專利名稱：一種低溫中性脂肪酶及產(chǎn)生該酶的白地霉的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵及其產(chǎn)物酶領(lǐng)域，特別是涉及從高寒地區(qū)分離獲得一種產(chǎn)生低溫中性脂肪酶的白地霉菌株及其由該菌株產(chǎn)生的新型低溫中性脂肪酶。
背景技術(shù)：
低溫微生物是研究在低溫條件下生物適應(yīng)性的極好材料，而且也是獲得在低溫條件下具有較高催化能力的低溫酶類的最佳來源。有關(guān)低溫酶的最早報(bào)道是在1984年，Kobori等從南極地區(qū)篩選的菌種中成功檢測(cè)到堿性磷酸酶的活性并觀察到該酶在低溫時(shí)的高比活力和高溫時(shí)的迅速失活的特性。直到20世紀(jì)90年代前期，隨著世界能源緊缺，石油價(jià)格上漲，節(jié)能降耗成為世界范圍內(nèi)亟待解決的熱點(diǎn)問題，低溫酶的研究才因此在國內(nèi)外引起廣泛關(guān)注。目前，國內(nèi)外研究較多的是海洋和極地環(huán)境下的低溫微生物及其低溫酶，而對(duì)于內(nèi)陸高寒地區(qū)、冰川凍土的研究較少。新疆是我國西北內(nèi)陸省區(qū)，具有獨(dú)特的自然環(huán)境，其中干旱和低溫是其兩個(gè)顯著的特點(diǎn)，這樣的特殊環(huán)境下蘊(yùn)藏著大量豐富的低溫微生物資源。研究、開發(fā)該地區(qū)低溫微生物資源及其相應(yīng)的低溫酶類具有重要的戰(zhàn)略意義。
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一種在自然界中普遍存在的酶類。按其來源可分為動(dòng)物、植物及微生物脂肪酶三大類。其中，微生物脂肪酶因其容易生產(chǎn)、易于擴(kuò)大等特點(diǎn)以及對(duì)脂肪類物質(zhì)專一性的分解特性，使其在洗滌、食品加工、皮革加工、有機(jī)合成化工產(chǎn)品、香料、藥物制備、油脂加工等方面得到廣泛應(yīng)用，成為世界主要工業(yè)用酶制劑之一。脂肪酶已從多種不同的微生物中分離如青霉(黃建忠等，工業(yè)微生物，25(3)1～5，1995)、白地霉(謝舜珍，微生物學(xué)報(bào)，26(3)260～264，1986)、根霉菌(金其榮等，工業(yè)微生物，25(1)17～20，1995)、類產(chǎn)堿假單胞菌(吳松剛等，微生物學(xué)報(bào)，37(1)32～39)、假單胞菌(Kotsuka等，美國專利US Patent5846801，1998年12月8日)、假絲酵母等(William等，Microbial Enzymes and Biotechnology，應(yīng)用科學(xué)出版社出版，225～247，1983)。其中多數(shù)脂肪酶的最適作用溫度在50℃左右，在低溫時(shí)酶活力很低。而低溫脂肪酶具有的最適酶活溫度低，在低溫下具有更高的催化效率等特點(diǎn)，在某些領(lǐng)域有著中溫脂肪酶所不可比擬的優(yōu)越性。低溫脂肪酶應(yīng)用于有關(guān)的工業(yè)生產(chǎn)可簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，節(jié)能降耗，保護(hù)環(huán)境，同時(shí)可降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。微生物產(chǎn)生的脂肪酶種類多，但是來源不同的脂肪酶具有多方面不同的性質(zhì)，從而導(dǎo)致微生物脂肪酶各具特色的應(yīng)用范圍，因此低溫酶的應(yīng)用前景廣闊，需要持續(xù)不斷地開發(fā)新特性脂肪酶以更好地滿足工業(yè)需要。
目前，國內(nèi)外已報(bào)道的低溫脂肪酶產(chǎn)生菌主要以細(xì)菌為主，兼少量酵母。如低溫微球菌(Mcrococcus antarcticus)T2所產(chǎn)生的低溫脂肪酶最適酶解溫度為35℃、pH8.0(劉洪燦等，一種低溫脂肪酶及其編碼基因與生產(chǎn)方法，專利公開號(hào)CN1611600A)；適冷性海洋酵母(Yarrowia lipolytica)Bohaisea-9145產(chǎn)生的低溫脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為35℃，在0℃時(shí)保持20％的相對(duì)酶活力，最適pH8.5、pH4.0～9.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性差(邵鐵娟等，微生物學(xué)報(bào)，6789-792，2004)；南大洋深海嗜冷菌22521021產(chǎn)生的酶最適酶解條件為35℃、pH7.5；深海適冷假單胞菌(Pseudomonas sp.)KB700A所產(chǎn)的低溫脂肪酶的最適酶活溫度也為35℃；方金瑞從深海泥樣分離到的菌株EQ223產(chǎn)生的低溫脂肪酶的最適作用溫度為10℃；適冷菌(Pseudomonas sp.)B1121產(chǎn)生的冷適應(yīng)脂肪酶最適作用溫度為45℃(林學(xué)政等，海洋學(xué)報(bào)，5154-158，2005)；氣單孢菌屬菌株(Aeromonas sp.)LPB4產(chǎn)生的低溫酶最適酶解溫度為10℃(Han-Ki Lee等，The Journal of Microbiology，22-27，March 2003)；假單孢菌Pseudomonas fragi產(chǎn)生的低溫脂肪酶最適酶解溫度為29℃、最適pH8.0(Claudia Alquati等，Eur.J.Biochem，2693321-3328，2002)；耐冷假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株BTs10022產(chǎn)生的脂肪酶的最適酶解溫度為24℃、10℃仍可保持35％的相對(duì)酶活力，最適pH為8.0，在pH7～9范圍內(nèi)具有較高的酶學(xué)特性(俞勇等，高技術(shù)通訊，1089-93，2003)；嗜冷桿菌屬(Psychrobacter sp.)7195所分泌的脂肪酶最適作用溫度為30℃，最適pH值為9.0，對(duì)熱敏感，60℃熱處理10min，剩余酶活為30％，是典型的低溫酶(張金偉等，生物磁學(xué)，6(1)6-10，2006)；發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)D2菌株所產(chǎn)脂肪酶的最適作用溫度在35℃左右，證明其為低溫酶，最適pH值為8(林容霞等，北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)，33(1)31-35，2006)。
國內(nèi)外尚未見有關(guān)霉菌產(chǎn)生低溫脂肪酶的報(bào)道。關(guān)于脂肪酶產(chǎn)生菌-白地霉，國內(nèi)只有零星的菌種選育和發(fā)酵生產(chǎn)的研究報(bào)道(謝舜珍，微生物學(xué)報(bào)，26(3)260～264，1986)，國外雖已克隆了多個(gè)白地霉脂肪酶基因，并進(jìn)行了酵母表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定(Bertolinie等，Eur.J.Biochem，219119～125，1994；Shimada等，J.Biochem，106383～388，1989；Alberghina等，Germany，VCH，16237～241，1990)，但報(bào)道的白地霉脂肪酶都不是低溫脂肪酶。
