn)疫苗，可有效預(yù)防動物的偽狂犬病。Gicguel等于1998年向美國專利局提交了名為“用作疫苗免疫原的弱化重組分枝桿菌”的專利申請(專利申請?zhí)?261568)。該專利采用基因定位置換法篩選獲得了結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)嘌呤合成酶必需基因purC突變的弱毒株。突變株用于免疫注射時雖然降低了增殖能力，在哺乳動物體內(nèi)的存活時間仍然能引起與野生型菌株相同的免疫反應(yīng)(Gicquel B et al，1998，Attenuatedrecombinant mycobacteria useful as immunogens or as vaccine components，United States Patent6261568.)。
隨著近代分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)的發(fā)展，一大批轉(zhuǎn)基因的重組微生物制劑已獲得有關(guān)基因工程安全管理機構(gòu)的批準(zhǔn)進入小區(qū)試驗、環(huán)境釋放或商品化生產(chǎn)。雖然重組微生物制劑在批準(zhǔn)前已逐級進行了嚴(yán)格的安全性試驗，證明它們的釋放沒有對環(huán)境中的其它生物產(chǎn)生可以檢測到的影響，但是仍難于排除由此而產(chǎn)生的生存競爭及其對其它環(huán)境生物的潛在威脅，尤其是當(dāng)重組微生物帶有抗性基因標(biāo)記時，重組微生物在環(huán)境中的存在將始終存在抗性基因向土著性微生物或其它環(huán)境生物轉(zhuǎn)移的可能性。
本發(fā)明的目的在于提出一種生態(tài)安全型根瘤菌制劑的生產(chǎn)工藝和方法，該根瘤菌只能在人工控制條件下生長繁殖并發(fā)揮其作用，在土壤、河流、湖泊和海洋等自然環(huán)境中將因得不到必需的營養(yǎng)物而死亡。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)采用分子生物學(xué)方法與技術(shù)，構(gòu)建和篩選費氏中華根瘤菌(Sinorhizobium fredii)嘌呤合成酶基因purL的突變株，該突變株只能在供給該必需基因產(chǎn)物嘌呤的人工培養(yǎng)條件下生長繁殖，一旦釋放到不含嘌呤的環(huán)境中時將因得不到該代謝產(chǎn)物而死亡。為了克服費氏中華根瘤菌突變株只結(jié)瘤不固氮的缺陷，本申請采用基因工程技術(shù)，從費氏中華根瘤菌中用PCR擴增法釣出該嘌呤purL的結(jié)構(gòu)基因，按以下技術(shù)路線構(gòu)建生態(tài)安全的費氏中華根瘤菌將已報道的根瘤菌誘導(dǎo)型固氮酶調(diào)節(jié)基因fixK啟動子和purL結(jié)構(gòu)基因一道克隆到可在大腸桿菌和費氏中華根瘤菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的穿梭質(zhì)粒載體上，將獲得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入上述PurL-突變株即可篩選獲得生態(tài)安全的重組費氏中華根瘤菌。該重組根瘤菌在人工培養(yǎng)或工業(yè)化生產(chǎn)時，可以用含有嘌呤的完全培養(yǎng)基生產(chǎn)接種劑。接種后與豆科植物形成根瘤的共生條件可以誘導(dǎo)fixK啟動子啟動purL基因的表達而恢復(fù)其共生固氮作用。一旦重組根瘤菌釋放到環(huán)境中之后，將由于缺少嘌呤營養(yǎng)物而不能生長，并且很快從環(huán)境中消亡。
以下對本發(fā)明作進一步描述一種構(gòu)建并篩選生態(tài)安全型重組根瘤菌的的方法，其特征包括如下步驟(1)根瘤菌必需基因突變株的篩選以費氏中華根瘤菌生產(chǎn)菌株為出發(fā)菌，采用定位誘變將發(fā)光酶標(biāo)記基因luxAB插入purL基因并克隆到不能在根瘤菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的自殺質(zhì)粒上，經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入供試根瘤菌后，可以從野生型出發(fā)菌中篩選獲得穩(wěn)定的嘌呤合成酶基因缺陷的PurL-突變株；(2)必需基因purL結(jié)構(gòu