專利名稱：發(fā)酵與擴(kuò)張床原位吸附耦合的乳酸生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種乳酸生產(chǎn)的新工藝。具體的說是采用發(fā)酵 方法生產(chǎn)乳酸；發(fā)酵過程中，采用擴(kuò)張床分離乳酸的工藝與發(fā)酵過程耦合，實(shí)現(xiàn)乳酸的在線 分離。
背景技術(shù)：
乳酸是一種重要的多用途有機(jī)酸，廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工、制革、紡織、環(huán)保和 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域。乳酸的衍生物_聚乳酸(PLA)，可以用來生產(chǎn)可生物降解纖維、可生物降 解塑料以及可生物降解醫(yī)用材料等，目前引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注。乳酸生產(chǎn)可分為化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵方法。其中化學(xué)合成方法環(huán)境污染嚴(yán) 重，原料價(jià)格較貴；而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸原料來源廣泛，生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品光學(xué)純度高、 安全性高，所以成為生產(chǎn)乳酸的重要方法。自然界中可產(chǎn)生乳酸的微生物很多，但目前應(yīng)用發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸常用的微生 物僅有兩大類，一類為乳酸細(xì)菌(Lactic acid bacteria)；另一類為根霉(Rhizopus)。目前，國內(nèi)外多采用根霉中的米根霉(Rhizopus oryzae)進(jìn)行L-乳酸的發(fā)酵。米 根霉?fàn)I養(yǎng)要求低，在發(fā)酵過程中對(duì)低PH環(huán)境有較高的耐受性，并且產(chǎn)物為高光學(xué)純度的 L-乳酸。但是，根霉的乳酸產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率比乳酸細(xì)菌低，并且產(chǎn)物除了乳酸外，還有富馬酸、 琥珀酸、甘油和乙醇等大量的副產(chǎn)物，使乳酸的提取和精制變得困難。基于上述原因，近年來人們逐漸將目光轉(zhuǎn)向同型發(fā)酵的乳酸細(xì)菌。用于乳酸生 產(chǎn)的菌屬主要有乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Sti^ptoccoccus)和芽胞桿菌屬 (Bacillus)以及最近報(bào)道的腸球菌屬(Enterococcus)。近年來，已經(jīng)用于生產(chǎn)的主要是乳 桿菌。通過菌種選育和培養(yǎng)物質(zhì)及培養(yǎng)條件的控制，發(fā)酵生產(chǎn)的L-乳酸可以達(dá)到高的光學(xué) 純度。并且乳桿菌的厭氧發(fā)酵或兼性厭氧發(fā)酵使可以大規(guī)模降低能耗，有利于連續(xù)發(fā)酵，減 少乳酸的生產(chǎn)成本。同型發(fā)酵的乳桿菌的實(shí)際轉(zhuǎn)化率大多在90%以上。另外，乳桿菌生長 速率較高，在很短的時(shí)間形成優(yōu)勢(shì)菌群，不易污染雜菌。從國際乳酸生產(chǎn)研究發(fā)展上看，應(yīng) 用乳桿菌進(jìn)行L-乳酸生產(chǎn)已成為趨勢(shì)。尤其是鼠李糖乳桿菌(Lb. rhamnosus)生產(chǎn)L-乳 酸，轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品光學(xué)純度高，成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。乳酸發(fā)酵是一個(gè)典型的產(chǎn)物抑制性發(fā)酵過程，大量乳酸的積累嚴(yán)重抑制了發(fā)酵進(jìn) 程和乳酸菌的生長。乳酸發(fā)酵最適PH值為5. 5-6. 0，pH值小于5. 