專利名稱：利用竹節(jié)參細胞培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得竹節(jié)參次生代謝產(chǎn)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物細胞培養(yǎng)工程領(lǐng)域，特別涉及一種利用竹節(jié)參細胞培養(yǎng)和生 物轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得竹節(jié)參次生代謝產(chǎn)物的方法，尤其是涉及利用竹節(jié)參細胞大規(guī)模 培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得竹節(jié)參皂苷等化合物的方法。
背景技術(shù)：
竹節(jié)參(尸朋au'a/ o/2ic^s C.A.Mey)又名竹節(jié)人參或白三七，是五加科人 參屬植物。分布于我國江西、湖北、廣西、四川、貴州、云南、西藏等省區(qū)的高 山灌木叢下，陰濕地或巖石溝澗旁邊。它有許多的異名，《中藥大辭典》上就說不同的書籍中有不同的稱謂，如土參、土精、血參(《花鏡》)，甜七、竹節(jié)七(《草本便方》)，竹節(jié)參(《科學(xué)的民間藥草》)，竹鞭三七、羅漢三七(《中 國藥植志》)，竹節(jié)七、竹七(《中藥形性經(jīng)驗鑒別法》)，蘿卜七、白三七(《中 藥材品種論述》)，水三七(《貴州草藥》)，明七、野三七、雞頭七(《云南 經(jīng)濟植物》)，這種種紛雜的異稱，足見竹節(jié)參在中藥藥用中的歷史和地位。民間用于滋補強壯，散瘀止痛，止血等。對于竹節(jié)參的作用早有記載，如《草本 便方》中有云"散血活血破血，治癰腫，療犬傷，金刀，跌撲……"近年來又 由于有報道證實竹節(jié)參皂大甙具有擴張冠狀動脈、降低心肌氧耗作用。同時發(fā)現(xiàn)
竹節(jié)參皂甙能使小鼠心肌細胞內(nèi)CAMP/CGMP比值明顯升高，此作用與其增強心力， 擴張冠狀動脈有關(guān)，其藥用價值潛力巨大，成為一個研究熱點。竹節(jié)參的生長緩慢，每年生1節(jié)，生物量極為有限，作為藥用的野生竹節(jié)參 一般在5年 數(shù)十年生不等。據(jù)統(tǒng)計我國的竹節(jié)參儲量只有2噸左右，屬于珍稀 名貴藥材，目前只是在湖北山區(qū)和川西南山區(qū)被當?shù)蒯t(yī)生有條件使用，在各大城 市醫(yī)院和藥店不見銷售。雖然在江西、湖南、湖北等地有人進行人工栽培，但是 由于其生長量有限，且繁殖困難，又易受病蟲害的困擾，長期以來很難實現(xiàn)大面 積人工栽培。因此利用生物技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)其替代產(chǎn)品，并且開發(fā)成治療心腦血 管疾病的特效新藥具有重要的經(jīng)濟價值和社會價值。 為此清華大學(xué)化工系生化所經(jīng)過數(shù)年研究開發(fā)出了一套為了將竹節(jié)參的自 然生產(chǎn)方式轉(zhuǎn)變?yōu)楣I(yè)化生產(chǎn)方式的新技術(shù)。該技術(shù)的應(yīng)用可以大幅度減少人們 對野生資源的采摘和依賴，同時可以大量獲得人們所需求的竹節(jié)參制品。為人們 對于竹節(jié)參的藥用價值進行深入研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，為廣大患者提供更優(yōu)良的廉 價藥物。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用竹節(jié)參細胞培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)竹節(jié)參 次生代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1) 在鼎培養(yǎng)基中，添加a—萘乙酸(NAA)、 2,4-D或卩引哚乙酸(IAA)O. l 10呢/L和6 —卞氨基嘌呤(6 — BA)或激動素(KT)0. 1 10mg/L，蔗糖或葡萄糖20 50g/L，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5 7.0，再添加1. 8 8g/L凝固劑，在 115 12(TC， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘后，經(jīng)冷卻制成斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基；(2) 將竹節(jié)參幼莖或幼芽作為外植體經(jīng)70%乙醇表面殺菌30 50秒，然后 再放入5 10%次氯酸鈉或次氯酸鈣溶液中殺菌10 20分鐘，用無菌水沖洗三次 后，在無菌條件下將表面殺菌后的莖尖切下來，或?qū)⑵溆浊o切成lmra長的莖段， 接種到上述斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，之后轉(zhuǎn)移到18 25°C， 2000 3000 Lux， 12 16 小時照光條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，1 2個月后形成愈傷組織；(3) 在RW培養(yǎng)基中，添加0.1 5mg/L a—萘乙酸(NAA)、 2, 4—D或卩引哚 乙酸(IAA)， 0. 