專利名稱：：一種生產l-乳酸的方法及其專用鼠李糖乳桿菌的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種生產L-乳酸的方法及其專用菌株，特別是涉及一種生產L-乳酸的方法及其專用鼠李糖乳桿菌。
背景技術：
：乳酸(LacticAcid)又名二羥基丙酸，是世界三大有機酸之一。作為一種傳統(tǒng)的多用途精細化學品，乳酸可作為酸味劑、芳香劑、防腐劑、植物生長調節(jié)劑、生物可降解性材料、藥物和農藥等，應用于食品、制藥、釀造、制革、紡織、環(huán)保和農業(yè)中。乳酸是一種手性分子，可分為L-乳酸、D-乳酸和DL-乳酸。由L-乳酸作為主要單體制成的聚乳酸具有良好的生物相容性和生物可降解性，可制成醫(yī)用緩釋材料、生物可降解纖維和生物可降解塑料等。L-乳酸正成為國內外乳酸行業(yè)的研究熱點。乳酸的生產方法主要有化學合成法、酶合成法和發(fā)酵法三種?；瘜W法直接合成的乳酸為DL-乳酸，若要得到D-乳酸或L-乳酸則需進行光學拆分。而且由于合成法所用的原料是乙醛和劇毒物氫氰酸，因此合成乳酸應用于食品不能被廣泛接受，此外其生產成本也較高。酶法催化可以專一性地得到光學純乳酸，但其反應過程研究難度很大，尚未應用于工業(yè)化生產。微生物發(fā)酵法生產乳酸，可通過菌種和培養(yǎng)條件的選擇而獲得D-乳酸、L-乳酸或是兩者一定比例的混合物，能以淀粉、纖維素等可再生資源分解所得到的葡萄糖等為原料發(fā)酵生產乳酸，且生產成本低、產品安全性高，是大規(guī)模生產乳酸的主要方法。申請?zhí)枮?00480036931.1的中國專利公開了一種采用丄fl"o6ac/〃wsparacwe/生產乳酸的方法，以葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨為發(fā)酵基質，產生181克/升的乳酸；以葡萄糖、蛋白胨和玉米浸漬粉為發(fā)酵基質，產生179.1克/升的乳酸。申請?zhí)枮?0051011卯41.3的中國專利公開了一種采用干酪乳桿菌改組菌株aflcto&"7/wcwez'—Lc一F34發(fā)酵生產L-乳酸的方法，該菌株以葡萄糖和酵母抽提物為發(fā)酵基質，搖瓶補料分批發(fā)酵生產乳酸，產生177.6克/升的乳酸；以玉米漿和葡萄糖為發(fā)酵基質，30升發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵生產乳酸，產生154.6克/升的L-乳酸。L-乳酸的生產成本是制約L-乳酸應用的關鍵因素之一。提高發(fā)酵法生產L-乳酸過程中發(fā)酵液中L-乳酸的濃度有利于降低成本。在發(fā)酵法生產L-乳酸的過程中，培養(yǎng)基中的氮源是影響L-乳酸生產成本的另一重要因素，采用來源廣泛、價格低廉的含氮原料作為酵母粉和蛋白胨等價格較高的氮源的替代物，是控制L-乳酸生產成本的另一有效途徑。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的是提供一株產L-乳酸的鼠李糖乳桿菌(丄acto^c/〃Mr/z扁"o犯s)CASL。本發(fā)明所提供的鼠李糖乳桿菌aacto6flc/〃^Wzam"omy)CASL是從山東濟南某牛奶廠附近土壤中篩選得到，鑒定為鼠李糖乳桿菌aacto6ac〃/wMam"(W"s)。鼠李糖乳桿菌a""o6ac〃/wAam"asws)CASL已于2007年9月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC,地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCW2183。鼠李糖乳桿菌aacto6ac/〃wAflmwomy)CASLCGMCCW2183為革蘭氏陽性菌，細胞長桿狀，長2.5—3.5(im，寬0.7—0.8pm?？衫煤Ｔ逄?、山梨糖醇、葡萄糖、乳糖、核糖、纖維二糖、麥芽糖、果糖等。本發(fā)明的第二個目的是提供一種利用鼠李糖乳桿菌a""o6a"'〃^Aam"amy)CASLCGMCC2183生產L-乳酸的方法。本發(fā)明所提供的生產L-乳酸的方法，是發(fā)酵鼠李糖乳桿菌(丄"ctoZ)"c///^Aam"as^)CASLCGMCCWs2183得到L-乳酸。所述鼠李糖乳桿菌(Za"o6ad//^Wzamwasw"CASLCGMCCW2183的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有碳源、氮源和用于控制發(fā)酵液pH的中和劑，所述碳源為工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)150—200克/升，所述氮源選自下述1)至3)中的任意一種1)豆粕水解液100_300克/升；2)豆粕粉20—30克/升；3)豆粕水解液100—300克/升，玉米漿10—30克/升；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.5—7。所述豆粕粉可直接作為氮源，也可先進行酸解或酶解，將得到的豆粕水解液作為氮源。所述豆粕水解液可按照下述方法制備，稱取豆粕粉(北京康明威培養(yǎng)基技術有限責任公司)，以lg豆粕粉5ml的2X硫酸溶液的比例進行充分混勻，卯r水浴15小時。當所述氮源為豆粕粉時，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還可含有0.05—0.1克/升的蛋白酶。所述中和劑具體可為碳酸鈣。所述鼠李糖乳桿菌aa"o6a"7/wWzam"(w^)CASLCGMCCW2183的發(fā)酵條件具體可為35—50。C培養(yǎng)48—80小時，如35—45。C培養(yǎng)50—68小時。