從微生物發(fā)酵液中分離純化酶的常用方法有沉淀分離和層析分離。沉淀分離純化酶的收得率高，一般在80％以上，但純度較低。層析分離方法分離純化酶的收得率低，一般在15～40％之間，純度在60％以上。在目的產(chǎn)物(酶)分子量已知的情況下，選擇葡聚糖凝膠過濾(Sephadex)技術(shù)比常用的離子交換層析技術(shù)更簡(jiǎn)便和更易于操作。因此，對(duì)于不同酶類的提取、分離，需要針對(duì)不同微生物及相應(yīng)的產(chǎn)物性質(zhì)來決定選擇不同的提取技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前國內(nèi)外尚未報(bào)道霉菌產(chǎn)生低溫脂肪酶的現(xiàn)狀，根據(jù)不同酶類的提取、分離，由不同微生物及相應(yīng)的產(chǎn)物性質(zhì)決定選擇不同的提取技術(shù)的現(xiàn)狀。本發(fā)明提供了從新疆寒冷地區(qū)含油凍土中篩選出的產(chǎn)生低溫中性脂肪酶的白地霉菌株ch-3及由此產(chǎn)生的新型低溫中性脂肪酶。同時(shí)，本發(fā)明創(chuàng)造性地運(yùn)用雙水相萃取和Sephadex G-75凝膠過濾技術(shù)的有機(jī)結(jié)合提取、純化獲得低溫中性脂肪酶。
本發(fā)明通過對(duì)新疆高寒地區(qū)的含油凍土樣本進(jìn)行微生物菌種的培養(yǎng)、分離，獲得一批低溫微生物，并從中分離篩選出一株低溫脂肪酶產(chǎn)生菌，編號(hào)為ch-3，從而提供了一株具有生產(chǎn)低溫中性脂肪酶優(yōu)良特性的脂肪酶產(chǎn)生菌。根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》和對(duì)ch-3菌株的形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化檢測(cè)及18SrRNA同源分析確定ch-3菌株為白地霉菌株(Geotrichum candidum)。
同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種低溫中性脂肪酶，通過利用本發(fā)明的菌株經(jīng)過本發(fā)明確定的具體發(fā)酵工藝及相應(yīng)的提取技術(shù)而獲得。
本發(fā)明具體提供了一種低溫中性脂肪酶菌株，命名為ch-3，其能夠產(chǎn)生低溫中性脂肪酶。該菌株已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏日期是2007年3月12日，保藏號(hào)是CGMCC No.1972。該菌株最適生長(zhǎng)溫度是20℃；優(yōu)先生長(zhǎng)于麥芽汁培養(yǎng)基和馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基PDA(去皮馬鈴薯∶水＝1∶5煮沸半小時(shí)，用紗布過濾，濾液加水稀釋至原來的體積，再加1％蔗糖和1.5％瓊脂粉，自然pH)。20℃下培養(yǎng)3d的菌落直徑為30～40mm，白色粉狀，菌落中心突起，有放射線。當(dāng)菌落表面被擾動(dòng)時(shí)，變成似酵母的粘稠狀。顯微鏡下觀察，具有真菌絲，有的有二叉分枝，橫隔或多或少。菌絲寬3～7um，繁殖方式為裂殖。形成的節(jié)孢子單個(gè)或連接成鏈，孢子呈長(zhǎng)筒形、方形，也有橢圓或圓形，末端鈍圓。節(jié)孢子絕大多數(shù)為3～6×6～12um。根據(jù)以上的形態(tài)特征初步確定菌株ch-3屬于地霉屬。菌株ch-3能水解蛋白、液化明膠、胨化牛奶，利用蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉為唯一碳源。通過BLAST同源比對(duì)，菌株ch-3的18SrRNA序列與Geotrichum candidumIFO4599的18SrRNA序列的相似性最高，因而將菌株ch-3確定為地霉屬白地霉(Geotrichum candidum)，該菌種簡(jiǎn)稱為G.candidum ch-3。
本發(fā)明通過G.candidum ch-3發(fā)酵獲得的低溫中性脂肪酶具有優(yōu)良的低溫活性，最適反應(yīng)溫度是35℃，在20～40℃酶的穩(wěn)定性最佳，隨著溫度升高，酶活力迅速下降。20℃保溫30min可保持90％的酶活力，而50℃保溫30min，僅有55％的酶活力。這一性質(zhì)在工業(yè)上具有很重要的開發(fā)潛能。該酶的最適pH是7.0，在pH6.5-8.0范圍內(nèi)溫育3h能保持原來酶活的93％以上。Fe2+、Cu2+、Mn2+對(duì)本發(fā)明的脂肪酶有較強(qiáng)的激活作用；Ca2+有輕微的激活作用；Mg2+和EDTA對(duì)酶有一定的抑制作用，表明本發(fā)明的脂肪酶是一種金屬酶。通過對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化，選用廉價(jià)普通的營(yíng)養(yǎng)成分，采用常規(guī)單批發(fā)酵方式，搖瓶發(fā)酵酶活達(dá)18.9U/mL。
本發(fā)明進(jìn)一步建立了菌種篩選、鑒定、保藏、復(fù)壯及選育的系統(tǒng)工藝流程技術(shù)。
(一)菌種篩選從新疆油脂化工廠油污排放池采集含油凍土，每克土樣與9mL無菌水混合，加無菌小玻璃珠振蕩搖勻后靜置片刻，取5mL上清液加入到富集培養(yǎng)液(橄欖油2％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，(NH4)2SO40.5％，MgSO4·7H2O0.05％，K2HPO40.4％，KH2PO40.1％，CaCl20.05％，pH7.5)中，20℃、150rpm搖瓶振蕩培養(yǎng)4d后，取5mL培養(yǎng)液加入另一新鮮富集培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。如此重復(fù)5-6次后，取富集培養(yǎng)液用無菌生理鹽水梯度稀釋，涂布分離培養(yǎng)基平板(0.1％(NH4)2SO4，0.1％K2HPO4，1％KCl，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％FeSO4·7H2O，12％橄欖油和聚乙烯醇乳化液，2％瓊脂)，倒置于20℃溫控培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d以上，將有黃色變色圈的菌落挑至LB斜面保藏，同時(shí)挑起一環(huán)至LB培養(yǎng)液中，20℃搖瓶振蕩培養(yǎng)48h后，離心，取30uL上清液加入羅丹明B定性平板(將羅丹明B溶解于去離子水中，使其終濃度為1mg/mL，過濾除菌?；A(chǔ)培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃，加入3.125％橄欖油和1％的羅丹明B溶液，混合后靜置10min，以消除泡沫，倒平板，平板呈不透明粉紅色。)的孔中，于20℃培養(yǎng)48h再在350nm紫外光下觀察，產(chǎn)脂肪酶的微生物發(fā)酵液周圍有橘黃色熒光圈。挑選熒光圈大的菌落接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，22℃、150rpm下培養(yǎng)48h，取發(fā)酵上清液測(cè)定脂肪酶活性。
(二)菌種鑒定根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株G.candidum ch-3的形狀、大小、生理生化反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明的低溫中性脂肪酶產(chǎn)生菌G.candidum ch-3的生物學(xué)特性如表1所示。
表1 低溫脂肪酶產(chǎn)生菌白地霉ch-3的生理生化特性