0時(shí)發(fā)酵被抑制，乳酸產(chǎn) 率僅約為1. 6%。乳酸發(fā)酵過程中隨著乳酸的不斷產(chǎn)生，發(fā)酵液的pH值不斷降低，使乳酸菌 的生長和產(chǎn)酸受到抑制，乳酸產(chǎn)率降低。如果不及時(shí)將產(chǎn)物分離或中和，發(fā)酵將無法繼續(xù)進(jìn) 行下去。傳統(tǒng)的發(fā)酵方法是添加碳酸鈣、氫氧化鈉、氨水中和產(chǎn)生的乳酸，以維持最適pH 值。由于乳酸鈣溶解度大，約有30%乳酸鈣殘留在結(jié)晶母液中，不能析出。此外過高的乳 酸鹽對(duì)乳酸菌的代謝也有抑制作用，在發(fā)酵液中造成乳酸菌活性下降，而使發(fā)酵周期延長。 發(fā)酵與分離耦合可以有效地解決這一問題。目前常用的發(fā)酵與分離耦合方法有電滲析
3(EDF)法、萃取法和離子交換層析法。電滲析法有很多優(yōu)點(diǎn)(1)不用中和劑就可以控制PH 值；(2)降低產(chǎn)物抑制；(3)濃縮產(chǎn)物；(4)簡化后提取工藝。但若不組合精密過濾裝置，乳 酸菌細(xì)胞會(huì)逐漸附著到陰離子膜上，造成乳酸菌細(xì)胞被殺死，發(fā)酵液中活細(xì)胞減少；另外還 會(huì)導(dǎo)致滲析膜電阻增大，電滲析效率下降。因此，在乳酸的電滲析法連續(xù)生產(chǎn)中，乳酸菌對(duì) 膜的吸附成為限制因素。萃取法提取發(fā)酵具有能耗低，溶劑選擇性高和無細(xì)菌污染等優(yōu)點(diǎn)。 研究者對(duì)乙醇、丁醇的提取發(fā)酵進(jìn)行了廣泛的研究，十二烷醇、油醇是常用的提取劑。但是 目前萃取的方法還是停留在研究階段，而且反萃問題尚未得到很好的解決。從工業(yè)化生產(chǎn)的角度來看，離子交換樹脂法以選擇性高、交換容量大、操作簡便、 易于自動(dòng)化控制等優(yōu)點(diǎn)具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。但是目前用來進(jìn)行乳酸吸附的層析柱都是固定 床層析柱，如乳酸菌固定化細(xì)胞原位分離發(fā)酵生產(chǎn)乳酸(CN200310106657. 8)，可是在進(jìn) 入層析柱之前仍需要先經(jīng)過固液分離處理，否則發(fā)酵液帶著滲漏的菌體進(jìn)入固定床層析柱 就很容易發(fā)生堵塞，無法實(shí)現(xiàn)原位分離。然而利用擴(kuò)張床層析柱與發(fā)酵相耦合則可以克服 固定床的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)在線分離乳酸，解除抑制。本發(fā)明使用的擴(kuò)張床吸附(Expanded bed adsorption. EBA)技術(shù)是20世紀(jì)90年 代發(fā)展起來的新型分離純化技術(shù)。不同于固定床和流化床，擴(kuò)張床中介質(zhì)處于穩(wěn)定分級(jí)的 流化狀態(tài)，一方面介質(zhì)在向上液流的影響下適度擴(kuò)張，增大了介質(zhì)之間的空隙，使得固體小 顆粒(如細(xì)胞、細(xì)胞碎片等)能直接通過床層，另一方面穩(wěn)定分級(jí)的床層結(jié)構(gòu)限制了介質(zhì)的 運(yùn)動(dòng)，使其穩(wěn)定在一定的區(qū)域，所以分離效果可與固定床層析相當(dāng)，這兩方面的因素共同決 定了擴(kuò)張床的特色能夠?qū)崿F(xiàn)直接從含有細(xì)胞的培養(yǎng)液或含有細(xì)胞碎片的勻漿液中提取目 標(biāo)產(chǎn)物。流化床吸附可以直接處理含固體顆粒的進(jìn)料，但分離效率低，不得不通過循環(huán)進(jìn)樣 來獲得改進(jìn)；固定床層析分離效率雖高，但進(jìn)料中的固體顆粒往往會(huì)引起床層的堵塞，必須 在層析操作之前加上一系列的預(yù)處理過程。擴(kuò)張床吸附技術(shù)作為一個(gè)新的單元操作，綜合 了流化床和固定床的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了流化床和固定床自身的一些缺陷，既可以直接處理 含固體顆粒的進(jìn)料，又具有與固定床相當(dāng)?shù)姆蛛x效率。與固定床使用的層析柱相比，最大 的不同之處在于兩個(gè)分布器。