專利名稱：運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測食源性假結(jié)核耶爾森氏菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌檢驗技術(shù)，具體地說是運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增反應(yīng)來檢測假結(jié)核耶爾森氏 菌，特別是食源性假結(jié)核耶爾森氏菌的檢測方法。
背景技術(shù)：
假結(jié)核耶爾森氏菌是食品中的常見細(xì)菌，可引起極為嚴(yán)重的食品中毒事件，并可以導(dǎo)致 多種疾病發(fā)生，嚴(yán)重威脅著人們的健康，為各國海關(guān)必檢微生物之一。快速、準(zhǔn)確的檢測食 品中的假結(jié)核耶爾森氏菌是有效預(yù)防和控制耶爾森氏菌感染的前提條件。目前食品中的細(xì)菌 鑒定通常還是利用傳統(tǒng)生理生化方法進(jìn)行檢測，利用傳統(tǒng)的方法檢測食品中的假結(jié)核耶爾森 氏菌，不僅需要4天的時間進(jìn)行菌落培養(yǎng)，更要消耗大量的人力和物力，現(xiàn)在已經(jīng)越來越無 法滿足進(jìn)出口貨物日益增長的現(xiàn)狀。
另外還有一種利用普通的PCR技術(shù)進(jìn)行檢測的方法，該方法在設(shè)備要求上非常嚴(yán)格，不 僅要有價格昂貴的PCR儀，更必須備有電泳裝置和相應(yīng)的實(shí)驗室，因此不便于廣泛推廣應(yīng)用。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，食品檢驗檢疫工作中的細(xì)菌鑒定方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的簡單生化實(shí) 驗水平上向分子生物學(xué)的方法如PCR、探針雜交等技術(shù)發(fā)展。最新開發(fā)出來的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò) 增技術(shù)是一種更為高效的分子檢測方法，已經(jīng)被很多國家認(rèn)同，并大力發(fā)展。因此如何運(yùn)用 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測食源性假結(jié)核耶爾森氏菌已成為食品檢驗檢疫工作中進(jìn)行攻關(guān)的重 要課題。

發(fā)明內(nèi)容
為了提高食品檢測效率，節(jié)約時間，以解決傳統(tǒng)檢測方法無法滿足進(jìn)出口貨物日益增長 的現(xiàn)狀，本發(fā)明經(jīng)過無數(shù)次的實(shí)驗檢測，終于探索出一種運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測食源 性假結(jié)核耶爾森氏菌的方法，該方法具有檢測快速、便捷、低成本等特點(diǎn)。 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
(1) 設(shè)計特異性寡核苷酸引物用于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測；
(2) 整合各引物使之不相互干擾。
(3) 以引物序列組，擴(kuò)增待測樣品模板，進(jìn)行目的基因的特異性擴(kuò)增；
(4) 擴(kuò)增完畢后可通過短暫離心直接目測白色沉淀檢測結(jié)果，或通過電泳帶形分析檢測結(jié)果。
本發(fā)明用特異性的引物組擴(kuò)增假結(jié)核耶爾森氏菌，反應(yīng)后目測結(jié)果和電泳結(jié)果均未發(fā)現(xiàn) 假陽性和假陰性的結(jié)果。
該方法包括應(yīng)用該方法檢測食源性假結(jié)核耶爾森氏菌所使用的引物組和與之配套的擴(kuò) 增反應(yīng)條件。其中所使用的引物組序列如下
引物序列一GCAAGGCGTAGTGTATTGTGAA
弓I物序列二 CTCTATTACAGGTTACTCTGGAACAAGCCGAAAACTGAA 引物序列三TCATCGCCTCTGACTGCCTA
弓I物序列四TCAAATAATCGCAACACAGCTCAACCTCACAACCCGAA
環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分濃度加樣量
擴(kuò)增體系預(yù)混合物2X12單
引物序列一10)jmol/L
引物序列二10pmol/Ll舉
引物序列三10|jmol/L0.2nL
引物序列四10nmol/Ll単
DNA樣品2pL
雙蒸水 6.9pL 總體積 25 nL
環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增擴(kuò)增程序為
(1) . 63 °C 1小時；
(2) . 80°C 10分鐘。
環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法包括
(1) . 10， OOOXg， 5分鐘，室溫，可在試管底部見到白色沉淀；
(2) .加入顯色劑，反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色；
(3) . 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果有階梯狀電泳條帶； 選擇以上三種環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法中的任意一種方法進(jìn)行檢測。 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增產(chǎn)物檢測理論依據(jù)
1、 陽性結(jié)果會產(chǎn)生白色沉淀在環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增過程中，dNTP不斷添加進(jìn)新合成的核 苷酸鏈，同時會生成大量的副產(chǎn)物——焦磷酸鎂。焦磷酸鎂是一種白色沉淀物，由于整個擴(kuò)
增實(shí)驗都是在63'C進(jìn)行，所以焦磷酸鎂沉淀無法溶解，最終，隨著陽性核苷酸鏈的增加，焦
磷酸鎂沉淀也不斷積累。從而在反應(yīng)結(jié)束后，可以直接通過觀察白色沉淀而確定陽性反應(yīng)。
2、 陽性結(jié)果在加入SYBR Green染料后，溶液變成綠色陽性的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增會合成 大量核苷酸鏈。反應(yīng)后，向陽性反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBR Green染料后，SYBR Green分子會大 量嵌入核苷酸鏈中，從而使SYBR Green分子產(chǎn)生綠色熒光。而陰性結(jié)果由于沒有目的基因 片段，無法擴(kuò)增出核苷酸鏈，SYBR Green也便無法同核苷酸鏈結(jié)合，結(jié)果只能是棕黃色。