1 5mg/L和6 —卞氨基嘌呤(6—BA)或激動素(KT) ， 20 50g/L 蔗糖、1.8 8g/L凝固劑,經(jīng)115 12(TC， 0. 1 0.15MPa壓力下消毒15分鐘后 經(jīng)冷卻d成平板馴化培養(yǎng)基；(4) 將上述誘導(dǎo)形成的愈傷組織，在上述馴化培養(yǎng)基中進行反復(fù)馴化繼代 培養(yǎng)后，可以篩選出生長速度快，質(zhì)地疏松的高產(chǎn)細胞株；(5) 在RW培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加蔗糖20 40g/L， a—萘乙酸(NAA)， 2， 4 一D或吲哚乙酸(IAA) 0. 1 2mg/L， 6—卞氨基嘌呤(6—BA)或激動素(KT) 0. l 2mg/L，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5 7.0，再添加1. 8 8g/L凝固劑，在 115 12(TC， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘后經(jīng)冷卻制成大型平面擴增培養(yǎng)基或者 取消凝固劑做成液體培養(yǎng)基；(6) 將上述高產(chǎn)細胞株接種在擴增培養(yǎng)基上，在20 25r，黑暗條件下培 養(yǎng)4 5周后，可以獲得大量高活力細胞，液體培養(yǎng)時搖床或生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速 為80 120轉(zhuǎn)/分；(7) 在fW培養(yǎng)基中，添加葡萄糖20 50g/L， a—萘乙酸(NM)， 2， 4一D 或吲哚乙酸(IAA) 0. l 2mg/L，6 —卞氨基嘌呤(6—BA)或激動素(KT)O. 1 2mg/L， 再添加組合前體(40 150mg)和組合誘導(dǎo)子(80ug 60mg)，用酸或堿將pH 值調(diào)整到5. 5 7. 0，在115 120°C， 0. 1 0. 15MPa壓力下消毒15分鐘后制成 合成培養(yǎng)基；(8) 將上述擴增的高活力竹節(jié)參愈傷組織細胞接種到上述合成培養(yǎng)基內(nèi)， 在25 3(TC，避光條件，80 120轉(zhuǎn)/分的搖床或大型生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)1 周，過濾收獲細胞，培養(yǎng)液經(jīng)調(diào)整后可返回反應(yīng)器繼續(xù)反復(fù)利用；(9) 將收獲細胞移送到提取灌中，經(jīng)過高速攪拌(300 400轉(zhuǎn)/分)破碎， 經(jīng)溶劑萃取和減壓濃縮獲得粗提物，再經(jīng)過分離純化獲得竹節(jié)參皂苷等化合物所述組合誘導(dǎo)子組成為赤霉素2 5mg/L、水楊酸20 90mg/L、過氧化氫20 80yl/L、酵母提取物0. 5 2g/L。 所述凝固劑為瓊脂或Gellan Gum。所述組合前體為丙酮酸鈉40 80mg/L、乙酸酐20 40 u 1/L和番茄汁100 200ml/L。本發(fā)明的有益效果是將竹節(jié)參的自然生產(chǎn)方式轉(zhuǎn)變?yōu)楣I(yè)化生產(chǎn)方式。該技 術(shù)的應(yīng)用可以大幅度減少人們對野生資源的采摘和依賴，同時可以大量獲得人們 所需求的竹節(jié)參制品。為人們對于竹節(jié)參的藥用價值進行深入研究奠定物質(zhì)基 礎(chǔ)，為廣大患者提供更優(yōu)良的廉價藥物。具體實施例本發(fā)明提供一種利用竹節(jié)參細胞培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)竹節(jié)參次生代謝 產(chǎn)物的方法下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
實例一(1) 在改良的RW培養(yǎng)基中，添加a—萘乙酸(NAA)2mg/L和6 —卞氨基嘌呤 (6—BA)4mg/升，蔗糖20g/L，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5. 5 7. 0，再添加 1. 9g/L Gellan Gum，在U5。C， 0. 1MPa壓力下消毒15分鐘后，經(jīng)冷卻制成斜面 誘導(dǎo)培養(yǎng)基；(2) 將竹節(jié)參幼莖或幼芽作為外植體經(jīng)70% (v/V)乙醇表面殺菌50秒，然 后再放入5^(v/v)次氯酸鈉溶液中殺菌20分鐘，用無菌水沖洗三次后，在無菌 條件下將表面殺菌后的莖尖切下來，接種到上述斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。之后轉(zhuǎn)移到 25°C， 2000Lux， 12小時照光條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，l個月后形成愈傷組織；(3) 在改良的RW培養(yǎng)基中，添加lmg/L a—萘乙酸(NAA)， 2mg/L和6 —卞 氨基嘌呤(6—BA)， 30g/L蔗糖、L9GellanGum，經(jīng)115。