技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種豬圓環(huán)病毒2型疫苗效力檢驗(yàn)方法。

背景技術(shù)：

豬圓環(huán)病毒2型(porcine cirovirus type 2,PCV2)是引起仔豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。自1991年在加拿大豬群中暴發(fā)以來，PMWS已經(jīng)波及全球，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2還與增生性壞死性肺炎、母豬繁殖障礙、豬皮炎與腎病綜合征和豬呼吸道疾病綜合征相關(guān)。豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCV2Associated Disease，PCVD)，主要是PMWS，在2005年給歐洲造成的損失高達(dá)6億歐元。PCV2感染性疾病引起死亡率增高、飼料報(bào)酬降低，加上我國規(guī)模化豬場飼養(yǎng)管理水平相對較為落后，因此PCVD也給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，國際上上市的PCV2疫苗分為滅活疫苗、亞單位疫苗和嵌合滅活苗。PCV2疫苗效力檢驗(yàn)方法通常是采用仔豬攻毒實(shí)驗(yàn)的方法。而我國豬群PCV2污染嚴(yán)重，對于篩選出合格的用于PCV2疫苗開發(fā)或者疫苗效力檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)豬比較困難，而且仔豬攻毒實(shí)驗(yàn)方法存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)錢及PCV2攻毒模型建立困難、檢驗(yàn)結(jié)果批間差異大等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于此，本發(fā)明通過豬圓環(huán)病毒2型疫苗免疫小白鼠，測定其血清中PCV2特異性抗體水平，提供了一種簡捷有效的PCV2疫苗效力檢驗(yàn)方法。包括下述步驟：

1.小白鼠的免疫

將豬圓環(huán)病毒2型疫苗經(jīng)皮下免疫小白鼠，10-21天后再按照相同的免疫途徑和劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次；

2小白鼠抗體水平的測定

加強(qiáng)免疫14-28天后，處死小白鼠，采集并分離血清，測定抗體水平；

本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗效力的檢驗(yàn)方法中，所述小白鼠的免疫劑量為0.1-0.2ml，并且分4點(diǎn)免疫。

本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒2型疫苗效力檢驗(yàn)方法中，所述小白鼠抗體水平的測定方法包括如下操作步驟，

①將待檢血清用PBS做倍比稀釋；

②加入已經(jīng)包被PCV2Cap蛋白的ELISA酶標(biāo)板中；

③放入37℃溫箱，作用1h；

④棄去一抗，PBST洗滌；

⑤加入PBS稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(二抗)，放入37℃溫箱，作用1h；

⑥棄去二抗，用PBST洗滌；

⑦加入顯色液進(jìn)行顯色；

⑧加入終止液終止顯色；

⑨酶標(biāo)儀讀取OD₄₅₀，判定疫苗效力；

所述稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液均為現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)用液。

最優(yōu)地，本發(fā)明所述的首次免疫小白鼠的時(shí)間為14天。

最優(yōu)地，本發(fā)明所述的加強(qiáng)免疫小白鼠的時(shí)間為21天。

本發(fā)明具有如下技術(shù)效果：

1.檢測時(shí)間短，比豬體內(nèi)效力檢驗(yàn)的時(shí)間至少減少20天；

2.本發(fā)明方法操作簡單，可重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確。

3.小白鼠遺傳穩(wěn)定，不會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異而引起的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異顯著；

4.用疫苗免疫小白鼠操作簡單，同時(shí)不需要買大量的實(shí)驗(yàn)豬，大大節(jié)約了成本、人力，提高了疫苗檢測的效率。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的實(shí)施例中利用平行實(shí)驗(yàn)的方法建立了免疫小白鼠抗體水平、免疫豬抗體水平及仔豬攻毒保護(hù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)免疫小白鼠抗體水平與免疫后豬的抗體水平及攻毒后淋巴結(jié)感染存在平行關(guān)系。應(yīng)用本發(fā)明的方法，可以替代通常采用的PCV2疫苗免疫豬抗體水平實(shí)驗(yàn)以及仔豬攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明實(shí)施例中還利用本發(fā)明檢測方法制定出PCV2疫苗效力的合格標(biāo)準(zhǔn)，為PCV2疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)和檢測提供了基礎(chǔ)。