)基因的克隆根據(jù)已報道的purL基因的編碼區(qū)5’和3’端序列再加上與擬用克隆載體的克隆位點相適合的限制性內(nèi)切酶位點設(shè)計并合成出一對引物，從供試菌基因組中擴增出purL基因的結(jié)構(gòu)基因，經(jīng)與同樣雙酶切并能在根瘤菌和大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)均能復(fù)制的穿梭載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選獲得含有purL結(jié)構(gòu)基因重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，從中分離出以purL基因為報告基因的啟動子探針載體；(3)誘導(dǎo)表達purL基因的克隆在基因信息庫上查出費氏中華根瘤菌共生條件下誘導(dǎo)表達的fixK基因啟動子區(qū)的DNA序列，根據(jù)purL結(jié)構(gòu)基因和穿梭載體的要求設(shè)計并人工合成出含有相應(yīng)雙酶切位點的誘導(dǎo)型啟動子序列，用于與經(jīng)同樣雙酶切的(2)步驟中所構(gòu)建的啟動子探針載體連接，構(gòu)建成含有誘導(dǎo)表達purL基因的重組質(zhì)粒。
(4)生態(tài)安全型重組根瘤菌的構(gòu)建與篩選用步驟(3)中獲得的含誘導(dǎo)型表達purL基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化在步驟(1)中得到的PurL-突變株，在編號為SM的基本培養(yǎng)基和YMA平板上篩選轉(zhuǎn)化子，只有在YMA上生長、在SM上不生長者才是需要的生態(tài)安全型重組費氏中華根瘤菌。
附圖及其說明

圖1，是本發(fā)明的基因置換載體pHN701的物理圖譜。
本發(fā)明的效果與常用的根瘤菌制劑相比，本發(fā)明的生態(tài)安全型根瘤菌菌劑的優(yōu)點如表1所示表1 本發(fā)明的根瘤菌菌劑與常用根瘤菌菌劑性能比較序號 比較項目 生態(tài)安全型根瘤菌劑 常規(guī)根瘤菌劑1 生存性 可誘導(dǎo)調(diào)節(jié) 不可調(diào)節(jié)2對環(huán)境安全性高低3 標(biāo)記基因 有無4 在環(huán)境中的追蹤檢測 容易 困難5 抗性基因轉(zhuǎn)移性 無 難于徹底排除抗生素用量對于大腸桿菌為慶大霉素20μg/ml，氨芐青霉素100μg/ml；對于根瘤菌為鏈霉素200μg/ml，慶大霉素20μg/ml。
篩選同源雙交換時培養(yǎng)基中添加蔗糖用量為10％。
2.大腸桿菌與根瘤菌間的接合轉(zhuǎn)移含有目的質(zhì)粒的大腸桿菌S17-1經(jīng)活化后在LB液體中培養(yǎng)至對數(shù)中期，與活化后在TY液體培養(yǎng)至對數(shù)中期的根瘤菌HH103等體積混合，菌體用TY液體洗滌三次后用小量TY液體懸浮，滴加在鋪于TY平板上的微孔濾膜上，28℃下靜置1-2天，用無菌水稀釋涂在含所需抗生素的SM平板上，挑取長出的菌落作相應(yīng)的分析。
3.質(zhì)粒DNA的抽提與克隆操作參照《分子克隆實驗指南》介紹的方法。
4.植物土培盆栽結(jié)瘤試驗供試大豆品種為黑農(nóng)33和鄂豆4號，土壤為經(jīng)121℃30分鐘滅菌的黃棕壤，用市售滅菌盆栽花瓷缽作盆栽試驗，大豆經(jīng)表面滅菌催芽后播種，并接種100倍稀釋菌劑1ml。在光照室培養(yǎng)，需要灌水時用無菌水補至原盆缽重。
二.操作步驟1.基因置換載體pHN701的構(gòu)建費氏中華根瘤菌L178(pMUS509)中含有攜帶有purL全基因的pMUS509質(zhì)粒。設(shè)計PCR引物，左端從purL結(jié)構(gòu)基因開始，帶有XbaI位點，序列為ACATCTAGAACGATGACGATTTCCAACACC，右端在purL轉(zhuǎn)錄終止子以后帶有EcoRV位點，序列為CATGTCTTCGCTATCGCCTG。用該引物對以pMUS509為模板，采用高保真pfu酶，擴增出含purL結(jié)構(gòu)基因的DNA片段，全長約2.4kb。PCR條件為96℃預(yù)熱3分鐘，再以96℃1分鐘，57℃2分鐘，72℃4分鐘循環(huán)25次，最后72℃10分鐘。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后用XbaI和EcoRV雙酶切并與同樣雙酶切的pUCM-T載體進行連接，得到重組質(zhì)粒pHNPURL1。