下分布器既要保證流體分布的均勻，使流體以平推流的形式 流過床層，又要確保料液中固體顆粒懸浮物能順利通過分布器，不造成阻塞。另外，分布器 的設(shè)計(jì)還必須考慮到剪應(yīng)力的影響，使剪應(yīng)力控制在最小范圍內(nèi)，以防止活性產(chǎn)品的失活。 而上分布器一般要求可以上下移動(dòng)，以適應(yīng)于不同的擴(kuò)張床高度，分布器內(nèi)可安裝一層網(wǎng) 隔，目的是防止介質(zhì)顆粒沖出柱子，同時(shí)保證進(jìn)料中的固體小顆?？梢皂樌ㄟ^。Amersham Biosciences公司最先推出商業(yè)化的擴(kuò)張床柱，命名為Streamline。擴(kuò)張床吸附技術(shù)集過濾、濃縮和初步純化于一步完成，減少了操作步驟，縮短了操 作時(shí)間，能提高收率和降低成本。其特點(diǎn)是既能像移動(dòng)床一樣處理含懸浮顆粒的液體，又能 像固定床一樣，混返程度低，分離效率高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵與分離耦合的乳酸生產(chǎn)裝置和利用擴(kuò)張床吸附實(shí) 現(xiàn)在線分離的乳酸發(fā)酵工藝，以解除乳酸的反饋抑制問題，提高乳酸產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率，克服現(xiàn) 有工藝的缺陷。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是乳酸生產(chǎn)裝置，包括微生物發(fā)酵部分和分離部 分，發(fā)酵部分由發(fā)酵罐構(gòu)成，分離部分由至少二個(gè)擴(kuò)張床層析柱構(gòu)成。發(fā)酵罐底部出料口與 擴(kuò)張床層析柱底部開口通過管路連接，在連接發(fā)酵罐底部出料口與擴(kuò)張床層析柱底部開口 的管路上設(shè)置有傳輸泵，擴(kuò)張床層析柱底部開口處設(shè)置有截止閥；擴(kuò)張床層析柱底部開口 還通過管路與洗脫液儲(chǔ)罐和再生液儲(chǔ)罐連接，在連接擴(kuò)張床層析柱底部開口與洗脫液儲(chǔ)罐 和再生液儲(chǔ)罐的管路上設(shè)置有傳輸泵，洗脫液儲(chǔ)罐和再生液儲(chǔ)罐的開口處設(shè)置有截止閥； 擴(kuò)張床層析柱頂部開口通過四通閥與發(fā)酵罐頂部進(jìn)料口和乳酸儲(chǔ)罐相連。在連接擴(kuò)張床層 析柱底部開口與發(fā)酵罐底部出料口和洗脫液儲(chǔ)罐及再生液儲(chǔ)罐的管路上設(shè)置有用以調(diào)節(jié) 通路的四通閥門；發(fā)酵罐的頂部進(jìn)料口與高位補(bǔ)料罐連接。由于擴(kuò)張床的介質(zhì)有具體的限制，所需的吸附劑必須是符合擴(kuò)張床流體性質(zhì)的， 具有一定粒徑分布的樹脂，例如大孔吸附樹脂、弱堿性陰離子交換樹脂或強(qiáng)堿性陰離子交 換樹脂。如D301弱堿性陰離子離子交換樹脂。本發(fā)明提供的在線分離乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于微生物發(fā)酵和乳酸分 離同時(shí)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)乳酸的在線分離，包括以下步驟1)發(fā)酵罐接種按常規(guī)方法準(zhǔn)備培養(yǎng)基后，將乳酸菌接種到發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵；2)擴(kuò)張床層析柱吸附當(dāng)發(fā)酵罐中的乳酸積累使發(fā)酵罐中PH低于乳酸菌發(fā)酵的 耐受值后，調(diào)節(jié)與擴(kuò)張床層析柱相連的閥門和傳輸泵，使得含有乳酸、殘?zhí)呛腿樗峋w的 發(fā)酵液直接進(jìn)入到第一個(gè)擴(kuò)張床層析柱中，其中乳酸被吸附介質(zhì)分離，菌體、糖類及其他營 養(yǎng)元素則回流入發(fā)酵罐中，此時(shí)發(fā)酵罐中PH回升，傳輸泵停止工作；當(dāng)pH再次低于乳酸菌 耐受值時(shí)，再次啟動(dòng)傳輸泵，如此循環(huán)；3)擴(kuò)張床層析柱更換當(dāng)?shù)谝粋€(gè)擴(kuò)張床層析柱中吸附介質(zhì)飽和后，調(diào)節(jié)閥門和傳 輸泵，將第二擴(kuò)張床層析柱與發(fā)酵罐相連，進(jìn)行吸附乳酸；當(dāng)?shù)诙游鲋斤柡秃?