3、 陽性結(jié)果在電泳中表現(xiàn)為階梯狀電泳條帶環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增的引物設(shè)計有一至關(guān)重要 的環(huán)節(jié)，即在正常擴(kuò)增引物的5'末端結(jié)合了一段鏈內(nèi)配對區(qū)域。其目的在于，在擴(kuò)增進(jìn)行 的同時，鏈內(nèi)配對區(qū)可以同新擴(kuò)增的核苷酸鏈中的某部區(qū)域配對，從而在新擴(kuò)增鏈的一端形 成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。同理，在新擴(kuò)增鏈的另一端，也可以形成相同的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。而在以后的擴(kuò)增過 程中，引物會不斷地擴(kuò)增這一段兩端成環(huán)的模板，從而不斷積累這一環(huán)狀單位的個數(shù)，使新 合成核苷酸鏈分子以一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)為基數(shù)，不斷合成、不斷積累。而這一分子量的積累，反 映在電泳中，則表現(xiàn)為形成階梯狀電泳條帶。
如出現(xiàn)其它結(jié)果則表明此次檢驗失敗不能確定是否存在假結(jié)核耶爾森氏菌，需重新檢驗。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是相比傳統(tǒng)生理生化檢測方法，基于環(huán)介導(dǎo)恒溫 擴(kuò)增的鑒定方法適用于直接從患者含菌體液、食品和體液培養(yǎng)物等臨床樣品中擴(kuò)增靶基因， 只需要一次環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增反應(yīng)就能夠檢測假結(jié)核耶爾森氏菌是否存在，大大提高了效率節(jié) 約了時間。相比較其它PCR方法，本方法僅需要簡單的設(shè)備——一個恒溫水域箱、 一個離心 機(jī)或普通電泳設(shè)備(電泳儀)即可，大大提高了性價比節(jié)約了成本。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增方法具 有檢測準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定特異的目的細(xì)菌。環(huán)介導(dǎo) 恒溫擴(kuò)增鑒定方法不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌生理狀態(tài)的影響，較生理生化鑒定方法更為準(zhǔn)確。


圖1某待測鮮雞肉樣品環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測待測樣品DNA，離心后目測沉淀結(jié)果 待測樣品試管(右側(cè))底部可見明顯白色沉淀；陰性對照(左側(cè))沒有沉淀。
圖2某待測鮮雞肉樣品環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測待測樣品DNA， SYBR Green染色結(jié)果 待測樣品溶液(右側(cè))呈現(xiàn)綠色；陰性對照(左側(cè))為棕黃色。
圖3某待測鮮雞肉樣品環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測待測樣品DNA， 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢 測結(jié)果待測樣品(第3道)出現(xiàn)階梯狀條帶；陰性對照(第2道)沒有條帶；第1道為Marker。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。 樣本某處出口鮮雞肉。
用常規(guī)生理、生化方法檢測出假結(jié)核耶爾森氏菌疑似菌落，然后進(jìn)行如下環(huán)介導(dǎo)恒溫
擴(kuò)增技術(shù)檢測
1. 樣品處理
(1) 取100克待檢樣品，粉碎。
(2) 將樣品放于裝有l(wèi)升營養(yǎng)肉湯的錐形瓶中，培養(yǎng)箱中37t:培養(yǎng)8小時。
2. DNA抽提
用滴管取培養(yǎng)后的營養(yǎng)肉湯lmL，在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下3000轉(zhuǎn)/分鐘， 離心IO分鐘，取上清液，室溫下10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄掉上清液，向沉淀中加入 50iul細(xì)菌裂解液，沸水浴10分鐘，室溫下10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，取上清液置-20'C保 存。
3. 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增 擴(kuò)增反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分濃度加樣量
擴(kuò)增體系預(yù)混合物2X
引物序列一1Opmol/LO萃
引物序列二10nmol/Ll攀
引物序列三10,ol/L0.2nL
引物序列四lOpmol/Ll單
DNA樣品2)xL
雙蒸水
總體積25 (jL
環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增程序為
(1) 63°C 1小時；
(2) 80°C 10分鐘。 反應(yīng)在恒溫水浴箱中進(jìn)行。
環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增共進(jìn)行2管反應(yīng)，其中一管中加入樣品DNA;另一管為無樣品DNA的 反應(yīng)體系，作為陰性對照。
4.對被檢測樣品結(jié)果進(jìn)行觀察
(1) 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增產(chǎn)物10， 000Xg離心5分鐘后，待測樣品試管底部有明顯白色沉 淀，陰性對照則沒有沉淀，結(jié)果如圖l。