實(shí)施例1

豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗效力的檢測

1.滅活疫苗來源

PCV2滅活疫苗的毒株為PCV2-SH株(保藏號CGMCC No.2389)。將PCV2-SH株接種PK15細(xì)胞，5天后收獲病毒抗原液做為滅活疫苗。

將制備的滅活疫苗分為三組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其抗原含量經(jīng)測定分別為10^5.0TCID₅₀/ml、10^5.5TCID₅₀/ml、10^6.0TCID₅₀/ml。下面以三組滅活疫苗為樣品，免疫小白鼠測定其血清抗體水平。

2.免疫小白鼠抗體檢測

(1)BALB/c小白鼠的免疫

將5-6周齡健康的BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組5只，Ⅰ組采用抗原含量10^5.0TCID₅₀/ml的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗免疫，Ⅱ組采用抗原含量10^5.5TCID₅₀/ml的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗免疫，Ⅲ組采用抗原含量10^6.0TCID₅₀/ml的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗免疫，Ⅳ組為空白組。分四點(diǎn)免疫，每個(gè)點(diǎn)免疫0.05ml，14天后再按照相同的免疫途徑和劑量加強(qiáng)免疫一次。

(2)小白鼠抗體水平的測定

加強(qiáng)免疫21天后，通過摘除眼球，采集分離血清，測定其抗體水平。操作步驟如下：

①待檢血清用稀釋液做1:50倍稀釋，然后再做2倍系列稀釋，至1:102400；

②將稀釋后的血清分別加入已經(jīng)包被PCV2Cap蛋白的ELISA酶標(biāo)板中，PCV2Cap蛋白由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化獲得，包被量為0.5μg/孔，步驟①中12個(gè)稀釋度每個(gè)稀釋度加1孔，每孔100μl。同時(shí)設(shè)立小白鼠相同稀釋度的陰性血清對照組；

③放入37℃溫箱，作用1h；

④棄去一抗，加入洗滌液，300μl/孔，洗滌3次，每次3-5min；

⑤加入用稀釋液作5000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG(二抗)，100μl/孔；放入37℃溫箱，作用1h；

⑥棄去二抗，用洗滌液，洗滌3次，每次3-5min；

⑦加入顯色液100μl/孔，進(jìn)行室溫避光顯色10-15min；

⑧加入終止液100μl/孔，終止顯色；

⑨酶標(biāo)儀讀取OD₄₅₀；

⑩結(jié)果判定方法：待檢血清OD₄₅₀/同稀釋度陰性血清OD₄₅₀≥2.1判定為陽性結(jié)果；待檢血清OD₄₅₀/同稀釋度陰性血清OD₄₅₀≤2.1判定為陰性結(jié)果。以陽性結(jié)果的最大稀釋度做為小白鼠的抗體水平。

小白鼠抗體水平檢測結(jié)果如下：

I組：5只小白鼠的抗體效價(jià)分別為1:200、1:200、1:200、1:200、1:400；Ⅱ組5只小白鼠的抗體效價(jià)分別為1:400、1:400、1:400、1:800、1:800；Ⅲ組5只小白鼠的抗體效價(jià)分別為1:800、1:800、1:800、1:800、1:1600；Ⅳ組即空白組5只小白鼠的抗體效價(jià)均≤1:50。

所用溶液如下：

稀釋液配方：

十二水磷酸氫二鈉 2.9克

磷酸二氫鉀 0.2克

氯化鈉 8.0克

氯化鉀 0.2克

加水定容至1000ml。

洗滌液配方：

十二水磷酸氫二鈉 2.9克

磷酸二氫鉀 0.2克

氯化鈉 8.0克

氯化鉀 0.2克

吐溫-20 0.5ml

加水定容至1000ml。

顯色液配方：

TMB底物液：(1mg/ml)

TMB粉末 0.01g

DMSO 10ml

TMB底物顯色緩沖液(pH5.0,100ml)