利用真菌18SrRNA的通用引物ca18spF2(5’-TCTCAAAGATTAAGCCATGC-3)ca18spR(5’-TAATGATCCTTCCGCAGGTT-3’)以菌株ch-3的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94℃30s，50℃30s，72℃2min，32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)Takara膠回收試劑盒純化后，與pGEM-Teasy載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，獲得陽性克隆，經(jīng)測(cè)序。應(yīng)用BLAST程序?qū)⑺玫?8SrRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行相似性比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株G.candidum ch-3與白地霉Geotrichum candidum IFO4599的18SrRNA序列相似性最高，為99％，表明二者的親緣關(guān)系最近。本發(fā)明的低溫中性脂肪酶產(chǎn)生菌G.candidum ch-3的18SrRNA序列如下1CTGCGAATGG CTCATTAAAT CAGTTATCGT TTATTTGATA TTACATTACTACTTGGATAA CCGTGGTAAT TCTAGAGCTA ATACATGCTA AAACGGCCGG101 GTTTCCGGCT GGTATTTATT AGATAAAAAA CCAATGCCTT CGGGCTCTATGGTGAATCAT AATAACTTGT CGAATCGCAT GGCCTTGTGC TGGCGATGGT201 TCATTCAAAT TTCTGCCCTA TCAACTTTCG ATGGTAGGAT AGAGGCCTACCATGGTTTTA ACGGGTAACG GGGAATCAGG GTTCGATTCC GGAGAGGGAG301 CCTGAGAAAC GGCTACCACA TCCAAGGAAG GCAGCAGGCG CGCAAATTACCCAATCCTGA CACAGGGAGG TAGTGACAAT AAATAACGAT ACGGGGCCTA401 TTAGGTCTCG TAATTGGAAT GAGAACAATT TAAATACCTT AACGAGGAACAATAGAGGGC AAGTTCTGGG CCAGCAGCCC CGGTAATTCC AGCTCTGATA501 GTATATATTA AAGTTTTGCA GTAAAAAGCT CGTAGTTGAA ACTTGGGTGCGTAGGGGCGG TCTCTTTTAG AGTACTACCC TGAAACATCT TTCTTTGGTG601 TAAACTTTCT ATTTATTTAG GAAGTGTAAA CCAAACATTT ACTTTGAAAAAATTAGAGTG TTCAAAAGCA GGCCTTTGCT CGAATATATT AGCATGGAAT701 AATAGAATAG GACGTATGGT TCTATTTTGT TGGTTTCTAG GACCGTCGTAATGATTAATA GGGACGGTCG GGGGCATCAG TATTCAGTTG TCAGAGGGAA801 ATTCTTGGAT TTACTGAAGA CTAACTACTG CGAAAGCATT TGCCAAGGACGTTTTCATTA ATCAAGAACG AAAGTTAGGG GATCGAAGAC GATCAGATAC901 CGTCGTAGTC TTAACCGTAA ACTATGCCGA CTAGGGATCG GAGGGCGTTATAATAACCTC TCCGGCACCT TACGAGAAAT CAAAGTTTTT GGGTTCTGGG1001 GGGAGTATGG TTGCAAGGCT GAAACTTAAA GGAATTGACG GAAGGGCACCACCAGGAGTG GAGCCTGCGG CTTAATTTGA CTCAACACGG GGAAACTCAC1101 CAGGTCCAGA CACAATAAGG ATTGACAGAT TGAGAGCTCT TTCATGATTTTGTGGGTGGT GGTGCATGGC CGTTCTTAGT TGGTGGAGTG ATTTGTCTGC1201 TTAATTGCGA TAACGAACGA GACCTTAACC TGCTAAATAG CTGTAACAATAGATTATTGT TTTGACAGCT TCTTAGAGGG ACTATCGATT TTCAAGTCGA1301 TGGAAGTTTG AGGCAATAAC AGGTCTGTGA TGCCCTTAGA CGTTCTGGGCCGCACGCGCG CTACACTGAC GGAGCCAGCG AGTCTAACCT GTGCCGAGAG1401 GTATGGGTAA TCTTGTGAAA CTCCGTCGTG CTGGGGATAG AGCATTGCAATTATTGCTCT TCAACGAGGA ATTCCTAGTA AGCGCAAGTC ATCAGCTTGC1501 GTTGATTACG TCCCTGCCCT TTGTACACAC CGCCCGTCGC TACTACCGATTGAATGGCTT AGTGAGGCTT CCGGATTGAT TAACTGGAGA GGGCAACTTT1601 TCTGGTTGAA CGAGAAGCTA GTCAAACTTG GTCATTTAGA GGAAGTA通過對(duì)菌株G.candidum ch-3的18SrRNA同源序列進(jìn)行進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)Geotrichum candidum IFO4599與其在同一分支，其進(jìn)化拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)參見附圖3所示。結(jié)合低溫脂肪酶產(chǎn)生菌ch-3的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及生理生化特性，確定其為地霉屬的白地霉菌株(Geotrichum candidum)。
(三)菌種保藏真空冷凍干燥或石蠟油保存。無菌條件下將100％石蠟油加入試管斜面上，使石蠟油液面超出培養(yǎng)基斜面，完全隔絕空氣對(duì)菌種的影響，將菌種保存于-70℃的超低溫冰箱中。
(四)菌種活化從石蠟油中取一菌種移植塊，接種到PDA培養(yǎng)基上，在20～25℃下培養(yǎng)1天左右，再轉(zhuǎn)接到一新鮮PDA培養(yǎng)基上，連續(xù)活化數(shù)次，就可進(jìn)行菌株其它實(shí)驗(yàn)的測(cè)定。
(五)菌種復(fù)壯首先按步驟(四)活化菌株，然后在篩選培養(yǎng)基中接種活化好的菌株并進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)菌株周圍的變色圈和橘黃色熒光圈的大小，選取變色圈和橘黃色熒光圈大的單菌落接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并將此菌株作為生產(chǎn)菌株使用。
本發(fā)明還具體提供一種低溫中性脂肪酶的生產(chǎn)方法，其包括(一)對(duì)G.candidum ch-3 CGMCC No.1972進(jìn)行菌種活化培養(yǎng)步驟；(二)利用如上步驟獲得的活化菌種進(jìn)行發(fā)酵步驟；(三)發(fā)酵后的純化、提取步驟。
具體的，本發(fā)明提供了一套完整的脂肪酶產(chǎn)生菌篩選方案。我們從新疆昌吉市采集冰凍的含油土壤，采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的橄欖油-溴甲酚紫指示劑平板和羅丹明B平板從中篩選出12株脂肪酶產(chǎn)生菌。又通過滴定法復(fù)篩，測(cè)定所有產(chǎn)酶菌的脂肪酶活性，最終確定其中產(chǎn)生低溫脂肪酶且產(chǎn)酶性質(zhì)較穩(wěn)定的G.candidum ch-3為生產(chǎn)菌株。