，可?再使用第三層析柱，依此類推；4)擴(kuò)張床層析柱再生當(dāng)擴(kuò)張床層析柱中介質(zhì)吸附飽和后，使用洗脫液、再生液 依次對(duì)該擴(kuò)張床層析柱進(jìn)行洗脫和再生，當(dāng)再生液經(jīng)過擴(kuò)張床層析柱后PH達(dá)到10. 0以上 時(shí)，再生完全，該擴(kuò)張床層析柱進(jìn)入待用狀態(tài)，需要時(shí)再將發(fā)酵罐與該層析柱連通；乳酸被 洗脫至產(chǎn)物儲(chǔ)罐；上述方法中發(fā)酵罐中的溫度保持在30-60°C，pH保持在5. 0 7. 4 ；所述的洗脫和 再生的溫度是10-100°C，所述的洗脫液是無機(jī)酸HC1、H2SO4或H3PO4 ；所述的再生液為無機(jī) 堿 NaOH 或 KOH。本發(fā)明利用的擴(kuò)張床既能像移動(dòng)床一樣處理含懸浮顆粒的液體，又能像固定床一 樣，混返程度低，分離效率高的特性。避免了以往固定床與發(fā)酵罐直接相連，使層析柱堵塞 的問題，省略了發(fā)酵罐和層析柱之間的固液分離裝置，實(shí)現(xiàn)了層析柱與反應(yīng)器的直接偶聯(lián)。 既可以原位吸附產(chǎn)物乳酸，又不會(huì)造成堵塞。本發(fā)明首次利用擴(kuò)張床的方法實(shí)現(xiàn)了乳酸發(fā)酵的原位分離，將擴(kuò)張床與發(fā)酵相耦 合，解除了乳酸的反饋抑制，提高了乳酸發(fā)酵的產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率。同時(shí)解決了以往使用固定床 吸附乳酸時(shí)，菌體堵塞床體的問題，省去了固定床與發(fā)酵罐之間的膜分離設(shè)備。由于允許未 經(jīng)處理的發(fā)酵液直接進(jìn)入層析柱，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵、分離的同步，大大減少了以往工藝中的下游 提取、分離費(fèi)用。


圖1為本發(fā)明發(fā)酵與擴(kuò)張床原位吸附耦合的乳酸生產(chǎn)裝置實(shí)施例圖，圖中數(shù)字標(biāo) 識(shí)所示部份為1高位補(bǔ)料罐；
2發(fā)酵罐；
3-號(hào)傳輸泵
4一號(hào)四通閥門
5-號(hào)擴(kuò)張床層析柱
6二號(hào)擴(kuò)張床層析柱
7-號(hào)截止閥
8二號(hào)截止閥
9二號(hào)四通閥門
10二號(hào)傳輸泵
11三號(hào)截止閥
12洗脫液儲(chǔ)罐
13四號(hào)截止閥
14再生液儲(chǔ)罐
15乳酸儲(chǔ)罐圖中虛線部分表示可以按需要添加的擴(kuò)張床和截止閥。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明的裝置包括高位補(bǔ)料罐、發(fā)酵罐、傳輸泵、四通閥門、擴(kuò)張床層析柱、洗脫 液儲(chǔ)罐、再生液儲(chǔ)罐、截止閥、乳酸儲(chǔ)罐。如附圖1所示。本裝置按需要可有兩個(gè)或兩個(gè)以上的擴(kuò)張床層析柱，其頂部通過四通閥門與乳酸 儲(chǔ)液罐和發(fā)酵罐循環(huán)液進(jìn)口相連；底部通過四通閥門與洗脫液儲(chǔ)罐、再生液儲(chǔ)罐以及發(fā)酵 罐循環(huán)液出口相連；所述的發(fā)酵罐帶有攪拌裝置、補(bǔ)料罐、電極，底部分別有發(fā)酵循環(huán)液的進(jìn)口、進(jìn)氣 口和出料口。本發(fā)明是利用擴(kuò)張床吸附、原位提取乳酸發(fā)酵分離的工藝發(fā)酵發(fā)酵罐中的菌種能夠在較高糖濃度下進(jìn)行發(fā)酵，糖濃度為20g/L_200g/L之 間。調(diào)節(jié)pH在5. 0-7.4，1151下滅菌301^11。在無菌條件下進(jìn)行接種，接種量為1 %-10%， 開啟攪拌，使發(fā)酵溫度保持在30-50°C。按照需要用酶膜生物傳感分析儀隨時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中 糖的含量，當(dāng)糖的含量降低到2%時(shí)，可按需要從高位補(bǔ)料罐向發(fā)酵罐中補(bǔ)充濃糖液，直至 發(fā)酵罐中的糖濃度達(dá)到10% -20%為止。