所述方法中，還可將鼠李糖乳桿菌aactokc/〃wCASLCGMCCW2183先接入如下種子培養(yǎng)基中，在35—4(TC培養(yǎng)12—20小時，再接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基；所述種子培養(yǎng)基每升中含有葡萄糖20克，酵母粉5克，蛋白胨5克，碳酸鈣10克，余量為水；所述種子培養(yǎng)基的pH為6.5。所述發(fā)酵的培養(yǎng)方式具體可為間歇振動培養(yǎng)(如用三角瓶發(fā)酵培養(yǎng))或間歇攪拌培養(yǎng)(如采用發(fā)酵罐培養(yǎng))，間隔時間均為12小時；所述攪拌的轉速為30—100轉/分鐘，旋轉半徑為33或42mm，攪拌時間為20—40分鐘；所述攪拌轉速優(yōu)選為50轉/分鐘，攪拌時間優(yōu)選為30分鐘。本發(fā)明利用鼠李糖乳桿菌aacto6ac/〃MMamwoms)CASLCGMCCWs2183生產L-乳酸，以工業(yè)葡萄糖為底物，在35T:—45t:條件下以94.5%—96.5%的轉化率高效發(fā)酵生產光學純度97.6%_98.7%的L-乳酸，其中L-乳酸濃度最高可達235克/升。本發(fā)明利用鼠李糖乳桿菌(Zacto6ac/〃MAflmwas^)CASLCGMCCW2183生產L-乳酸，以豆粕粉為氮源時，同時可加入蛋白酶，使蛋白質水解與乳酸發(fā)酵同時進行，提高了豆粕粉的利用效率，簡化了原料處理過程，同時也可以控制L-乳酸的生產成本。圖1為鼠李糖乳桿菌a"cto^c/〃^Aam"ams)CASLCGMCCW2183發(fā)酵生產L-乳酸發(fā)酵液和L-乳酸標準品、D-乳酸標準品高效液相色譜圖。其中，A為L-乳酸標準品高效液相色譜圖，B為D-乳酸標準品高效液相色譜圖。圖2為鼠李糖乳桿菌aa"o6ac/〃wsAammwws)CASLCGMCCW2183發(fā)酵生產L-乳酸過程中，葡萄糖和L-乳酸隨時間變化過程曲線。具體實施例方式本發(fā)明的利用鼠李糖乳桿菌aa"o6ac/〃wsAamwo^ms)CASLCGMCC^2183發(fā)酵生產L-乳酸方法中涉及的步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將鼠李糖乳桿菌(丄acto6ac/〃MW2am"osay)CASLCGMCCW2183菌種接種于含有1.5g/100ml瓊脂的固體斜面培養(yǎng)基上，35—40。C條件下，培養(yǎng)24—48小時；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)的斜面培養(yǎng)物，在無菌條件下接種到30ml種子培養(yǎng)基中，35—4(TC條件下，靜止培養(yǎng)10—24小時，加入中和劑控制發(fā)酵液pH，制得種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)以5—15%體積比的接種量，將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，35—5(TC條件下培養(yǎng)48—80小時，其中，三角瓶中發(fā)酵采用手動振動，每隔12小時振動一次，發(fā)酵罐采用間歇攪拌培養(yǎng)，每隔12小時攪拌一次，攪拌速度30—100轉/分鐘，旋轉半徑為33或42mm，攪拌時間20—40分鐘，加入中和劑控制發(fā)酵液pH，制得含有L-乳酸的發(fā)酵培養(yǎng)液；(4)處理樣品取發(fā)酵液6，000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液；(5)樣品檢測取上清液稀釋，檢測葡萄糖含量、L-乳酸含量和D-乳酸含量；其中，步驟(1)中所述的菌體培養(yǎng)溫度具體可為37—4(TC。其中，步驟(2)中所述的菌體培養(yǎng)溫度具體可為37—4(TC。其中，步驟(3)中所述的菌體培養(yǎng)溫度具體可為35—45'C。其中，步驟(1)中所述的菌體培養(yǎng)時間具體可為24—36小時。其中，步驟(2)中所述的菌體培養(yǎng)時間具體可為12—20小時。其中，步驟(3)中所述的菌體培養(yǎng)時間具體可為50—68小時。其中，步驟(2)、(3)所述的培養(yǎng)過程中加入的中和劑為碳酸鈣，控制pH為其中，葡萄糖的測定方法為，發(fā)酵液離心后稀釋，采用生物傳感分析儀SBA-40C(山東省科學院生物研究所)測定。生物傳感分析儀SBA-40C是以固定化酶為傳感器的分析儀器，葡萄糖與氧氣、水在葡萄糖氧化酶的催化下生成葡萄糖酸和雙氧水。反應放出的雙氧水與白金一銀電極接觸，并產生電流信號，該電流信號與葡萄糖濃度成線性比例關系，通過測定電流信號強度可得出葡萄糖濃度。L-乳酸和D-乳酸含量采用Agilent1100液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測定，手性分離柱(日本三菱化學公司，MCIGEL-CRS10W(3u)4.6IDX50mm，光學異體分離用)，流動相為0.002mol/L硫酸銅，流量0.5ml/min，進樣量20uL，紫外檢測器，檢測波長254nm，操作溫度25。C。L-乳酸標準品為Sigma-Aldrich公司產品，貨號為L1750。D-乳酸標準品為Sigma-Aldrich公司產品，貨號為L0625。在以上色譜條件下，標準品的高效液相色譜檢測結果見附圖1。其中，A為L-乳酸標準品高效液相色譜圖，B為D-乳酸標準品高效液相色譜圖，C為鼠李糖乳桿菌aacto6ac/〃wsAammwws)CASLCGMCCW2183發(fā)酵生產L-乳酸發(fā)酵液高效液相色譜圖。在該色譜條件下，L-乳酸標準品的保留時間為11.566分鐘，D-乳酸標準品的保留時間為9.724分鐘。