本發(fā)明的低溫中性脂肪酶的產(chǎn)生菌，既可為本發(fā)明所保護(hù)的菌株，也可為自然篩選的原始菌株，或?yàn)楸Ｗo(hù)菌株通過自然變異或人工誘變產(chǎn)生的變異菌株，通過本發(fā)明所述的方法，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所闡述的技術(shù)效果。
作為上述變異菌株的研制方法，包括物理誘變，如紫外線輻射處理、鈷60輻照處理、離子注入處理、激光輻照等各種射線處理；化學(xué)誘變，如亞硝基胍、硫酸二乙酯等化學(xué)誘變劑處理，用常規(guī)脂肪酶產(chǎn)生菌分離篩選培養(yǎng)基及方法優(yōu)選出生產(chǎn)性能優(yōu)異的菌株。另外，也可通過分子生物學(xué)技術(shù)，從原始菌或誘導(dǎo)變異菌中獲取低溫中性脂肪酶基因，以原核生物如大腸桿菌等作為基因受體菌，構(gòu)建基因工程生產(chǎn)菌株，也可作為本發(fā)明的低溫中性脂肪酶產(chǎn)生菌種。
白地霉G.candidum ch-3產(chǎn)酶培養(yǎng)基的培養(yǎng)源可廣泛使用通常用于培養(yǎng)的培養(yǎng)源包括碳源、氮源、無機(jī)鹽以及其它必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在不同的碳源培養(yǎng)基中，本發(fā)明G.candidum ch-3的產(chǎn)酶能力有很大差異，以可溶性淀粉為碳源時(shí)最有利于產(chǎn)酶，酶活可達(dá)14.7U/mL；而以葡萄糖為碳源時(shí)，發(fā)酵液產(chǎn)生較低的酶活。
本發(fā)明G.candidum ch-3的氮源的選擇和用量，可根據(jù)其它培養(yǎng)源的成分和用量的不同而不同，玉米漿為氮源最有利于產(chǎn)酶，此時(shí)酶活力達(dá)到20U/mL；其次是酵母粉；以乙酸銨和硝酸鈉為氮源時(shí)，幾乎不產(chǎn)酶。通過氮源濃度的研究可知，玉米漿濃度為2.0％時(shí)，酶活最高。
不同培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響不同，結(jié)果表明G.candidum ch-3在24℃培養(yǎng)48h時(shí)酶活力最高。
不同起始pH對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響不同，結(jié)果表明不同的培養(yǎng)基起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響很大，在起始pH8.0時(shí)G.candidum ch-3的酶活力最高。
不同搖瓶裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響不同，結(jié)果表明最適裝液量為90mL。
不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響不同，結(jié)果表明最佳接種量為10％。
不同接種齡對(duì)產(chǎn)酶的影響不同，菌體在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中接入種齡48h的種子，有利于產(chǎn)酶。
油脂在脂肪酶合成過程中起碳源的作用，同時(shí)也是誘導(dǎo)物，因此油脂是產(chǎn)酶培養(yǎng)基的一個(gè)重要組分。在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入10g/L的各種油脂，在特定條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)測(cè)酶活，結(jié)果表明豆油是最好的誘導(dǎo)物，而甘油、豬油和菜籽油對(duì)該酶的形成有一定的抑制作用。
無機(jī)鹽類對(duì)G.canidum ch-3產(chǎn)酶的影響不同。以不加鹽類的酶活力為100％，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10mmol/L的Fe2+、Cu2+和Mn2+對(duì)酶的產(chǎn)生有促進(jìn)作用；而Zn2+、Mg2+、Na+、K+及EDTA對(duì)酶的形成有不同程度的抑制作用，其中Mg2+和EDTA的抑制作用最為明顯。
G.candidum ch-3經(jīng)搖瓶培養(yǎng)48h，取發(fā)酵上清液分析酶的性質(zhì)。G.candidum ch-3發(fā)酵上清液中的脂肪酶最適作用溫度為35℃，在0℃可保持66％的相對(duì)酶活力，對(duì)熱較敏感；最適pH為8。標(biāo)明G.candidum ch-3產(chǎn)生的脂肪酶為低溫脂肪酶。
通過雙水相萃取和Sephadex G-75凝膠過濾兩步純化，從G.candidumch-3發(fā)酵液中分離、獲得了電泳均一的蛋白，用SDS-PAGE測(cè)得該蛋白的分子量約為38kDa。通過酶活性測(cè)定及凝膠電泳酶活性條帶印跡實(shí)驗(yàn)，證明以上純化的38kDa蛋白確為脂肪酶，我們將其命名為L(zhǎng)IP3。搖瓶發(fā)酵脂肪酶比活力為4.65U/mg，經(jīng)兩步法純化后提高到337.5U/mg，純化后酶活性得率為16.3％，純化倍數(shù)為72.6。通過雙水相萃取和反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移兩種酶提取方法的比較，可看到反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移法造成G.candidum ch-3的脂肪酶活力損失較大，而雙水相萃取法使酶活力損失較小。采用雙水相萃取法純化脂肪酶的最佳條件為PEG濃度為15％，硫酸銨濃度為22.5％及pH8.0，此時(shí)脂肪酶的比活力提高到40.3U/mg，純度提高了8.6倍。
在不同溫度下按常規(guī)法測(cè)定酶活力，獲得的LIP3最適作用溫度為35℃。在20～40℃酶的穩(wěn)定性最佳，隨著溫度的升高，酶活力迅速下降。50℃保溫30min，僅有55％的酶活力?？梢奓IP3對(duì)熱敏感，是一種低溫脂肪酶。按常規(guī)法測(cè)定酶活力。由pH-酶活力曲線可以看到脂肪酶最適pH為7.0，pH低于6.5酶活力迅速下降。由pH穩(wěn)定性曲線可以看出該酶在pH6.5-8.0范圍內(nèi)酶活力可保持在95％以上?？梢娭久窵IP3為低溫中性脂肪酶。實(shí)驗(yàn)證明，F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+對(duì)酶有較強(qiáng)的激活作用；而Mg2+和EDTA對(duì)酶有一定的抑制作用。為了降低酶失活的速度，我們還研究了保藏條件和保護(hù)劑對(duì)脂肪酶活力的影響。
本發(fā)明提供的G.candidum ch-3是具有良好商業(yè)應(yīng)用前景的低溫中性脂肪酶產(chǎn)生菌，產(chǎn)酶溫度穩(wěn)定，原料來源廣泛，生產(chǎn)成本低廉，有利于進(jìn)一步開拓低溫微生物資源的應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明提供的LIP3為新型低溫中性脂肪酶，最適作用溫度為35℃，最適pH為7.0，可廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)學(xué)制品等領(lǐng)域中。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
通過實(shí)施本發(fā)明具體的技術(shù)指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果。
1、定向篩選到低溫中性脂肪酶產(chǎn)生菌ch-3，經(jīng)鑒定為白地霉菌株(Geotrichum candidum，G.candidum)，經(jīng)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證明G.candidum ch-3發(fā)酵上清液中的脂肪酶是一種對(duì)熱較敏感的低溫脂肪酶。