C， 0. lMPa壓力下消毒 15分鐘后經(jīng)冷卻制成平板馴化培養(yǎng)基；(4) 將上述誘導(dǎo)形成的愈傷組織，在上述馴化培養(yǎng)基中進行反復(fù)馴化繼代 培養(yǎng)后，可以獲得生長速度快，質(zhì)地疏松的高產(chǎn)細胞系；(5) 在改良RW培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加蔗糖40g/L， a —萘乙酸(NAA)O. 8mg/L， 6—卞氨基嘌呤(6-BA)0. 5mg/L，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5. 5 7. 0，再添加 1.9g/L Gellan Gum (是國內(nèi)外常用的多糖類物質(zhì))，在115。C， 0.1MPa壓力下 消毒15分鐘后經(jīng)冷卻制成大型平面擴增培養(yǎng)基或取消凝固劑做成液體培養(yǎng)基；(6) 將上述高產(chǎn)細胞株接種在擴增培養(yǎng)基上，在25'C，黑暗條件下培養(yǎng)4 周后，可以獲得大量高活力細胞。液體培養(yǎng)時搖床或生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速為80 120 轉(zhuǎn)/分；(7) 在RW培養(yǎng)基中，添加葡萄糖30g/U a—萘乙酸(NAA) 0.2呢/L, 6 — 卞氨基嘌呤(6—BA) 0. 2mg/L，再添加組合前體(包括丙酮酸鈉40mg/L、乙酸酐 20ul/L和番茄汁100ml/L)和組合誘導(dǎo)子(赤霉素2mg/L、水楊酸30p 1/L、過 氧化氫25"1/L、酵母提取物1.0%)，用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5 7.0，在 115°C， 0.1MPa壓力下消毒15分鐘后制成合成培養(yǎng)基；(8) 將上述擴增的高活力竹節(jié)參愈傷組織細胞接種到上述合成培養(yǎng)基內(nèi)，在28。C，避光條件，100轉(zhuǎn)/分的搖床或大型生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)1周，過濾收獲細胞，培養(yǎng)液經(jīng)調(diào)整后可返回反應(yīng)器繼續(xù)反復(fù)利用；(9)將收獲細胞移送到提取灌中，經(jīng)過高速攪拌(300轉(zhuǎn)/分)破碎，經(jīng)溶劑萃取和減壓濃縮獲得粗提物一竹節(jié)參皂苷粗提物及其副產(chǎn)物，再經(jīng)過純化獲得竹節(jié)參總皂苷10%以上，竹節(jié)參多糖5%以上以及其它化合物。實例二(1) 在改良的CT培養(yǎng)基中，添加吲哚乙酸(IAA)2mg/L和激動素(KT) 4mg/ 升，蔗糖20g/L，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5 7.0，再添加1. 9g/L Gellan Gum，在115'C， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘后，經(jīng)冷卻制成斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基；(2) 將竹節(jié)參幼莖或幼芽作為外植體經(jīng)70%乙醇表面殺菌30秒，然后再放 入8W次氯酸鈣溶液中殺菌i5分鐘，用無菌水沖洗三次后，在無菌條件下將表面 殺菌后的莖尖切下來，接種到上述斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。之后轉(zhuǎn)移到25。C，2000Lux， 14小時照光條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，1個月后形成愈傷組織；(3) 在改良的RW培養(yǎng)基中，添加lmg/L a—萘乙酸(NAA)， 2mg/L和激動 素(KT) ， 30g/L蔗糖、1.9GellanGum，經(jīng)115。C， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘 后經(jīng)冷卻制成平板馴化培養(yǎng)基；(4) 將上述誘導(dǎo)形成的愈傷組織，在上述馴化培養(yǎng)基中進行反復(fù)馴化繼代 培養(yǎng)后，可以獲得生長速度快，質(zhì)地疏松的高產(chǎn)細胞系；(5) 在改良RW培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加蔗糖30g/L，添加B引哚乙酸(IAA) lmg/L 和激動素(KT) lmg/升，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5. 5 7.0，再添加1.9g/L Gellan Gum，在115t:， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘后經(jīng)冷卻制成大型平面擴增 培養(yǎng)基或取消凝固劑做成液體培養(yǎng)基；(6) 將上述高產(chǎn)細胞株接種在擴增培養(yǎng)基上，在2(TC，黑暗條件下培養(yǎng)4 周后，可以獲得大量高活力細胞。液體培養(yǎng)時搖床或生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速為80 120 轉(zhuǎn)/分；(7) 在RW培養(yǎng)基中，添加葡萄糖40g/L， a—萘乙酸(NAA) 0.4mg/L，激動 素(KT) 0.2mg/L，再添加組合前體(包括丙酮酸鈉60mg/L、乙酸酐30ul/L和