L-乳酸光學純度計算方法L-乳酸光學純度(％)二[L-乳酸濃度(克/升)一D-乳酸濃度(克/升)]+[L-乳酸濃度(克/升)屮D-乳酸濃度(克/升)]"00%轉化率計算方法轉化率(％)=1^乳酸濃度(克/升)+葡萄糖消耗量(克/升)xl00%下面通過實施例進一步闡明本發(fā)明。實施例1、鼠李糖乳桿菌aactotoc/〃ww/zam"oms)CASLCGMCC熗2183的分離、誘變篩選和鑒定1、菌種的分離、誘變篩選1)菌種的分離從山東濟南某牛奶廠附近取得土樣，稱取5克土樣于250ml三角瓶中，加入100ml生理鹽水，充分混均后用無菌水稀釋10,000倍涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，4(TC培養(yǎng)，待長出單菌落后，部分單菌落由于產酸將菌落周圍培養(yǎng)基中的碳酸鈣溶解而形成透明圈。挑取透明圈較大的單菌落，接種于10ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，4(TC靜置培養(yǎng)72小時，測定發(fā)酵液中L-乳酸濃度，挑取一株L-乳酸產量最高的菌株，接種于MRS培養(yǎng)基斜面上冷藏備用。2)離子束誘變篩選將以上獲得的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，4(TC靜置培養(yǎng)至對數中期，離心后用生理鹽水懸浮，制成菌懸液。吸取lOO)nL菌懸液涂布于直徑為3.5cm的無菌空白培養(yǎng)皿上，涂布直徑約1.5cm，無菌風吹干制成菌膜后進行離子注入，離子能量30keV，注入劑量分別為lxl0"ions/cm2、5xl014ions/cm2、10><1014ions/cm2、50><1014ions/cm2、100x10"ions/cm2。離子注入后的平皿用lmL生理鹽水洗脫。各不同注入劑量分別吸取10(HiL，稀釋后涂布在MRS固體培養(yǎng)基上，待長出單菌落后，挑選透明圈較大的菌落，接種于10ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，4(TC靜置培養(yǎng)72小時，測定發(fā)酵液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和D-乳酸濃度。經過多次篩選，獲得一株L-乳酸產量比離子束誘變篩選前的菌株有明顯提高、L-乳酸光學純度98X以上、轉化率95%以上的菌株，即鼠李糖乳桿菌(丄a"o^c/〃^r/^mwoms)CASLCGMCCW2183，經多次傳代后發(fā)酵測試，L-乳酸產量、L-乳酸光學純度和轉化率沒有明顯變化。鼠李糖乳桿菌aacto&ac/〃wsr/2ammw^)CASLCGMCC2183篩選中所用的MRS固體培養(yǎng)基為葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氫二鉀2克/升，檸檬酸二銨2克/升，乙酸鈉5克/升，吐溫801毫升/升，七水硫酸鎂0.58克/升，四水硫酸錳0.25克/升，碳酸鈣15克/升，瓊脂粉15克/升。培養(yǎng)基的pH值為6.5。115。C條件下滅菌20分鐘。鼠李糖乳桿菌aacto^c/〃ww/zam朋ms)CASLCGMCC2183篩選中所用的MRS液體培養(yǎng)基為葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白胨10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氫二鉀2克/升，檸檬酸二銨2克/升，乙酸鈉5克/升，吐溫801毫升/升，七水硫酸鎂0.58克/升，四水硫酸錳0.25克/升。培養(yǎng)基的pH值為6.5。115"條件下滅菌20分鐘。鼠李糖乳桿菌aacto6ac/〃wCASLCGMCCW2183篩選中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基為工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)180克/升，豆粕水解液(豆粕水解液制備方法豆粕粉(北京康明威培養(yǎng)基技術有限責任公司)，以lg豆粕粉5ml的2%(體積百分含量)硫酸溶液的比例進行充分混勻，9(TC水浴15小時，得到豆粕水解液)100克/升，玉米漿(上海西王淀粉糖有限公司)10克/升，碳酸鈣90克/升。培養(yǎng)基的pH值為6.5。115'C條件下滅菌20分鐘。2、菌株的鑒定按照"伯杰細菌鑒定手冊"(第八版)禾n"常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊"(東秀珠，蔡妙英等編著，北京科學出版社，2001.2)中描述的方法，對該菌株進行形態(tài)特征觀察和生理生化特性鑒定；鑒定結果表明鼠李糖乳桿菌(丄acto6ad〃MWzammww)CASLCGMCCW2183為革蘭氏陽性菌，細胞長桿狀，長2.5—3.5,，寬0.7—0.8pm?？衫煤Ｔ逄?、山梨糖醇、葡萄糖、乳糖、核糖、纖維二糖、麥芽糖、果糖、甘露醇、松三糖、鼠李糖、半乳糖、七葉苷、甘露糖。不能利用蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、肌醇、棉子糖。氧化酶陰性。溶血試驗陰性。能夠在15。C和45X:生長?；谝陨咸卣?，將本株L-乳酸生產菌鑒定為鼠李糖乳桿菌(丄flcto^c///^CASL，并于2007年9月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCW22183。鼠李糖乳桿菌afl"oZ)ac/〃wsr/^moms)CASLCGMCCWs2183與"乳酸細菌分類鑒定及實驗方法"(凌代文主編；凌代文，東秀珠編著，北京中國輕工業(yè)出版社，1999.3)中所述的鼠李糖乳桿菌aflcto6ac/〃ztfW^m"ams)生理生化特征比較見表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>條件下滅菌20分鐘。