2、經(jīng)雙水相萃取和Sephadex G-75凝膠過濾兩步法純化后G.candidumch-3的脂肪酶比活力由原來的4.65U/mg，提高到337.5U/mg，酶純度提高了72.6倍，酶活性得率為16.3％。
3、純化獲得的脂肪酶LIP3的最適作用溫度為35℃。在20～40℃酶的穩(wěn)定性最佳，隨著溫度的升高，酶活力迅速下降；50℃保溫30min，僅有55％的相對(duì)酶活力?？梢奓IP3對(duì)熱敏感，是一種低溫脂肪酶。
4、純化獲得的脂肪酶LIP3最適pH為7.0，pH低于6.5酶活力迅速下降。由pH穩(wěn)定性曲線可以看出該酶在pH6.5-8.0范圍內(nèi)可保持95％以上的酶活力。可見脂肪酶LIP3為低溫中性脂肪酶。


圖1A和B為定向篩選G.candidum ch-3時(shí)在羅丹明B和溴甲酚紫指示劑平板上產(chǎn)生熒光圈和黃色變色圈的情況。
圖2A為G.candidum ch-3的發(fā)酵粗酶液的溫度-酶活力曲線；B示粗酶液的pH-酶活力曲線。
圖3為G.candidum ch-3的系統(tǒng)進(jìn)化樹。
圖4A為低溫中性脂肪酶LIP3的溫度-酶活力曲線；B示LIP3的熱穩(wěn)定性曲線。
圖5A為低溫中性脂肪酶LIP3的pH-酶活力曲線；B示LIP3的pH穩(wěn)定性曲線。
圖6為金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對(duì)低溫中性脂肪酶LIP3活力的影響。
圖7A為保藏條件對(duì)低溫中性脂肪酶LIP3活力的影響；B示保護(hù)劑對(duì)LIP3活力的影響。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1低溫脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的橄欖油-溴甲酚紫指示劑平板法從新疆昌吉市油脂化工廠含油凍土中篩選出12株脂肪酶產(chǎn)生菌，再轉(zhuǎn)接到羅丹明B平板上進(jìn)一步鑒定和檢測(cè)，最后接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行脂肪酶活性測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其中白地霉(Geotrichum candidum)ch-3在橄欖油-溴甲酚紫指示劑平板上形成的黃色變色圈與菌落直徑的比值較大，產(chǎn)生的脂肪酶活力較高。參見附圖1A可看到白地霉(Geotrichum candidum)ch-3在羅丹明B平板上形成橘黃色熒光圈；附圖1B顯示白地霉ch-3在油脂同化平板上形成黃色變色圈的情況。
G.candidum ch-3經(jīng)搖瓶培養(yǎng)48h，取發(fā)酵液上清分析酶的性質(zhì)。參見附圖2A溫度-酶活力曲線和附圖2B pH-酶活力曲線可以看到白地霉發(fā)酵上清液中的脂肪酶最適作用溫度為35℃，在0℃可保持66％的相對(duì)酶活力，對(duì)熱較敏感；最適pH為8，表明Geotrichum candidum ch-3產(chǎn)生的脂肪酶是低溫脂肪酶。
實(shí)施例2產(chǎn)酶菌株的鑒定菌株G.candidum ch-3在PDA和麥芽汁培養(yǎng)基上20℃培養(yǎng)2-3d的菌落直徑為30～40mm，白色粉狀，菌落中心突起，有放射線。當(dāng)菌落表面被擾動(dòng)時(shí)，變成似酵母的粘稠狀。顯微鏡下觀察，具有真菌絲，有的有二叉分枝，橫隔或多或少。菌絲寬3～7um，繁殖方式為裂殖。形成的節(jié)孢子單個(gè)或連接成鏈，孢子呈長(zhǎng)筒形、方形，也有橢圓形或圓形，末端鈍圓。節(jié)孢子絕大多數(shù)為3～6×6～12um。根據(jù)以上的形態(tài)特征初步確定菌株ch-3屬于地霉屬。
為了進(jìn)一步確定菌株G.candidum ch-3的分類學(xué)位置，我們測(cè)定了其18SrRNA基因序列。以菌株G.candidum ch-3的基因組DNA為模板，ca18spF2和ca18spR為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94℃30s，50℃30s，72℃2min，32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)Takara膠回收試劑盒純化后，與pGEM-Teasy載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，獲得陽性克隆、測(cè)序。應(yīng)用BLAST程序?qū)⑺玫?8SrRNA序列與NCBI中已公布的真菌18SrRNA序列進(jìn)行相似性比較分析，結(jié)果表明菌株G.candidumch-3與Geotrichum candidum IFO4599的相似性最高為99％，表明菌株ch-3與Geotrichum candidum IFO4599的親緣關(guān)系最近，它們?cè)谙到y(tǒng)進(jìn)化樹的同一分支，參見附圖3所示，因而菌株ch-3是地霉屬白地霉菌株(Geotrichumcandidum)。
引物選用ca18spF2(5’-TCTCAAAGATTAAGCCATGC-3’)和ca18spR(5’-TAATGATCCTTCCGCAGGTT-3’)。
實(shí)施例3低溫中性脂肪酶活性測(cè)定方法根據(jù)中華人民共和國輕工業(yè)部部頒標(biāo)準(zhǔn)GB/T 1803-93(2002)，工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法，在測(cè)試過程中溫度設(shè)定為35℃。
A4.1 定義1g固體酶粉(或1mL液體酶)，于一定溫度和pH的條件下，水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1umoL的脂肪酸，即為一個(gè)脂肪酶國際單位，以U/g(或U/mL)表示。
A4.2 原理脂肪酶在一定條件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯和甘油，所釋放的脂肪酸，可用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液進(jìn)行中和滴定，用pH計(jì)或酚酞指示液指示反應(yīng)終點(diǎn)，根據(jù)消耗的堿量，計(jì)算其酶活力。反應(yīng)式為RCOOH+NaOH→RCOONa+H2OA4.3 試劑和溶液A4.3.1 聚乙烯醇(PVA)聚合度1750±50。
A4.3.2 橄欖油采用中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品。
A4.3.3 95％(V/V)乙醇(GB679)A4.3.4 底物溶液的制備a.稱取聚乙烯醇(PVA)40g，加水800mL，在沸水浴中加熱、攪拌，直至全部溶解，冷卻后定容至1000mL。以干凈的雙層紗布過濾，取濾液備用；b.量取4％PVA溶液(A4.3.4a)150mL，加橄欖油50mL，用高速組織搗碎機(jī)處理6min(分2次處理，每次3min，中間休息5min)，即成乳白色PVA乳化液。該溶液要現(xiàn)用現(xiàn)配。該溶液如貯存在冰箱中，有效期為一周。
A4.3.5 0.025mol/L磷酸緩沖液(pH＝7.5)甲液稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4)17.01g，加水溶解并定容至500mL。
乙液稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)44.77g，加水溶解并定容至500mL。
使用液吸取甲液13mL，加乙液100mL，混勻，即成0.25mol/L磷酸緩沖液。使用時(shí)用水稀釋10倍，即成0.025mol/L磷酸緩沖液，用pH計(jì)校正。