番茄汁150ml/L)和組合誘導(dǎo)子(赤霉素3mg/L、水楊酸90mg/L、過氧化氫30u 1/L、酵母提取物1.5%)，用酸或堿將pH值調(diào)整到5. 5 7.0，在115。C， 0. lMPa 壓力下消毒15分鐘后制成合成培養(yǎng)基；(8) 將上述擴增的高活力竹節(jié)參愈傷組織細胞接種到上述合成培養(yǎng)基內(nèi)， 在29"C，避光條件，90轉(zhuǎn)/分的搖床或大型生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)1周，過濾收 獲細胞，培養(yǎng)液經(jīng)調(diào)整后可返回反應(yīng)器繼續(xù)反復(fù)利用；(9) 將收獲細胞移送到提取灌中，經(jīng)過高速攪拌(350轉(zhuǎn)/分)破碎，經(jīng)溶 劑萃取和減壓濃縮獲得粗提物一竹節(jié)參皂苷粗提物及其副產(chǎn)物，再經(jīng)過純化獲得 竹節(jié)參總皂苷10%以上，竹節(jié)參多糖5%以上以及其它化合物。實例三(1) 在改良的RW培養(yǎng)基中，添加2， 4一D 1.5mg/L和6—卞氨基嘌吟(6 — BA)3mg/升，蔗糖20g/L，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5. 5 7. 0，再添加6g/L 瓊脂，在120。C， 0. 15MPa壓力下消毒15分鐘后，經(jīng)冷卻制成斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基；(2) 將竹節(jié)參幼莖或幼芽作為外植體經(jīng)70%乙醇表面殺菌40秒，然后再放 入10%次氯酸鈉溶液中殺菌10分鐘，用無菌水沖洗三次后，在無菌條件下將表 面殺菌后的莖尖切下來，接種到上述斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。之后轉(zhuǎn)移到25°〇， 2000Lux， 16小時照光條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，l個月后形成愈傷組織；(3) 在改良的RW培養(yǎng)基中，添加0. 8mg/L 2, 4-D， 0. 5mg/L和6 —卞氨基嘌 呤(6—BA)， 30g/L蔗糖、6g/L瓊脂，經(jīng)120。C， 0. 15MPa壓力下消毒15分鐘后 經(jīng)冷卻制成平板馴化培養(yǎng)基；(4) 將上述誘導(dǎo)形成的愈傷組織，在上述馴化培養(yǎng)基中進行反復(fù)馴化繼代 培養(yǎng)后，可以獲得生長速度快，質(zhì)地疏松的高產(chǎn)細胞系；(5) 在改良RW培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加蔗糖30g/L， 2，4-D 0. 5mg/L， 6—卞 氨基嘌呤(6—BA)0.3mg/L，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5. 5 7. 0，再添加6g/L 瓊脂，在12(TC， 0. 15MPa壓力下消毒15分鐘后經(jīng)冷卻制成大型平面擴增培養(yǎng)基 或取消凝固劑做成液體培養(yǎng)基；(6) 將上述高產(chǎn)細胞株接種在擴增培養(yǎng)基上，在22匸，黑暗條件下培養(yǎng)4
周后，可以獲得大量高活力細胞。液體培養(yǎng)時搖床或生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速為80 120 轉(zhuǎn)/分；(7) 在RW培養(yǎng)基中，添加葡萄糖50g/L, 2,4-D 0. 4mg/L， 6—卞氨基嘌呤 (6—BA)0.4mg/L，再添加組合前體(包括丙酮酸鈉70mg/L、乙酸酐25ul/L和番 茄汁130ml/L)和組合誘導(dǎo)子(赤霉素4mg/L、水楊酸40mg/L、過氧化氫20 u 1/L、 酵母提取物1.3%)，用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5 7.0，在120。C， 0. 15MPa壓 力下消毒15分鐘后制成合成培養(yǎng)基；(8) 將上述擴增的高活力竹節(jié)參愈傷組織細胞接種到上述合成培養(yǎng)基內(nèi)， 在3(TC，避光條件，110轉(zhuǎn)/分的搖床或大型生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)1周，過濾 收獲細胞，培養(yǎng)液經(jīng)調(diào)整后可返回反應(yīng)器繼續(xù)反復(fù)利用；(9) 將收獲細胞移送到提取灌中，經(jīng)過高速攪拌(400轉(zhuǎn)/分)破碎，經(jīng)溶 劑萃取和減壓濃縮獲得粗提物一竹節(jié)參皂苷粗提物及其副產(chǎn)物，再經(jīng)過純化獲得竹節(jié)參總皂苷10%以上，竹節(jié)參多糖5%以上以及其它化合物。
權(quán)利要求