本發(fā)明發(fā)酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)將鼠李糖乳桿菌aa"o&ac/〃wsAammwz^)CASLCGMCCW2183菌種接種于固體斜面培養(yǎng)基上，37。C培養(yǎng)36小時；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝有30ml種子培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，37。C靜置培養(yǎng)20小時，制得種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)在裝有90ml發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml三角瓶中接入10ml步驟(2)的種子養(yǎng)液，4(TC靜置培養(yǎng)72小時，結束發(fā)酵。其中，每隔12小時振蕩攪拌一次。實驗共設3次重復。發(fā)酵結束時，取發(fā)酵液，6,000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，根據上述方法檢測發(fā)酵液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和D-乳酸濃度，計算L-乳酸光學純度和轉化率。結果表明葡萄糖的濃度為10克/升±0.5克/升，L-乳酸濃度132克/升±3克/升，轉化率94.5%±0.3%，L-乳酸光學純度98.5%±0.4%。實施例3、利用鼠李糖乳桿菌(丄acto6ac/〃M)CASLCGMCC2183在三角瓶中發(fā)酵法生產L-乳酸該實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)150克/升，豆粕水解液(制備方法同實施例1)300克/升，碳酸鈣75克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為7。115°C條件下滅菌20分鐘。本發(fā)明發(fā)酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例2;(2)種子培養(yǎng)同實施例2;(3)發(fā)酵培養(yǎng)在裝有85ml發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml三角瓶中接入15ml步驟(2)的種子養(yǎng)液，37"C靜置培養(yǎng)65小時,結束發(fā)酵。其中，每隔12小時振蕩攪拌一次。實驗共設3次重復。發(fā)酵結束時，取發(fā)酵液，6,000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發(fā)酵液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和D-乳酸濃度，計算L-乳酸光學純度和轉化率。結果表明葡萄糖的濃度為2克/升±0.3克/升，L-乳酸濃度140克/升±4克/升，轉化率95.2%±0.5%，L-乳酸光學純度98.0%±0.2%。實施例4、利用鼠李糖乳桿菌(/^"0^"7/^^7"/^705^)CASLCGMCC在三角瓶中發(fā)酵法生產L-乳酸該實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下-斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)150克/升，豆粕水解液(制備方法同實施例1)220克/升，碳酸鈣75克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為5.5。115°C條件下滅菌20分鐘。本發(fā)明發(fā)酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例2;(2)種子培養(yǎng)同實施例2;(3)發(fā)酵培養(yǎng)在裝有95ml發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml三角瓶中接入5ml步驟(2)的種子養(yǎng)液，4(TC靜置培養(yǎng)50小時,結束發(fā)酵。其中，每隔12小時振蕩攪拌一次。實驗共設3次重復。發(fā)酵結束時，取發(fā)酵液，6,000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發(fā)酵液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和D-乳酸濃度，計算L-乳酸光學純度和轉化率。結果表明葡萄糖的濃度為1克/升±0.3克/升，L-乳酸濃度142克/升±2克/升，轉化率95.3%±0.3%，L-乳酸光學純度98.5%±0.5%。實施例5、利用鼠李糖乳桿菌aa"o6ac/〃ww/^mwomy)CASLCGMCCW2183在三角瓶中發(fā)酵法生產L-乳酸該實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)180克/升，豆粕水解液(制備方法同實施例l)100克/升，玉米漿(上海西王淀粉糖有限公司)30克/升，碳酸鈣90克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6。115"C條件下滅菌20分鐘。