專利名稱：一種植物組織特異性表達dna調控元件的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領域。通過在啟動子中利用本發(fā)明的DNA調控序列，使目標基因在特定的組織中特異性表達或優(yōu)勢表達，以產生有價值的轉基因植物。
背景技術：
啟動子對于利用基因工程修飾植物表型是不可或缺的?；虻谋磉_主要通過對轉錄水平控制來調節(jié)的，即主要通過啟動子來調節(jié)的。啟動子是控制DNA轉錄的5’調控元件，是控制基因表達的主要成分。根據作用范圍或組織特性，可將啟動子分類。例如，組成型啟動子可將其旁側的DNA在多種組織中轉錄表達。組織增強或組織特異性啟動子使DNA序列在特定組織中高表達或特異性表達。誘導型啟動子可被外在刺激，如化學物質、發(fā)育或環(huán)境刺激(如非生物脅迫)等誘導表達。
在各種目的的轉基因植物實踐中，運用不同類型的啟動子是非常必要的。例如，利用強啟動子在組織中高水平轉錄BT毒蛋白基因而獲得轉基因抗蟲作物；利用非生物脅迫誘導啟動子在轉基因植物中表達DREB1轉錄因子從而提高植物的抗旱、抗寒和抗高鹽能力。通常，組織發(fā)育特異性啟動子或條件表達啟動子使外源基因在恰當的時期、恰當的部位或合適的條件下表達，從而將外源基因對宿主植物的不利影響降低到最小程度。
用遺傳修飾的方法創(chuàng)建作物新種質已發(fā)展到多性狀導入的時期。該方法通過導入多個基因使植物獲得多種目標性狀。在將多個基因導入植物時，優(yōu)化每個基因的表達是非常重要的，這需要不同的啟動子來完成，而且，使用不同的調控元件可以降低同源序列重組造成的基因沉默。因此，通過使用恰當的啟動子來優(yōu)化基因的表達以及使用不同的調控序列來降低基因沉默的風險對植物生物技術來說是非常重要的。
各類啟動子可以通過不同的策略獲得。例如，通過分離具有相應表達特性的基因的5’調控序列來獲得；通過對天然啟動子中的順式作用原件的增刪；通過對不同啟動子或啟動子的部分序列的組合等方法來獲得新特性的啟動子。這些啟動子片段的分離或重組采用常規(guī)的分子生物學方法，如PCR和DNA重組技術等。

發(fā)明內容
煙草SAR8.2b基因受水楊酸誘導表達，其啟動子的-728到-927bp和-197到-351bp這兩段對水楊酸誘導的高表達特性是必需的。在對SAR8.2b基因啟動子的序列分析發(fā)現，在-581到-470bp區(qū)存在一段重復序列，由一段37bp的序列重復3次構成，重復單元之間只有1個堿基的差別。為了鑒定該序列的功能，將該序列與CaMV35S啟動子的基本轉錄元件連接構成一個新啟動子，并用該啟動子驅動GUS基因在擬南芥中表達，發(fā)現GUS的表達具有組織特異性GUS活性主要存在與表皮毛刺、子葉和根中。因此，SAR8.2b基因啟動子中的這段重復序列賦予了SAR8.2b基因的組織特異性表達特性。包含該重復片段的啟動子可以用于在棉花纖維、植物被毛、子葉以及根中表達目的基因，以獲得抗病、抗蟲轉基因植物、纖維品質改良的棉花以及抗非生物脅迫的植物等。
本發(fā)明的目的是提供一種能使基因在植物毛刺、根和子葉中優(yōu)勢表達的分離的DNA片段。本發(fā)明包含了這些DNA片段的合成、利用這些DNA片段構建組織優(yōu)勢表達啟動子以及利用該啟動子指導基因在植物中表達等。這些DNA片段及其延伸序列可在轉錄水平上提高結構DNA序列、反義RNA、干擾RNA(RNAi)、mRNA、hnRNA以及其它核酸在特定的植物組織器官中表達。
具體的，本發(fā)明所說的DNA片段是SEQ ID NO1，或SEQ ID NO1的突變體，或包含SEQ ID NO1或其突變體的DNA片段，這些DNA片段可用于構建啟動子，這些啟動子有利于基因在植物的特定組織優(yōu)勢表達，特別是在表皮毛刺、根和子葉中。所述DNA片段可以采用化學合成、PCR、DNA重組等技術獲得。
