一種重組豬圓環(huán)病毒病毒樣顆粒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，公開(kāi)了一種重組豬圓環(huán)病毒病毒樣顆粒及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巴斯德畢赤酵母作為一種宿主菌，其表達(dá)系統(tǒng)由于具有表達(dá)量高、本身遺傳穩(wěn)定、 具翻譯后加工能力等自身優(yōu)勢(shì)，實(shí)質(zhì)越來(lái)越受到關(guān)注，其研宄和商業(yè)價(jià)值也不斷體現(xiàn)。巴斯 德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白分胞內(nèi)的表達(dá)和分泌到胞外兩種方式。分泌表達(dá)的蛋白在培養(yǎng)基 中會(huì)被自身分泌的蛋白酶降解，由于甲醇酵母多采用高密度發(fā)酵，蛋白酶也會(huì)隨著細(xì)胞密 度的增高而增高。此外，該分泌表達(dá)系統(tǒng)發(fā)酵周期較長(zhǎng)，易污染，且長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵不利于外 源蛋白的表達(dá)。因此，促進(jìn)重組蛋白的胞內(nèi)表達(dá)并縮短發(fā)酵周期具有很重要的工業(yè)意義。
[0003] 病毒樣顆粒（Virus Like Particles，VLP)是含有病毒一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的空 心顆粒，沒(méi)有病毒核酸（DNA/RNA)，不能自主復(fù)制，其在形態(tài)上與真正的病毒粒子相同或相 似，可通過(guò)與病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效地誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫 保護(hù)反應(yīng)。由于VLPs沒(méi)有感染性，作為免疫原，它可通過(guò)和病毒感染一樣的途徑呈遞給免 疫細(xì)胞，有效地誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，而宿主、病毒和疫苗因素共同決定 VLPs產(chǎn)生的機(jī)體防護(hù)水平。
[0004] 目前活病毒疫苗的缺陷就是一旦病毒活性恢復(fù)，安全性不能保證。同時(shí)，滅活病毒 疫苗可因滅活過(guò)程不完全而導(dǎo)致安全性問(wèn)題。但VLPs疫苗沒(méi)有感染性，穩(wěn)定性好，不易失 活，具有廣闊的發(fā)展前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種重組豬圓環(huán)病毒病毒樣顆粒及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種基因工程細(xì)胞，所述基因工程細(xì)胞為真核細(xì)胞，并 且所述細(xì)胞的基因組中整合有豬圓環(huán)病毒外殼蛋白的表達(dá)盒；或者所述細(xì)胞中含有表達(dá)載 體，所述表達(dá)載體含有所述豬圓環(huán)病毒外殼蛋白的表達(dá)盒；
[0007] 并且所述基因工程細(xì)胞在胞內(nèi)表達(dá)所述外殼蛋白，且所述外殼蛋白在所述基因工 程細(xì)胞內(nèi)部形成病毒樣顆粒（VLP)。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述病毒為豬圓環(huán)病毒，優(yōu)選地為豬圓環(huán)病毒2型。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述病毒樣顆粒為豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白形成的病毒樣顆粒。 [0010] 在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞為酵母細(xì)胞，優(yōu)選為畢赤酵母細(xì)胞，更優(yōu)選為畢赤酵母 KM71菌株。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒包括5'至3'可操作地連接的以下元件：?jiǎn)?dòng)子、 起始密碼子、所述外殼蛋白的ORF序列和終止密碼子。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的起始密碼子和所述外殼蛋白的ORF序列直接相連。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒不含有分泌表達(dá)元件。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒不含有分泌肽、引導(dǎo)肽、或信號(hào)肽。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述外殼蛋白基因?yàn)樨i圓環(huán)病毒ORF2抗原基因。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述豬圓環(huán)病毒ORF2抗原基因序列如SEQ ID NO. : 1所示（含 起始密碼子和終止密碼子）。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述表達(dá)載體以畢赤酵母pPICX載體為骨架。
[0018] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種病毒樣顆粒（VLP)，所述VLP由本發(fā)明第一方面所 述的基因工程細(xì)胞表達(dá)。
[0019] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括本發(fā)明第二方 面所述的病毒樣顆粒，和藥學(xué)上可以接受的載體。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物包括疫苗組合物。
[0021] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種制備VLP的方法，包括步驟：
[0022] 在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第一方面所述的細(xì)胞，從而表達(dá)出本發(fā)明第二 方面所述的病毒樣顆粒（VLP);和
[0023] 分離所述病毒樣顆粒（VLP)。
[0024] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種分離的經(jīng)密碼子優(yōu)化的多核苷酸，所述多核苷酸 編碼SEQ ID NO. : 2所示的多肽；并且所述多核苷酸選自下組：
[0025] (a)序列如SEQIDNO. : 1所示的多核苷酸；
[0026] (b)核苷酸序列與SEQ ID NO. : 1所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的
[0027] 多核苷酸；
[0028] (c)如SEQ ID NO. : 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60個(gè)
[0029] (較佳地1-30,更佳地1-10個(gè)）核苷酸的多核苷酸；
[0030] (e)與（a)-(c)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