本發(fā)明發(fā)酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例2;(2)種子培養(yǎng)同實施例2;(3)發(fā)酵培養(yǎng)在裝有90ml發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml三角瓶中接入10ml步驟(2)的種子養(yǎng)液，37'C靜置培養(yǎng)60小時,結束發(fā)酵。其中，每隔12小時振蕩攪拌一次。實驗共設3次重復。發(fā)酵結束時，取發(fā)酵液，6,000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發(fā)酵液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和D-乳酸濃度，計算L-乳酸光學純度和轉化率。結果表明葡萄糖的濃度為8克/升±1.0克/升，L-乳酸濃度165克/升±5克/升，轉化率96.0%±0.5%，L-乳酸光學純度98.2%±0.3%。實施例6、利用鼠李糖乳桿菌(丄actoZ)ac/〃Mw/2flmwoms)CASLCGMCCW2183在三角瓶中發(fā)酵法生產L-乳酸該實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)200克/升，豆粕水解液(制備方法同實施例l)300克/升，玉米漿(上海西王淀粉糖有限公司)10克/升，碳酸鈣100克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。115"C條件下滅菌20分鐘。本發(fā)明發(fā)酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例2;(2)種子培養(yǎng)同實施例2;(3)發(fā)酵培養(yǎng)在裝有85ml發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml三角瓶中接入15ml步驟(2)的種子養(yǎng)液，35'C靜置培養(yǎng)48小時,結束發(fā)酵。其中，每隔12小時振蕩攪拌一次。實驗共設3次重復。發(fā)酵結束時，取發(fā)酵液，6,000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發(fā)酵液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和D-乳酸濃度，計算L-乳酸光學純度和轉化率。結果表明葡萄糖的濃度為1克/升±0.5克/升，L-乳酸濃度192克/升±2克/升，轉化率96.5%±0.4%，L-乳酸光學純度97.6%±0.2%。實施例7、利用鼠李糖乳桿菌aacto&d〃"H/2flm朋my)CASLCGMCC2183在三角瓶中發(fā)酵法生產L-乳酸該實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)150克/升(發(fā)酵初始濃度)，豆粕水解液(制備方法同實施例1)250克/升，玉米漿(上海西王淀粉糖有限公司)20克/升，碳酸鈣75克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。115。C條件下滅菌20分鐘。本發(fā)明發(fā)酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例2;(2)種子培養(yǎng)同實施例2;(3)發(fā)酵培養(yǎng)在裝有90ml發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml三角瓶中接入10ml步驟(2)的種子養(yǎng)液，4CTC靜置培養(yǎng)50小時，每隔12小時振蕩攪拌一次。其中，在30小時補加8克工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)和4克碳酸鈣。實驗共設3次重復。發(fā)酵結束時，取發(fā)酵液，6,000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發(fā)酵液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和D-乳酸濃度，計算L-乳酸光學純度和轉化率。結果表明表明葡萄糖的濃度為2克/升±0.3克/升，L-乳酸濃度220克/升±3克/升，轉化率96.3%±0.4%，L-乳酸光學純度98.0X士0.2X。實施例8、利用鼠李糖乳桿菌afl"o&c/〃MAamw(wt^)CASLCGMCC2183在三角瓶中發(fā)酵法生產L-乳酸該實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)150克/升，豆粕粉(北京康明威培養(yǎng)基技術有限責任公司)30克/升，碳酸鈣75克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。115"C條件下滅菌20分鐘。本發(fā)明發(fā)酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例2;(2)種子培養(yǎng)同實施例2;(3)發(fā)酵培養(yǎng)在裝有90ml發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml三角瓶中接入10ml步驟(2)的種子養(yǎng)液，5(TC靜置培養(yǎng)65小時,結束發(fā)酵。其中，每隔12小時振蕩攪拌一次。實驗共設3次重復。