擴(kuò)張床層析柱吸附發(fā)酵過程中pH逐漸降低，當(dāng)發(fā)酵液中的pH降到5. 0時(shí)，打開 擴(kuò)張床層析柱底部的截止閥，調(diào)節(jié)一號(hào)四通閥門4和二號(hào)四通閥門9，使得擴(kuò)張床層析柱與 發(fā)酵罐2相連，通過一號(hào)傳輸泵3實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液在發(fā)酵罐與擴(kuò)張床之間的循環(huán)，經(jīng)過擴(kuò)張床層
6析柱除去發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸的發(fā)酵液返回到發(fā)酵罐中；當(dāng)PH恢復(fù)到6. 5后，關(guān)閉一號(hào)傳輸泵 3和截止閥，發(fā)酵繼續(xù)進(jìn)行。擴(kuò)張床層析柱更換發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸經(jīng)過一號(hào)擴(kuò)張床層析柱5吸附，當(dāng)回流的發(fā) 酵液PH為5. 0時(shí)，認(rèn)為一號(hào)擴(kuò)張床層析柱5吸附飽和，對(duì)一號(hào)擴(kuò)張床層析柱進(jìn)行洗脫、再 生，再生完成后進(jìn)入待用狀態(tài)；同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)張床層析柱的更換，將與二號(hào)擴(kuò)張床層析柱6相 連的二號(hào)截止門8打開，并調(diào)節(jié)一號(hào)四通閥門4和二號(hào)四通閥門9，使得二號(hào)擴(kuò)張床層析柱 6與發(fā)酵罐2相連，循環(huán)液通過二號(hào)擴(kuò)張床層析柱6。等到二號(hào)層析柱6飽和后，重復(fù)上一 步操作，對(duì)其進(jìn)行洗脫和再生，二號(hào)層析柱進(jìn)入待用狀態(tài)，反復(fù)循環(huán)。當(dāng)使用多個(gè)層析柱時(shí)， 此方法進(jìn)行類推。擴(kuò)張床層析柱再生當(dāng)一號(hào)擴(kuò)張床層析柱5吸附飽和后，對(duì)一號(hào)擴(kuò)張床層析柱5的 再生；打開一號(hào)截止閥7、三號(hào)截止閥11、四號(hào)截止閥13，調(diào)節(jié)一號(hào)四通閥門4、二號(hào)四通閥 門9，通過管路使得洗脫液儲(chǔ)罐、再生液儲(chǔ)罐和乳酸儲(chǔ)罐與一號(hào)層析柱連通。通過調(diào)節(jié)二號(hào) 傳輸泵10，使洗脫液儲(chǔ)罐12、再生液儲(chǔ)罐14中的洗脫液和再生液分別對(duì)一號(hào)擴(kuò)張床層析柱 5進(jìn)行洗脫和再生，其中洗脫液是無機(jī)酸(HC1，H2SO4, H3PO4)，再生液為無機(jī)堿(NaOH，Κ0Η)， 他們的濃度范圍分別是0. 5wt%-40wt%，將洗脫的乳酸存放于乳酸儲(chǔ)罐中；再生完成后， 關(guān)閉一號(hào)截止閥7、三號(hào)截止閥11、四號(hào)截止閥13和二號(hào)傳輸泵10，一號(hào)擴(kuò)張床層析柱5進(jìn) 入待用狀態(tài)；二號(hào)擴(kuò)張床層析柱6吸附飽和后，重復(fù)上述步驟。當(dāng)使用多個(gè)層析柱時(shí)，此方 法進(jìn)行類推。將洗脫的粗乳酸經(jīng)過脫色、濃縮、除雜后得到高純度的乳酸。經(jīng)過再生后的層 析柱繼續(xù)投入使用，其中擴(kuò)張床層析柱經(jīng)過10次吸附、洗脫、再生后，其解吸率不低于原來 的 90%。實(shí)施例2參見圖1。本發(fā)明發(fā)酵與擴(kuò)張床原位吸附耦合的乳酸生產(chǎn)裝置包括1個(gè)發(fā)酵罐，兩 個(gè)并聯(lián)的擴(kuò)張床層析柱，兩個(gè)傳輸泵，4個(gè)截止閥，2個(gè)四通閥門，高位補(bǔ)料罐，洗脫液儲(chǔ)罐， 再生液儲(chǔ)罐和乳酸儲(chǔ)罐。