檸檬酸：1.02克

十二水磷酸氫二鈉 3.69克

顯色液：避光顯色

TMB底物液 1ml

TMB底物顯色緩沖液 9ml

30％雙氧水 10μl

終止液配方：2mol/L硫酸

3.豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗免疫豬抗體水平測定

(1)實(shí)驗(yàn)豬的免疫

將21日齡健康的PCV2抗原抗體陰性及豬藍(lán)耳病抗原抗體陰性斷奶仔豬，隨機(jī)分為4組，每組5只，Ⅰ組采用抗原含量10^5.0TCID₅₀/ml的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗免疫，Ⅱ組采用抗原含量10^5.5TCID₅₀/ml的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗免疫，Ⅲ組采用抗原含量10^6.0TCID₅₀/ml的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗免疫，Ⅳ組為空白組。每頭免疫1ml，14天后再按照相同的免疫途徑和劑量加強(qiáng)免疫一次。

(2)豬抗體水平的測定

加強(qiáng)免疫21天后，通過前腔靜脈進(jìn)行采血，分離血清，測定其抗體水平。抗體測定方法操作步驟如下：

①待檢血清用稀釋液做1:50倍稀釋，然后再做2倍系列稀釋，至1：102400；

②將稀釋后的血清分別加入已經(jīng)包被PCV2Cap蛋白的ELISA酶標(biāo)板中，PCV2Cap蛋白由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化獲得，包被量為0.5μg/96孔，每個(gè)稀釋度加1孔，100μl/孔，同時(shí)設(shè)立仔豬陰性血清對照，做同樣的稀釋度；

③放入37℃溫箱，作用1h；

④棄去一抗，加入洗滌液，300μl/孔，洗滌3次，每次3-5min；

⑤加入用稀釋液做10000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗豬IgG(二抗)，100μl/孔；放入37℃溫箱，作用1h；

⑥棄去二抗，用洗滌液；洗滌3次，每次3-5min；

⑦加入TMB顯色液100μl/孔，進(jìn)行室溫避光顯色10-15min；

⑧加入2mol/L H₂SO₄溶液100μl/孔，終止顯色；

⑨酶標(biāo)儀讀取OD₄₅₀；

⑩結(jié)果判定方法：待檢血清OD₄₅₀/同稀釋度陰性血清OD₄₅₀≥2.1判定為陽性結(jié)果；待檢血清OD₄₅₀/同稀釋度陰性血清OD₄₅₀≤2.1判定為陰性結(jié)果。以陽性結(jié)果的最大稀釋度做為小白鼠的抗體水平。

豬抗體水平檢測結(jié)果如下：

I組：5頭豬的抗體效價(jià)分別為1:1600、1:1600、1:800、1:3200、1:6400；Ⅱ組5頭豬的抗體效價(jià)分別為1:3200、1:3200、1:3200、1:3200、1:6400；Ⅲ組5頭豬的抗體效價(jià)分別為1:3200、1:3200、1:6400、1:6400、1:12800；Ⅳ組即空白組5頭豬的抗體效價(jià)均為≤1:50。

4.仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn)

目前，PCV2攻毒模型很難建立，是因?yàn)樗呐R床癥狀不明顯，臨床上主要是因?yàn)镻CV2和其它病原混合感染，所以很難通過臨床癥狀檢驗(yàn)PCV2的感染狀況。而PCV2在豬體內(nèi)主要靶組織是淋巴組織。因此，本實(shí)施例采用采集攻毒后仔豬的肺門淋巴結(jié)或者腹股溝淋巴結(jié)，免疫組織化學(xué)(IHC)方法檢測其抗原情況，以此判斷仔豬攻毒保護(hù)結(jié)果。

將免疫組和空白組中的所有豬進(jìn)行PCV2-SH株(10^6.0TCID₅₀/ml)的攻毒。每頭豬滴鼻1ml，頸部肌肉注射2ml，隔離飼養(yǎng)。攻毒后第4、7天分別在兩腋下和兩臀部注射弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍(lán)蛋白(4mg/ml，0.5ml)和腹腔注射巰基乙酸培養(yǎng)基10ml。在第11天和19天腹腔注射巰基乙酸培養(yǎng)基10ml。攻毒后25天進(jìn)行剖殺，采集肺門淋巴結(jié)或者腹股溝淋巴結(jié)進(jìn)行固定，然后用IHC方法進(jìn)行抗原檢測，比較空白組和免疫組淋巴結(jié)中感染PCV2抗原情況，以此判斷仔豬攻毒保護(hù)結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

將豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗3個(gè)批次免疫小白鼠抗體水平與免疫豬抗體水平以及仔豬攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行了比較，結(jié)果見表1。