發(fā)酵結束時，取發(fā)酵液，6,000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發(fā)酵液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和D-乳酸濃度，計算L-乳酸光學純度和轉化率。結果表明葡萄糖的濃度為28克/升±0.8克/升，L-乳酸濃度115克/升±2克/升，轉化率95.2%±0.5%，1^-乳酸光學純度98.0%±0.3%。實施例9、利用鼠李糖乳桿菌aacto6ac/〃w〃/^mwom)CASLCGMCCWs2183在三角瓶中發(fā)酵法生產L-乳酸該實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)180克/升，豆粕粉(北京康明威培養(yǎng)基技術有限責任公司)30克/升，蛋白酶(諾維信風味蛋白酶，Flavourzyme500MG)0.05克/升，碳酸l丐90克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為7。115。C條件下滅菌20分鐘。其中，蛋白酶在滅菌后加入。本發(fā)明發(fā)酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例2;(2)種子培養(yǎng)同實施例2;(3)發(fā)酵培養(yǎng)在裝有90ml發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml三角瓶中接入10ml步驟(2)的種子養(yǎng)液，42t:靜置培養(yǎng)72小時，結束發(fā)酵。其中，每隔12小時振蕩攪拌一次。實驗共設3次重復。發(fā)酵結束時，取發(fā)酵液，6,000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發(fā)酵液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和D-乳酸濃度，計算L-乳酸光學純度和轉化率。結果表明葡萄糖的濃度為28克/升±0.7克/升，L-乳酸濃度145克/升±3克/升，轉化率95.5%±0.3%，1^-乳酸光學純度98.5%±0.2%。實施例10、利用鼠李糖乳桿菌aflcto6ac/〃wWzam"oms)CASLCGMCCW2183在三角瓶中發(fā)酵法生產L-乳酸該實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)180克/升，豆粕粉(北京康明威培養(yǎng)基技術有限責任公司)20克/升，蛋白酶(諾維信風味蛋白酶，Flavourzyme500MG)0.1克/升，碳酸鈣90克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。115°C條件下滅菌20分鐘。其中，蛋白酶在滅菌后加入。本發(fā)明發(fā)酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例2;(2)種子培養(yǎng)同實施例2;(3)發(fā)酵培養(yǎng)在裝有90ml發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml三角瓶中接入10ml步驟(2)的種子養(yǎng)液，42。C靜置培養(yǎng)80小時，結束發(fā)酵。其中，每隔12小時振蕩攪拌一次。實驗共設3次重復。發(fā)酵結束時，取發(fā)酵液，6,000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發(fā)酵液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和D-乳酸濃度，計算L-乳酸光學純度和轉化率。結果表明葡萄糖的濃度為17克/升±0.5克/升，L-乳酸濃度156克/升±5克/升，轉化率96.0%±0.3%，1^乳酸光學純度98.2%±0.7%。實施例11、利用鼠李糖乳桿菌aacto6a"7/wAam"omy)CASLCGMCCWs2183在5升發(fā)酵罐中發(fā)酵法生產L-乳酸該實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)180克/升，豆粕粉(北京康明威培養(yǎng)基技術有限責任公司)28克/升，蛋白酶(諾維信風味蛋白酶，Flavourzyme500MG)0.08克/升，碳酸鈣90克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。115°C條件下滅菌20分鐘。其中，蛋白酶在滅菌后加入。本發(fā)明發(fā)酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例2;(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝有30ml種子培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，37。C靜置培養(yǎng)20小時；1升三角瓶中加入400ml種子培養(yǎng)基，將30ml種子培養(yǎng)液接入400ml種子培養(yǎng)基，37"C靜置培養(yǎng)20小時，制得種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)上海保興BIOTECH5升發(fā)酵罐中加入3.6升發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入400ml種子培養(yǎng)液，45。C靜置培養(yǎng)72小時,結束發(fā)酵。其中，每隔12小時攪拌一次。攪拌轉速30轉/分，旋轉半徑為33mm，攪拌時間40分鐘。實驗共設3次重復。