A4.3.6 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液c(NaOH)＝0.05mol/L按GB601配制與標(biāo)定c(NaOH)＝0.5mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用時(shí)，準(zhǔn)確稀釋10倍。
A4.3.7 10g/L酚酞指示液按GB603配制。
A4.4 儀器和設(shè)備A4.4.1 恒溫水浴35±0.2℃。
A4.4.2 高速組織搗碎機(jī)8000～12000r/min。
A4.4.3 pH計(jì)分度值為0.02pH單位或2mV。
A4.4.4 電磁攪拌器。
A4.4.5 微量滴定管10mL，分刻度≤0.05mL。
A4.5 分析步驟A4.5.1 待測(cè)酶液的制備A4.5.2 測(cè)定A4.5.2.2 指示劑滴定法(第二法)a.取兩個(gè)100mL三角瓶，分別于空白瓶(A)和樣品瓶(B)中，各加底物溶液(A4.3.4)4.00mL和磷酸緩沖液(A4.3.5)5.00mL，再于A瓶中加入95％乙醇(A4.3.3)15.0mL，于35±0.2℃水浴預(yù)熱5min，然后，在兩瓶中各加待測(cè)酶液1.00mL，立即混勻計(jì)時(shí)，在35±0.2℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)15min，在B瓶中立即補(bǔ)加95％乙醇15.0mL終止反應(yīng)，取出；b.于空白和樣品溶液中各加酚酞指示液2滴，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至微紅色并保持30s不褪為其終點(diǎn)，記錄消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。
A4.6 計(jì)算樣品的酶活力(U/mL)＝10/3×(B-A)×n式中B-滴定樣品時(shí)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；A-滴定空白時(shí)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；n-稀釋倍數(shù)。
實(shí)施例4產(chǎn)酶條件的研究1.碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響以文獻(xiàn)報(bào)道的脂肪酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，改變碳源種類，24℃下?lián)u瓶發(fā)酵48h，發(fā)酵液離心去除菌體沉淀測(cè)酶活。以1％橄欖油為碳源時(shí)酶活力為100％，結(jié)果見表2。從表2可以看出，在不同的碳源培養(yǎng)基中，白地霉(Geotrichum candidum)ch-3的產(chǎn)酶能力有很大差異，以可溶性淀粉為碳源最有利于產(chǎn)酶，酶活可達(dá)14.7U/mL；而以葡萄糖為碳源時(shí)，發(fā)酵液產(chǎn)生較低的酶活，這與前人報(bào)道的葡萄糖對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生脂肪酶不利的結(jié)論相吻合。
表2 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響以1％可溶性淀粉為碳源，加入2％不同氮源，24℃下?lián)u瓶發(fā)酵48h，發(fā)酵液離心去除菌體沉淀測(cè)酶活。以2％豆餅粉的酶活力為100％，結(jié)果見表3。從表3可以看出，玉米漿為氮源最有利于產(chǎn)酶，此時(shí)酶活力達(dá)到20U/mL；其次是酵母粉；以乙酸銨和硝酸鈉為氮源時(shí)，幾乎不產(chǎn)酶。通過氮源濃度的研究可知，玉米漿濃度為2.0％時(shí)，酶活最高。
表3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響


3.不同培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響以1％可溶性淀粉為碳源，2％玉米漿為氮源，培養(yǎng)基初始pH6.0，500mL三角瓶裝液量100mL，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，分別在20℃、22℃、24℃、26℃和28℃五個(gè)溫度下培養(yǎng)11h、25h、48h、72h、98h和120h后測(cè)定酶活，結(jié)果見表4。由表4可知，白地霉ch-3在24℃培養(yǎng)48h時(shí)產(chǎn)生的脂肪酶活力最高。
表4 培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

4.不同起始pH對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響將產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值用NaOH或HCl分別調(diào)至pH6.5～8.5，以0.5個(gè)pH為一個(gè)單位，24℃下?lián)u瓶發(fā)酵48h，離心取發(fā)酵液上清測(cè)酶活力，結(jié)果表明不同的起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響很大，在pH8.0時(shí)酶活力最高，如表5所示。
表5 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

5.不同搖瓶裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響控制搖床轉(zhuǎn)速在180r/min，在500mL三角瓶中分別裝入30mL、60mL、90mL、100mL、120mL和150mL的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，24℃下?lián)u瓶培養(yǎng)48h測(cè)酶活，如表6，結(jié)果表明最適搖瓶裝液量為90mL。
表6 搖瓶裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

6.不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響將培養(yǎng)48h的種子培養(yǎng)液，分別以2％、5％、10％和20％(V/V)的接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基，其余培養(yǎng)條件同上，24℃搖瓶培養(yǎng)48h后測(cè)酶活，結(jié)果見表7，最佳接種量為10％。
表7 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

7.最佳接種齡對(duì)產(chǎn)酶的影響白地霉ch-3接種于種子培養(yǎng)基中于20℃，180r/min分別培養(yǎng)14h、20h、38h、48h、63h和72h后，再以10％接種量接入起始pH8.0的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)48h后測(cè)酶活，見表8，結(jié)果表明產(chǎn)酶培養(yǎng)基中接入種齡48h的種子，有利于產(chǎn)酶。
表8 接種齡對(duì)產(chǎn)酶的影響

8.油脂對(duì)酶形成的影響油脂在脂肪酶合成過程中起碳源的作用，同時(shí)也是誘導(dǎo)物，因此油脂是產(chǎn)酶培養(yǎng)基的一個(gè)重要組分。在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入10g/L各種油脂，在特定條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)測(cè)酶活，結(jié)果見表9。由表9可以看出，豆油是最好的誘導(dǎo)物，而甘油、豬油和菜籽油對(duì)該酶的形成有一定的抑制作用。