發(fā)酵罐2與一號(hào)擴(kuò)張床層析柱5和二號(hào)擴(kuò)張床層析柱6通過管路連接，一號(hào)擴(kuò)張 床層析柱5和二號(hào)擴(kuò)張床層析柱6的底部開口分別連接有截止閥7、8，并通過二號(hào)四通閥9 與發(fā)酵罐2的底部出料口和洗脫液儲(chǔ)罐12及再生液儲(chǔ)罐14相連；一號(hào)擴(kuò)張床層析柱5和 二號(hào)擴(kuò)張床層析柱6的頂部開口通過一號(hào)四通閥4與發(fā)酵罐2的頂部進(jìn)料口和乳酸儲(chǔ)罐15 相連。在發(fā)酵罐2與一號(hào)、二號(hào)擴(kuò)張床層析柱5、6的連接管路中，安裝有傳輸泵3 ；在洗 脫液儲(chǔ)罐12、再生液儲(chǔ)罐14與一號(hào)、二號(hào)擴(kuò)張床層析柱5、6的連接管路中安裝有傳輸泵 10 ；洗脫液儲(chǔ)罐12和再生液儲(chǔ)罐14的出口處分別設(shè)置有截止閥11、13。高位補(bǔ)料罐1通過管路與發(fā)酵罐2的一個(gè)進(jìn)料口相連。利用擴(kuò)張床吸附、原位提取乳酸發(fā)酵分離的工藝如前文所述。發(fā)酵所選的微生物是鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)。培養(yǎng)基的配制 種子培養(yǎng)基的配方(單位g/L)蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，K2HP042，檸檬酸銨2，乙酸鈉 5，葡萄糖 20，吐溫 801mL, MgSO4 · 7H20 0. 58，MnSO4 · 4H20 0. 25，蒸餾水 lOOOmL，調(diào)節(jié) pH 值 為6. 0-7. 0，121°C滅菌30min ；發(fā)酵培養(yǎng)基配方(單位g/L)，葡萄糖150,MgSO4 ·7Η20 0. 2， 酵母粉 15，K2HPO4O. 3，KH2PO4O. 3,MnSO4O. 03，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 0. 03，調(diào)節(jié) pH 值為 6. 0-7. 0，121°C
7滅菌30min。在無菌條件下接種，接種量為5-10% (ν/ν) 0開啟攪拌，發(fā)酵罐攪拌槳轉(zhuǎn)速為 100-150rpm，在37-45°C條件下進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，乳酸不斷積累，當(dāng)pH下降到5. 0以下時(shí)，開啟傳輸泵，調(diào)節(jié)相關(guān)四 通閥門，打開相關(guān)截止閥，擴(kuò)張床中的介質(zhì)不斷吸附乳酸，并中和發(fā)酵液，當(dāng)PH大于5.0時(shí)， 關(guān)閉傳輸泵。發(fā)酵液中的乳酸經(jīng)過一號(hào)擴(kuò)張床層析柱吸附后，用pH計(jì)檢測(cè)循環(huán)液的pH值，當(dāng)pH 值小于5. 0時(shí)，則認(rèn)為該擴(kuò)張床層析柱已經(jīng)吸附飽和；在20-45°C下對(duì)擴(kuò)張床進(jìn)行洗脫和再 生，再生完成后一號(hào)擴(kuò)張床進(jìn)入待用狀態(tài)，洗脫的粗乳酸存放在乳酸儲(chǔ)罐中；與此同時(shí)，將 二號(hào)擴(kuò)張床與發(fā)酵罐連接，利用二號(hào)擴(kuò)張床對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸進(jìn)行吸附，當(dāng)二號(hào)擴(kuò)張床吸 附飽和后，進(jìn)行洗脫、再生；同時(shí)將一號(hào)擴(kuò)張床與發(fā)酵罐連接，進(jìn)行吸附乳酸，如此循環(huán)。按照需要，可以進(jìn)行補(bǔ)料。利用酶膜生物傳感器對(duì)發(fā)酵罐中的糖含量進(jìn)行檢測(cè)， 當(dāng)發(fā)酵液中的糖含量低于20g/L時(shí)，可以從高位補(bǔ)料罐進(jìn)行補(bǔ)料；當(dāng)發(fā)酵液中含糖量達(dá)到 100-150g/L時(shí)，停止補(bǔ)料?？疾彀l(fā)酵耦合擴(kuò)張床層析柱原位分離發(fā)酵的乳酸產(chǎn)量、補(bǔ)料不原位分離發(fā)酵的乳 酸產(chǎn)量以及未補(bǔ)料未原位分離發(fā)酵的乳酸產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。