1.一種利用竹節(jié)參細胞培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)竹節(jié)參次生代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于，包括以下步驟1)在RW培養(yǎng)基中，按每升培養(yǎng)液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，植物生長激素0.1～5mg和植物細胞分裂素0.1～5mg，將pH值調(diào)整到5.5～7.0，再添加1.8～8g/L凝固劑，在115～120℃，0.1MPa壓力下消毒15分鐘后，經(jīng)冷卻制成斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基；2)將竹節(jié)參的外植體經(jīng)表面殺菌，在無菌條件下接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25℃避光條件下培養(yǎng)1～2個月誘導(dǎo)形成愈傷組織；3)將竹節(jié)參愈傷組織接種在生長培養(yǎng)基上擴增，25℃避光條件下培養(yǎng)1個月獲得大量細胞；4)在RW培養(yǎng)基中添加組合前體40～150mg和組合誘導(dǎo)子80μg～60mg，制成合成培養(yǎng)基；5)將大量擴增的愈傷組織細胞接種到合成培養(yǎng)液中，在25℃避光條件下振蕩培養(yǎng)1周后收獲細胞；6)用溶劑萃取收獲細胞獲得竹節(jié)參皂苷粗提物及其副產(chǎn)物，再經(jīng)過純化獲得竹節(jié)參皂苷，竹節(jié)參多糖以及其它化合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用竹節(jié)參細胞培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)竹節(jié)參次生 代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于，所述植物生長激素為6 —卞氨基嘌呤(6—BA)或激 動素(KT)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用竹節(jié)參細胞培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)竹節(jié)參次生 代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于，所述植物細胞分裂素為a—萘乙酸(NAA)、 2，4-D 或噴哚乙酸(IAA)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用竹節(jié)參細胞培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)竹節(jié)參次生 代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于，所述組合誘導(dǎo)子的組成為赤霉素2 5mg/U水楊 酸20 90mg/L、過氧化氫20 80y 1/L、酵母提取物0. 5 2g/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用竹節(jié)參細胞培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)竹節(jié)參次生代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于，所述凝固劑為瓊脂或Gellan Gum。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用竹節(jié)參細胞培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)竹節(jié)參次生 代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于，所述組合前體為丙酮酸鈉40 80mg/L、乙酸酐 20 40 u 1/L和番茄汁100 200ml/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用竹節(jié)參細胞培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)竹節(jié)參次生 代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于，該方法具體步驟如下(1) 在RW培養(yǎng)基中，添加a—萘乙酸(NAA)、 2， 4-D或吲哚乙酸(IAA)0. l 10mg/L和6 —卞氨基嘌呤(6—BA)或激動素(KT)0.廣10mg/L，蔗糖或葡萄糖20 50g/L，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5 7.0，再添加1. 