pHN101質(zhì)粒上攜帶有約3.3kb的luxAB片段，可用BglII切下，經(jīng)純化后與BglII酶切的pUCM-T載體相連，得到重組質(zhì)粒pHNLUX1，再用NotI和XhoI雙酶切下luxAB片段，與經(jīng)同樣雙酶切的pHNPURL1載體連接，可得到pHNPURL2載體，purL結(jié)構(gòu)基因中的NotI-XhoI片段已被luxAB取代，造成基因的缺失破壞。再用XbaI和KpnI酶切下4.7kb已插入luxAB的purL片段，與同樣酶切的pJQ200KS載體相連，得到基因置換載體pHN701(由圖1所示)。
2.腺嘌呤缺陷型突變株的篩選用pHN701轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-1，活化后在LB液體中培養(yǎng)至對數(shù)中期，與培養(yǎng)至對數(shù)中期的S.fredii HH103等體積混合后加2ml無菌水，將菌液均勻涂在SMAV固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)一周，長出的菌落經(jīng)在TY平板活化，共得到9個可能發(fā)生了單交換的菌株。選取5個在SMVA中培養(yǎng)24小時，菌液稀釋至10-3，均勻涂在添加了10％蔗糖的SMAV平板上，同時設(shè)置不加蔗糖的平板作為對照。培養(yǎng)7天后可以發(fā)現(xiàn)在5個含蔗糖平板上各長出23、40、9、6和38個菌落，而不加蔗糖平板上的菌落數(shù)均達104左右，這些在蔗糖平板長出的菌落即可能是發(fā)生了雙交換而丟失了sacB基因。為了驗證是否發(fā)生了基因交換并且破壞了其原有正常的purL基因，選取部分菌落分別點種在SM和SMAV平板上，28℃培養(yǎng)3天后，發(fā)現(xiàn)有一些菌落在SMAV平板上長勢與野生型相同，而在SM培養(yǎng)基上不生長或生長極其緩慢。將這些生長需要腺嘌呤的菌落接種在液體培養(yǎng)基上檢驗，證實均系purL基因破壞的腺嘌呤缺陷型突變株。將它們命名為P825。
6.含共生特異性啟動子Pfixk的purL誘導(dǎo)表達系統(tǒng)的建立為了使purL基因能在共生固氮過程中特異性表達，需要對基因的啟動子進行改造，換成共生固氮過程的特異性啟動子。為此本發(fā)明選擇了苜宿中華根瘤菌(Sinorhizobium.meliloti)的fixK啟動子進行purL原有啟動子的改造。PfixK受厭氧感應(yīng)組分FixJ的調(diào)控(David，M.Cell，1988，54671-683)，在共生固氮階段特異性啟動。
S.meliloti的fixK全基因序列，設(shè)計引物擴增它的啟動子并包含核糖體結(jié)合位點的SD序列。PfixK的引物為5’-CTCAAGCTTCTTCTGATCTGCCGAGTTGA和3’-ACATCTAGATTCCCCGTTCGATGTGGGGAC，左右引物分別含HindIII與XbaI位點。以S.meliloti總DNA為模板擴增PfixK。PCR條件為94℃預(yù)熱3分鐘，以94℃1.5分鐘，56℃2分鐘，72℃1.5分鐘循環(huán)25次，最后72℃10分鐘。得到PfixK片段約500kb。擴增片段經(jīng)純化，用HindIII與XbaI雙酶切，與經(jīng)同樣酶切的pUCM-T載體連接，得到重組質(zhì)粒pHNFIXK。質(zhì)粒pHNPURL1用XbaI和KpnI酶切，回收2.4kb的含purL結(jié)構(gòu)基因的片段，與同樣酶切的pHNFIXK載體連接，得到重組質(zhì)粒pHNFKP，purL的啟動子則更換成PfixK。質(zhì)粒pBBR1MCS5是能在根瘤菌和大腸桿菌中穩(wěn)定遺傳的穿梭載體，用HindIII和KpnI雙酶切該質(zhì)粒，與來自pHNFKP的含誘導(dǎo)型啟動子的purL片段相連，得到重組質(zhì)粒pHN801K。其上攜帶有PfixK+purL的共生特異性表達基因。另外，還將的purL結(jié)構(gòu)基因克隆到pBBR1MCS5上，命名為pHN801C，作為無啟動子對照。