表9 不同油脂對(duì)產(chǎn)酶的影響

9.無機(jī)鹽類對(duì)產(chǎn)酶的影響試驗(yàn)了8種無機(jī)鹽類對(duì)產(chǎn)酶的影響，以不加鹽類的酶活力為100％，結(jié)果見表10。由表10可知，10mmol/L的Fe2+、Cu2+和Mn2+對(duì)酶的產(chǎn)生有促進(jìn)作用；而Zn2+、Na+、K+、Mg2+及EDTA對(duì)酶的形成有不同程度的抑制作用，其中Mg2+和EDTA的抑制作用最為明顯。此外，蔗糖可促進(jìn)該酶的產(chǎn)生，其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。
表10 無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響


*各種金屬離子的終濃度為10mmoL/L。
實(shí)施例5低溫中性脂肪酶的分離、純化白地霉(Geotrichum candidum)ch-3接種產(chǎn)酶培養(yǎng)基后，置于往復(fù)式搖床(180rpm)24℃發(fā)酵培養(yǎng)48h。取發(fā)酵液于4℃、6000rpm離心20min，收集發(fā)酵上清液即為脂肪酶粗酶液。
將粗酶液進(jìn)行雙水相萃取。雙水相體系在22℃按重量配制。體系總質(zhì)量為10g，酶液量為3g。按計(jì)算稱取一定量50％(m/m)PEG溶液和一定量成相的(NH4)2·SO4固體鹽，不足部分以水補(bǔ)充。所配混合物定量轉(zhuǎn)到離心管，2000r/min離心5min，分相。讀出上、下相體積，用取樣器吸取一定量的上、下相溶液，測(cè)定酶活力和總蛋白含量。有關(guān)計(jì)算公式為相比R＝上相體積/下相體積；分配系數(shù)K＝上相萃取物濃度/下相萃取物濃度；萃取率C＝RK/(1+RK)。為優(yōu)化雙水相萃取的條件，以脂肪酶比活力為指標(biāo)做三因素三水平的正交試驗(yàn)。結(jié)果表明PEG濃度為15％，硫酸銨濃度為22.5％及pH8.0時(shí)脂肪酶的比活力達(dá)到最大，也是雙水相萃取的最佳條件。本步得到了純化倍數(shù)為8.6、酶活性收率為88％、比活力為40.3U/mg的脂肪酶。雙水相萃取后的酶樣品用PEG20000濃縮至1-2mL，上樣至預(yù)先用重蒸水平衡好的Sephadex G-75凝膠過濾層析柱上(2×20cm)，用0.1mmol/L磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為0.4mL/min，部分收集器分步收集洗脫液，自動(dòng)記錄儀記錄洗脫曲線，分別測(cè)定各管酶活力，合并酶活性峰各管的酶液，測(cè)定合并酶液的蛋白質(zhì)含量及酶活力，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和活性染色分析。經(jīng)Sephadex G-75凝膠過濾后的脂肪酶比活力是雙水相萃取后的酶比活的7.4倍。經(jīng)過兩步法純化后脂肪酶被提純約73倍，酶活力回收率為16.3％，參見表11。
表11 低溫脂肪酶LIP3的純化結(jié)果表

經(jīng)過雙水相萃取和Sephadex G-75凝膠過濾兩步法純化獲得的酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，呈現(xiàn)單一條帶，證明該蛋白已經(jīng)達(dá)到電泳純。用標(biāo)準(zhǔn)的不同蛋白質(zhì)分子量對(duì)數(shù)對(duì)Rf值作圖，求出該蛋白的分子量約為38kDa。將38kDa蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，電泳后的凝膠放在維多利亞藍(lán)指示劑平板(分別將2.5g瓊脂粉、6.25mL三丁酸甘油酯、18.75mL 3g/dL聚乙烯醇、2.5mL 1g/dL維多利亞藍(lán)和225mL磷酸緩沖液加入500mL三角瓶中，加熱溶解瓊脂粉，趁熱用高速組織搗碎機(jī)均質(zhì)，倒平皿，靜置冷卻，制成含脂肪酶作用底物和指示劑的固體瓊脂平板)上，37℃反應(yīng)16h左右，可觀察到透明條帶出現(xiàn)。與SDS-PAGE凝膠電泳顯示的條帶進(jìn)行比較，它們的位置和數(shù)目相同，因此可以確定純化得到的38kDa蛋白是脂肪酶，將其命名為L(zhǎng)IP3。
實(shí)施例6溫度對(duì)低溫中性脂肪酶LIP3酶活力的影響1.LIP3最適作用溫度的測(cè)定及結(jié)果除了在pH7.0磷酸緩沖液中，分別置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和50℃的溫度下反應(yīng)30min，其它條件都相同，酶活測(cè)定方法具體參照實(shí)施例3。
測(cè)定、比較各溫度的酶活，35℃的條件下酶活最高，表明脂肪酶LIP3的最適作用溫度為35℃。結(jié)果參見附圖4A。
2.LIP3熱穩(wěn)定性的測(cè)定及結(jié)果除了將酶液分別置于20℃、30℃、40℃、50℃和60℃下保溫30min后，迅速冷卻，再調(diào)至35℃，測(cè)定剩余酶活外，酶活測(cè)定方法具體參照實(shí)施例3。以同時(shí)置于35℃下測(cè)定的酶活力為100％對(duì)照，求出剩余酶活。由附圖4B可知，在20～40℃的溫度范圍內(nèi)酶的穩(wěn)定性最佳，隨著溫度升高，酶活力迅速下降。20℃下保溫30min后再在35℃測(cè)定，剩余酶活為90％，50℃保溫30min后測(cè)定的剩余酶活僅為55％。可見LIP3對(duì)熱敏感，在低溫下活力較高、較穩(wěn)定，因而是一種低溫脂肪酶。
實(shí)施例7pH對(duì)低溫中性脂肪酶LIP3酶活力的影響配制不同pH值的緩沖液(1)0.1mol/L醋酸緩沖液的配制(pH5.0、pH5.5)溶液A0.2mol/L醋酸(11.55mL冰醋酸溶于1L水)。
溶液B0.2mol/L醋酸鈉(16.4g醋酸鈉溶于1L水)。
取14.8mL、0.2mol/L醋酸與35.2mL、0.2mol/L醋酸鈉溶液混合，最后稀釋成100mL，即配制成pH5.0醋酸緩沖液；取4.8mL、0.2mol/L醋酸與45.2mL、0.2mol/L醋酸鈉溶液混合，最后稀釋成100mL，即配制成pH5.5醋酸緩沖液。
(2)0.1mol/L磷酸緩沖液的配制(pH6.0～8.0)溶液A0.2mol/L NaH2PO4(27.8g溶于1L水)。
溶液B0.2mol/L Na2HPO4(53.65g Na2HPO4·7H2O溶于1L水)。
取87.7mL、0.2mol/L NaH2PO4與12.3mL Na2HPO4混合后，用水稀釋至終體積為200mL，即配制成pH6.0磷酸緩沖液；取68.5mL、0.2mol/L NaH2PO4與31.5mL Na2HPO4混合后，用水稀釋至終體積為200mL，即配制成pH6.5磷酸緩沖液；取39.0mL、0.2mol/L NaH2PO4與61.0mL Na2HPO4混合后，用水稀釋至終體積為200mL，即配制成pH7.0磷酸緩沖液；取16.0mL、0.2mol/L NaH2PO4與84.0mL Na2HPO4混合后，用水稀釋至終體積為200mL，即配制成pH7.5磷酸緩沖液；
取5.3mL、0.2mol/L NaH2PO4與94.7mL Na2HPO4混合后，用水稀釋至終體積為200mL，即配制成pH8.0磷酸緩沖液。
(3)0.1mol/L Tris-HCl緩沖液的配制(pH8.5、pH9.0)1.pH對(duì)LIP3酶活力的影響以上述不同pH值的緩沖液配制底物和稀釋酶液，分別在pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0的磷酸緩沖液中35℃下反應(yīng)30min，其它條件都相同，然后測(cè)定酶活，酶活測(cè)定方法具體參照實(shí)施例3。