(2) 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBRGreen染色后，待測樣品溶液呈現(xiàn)綠色，陰性對照 為棕黃色，結(jié)果如圖2。
(3) 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，待測樣品有階梯狀電泳條帶，陰 性對照沒有電泳條帶，結(jié)果如圖3。
可以選擇以上三種環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法中的任意一種方法進(jìn)行檢測。 實(shí)驗表明樣品中含有假結(jié)核耶爾森氏菌。
3天后，通過常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測證明，所檢驗的目的菌落為假結(jié)核耶爾森氏菌。 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增檢驗結(jié)果與生化檢測結(jié)果一致。
序列列表
SEQUENCE LISTING
<110> 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
<120> 運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測食源性假結(jié)核耶爾森氏菌的方法
<160> 4
< 170> Patentln version 3.1 <210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 <220>
<221 > primer bind
<222> (1)..(22) <223>
<400> 1
gcaaggcgta gtgtattgtg aa 22
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列 <220>
<221> primer bind
<222> (1)..(39) <223>
<400> 2
ctctattaca ggttactctg gaacaagccg aaaactgaa 39
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 <220>
<221> primer bind
<222> (1)..(20) <223>
<400> 3
tcatcgcctc tgactgccta 20
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列 <220>
<221> primer bind
<222> (1)..(38) <223>
<400> 4
tcaaataatc gcaacacagc tcaacctcac aacccgaa 38
權(quán)利要求
1.一種運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測食源性假結(jié)核耶爾森氏菌的方法，其特征在于，所使的引物組序列如下引物序列一GCAAGGCGTAGTGTATTGTGAA引物序列二CTCTATTACAGGTTACTCTGGAACAAGCCGAAAACTGAA引物序列三TCATCGCCTCTGACTGCCTA引物序列四TCAAATAATCGCAACACAGCTCAACCTCACAACCCGAA
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測食源性假結(jié)核耶爾森氏菌的方法，其特征在于，擴(kuò)增反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量擴(kuò)增體系預(yù)混合物2X12單引物序列一10(xmol/L0.2^引物序列二10nmol/Ll舉引物序列三10pmol/L引物序列四10nmol/Ll單dna樣品2jjL雙蒸水6舉總體積25
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測食源性假結(jié)核耶爾森氏菌的方 法，其特征在于，環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增程序為-(1) . 63°C1小時；(2) . 80°C IO分鐘。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測食源性假結(jié)核耶爾森氏菌的方法，其特征在于，環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法包括(1) . 10， OOOXg， 5分鐘，室溫，可在試管底部見到白色沉淀-,(2) .加入顯色劑，反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色；(3) . 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果有階梯狀電泳條帶； 選擇以上三種環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法中的任意一種方法進(jìn)行檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測食源性假結(jié)核耶爾森氏菌的方法，屬于細(xì)菌檢驗技術(shù)領(lǐng)域，主要的技術(shù)方案是設(shè)計了引物組序列，采用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測，其環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法包括(1)10,000×g，5分鐘，室溫，陽性可見在試管底部見到白色沉淀；(2)加入顯色劑，陽性結(jié)果成綠色；(3)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果有階梯狀電泳條帶；可以選擇以上三種環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法中的任意一種方法進(jìn)行檢測。該方法具有檢測準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定特異的目的細(xì)菌，提高了檢測效率，節(jié)約了時間，從而解決傳統(tǒng)檢測方法無法滿足進(jìn)出口貨物日益增長的現(xiàn)狀。
文檔編號C12Q1/68GK101182575SQ200710150208
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月19日
發(fā)明者葉露萌, 張宏偉, 宏 趙, 趙玉龍, 鄭文杰, 黃熙泰 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心