發(fā)酵結束時，取發(fā)酵液，6,000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發(fā)酵液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和D-乳酸濃度，計算L-乳酸光學純度和轉化率。結果表明葡萄糖的濃度為10克/升±0.6克/升，L-乳酸濃度160克/升±4克/升，轉化率94.8%±0.4%，匸乳酸光學純度98.7%±0.3%。實施例12、利用鼠李糖乳桿菌aactokc/〃w^amwas^)CASLCGMCCWs2183在5升發(fā)酵罐中發(fā)酵法生產L-乳酸該實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)200克/升(發(fā)酵初始濃度)，豆粕水解液(制備方法同實施例1)230克/升，玉米漿(上海西王淀粉糖有限公司)22克/升，碳酸鈣100克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。115。C條件下滅菌20分鐘。本發(fā)明發(fā)酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例2;(2)種子培養(yǎng)同實施例11;(3)發(fā)酵培養(yǎng)上海保興BIOTECH5升發(fā)酵罐中加入3.6升發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入400ml種子培養(yǎng)液，4(TC靜置培養(yǎng)60小時。其中，每隔12小時攪拌一次。攪拌轉速50轉/分，旋轉半徑為33mm，攪拌時間30分鐘。其中，在40小時補加200克工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)和IOO克碳酸鈣。實驗共設3次重復。發(fā)酵結束時，取發(fā)酵液，6,000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發(fā)酵液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和D-乳酸濃度，計算L-乳酸光學純度和轉化率。結果表明葡萄糖的濃度為3克/升±0.4克/升，L-乳酸濃度235克/升±3克/升，轉化率95.2%±0.3%，L-乳酸光學純度97.9%±0.5%。發(fā)酵液高效液相色譜檢測結果見附圖1。其中C為鼠李糖乳桿菌(Za"o/^"W^rAgyzmo^^)CASLCGMCCN22183發(fā)酵生產L-乳酸發(fā)酵液高效液相色譜圖。鼠李糖乳桿菌aacto6ac/〃wsWzam"o^w)CASLCGMCCW2183發(fā)酵過程曲線見附圖2。實施例13、利用鼠李糖乳桿菌aacto^c///^AammwM)CASLCGMCC2183在30升發(fā)酵罐中發(fā)酵法生產L-乳酸該實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)200克/升，豆粕水解液(制備方法同實施例1)200克/升，玉米漿(上海西王淀粉糖有限公司)30克/升，碳酸鈣100克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。115t:條件下滅菌20分鐘。本發(fā)明發(fā)酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例2;(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝有30ml種子培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，37。C靜置培養(yǎng)20小時；1升三角瓶中加入400ml種子培養(yǎng)基，將30ml種子培養(yǎng)液接入400ml種子培養(yǎng)基，37。C靜止培養(yǎng)20小時；5升三角瓶中加入2升種子培養(yǎng)基，將400ml種子培養(yǎng)液接入2升種子培養(yǎng)基，37°C靜置培養(yǎng)20小時，制得種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)上海保興BIOTECH30升發(fā)酵罐中加入18升發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入2升種子培養(yǎng)液，42。C靜置培養(yǎng)48小時,其中，每隔12小時攪拌一次，攪拌轉速50轉/分，旋轉半徑為42mm，攪拌時間30分鐘。實驗共設3次重復。發(fā)酵結束時，取發(fā)酵液，6,000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發(fā)酵液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和D-乳酸濃度，計算L-乳酸光學純度和轉化率。結果表明葡萄糖的濃度為9克/升±0.3克/升，L-乳酸濃度182克/升±4克/升，轉化率95.3%±0.4%，L-乳酸光學純度98.3%±0.3%。實施例14、利用鼠李糖乳桿菌aactoZ)flc/〃^r/^m"ay^)CASLCGMCCW2183在30升發(fā)酵罐中發(fā)酵法生產L-乳酸該實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例2。發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)200克/升(發(fā)酵初始濃度)，豆粕水解液(制備方法同實施例1)230克/升，玉米漿(上海西王淀粉糖有限公司)25克/升，碳酸鈣100克/升。該培養(yǎng)基的初始pH為6.5。