SEQ ID NO1序列ATGTAGACAATTGGTGGCCGAGTGACTCCAACTCTTGACGTAGATAATTGGTGGCGAGTGACTCCAACTCTTGACGTAGATAATTGGTGGCCGAGTGACTCCAACTCTTG發(fā)明還包含了與序列SEQ ID NO1或其互補序列相同的核酸片段或核酸分子、包含序列SEQ ID NO1中至少10個以上連續(xù)的核酸序列或其互補序列或核酸分子以及能夠賦予與之相連的操作基因、結構RNAs、RNAi、hnRNA、mRNA和反義RNA在植物的特定組織中優(yōu)勢表達；所述特定組織指的是莖、葉表皮被毛(刺)、種皮毛、棉纖維、植物根系和子葉。
一種載體，包含有上述核酸片段或與其它異源核酸片段組合的核酸片段的一個或多個組合。所述載體是指適用于植物細胞的質粒載體或表達載體；所述載體中可以插入有效基因；所述有效基因選自調節(jié)棉花纖維發(fā)育的基因、調節(jié)植物表皮毛發(fā)育的基因、促進植物根系發(fā)育的基因、抗生物或非生物脅迫的基因中的一種。
含有與本發(fā)明相一致的DNA的轉基因植物可以是任何植物，包括小麥、玉米、黑麥、水稻、燕麥、大麥、草皮草、高梁、小米、甘蔗、煙草、番茄、馬鈴薯、大豆、棉花、苜蓿、太陽花和擬南芥，本發(fā)明的一個具體例子是擬南芥。依據本發(fā)明的轉基因植物可以是任何世代，包括有性或無性的T0轉基因植物及其種子，任何包含SEQ IDNO.1或其一部分的種子。發(fā)明也包括可育T0植株的任何子代植株，任何包含SEQ ID NO.1或其一部分的子代植株以及它們的種子。
本發(fā)明提供的DNA片段，可用于靈活的構建植物組織特異性表達啟動子，特別是該片段賦予啟動子在植物表皮毛、根和子葉中優(yōu)勢表達。因此具有下列優(yōu)點1.在棉花纖維品質改良的基因工程中可以實現外源基因在纖維中優(yōu)勢表達，從而在改良纖維發(fā)育特性的同時，減少外源基因對棉花其它生物性狀的影響。
2.可以消除植物轉基因中引起的基因沉默現象。植物基因工程中，如果使用的植物啟動子與受體植物基因組具有一定的同源性或在多個基因的導入時使用的啟動子具有相同的序列時，往往會在寄主植物體內引起基因沉默現象。而本發(fā)明中的DNA調節(jié)序列可以與其它啟動子片段組合成各種新啟動子，因此可以靈活使用，避免序列的重復，減小基因沉默的風險。
3.應用本發(fā)明中的DNA片段構建的啟動子，可以進行植物分化機制研究。棉花纖維細胞是研究植物細胞分化、極性生長和纖維素沉積的理想模型。纖維特異性啟動子為闡述基因對棉纖維細胞發(fā)育提供有力工具。


圖1是植物表達載體圖。其中“SAR”是SEQ ID NO1序列；“mini-35S”為CaMV35啟動子的最小轉錄元件，單獨使用無啟動子活性?！唉浮睘榉g增強序列。其后連接有GUS報告基因。
圖2是在真葉中轉基因擬南芥的GUS表達染色圖片。其中葉表皮毛被染色。
圖3是在子葉中轉基因擬南芥的GUS表達染色圖片。其中葉肉細胞和葉脈均被染色。
圖4是擬南芥表皮毛轉基因的GUS表達染色圖片。其中擬南芥表皮毛的三個分枝均被染色。
圖5是擬南芥植株的轉基因的GUS表達染色圖片。
具體實施例方式
用下列非限定性實施例對本發(fā)明進一步說明(一)SEQ ID NO1序列的合成SEQ ID NO1為一段具有3個單元的重復序列，用PCR法分離有困難，因此采用大引物延伸法合成該片段。首先分別合成該片段的左右兩個部分，然后利用這兩個小片段的3’端的互補粘端相互延伸，即獲得完整序列。片段合成的同時，在兩端引入HindIII、SalI、SpeI和XbaI位點，以便后續(xù)的重組操作。片段合成具體操作如下1.設計并合成下列引物(上海生工)p1ATCTACGTCAAGAGTTp2CCCTCTAGAATGTAGACAATTGGTGGCCGAGTGACTCCAACTCTTGACGTAGATAATTGGTGGCGAGTGACTCCp3AACTCTTGACGTAGATp4CCGAAGCTTGTCGACACTAGTCAAGAGTTGGAGTCACTCGGCCACCAATTATCTACGTCAAGAGTTGGAGTCACTCGCCACCAATT2.用DNA熱聚合酶Tsg(上海生工)分別將引物p1和p2、p3和p4互補延伸。反應體系ddH2O 25.5μl10×PCR buffer5.0μldNTPs(各2.5mM)5.0μlMgCl2(25mM) 4.0μlp1(p3)(50μM) 5.0μlp2(p4)(5μM) 5.0μltotal 49.5μl