[0031] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有本發(fā)明第五方面所 述的多核苷酸。
[0032] 本發(fā)明的第七方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第六方面 所述的表達(dá)載體，或者在基因組中整合有本發(fā)明第五方面所述的多核苷酸。
[0033] 本發(fā)明的第八方面，提供了一種藥物組合物，所述的組合物含有本發(fā)明第二方面 所述的病毒樣顆粒（VLP)、本發(fā)明第五方面所述的多核苷酸或者本發(fā)明第六方面所述的表 達(dá)載體或者本發(fā)明第七方面所述的宿主細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物包括疫苗組合物。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的疫苗組合物還含有佐劑。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的佐劑包括氧化鋁、皂苷、qui 1 A、胞壁酰二肽、礦物油或 植物油、基于囊泡的佐劑、非離子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、細(xì)胞因子（包括IL-1、IL-2、 IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和 CpG)。
[0037] 本發(fā)明的第九方面，提供了一種分離的重組多肽，所述重組多肽中具有豬圓環(huán)病 毒Cap蛋白的氨基酸序列，并且所述重組多肽被包裝為病毒樣顆粒。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的重組多肽由本發(fā)明第一方面所述的基因工程細(xì)胞表達(dá)。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述重組多肽具有如SEQIDNO. : 2所示的氨基酸序列。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述重組多肽具有以下特性：
[0041] (1)能夠特異性地與抗豬圓環(huán)病毒抗體結(jié)合；和/或
[0042] (2)能夠誘發(fā)動(dòng)物體產(chǎn)生針對(duì)豬圓環(huán)病毒的免疫反應(yīng)。
[0043] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0044] 圖1顯示了PCVCAPS基因的核苷酸及編碼的氨基酸序列。
[0045] 圖2顯示了Westernblot檢測(cè)PCV2cap蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)。
[0046] 圖3顯示了ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0047] 圖4顯示了 PCV2VLP Optipr印密度梯度離心的結(jié)果。
[0048] 圖5顯示了電鏡負(fù)染實(shí)驗(yàn)觀察PCV2病毒顆粒。
[0049] 圖6顯示了 VLP免疫小鼠后血清IPMA結(jié)果，其中圖A、圖B為陽(yáng)性結(jié)果，圖C為陰 性結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 本發(fā)明人通過(guò)廣泛而深入的研宄，獲得一種重組豬圓環(huán)病毒病毒樣顆粒，首次實(shí) 現(xiàn)了在基因工程細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)形成豬圓環(huán)病毒病毒樣顆粒（VLP)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該重組豬 圓環(huán)病毒病毒樣顆粒能夠特異性地與抗豬圓環(huán)病毒抗體結(jié)合，且能夠誘發(fā)動(dòng)物體產(chǎn)生抗豬 圓環(huán)病毒的免疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供了上述重組豬圓環(huán)病毒病毒樣顆粒的制備方法。
[0051] 豬圓環(huán)病毒
[0052] 本發(fā)明選取豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)Cap蛋白VLPs為報(bào)告蛋白。PCV2的感染與斷 奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS)的發(fā)生密切相關(guān)，其感染呈世界性分布，已成為危害養(yǎng)豬 業(yè)健康發(fā)展的重要原因之一。而且由于疫苗抗原的制備成本居高不下，導(dǎo)致市場(chǎng)供應(yīng)的各 種PCV2疫苗單頭份價(jià)格在8~48元人民幣之間，高昂的疫苗價(jià)格嚴(yán)重制約了 PCV2疫苗的 推廣使用。因此，本發(fā)明提供的VLPs疫苗能夠在動(dòng)物病毒性傳染病毒控制工作中發(fā)揮了巨 大的作用，對(duì)PMWS的防治及養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展有重要的戰(zhàn)略和現(xiàn)實(shí)意義。
[0053] 優(yōu)選地，本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型（PCV2) Cap蛋白VLPs的氨基酸序列如下：
[0054] MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTVKATTVRTPSWAV DMMRFNLDDFVPPGGGTNKISIPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQ⑶RGVGSTAVILDDNFVPKVTAQTYDPYVNYSS RHTIPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTSRNVDHVGLGTAFENSIYDQDYNIRVTMYVQFRE FNLKDPPLKP(SEQIDNO. :2)；
[0055] 其優(yōu)化后的編碼核苷酸序列優(yōu)選如下：
[0056] GGATCCAAACGATGACTTATCCAAGAAGAAGATACAGAAGAAGAAGACACAGACCTAGATCCCATCTGG GTCAGATCCTGAGAAGAAGACCTTGGCTGGTTCATCCTAGACACAGATACAGATGGAGAAGAAAGAACGGTATCTTC AACACCAGACTGTCCAGAACCTTCGGTTACACTGTCAAGGCTACCACTGTCAGAACTCCATCTTGGGCTGTCGATAT GATGAGATTCAACCTGGACGACTTCGTTCCACCTGGTGGTGGTACTAACAAAATCTCCATCCCATTCGAGTACTACA GAATCAGAAAGGTCAAGGTCGAGTTCTGGCCATGCTCTCCAATCACTCAGGGTGACAGAGGTGTTGGTTCTACTGCT GTCATTCTGGATGACAACTTCGTCCCAAAGGTCACTGCACAAACCTACGATCCATACGTCAACTACTCTTCCAGACA CACCATCCCACAACCATTCTCCTACCACTCCAGATACTTCACTCCTAAGCCTGTTCTGGACTCCACTATCGACTACT TCCAACCAAACAACAAGAGAAACCAGCTGTGGCTGAGATTGCAGAC