表1不同發(fā)酵方式比較 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，未補(bǔ)料、未原位分離時(shí)乳酸產(chǎn)量很低，僅為30. 6g/L，這說明 乳酸的對(duì)發(fā)酵的抑制作用相當(dāng)明顯；當(dāng)采用半連續(xù)發(fā)酵時(shí)，乳酸產(chǎn)量顯著提高，但是產(chǎn)量還 是偏低；當(dāng)采用擴(kuò)張床原位分離時(shí)，抑制被解除，達(dá)到了半連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)量的2倍。實(shí)施例3采用上述的擴(kuò)張床系統(tǒng)。進(jìn)行擴(kuò)張床層析柱耦合原位分離批式發(fā)酵。根據(jù)培養(yǎng)基 中初糖的含量，發(fā)酵在48h內(nèi)結(jié)束。結(jié)果如表2所示。表2原位分離批式發(fā)酵結(jié)果
8 實(shí)施例3擴(kuò)張床層析柱填充柱樹脂選用的類型如表3所示，樹脂先用去離子水浸泡24小 時(shí)，然后經(jīng)過3次“l(fā)mol/L HC1、水、lmol/L NaOH、水”預(yù)處理，樹脂處理為-OH型，最后用無 菌水沖洗床層至中性，即準(zhǔn)備完成。吸附飽和后，使用10wt% -40wt% H2SO4作為解吸劑洗 脫。然后再用lmol/L NaOH或KOH進(jìn)行再生。經(jīng)過1次“吸附、洗脫、再生”循環(huán)后，樹脂的 吸附性能及解析率如表3所示。表3 從上表的結(jié)果可以看出，本發(fā)明分離工藝好。多數(shù)樹脂的交換容量高，能夠一次性 吸附大量的乳酸。而且經(jīng)過一次吸附、洗脫后，解析率較高。實(shí)施例4擴(kuò)張床層析柱填充柱選用的類型如表4所示，樹脂先用去離子水浸泡24小時(shí)，然 后經(jīng)過3次“ lmol/L HC1、水、lmol/L NaOH、水”預(yù)處理，樹脂處理為-0H型，最后用無菌水沖 洗床層至中性，即準(zhǔn)備完成。吸附飽和后，使用10wt%-40wt%H2S04作為解吸劑洗脫。然 后再用lmol/L NaOH或KOH進(jìn)行再生。經(jīng)過10次“吸附、洗脫、再生”循環(huán)后，樹脂的吸附 性能及解析率如表4所示。表 4 從上表的結(jié)果可以看出，本發(fā)明連續(xù)分離工藝穩(wěn)定。樹脂的穩(wěn)定性較高，再生10 次后，吸附性能仍然能夠達(dá)到一次吸附、洗脫處理的90%，保持較高水平。
權(quán)利要求
一種發(fā)酵與分離耦合的乳酸生產(chǎn)裝置，包括微生物發(fā)酵部分和分離部分，發(fā)酵部分由發(fā)酵罐構(gòu)成，其特征在于分離部分由至少二個(gè)擴(kuò)張床層析柱構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，發(fā)酵罐底部出料口與擴(kuò)張床層析柱底部 開口通過管路連接，在連接發(fā)酵罐底部出料口與擴(kuò)張床層析柱底部開口的管路上設(shè)置有傳 輸泵；擴(kuò)張床層析柱底部開口處設(shè)置有截止閥；擴(kuò)張床層析柱底部開口還通過管路與洗脫 液儲(chǔ)罐和再生液儲(chǔ)罐連接，在連接擴(kuò)張床層析柱底部開口與洗脫液儲(chǔ)罐和再生液儲(chǔ)罐的管 路上設(shè)置有傳輸泵，洗脫液儲(chǔ)罐和再生液儲(chǔ)罐的開口處設(shè)置有截止閥；擴(kuò)張床層析柱頂部 開口通過四通閥與發(fā)酵罐頂部進(jìn)料口和乳酸儲(chǔ)罐相連。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的裝置，其特征在于，在連接擴(kuò)張床層析柱底部開口與發(fā)酵 罐底部出料口和洗脫液儲(chǔ)罐及再生液儲(chǔ)罐的管路上設(shè)置有用以調(diào)節(jié)通路的四通閥門。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，發(fā)酵罐的頂部進(jìn)料口與高位 補(bǔ)料罐連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，擴(kuò)張床層析柱中的吸附介質(zhì) 是大孔吸附樹脂、弱堿性陰離子離子交換樹脂或強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，擴(kuò)張床層析柱中的吸附介質(zhì) 是D301弱堿性陰離子離子交換樹脂。