測(cè)定、比較各pH值的酶活大小，在pH7.0酶活最高，結(jié)果參見附圖5A。由附圖5A可知脂肪酶LIP3反應(yīng)最適pH為7.0。低于6.5酶活力急速下降。
2.pH對(duì)LIP3穩(wěn)定性的影響將酶液用不同pH值緩沖液稀釋(pH5.0～9.0)，35℃保溫3h后，用pH7.0的磷酸緩沖液適當(dāng)稀釋，測(cè)定剩余酶活，酶活測(cè)定方法具體參照實(shí)施例3。結(jié)果表明，脂肪酶LIP3在pH6.5-8.0范圍內(nèi)可保持93％以上的酶活力，參見附圖5B。表明LIP3是一種低溫中性脂肪酶。
實(shí)施例8金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對(duì)LIP3酶活力的影響除了10mmol/L的各種金屬離子溶液分別與酶液混合后在35℃下保溫30min，其它條件都相同，測(cè)定酶活力，以未加金屬離子的酶液為100％對(duì)照，酶活測(cè)定方法具體參照實(shí)施例3。
結(jié)果表明Fe2+、Cu2+、Mn2+對(duì)酶有較強(qiáng)的激活作用；Ca2+對(duì)酶有輕微的激活作用；Mg2+和EDTA則對(duì)酶有一定的抑制作用，參見附圖6。
實(shí)施例9保藏條件和保護(hù)劑對(duì)低溫中性脂肪酶LIP3活力的影響1.保藏條件對(duì)LIP3活力的影響將酶液在4℃、-20℃和-70℃下分別放置1h，2h，6h，15h，30h和60h后測(cè)定酶活力隨時(shí)間的變化值，酶活測(cè)定方法具體參照實(shí)施例3。
由附圖7A可知，低溫中性脂肪酶LIP3在4℃下貯存活力喪失較快，-20℃和-70℃下貯存酶活力均較為穩(wěn)定，其中-70℃適于短期貯存，-20℃適于長(zhǎng)期貯存。
2.保護(hù)劑對(duì)LIP3穩(wěn)定性的影響由于酶在使用過程中本身會(huì)發(fā)生降解，會(huì)失去部分活性，所以有必要尋找合適的保護(hù)劑，保持酶的穩(wěn)定性，降低酶失活的速度。在酶液中分別加入單糖、雙糖、多糖及多元醇至飽和，在不同溫度下放置1d、2d、2.5d、4d、4.5d和6d，測(cè)定酶活力隨時(shí)間的變化值，以未加入保護(hù)劑的酶活力為100％，其它條件都相同，酶活測(cè)定方法具體參照實(shí)施例3。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分別加入麥芽糖、乳糖、葡萄糖、甘油和山梨醇后在25℃貯存4d，仍有70-85％的酶活力；從附圖7B可以看出20℃下酶活較高，酶活力變化曲線比較平緩；隨著溫度的升高，脂肪酶LIP3變得不穩(wěn)定，溫度越高，酶活力下降得越快。
權(quán)利要求
1.一種低溫中性脂肪酶產(chǎn)生菌白地霉(Geotrichum candidum)CGMCC.No.1972。
2.一種低溫中性脂肪酶的生產(chǎn)方法，其包括，A，對(duì)白地霉(Geotrichum candidum)CGMCC.No.1972進(jìn)行菌種活化培養(yǎng)步驟；B，利用步驟A獲得的活化菌種進(jìn)行發(fā)酵步驟；C，發(fā)酵后的純化提取步驟。
3.如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，在菌種活化培養(yǎng)后該菌產(chǎn)酶的條件為起始pH8.0，培養(yǎng)溫度24℃，180rpm振蕩培養(yǎng)48h，其培養(yǎng)基由重量百分比的1％可溶性淀粉、1％豆油、2％玉米漿、0.1％(NH4)2SO4、0.5％ K2HPO4、0.1％ MgSO4·7H2O和0.1％ FeSO4·7H2O組成。
4.如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，以玉米漿、酵母粉為氮源，其中，優(yōu)選濃度為2.0％玉米漿。
5.如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)步驟中，菌株最適生長(zhǎng)溫度是20℃，按體積比計(jì)，最適裝液量為12-20％，優(yōu)選18％，最佳接種量為10％。最適發(fā)酵溫度24℃，攪拌速度為180rpm，發(fā)酵周期48小時(shí)。
6.如權(quán)利要求2所述的發(fā)酵后的純化提取步驟，其特征在于，白地霉(Geotrichum candidum)CGMCC.No.1972的發(fā)酵液經(jīng)雙水相萃取和Sephadex G-75凝膠過濾純化，并用SDS-PAGE測(cè)得單一蛋白條帶，獲得純化的低溫中性脂肪酶。
7.如權(quán)利要求6所述的雙水相萃取，其特征在于，雙水相體系在22℃按重量配制，體系總質(zhì)量為10g，酶液量為3g，在PEG濃度為15％，硫酸銨濃度為22.5％及pH8.0時(shí)獲得脂肪酶比活力最大。
8.如權(quán)利要求6所述的Sephadex G-75凝膠過濾，其特征在于，雙水相萃取后的酶樣品用PEG20000濃縮至1-2mL，上樣至預(yù)先用重蒸水平衡好的2.0×20cm的Sephadex G-75凝膠層析柱上，用0.1mmol/L磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為0.4mL/min。
9.一種低溫中性脂肪酶，其利用權(quán)利要求1所述的白地霉(Geotrichumcandidum)CGMCC.No.1972，由權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)方法制備而成。
10.如權(quán)利要求9所述的低溫中性脂肪酶，其特征在于，最適反應(yīng)溫度是20～35℃，在20～40℃酶的穩(wěn)定性最佳，隨著溫度升高，酶活力迅速下降；在0℃可保持66％的相對(duì)酶活，20℃保溫30min仍可保持90％的酶活力，而50℃保溫30min，僅有55％的酶活力；該酶的最適pH是7.0，在pH6.5-8.0范圍內(nèi)溫育3h能保持原來酶活的93％以上，pH低于6.5酶活力迅速下降；Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+對(duì)酶有激活作用，Mg2+和EDTA對(duì)酶有抑制作用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白地霉(Geotrichum candidum)CGMCC.No.1972及其表達(dá)產(chǎn)物低溫中性脂肪酶，本發(fā)明還同時(shí)提供了采用雙水相萃取和Sephadex G－75凝膠過濾的方法對(duì)白地霉發(fā)酵液進(jìn)行了分離純化技術(shù)。本發(fā)明通過提供的菌種是具有良好商業(yè)應(yīng)用前景的低溫中性脂肪酶產(chǎn)生菌，產(chǎn)酶溫度穩(wěn)定，原料來源廣泛，生產(chǎn)成本低廉。其表達(dá)產(chǎn)物是一種新型低溫中性脂肪酶，最適作用溫度為35℃，最適pH為7.0，可廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)學(xué)制品等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N9/18GK101058797SQ20071010048
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2007年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月13日
發(fā)明者付建紅, 姚斌, 石玉瑚, 孟昆, 歐陽平凱, 袁鐵錚, 古麗尼莎 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所