7.生態(tài)安全型重組大豆根瘤菌的獲得將pHN801C和pHN801K分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17-1中，與前面已得到的腺嘌呤缺陷型菌株作接合轉(zhuǎn)移，在SM+鏈霉素(200μg/ml)+慶大霉素(20μg/ml)平板上篩選到轉(zhuǎn)移子，即得到生態(tài)安全性重組大豆根瘤菌S.fredii P825(pHN801C)和P825(pHN801K)。
8.盆栽實驗將供試大豆種子表面滅菌并催芽后，播種在無菌土缽中，分別用S.fredii HH103，P825，P825(pHN801C)和P825(pHN801K)活化后接種，光照培養(yǎng)40天后測定各處理植株生長狀況與干重，并分別在收后7天，15天，1月，2月，3月，4月，5月和6月內(nèi)取土樣檢測發(fā)光根瘤菌數(shù)量。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建并篩選生態(tài)安全型重組根瘤菌的的方法，其特征包括如下步驟(1)根瘤菌必需基因突變株的篩選以費氏中華根瘤菌為出發(fā)菌，采用定位誘變將發(fā)光酶標(biāo)記基因luxAB插入purL基因后克隆到不能在根瘤菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的自殺質(zhì)粒上，經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入根瘤菌株后從野生型出發(fā)菌中篩選獲得穩(wěn)定的嘌呤合成酶基因缺陷的PurL-突變株；(2)必需基因purL結(jié)構(gòu)基因的克隆根據(jù)已報道的purL基因的編碼區(qū)5’和3’端序列再加上與擬用克隆載體的克隆位點相適合的限制性內(nèi)切酶位點設(shè)計并合成出一對引物，從供試菌基因組中擴增出purL基因的結(jié)構(gòu)基因，經(jīng)與同樣雙酶切并能在根瘤菌和大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)均能復(fù)制的穿梭載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選獲得含有purL結(jié)構(gòu)基因重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，從中分離出以purL基因為報告基因的啟動子探針載體；(3)誘導(dǎo)表達purL基因的克隆根據(jù)費氏中華根瘤菌共生條件下誘導(dǎo)表達的fixK基因啟動子區(qū)的DNA序列、purL結(jié)構(gòu)基因和穿梭載體的要求設(shè)計并人工合成出含有相應(yīng)雙酶切位點的誘導(dǎo)型啟動子序列，用于與經(jīng)同樣雙酶切的(2)步驟中所構(gòu)建的啟動子探針載體連接，構(gòu)建成含有誘導(dǎo)表達purL基因的重組質(zhì)粒；(4)生態(tài)安全型重組根瘤菌的構(gòu)建與篩選用步驟(3)中獲得的含誘導(dǎo)型表達purL基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化在步驟(1)中得到的PurL-突變株，在編號為SM基本培養(yǎng)基和YMA平板上篩選轉(zhuǎn)化子，只有在YMA上生長、SM上不生長者才是需要的生態(tài)安全型重組費氏中華根瘤菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物根瘤菌分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于提出一種生態(tài)安全型根瘤菌制劑的生產(chǎn)工藝和方法，該根瘤菌只能在人工控制條件下生長繁殖并發(fā)揮其作用，在土壤、河流、湖泊和海洋等自然環(huán)境中將因得不到必需的營養(yǎng)物而死亡。本發(fā)明的要點是通過根瘤菌必需基因突變株的篩選，必需基因purL結(jié)構(gòu)基因的克隆，誘導(dǎo)表達purL基因的克隆，從而構(gòu)建、篩選得到生態(tài)安全型重組根瘤菌，以該菌為原料制成一種生態(tài)安全型根瘤菌制劑。
文檔編號C12N15/70GK1412299SQ01133548
公開日2003年4月23日 申請日期2001年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月11日
發(fā)明者周俊初 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)