115。C條件下滅菌20分鐘。本發(fā)明發(fā)酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例2;(2)種子培養(yǎng)同實施例13;(3)發(fā)酵培養(yǎng)上海保興BIOTECH30升發(fā)酵罐中加入18升發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入2升種子培養(yǎng)液，37t:靜置培養(yǎng)68小時,其中，每隔12小時攪拌一次，攪拌轉速100轉/分，旋轉半徑為42mm，攪拌時間20分鐘。其中，在48小時補加1000克工業(yè)葡萄糖(淄博虹宇工業(yè)糖有限公司)和500克碳酸鈣。實驗共設3次重復。發(fā)酵結束時，取發(fā)酵液，6,000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發(fā)酵液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和D-乳酸濃度，計算L-乳酸光學純度和轉化率。結果表明葡萄糖的濃度為15克/升±0.6克/升，L-乳酸濃度226克/升±3克/升，轉化率96.3%±0.5%，L-乳酸光學純度98.0X土0.3X。權利要求1、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)CASL，其保藏號為CGMCC№2183。2、一種生產L-乳酸的方法，是發(fā)酵鼠李糖乳桿菌(丄acto6ac/〃wsAam"w^)CASLCGMCC処2183得到L-乳酸。3、根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述鼠李糖乳桿菌aacto^c/〃wA函朋ms)CASLCGMCCWs2183的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有碳源、氮源和用于控制發(fā)酵液pH的中和劑；所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖150—200克/升；所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源為下述l)至3)中的任意一種1)豆粕水解液100—300克/升，優(yōu)選為220克/升；2)豆粕粉20—30克/升；3)豆粕水解液100—300克/升，玉米漿10—30克/升。4、根據權利要求3所述的方法，其特征在于當所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源為豆粕粉時，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還可含有0.05—0.1克/升的蛋白酶。5、根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的中和劑為碳酸鈣，所述碳酸鈣的濃度為75—100克/升，優(yōu)選為90克/升。6、根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.5一7。7、根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵條件為35—5(TC培養(yǎng)48—80小時。8、根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵條件為35—45'C培養(yǎng)50一68小時。9、根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的培養(yǎng)方式在三角瓶中采用間歇振動培養(yǎng)，發(fā)酵罐中采用間歇攪拌培養(yǎng)，間隔時間均為12小時，所述攪拌的轉速為30—100轉/分鐘，旋轉半徑為33或42mm，攪拌時間為20—40分鐘。10、根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述攪拌轉速為50轉/分鐘；攪拌時間為30分鐘。全文摘要本發(fā)明公開了一種生產L-乳酸的方法及其專用鼠李糖乳桿菌。本發(fā)明所提供的鼠李糖乳桿菌是鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)CASLCGMCC№2183。培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)CASLCGMCC№2183即可得到L-乳酸。該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有碳源、氮源和用于控制發(fā)酵液pH的中和劑；所述碳源為葡萄糖150-200克/升(發(fā)酵初始濃度)；所述氮源為豆粕水解液、豆粕水解液+玉米漿或豆粕粉；當所述氮源為豆粕粉時，還可含有蛋白酶0.05-0.1克/升；所述中和劑為碳酸鈣75-100克/升，余量為水，該發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.5-7。鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)CASLCGMCC№2183，以葡萄糖為底物，在35℃-45℃條件下以94.5％-96.5％的轉化率，生產光學純度97.6％-98.7％的L-乳酸，其濃度最高可達235克/升。文檔編號C12N1/20GK101173241SQ20071017605公開日2008年5月7日申請日期2007年10月18日優(yōu)先權日2007年10月18日發(fā)明者帥周,秦加陽,平許,博趙,馬翠卿申請人:中國科學院微生物研究所