8 8g/L凝固劑，在 115 12(TC， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘后，經(jīng)冷卻制成斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基；(2) 將竹節(jié)參幼莖或幼芽作為外植體經(jīng)70%乙醇表面殺菌30 50秒，然后 再放入5 10%次氯酸鈉或次氯酸銬溶液中殺菌10 20分鐘，用無菌水沖洗三次 后，在無菌條件下將表面殺菌后的莖尖切下來，或?qū)⑵溆浊o切成lmm長的莖段， 接種到上述斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，之后轉(zhuǎn)移到18 25°C， 2000 3000 Lux， 12 16 小時照光條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，1 2個月后形成愈傷組織；(3) 在RW培養(yǎng)基中，添加0.1 5mg/L a—萘乙酸(NAA)、 2， 4一D或吲哚 乙酸(IAA)， 0. 1 5mg/L和6 —卞氨基嘌呤(6—BA)或激動素(KT) ， 20 50g/L 蔗糖、1.8 8g/L凝固劑，經(jīng)115 120。C， 0. 1 0. 15MPa壓力下消毒15分鐘后 經(jīng)冷卻制成平板馴化培養(yǎng)基；(4) 將上述誘導(dǎo)形成的愈傷組織，在上述馴化培養(yǎng)基中進行反復(fù)馴化繼代 培養(yǎng)后，可以篩選出生長速度快，質(zhì)地疏松的高產(chǎn)細胞株；(5) 在RW培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加蔗糖20 40g/L， a—萘乙酸(NAA)， 2， 4 一D或吲哚乙酸(IAA) 0. l 2mg/L， 6—卞氨基嘌呤(6—BA)或激動素(KT) 0. l 2mg/L，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.5 7.0，再添加1. 8 8g/L凝固劑，在 115 12(TC， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘后經(jīng)冷卻制成大型平面擴增培養(yǎng)基或者 取消凝固劑做成液體培養(yǎng)基； (6) 將上述高產(chǎn)細胞株接種在擴增培養(yǎng)基上，在20 25。C，黑暗條件下培 養(yǎng)4 5周后，可以獲得大量高活力細胞，液體培養(yǎng)時搖床或生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速 為80 120轉(zhuǎn)/分；(7) 在RW培養(yǎng)基中，添加葡萄糖20 50g/L， a—蔡乙酸(NAA)， 2， 4一D 或吲哚乙酸(IAA) 0. 1 2mg/L，6 —卞氨基嘌呤(6—BA)或激動素(KT)0. 1 2mg/L， 再添加組合前體40 150mg和組合誘導(dǎo)子80 ti g 60mg，用酸或堿將pH值調(diào)整到 5. 5 7. 0，在115 12(TC， 0. 1 0. 15MPa壓力下消毒15分鐘后制成合成培養(yǎng)基；(8) 將上述擴增的高活力竹節(jié)參愈傷組織細胞接種到上述合成培養(yǎng)基內(nèi)， 在25 30。C，避光條件，80 120轉(zhuǎn)Z分的搖床或大型生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)1 周，過濾收獲細胞，培養(yǎng)液經(jīng)調(diào)整后可返回反應(yīng)器繼續(xù)反復(fù)利用；(9) 將收獲細胞移送到提取灌中，經(jīng)過高速攪拌(300 400轉(zhuǎn)/分)破碎， 經(jīng)溶劑萃取和減壓濃縮獲得粗提物，再經(jīng)過分離純化獲得竹節(jié)參皂苷等化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于植物細胞培養(yǎng)工程領(lǐng)域的一種利用竹節(jié)參細胞培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得竹節(jié)參次生代謝產(chǎn)物的方法。在改良的RW培養(yǎng)基中，加蔗糖、植物生長激素和植物細胞分裂素，再加入凝固劑經(jīng)高溫消毒，經(jīng)冷卻后制成誘導(dǎo)培養(yǎng)基；將竹節(jié)參的外植體在無菌條件下接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)形成愈傷組織；經(jīng)擴增，獲得大量細胞；在合成培養(yǎng)基中將大量擴增的愈傷組織細胞接種到合成培養(yǎng)液中，用溶劑萃取收獲細胞獲得竹節(jié)參皂苷粗提物及其副產(chǎn)物，再經(jīng)過純化獲得竹節(jié)參皂苷，竹節(jié)參多糖以及其它化合物。利用本發(fā)明所述方法可以生產(chǎn)出竹節(jié)參的次生代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)成本低，培養(yǎng)周期短，不受自然環(huán)境限制，可以實現(xiàn)周年生產(chǎn)。
文檔編號C12N5/04GK101113430SQ20071011774
公開日2008年1月30日 申請日期2007年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月22日
發(fā)明者孫瑞強, 郭志剛 申請人:清華大學(xué)