7.—種在線分離乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于微生物發(fā)酵和乳酸分離同時(shí)進(jìn) 行，實(shí)現(xiàn)乳酸在線分離，包括以下步驟1)發(fā)酵罐接種按常規(guī)方法準(zhǔn)備培養(yǎng)基后，將乳酸菌接種到發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵；2)擴(kuò)張床層析柱吸附當(dāng)發(fā)酵罐中的乳酸積累使發(fā)酵罐中PH低于乳酸菌發(fā)酵的耐受 值后，調(diào)節(jié)與擴(kuò)張床層析柱相連的閥門和傳輸泵，使得含有乳酸、殘?zhí)呛腿樗峋w的發(fā)酵 液直接進(jìn)入到第一個(gè)擴(kuò)張床層析柱中，其中乳酸被吸附介質(zhì)分離，菌體、糖類及其他營養(yǎng)元 素則回流入發(fā)酵罐中，此時(shí)發(fā)酵罐中PH回升，傳輸泵停止工作；當(dāng)pH再次低于乳酸菌耐受 值時(shí)，再次啟動(dòng)傳輸泵，如此循環(huán)；3)擴(kuò)張床層析柱更換當(dāng)?shù)谝粋€(gè)擴(kuò)張床層析柱中吸附介質(zhì)飽和后，調(diào)節(jié)閥門和傳輸 泵，將第二擴(kuò)張床層析柱與發(fā)酵罐相連，進(jìn)行吸附乳酸；當(dāng)?shù)诙游鲋斤柡秃?，可以?使用第三層析柱，依此類推；4)擴(kuò)張床層析柱再生當(dāng)擴(kuò)張床層析柱中介質(zhì)吸附飽和后，使用洗脫液、再生液依次 對(duì)該擴(kuò)張床層析柱進(jìn)行洗脫和再生，當(dāng)再生液經(jīng)過擴(kuò)張床層析柱后PH達(dá)到10. 0以上時(shí)，再 生完全，該擴(kuò)張床層析柱進(jìn)入待用狀態(tài)，需要時(shí)再將發(fā)酵罐與該層析柱連通；乳酸被洗脫至 產(chǎn)物儲(chǔ)罐。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，發(fā)酵罐中的溫度保持在30 60°C，pH保持 在 5. 0 7. 4。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述的洗脫和再生的溫度是10 100°C，所 述的洗脫液是無機(jī)酸HCl、H2SO4或Η3Ρ04。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述的再生液為無機(jī)堿NaOH或Κ0Η。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)酵與分離耦合的乳酸生產(chǎn)裝置和利用擴(kuò)張床原位吸附實(shí)現(xiàn)在線分離的乳酸發(fā)酵工藝，本發(fā)明將擴(kuò)張床與發(fā)酵罐相偶聯(lián)，利用擴(kuò)張床的方法實(shí)現(xiàn)了乳酸發(fā)酵的在線分離，解除了乳酸的反饋抑制，提高了乳酸發(fā)酵的產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率，同時(shí)解決了以往使用固定床吸附乳酸時(shí)，菌體堵塞床體的問題，允許未經(jīng)處理的發(fā)酵液直接進(jìn)入層析柱。由于實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵、分離的同步，大大減少了以往工藝中的下游提取和分離費(fèi)用。
文檔編號(hào)B01D15/08GK101914433SQ201010263909
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者何峰, 何謐, 余龍江, 曾翔, 魯明波 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué);湖北廣濟(jì)藥業(yè)股份有限公司