表1.小白鼠抗體水平與豬抗體水平以及仔豬攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)的關(guān)系

通過將不同抗原含量的3組豬圓環(huán)病毒2型疫苗免疫BALB/c小鼠和PCV2抗原抗體雙陰性的斷奶仔豬，通過比較免疫小白鼠抗體水平與免疫豬抗體水平，發(fā)現(xiàn)兩者產(chǎn)生的PCV2抗體具有平行關(guān)系，即免疫小白鼠抗體水平與免疫豬抗體水平呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。

對免疫后的仔豬進(jìn)行了攻毒保護(hù)試驗(yàn)，通過對淋巴結(jié)中PCV2抗原的檢測，發(fā)現(xiàn)仔豬攻毒后淋巴結(jié)中感染的PCV2的細(xì)胞所占的比例與免疫小白鼠抗體水平具有平行關(guān)系，即免疫小白鼠抗體水平越高，淋巴結(jié)中感染的PCV2的細(xì)胞所占的比例越小，說明表明保護(hù)性好；相反免疫小白鼠抗體水平越低，淋巴結(jié)中感染的PCV2的細(xì)胞所占的比例越大，說明表明保護(hù)性差。

3批不同抗原含量的疫苗的仔豬免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示抗原含量為10^5.0TCID₅₀/ml的疫苗可以提供仔豬40％的保護(hù)力，抗原含量為10^5.5TCID₅₀/ml的疫苗可以提供80％的保護(hù)力，抗原含量為10^6.0TCID50/ml的疫苗可以提供100％的保護(hù)力。我們也不難看出攻毒保護(hù)試驗(yàn)的結(jié)果與小白鼠抗體水平具有平行關(guān)系。同時(shí)由此可以得出10^5.5TCID₅₀/ml的抗原為最小保護(hù)劑量，此劑量下的疫苗免疫小白鼠抗體水平為1:400或者1:800。由此，利用本發(fā)明檢測方法可以制定出PCV2疫苗效力的合格標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)施例中，采用本發(fā)明的方法檢測小白鼠抗體水平大于1:400，做為樣品疫苗檢驗(yàn)合格的標(biāo)準(zhǔn)，即可以達(dá)到對豬群產(chǎn)生80％保護(hù)率，有效防御PCVD的目的。

綜上所述，可以得出免疫小白鼠抗體水平和豬的抗體水平及攻毒后淋巴結(jié)感染存在平行關(guān)系。應(yīng)用PCV2疫苗免疫小白鼠，測定其血清中PCV2特異性抗體水平實(shí)驗(yàn)，可以替代現(xiàn)有豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗效力檢驗(yàn)方法通常采用的疫苗免疫豬抗體水平實(shí)驗(yàn)以及仔豬攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)。

本發(fā)明的疫苗效力的檢驗(yàn)方法，首次免疫與加強(qiáng)免疫的時(shí)間間隔并不限于14天，首次免疫10-21天后再按照相同的免疫途徑和劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫，其疫苗效力的檢驗(yàn)的結(jié)果與14天的結(jié)果無明顯差異。加強(qiáng)免疫后與處死小鼠采集血樣的時(shí)間間隔并不限于21天，加強(qiáng)免疫14-28天后，處死小白鼠，采集并分離血清，其疫苗效力的檢驗(yàn)的結(jié)果與21天的結(jié)果無明顯差異。

本發(fā)明所述的疫苗效力的檢驗(yàn)方法，小白鼠的免疫劑量并不限于0.05ml，免疫劑量為0.1-0.2ml時(shí)，疫苗效力的檢驗(yàn)的結(jié)果與免疫劑量為0.05ml的結(jié)果無明顯差異。

本發(fā)明的檢測疫苗的方法，不限于應(yīng)用于PCV2滅活疫苗，因?yàn)槠渌愋偷腜CV2疫苗如基因工程疫苗、亞單位疫苗也可以在小白鼠體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，其他類型PCV2疫苗，如基因工程疫苗、亞單位疫苗均可以用本發(fā)明之方法檢測。

豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗免疫小白鼠抗體水平測定方法檢測時(shí)間短，操作簡單，成本低，得到的結(jié)果準(zhǔn)確，可重復(fù)性好，具有很好的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場前景。