在PCR管內混合上述試劑后，95℃變性5min，然后加入0.5μl TsgDNA聚合酶(5U/μl)，在45℃，30s和72℃，30s兩個過程中循環(huán)10次。
3.將p1和p2、p3和p4的合成產物等體積混合，在55℃，30s和72℃，60s兩個過程中循環(huán)10次。
4.用2.5％的瓊脂糖凝膠分離3的合成產物，回收140bp片段，用PCR產物膠回收試劑盒(WizardSV Gel and PCRClean-UpSystem，Promega)純化。
5.將回收片段克隆到T-載體上(pGEM-T easy Vector Systems，Promega)，測序確定序列正確。
(二)Mini-35S-Ω片段的合成SEQ ID NO1單獨不具有啟動子活性，必須和其它啟動子或啟動子的基本轉錄元件連接才能構成新的或完整的啟動子。例如與CaMV35S啟動子的基本轉錄單元(-62-+2區(qū)域)相連。單獨的CaMV35S啟動子的-62-+2區(qū)域同樣不具有轉錄活性，被稱為Mini-35S啟動子。當SEQ ID NO1與Mini-35S啟動子相連，即構成了具有轉錄活性的完整啟動子。為了提高基因的表達量，本例在Mini-35S啟動子后還連接了來自TMV的“Ω”翻譯增強序列，該序列轉錄產物的蛋白質翻譯水平。
Mini-35S-Ω片段同樣采用大引物延伸法合成，并在兩端分別加上XbaI和BamHI位點1.合成引物P5
GACTCTAGACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGATCGTATTTTTACAACAATTACCAACAAP6CGGGGATCCTGTACAATGTAATTGTAAATAGTAATTGTAATGTTGTTTGTTGTTTGTTGTTGTTGGTAATTGTTGTAAA2.用DNA熱聚合酶Tsg(上海生工)將引物p5和p6互為模板延伸。反應體系ddH2O 25.5μl10×PCR buffer 5.0μldNTPs(各2.5mM) 5.0μlMgCl2(25mM) 4.0μlP5(50μM) 5.0μlP6(5μM)5.0μltotal 49.5μl在PCR管內混合上述試劑后，95℃變性5min；然后加入0.5μl TsgDNA聚合酶(5U/μl)；45℃，30s；72℃，7min。
3.產物用PCR產物純化試劑盒純化。
(三)植物表達載體構建1.構建最小啟動子中間載體pBSO將Mini-35S-Ω片段，通過XbaI和BamHI位點，克隆到中間載體pBI221上，構建成中間載體pBSOa)Mini-35S-Ω片段經XbaI和BamHI雙酶切后，用3％的瓊脂糖凝膠分離回收160bp片段，用PCR產物膠回收試劑盒純化。同法，用XbaI和BamHI雙酶切pBI221，電泳回收5660bp片段(WizardDNA Clean-Up System，Promega)。
酶切反應體系(MBI Fermentas)為DNA 5μgBuffer 10X TangoTM2μLXbaI(10U/uL) 1μLBamHI(10U/uL) 1μL補ddH2O至 20uL37℃酶切2h。
b)連接反應(DNA Ligation Kit Ver.2.0)將1μLMini-35S-Ω酶切片段和4μL pBI221酶切片段混合后加入5μL SolutionI，16℃，30min。
c)轉化篩選和鑒定取5μL連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞(化學轉化法，分子克隆III，中文版)，經氨芐青霉素平板(60μg/mL)篩選后，測序。
2.構建成中間載體pBSAR用HindIII和XbaI將SEQ ID NO1從T-載體上切下，相連到pBSO的相應位點，即構建成中間載體pBSAR。方法同1.。
3.構建植物表達載體用HindIII和EcoRI從pBSAR上切下完整的表達框SAR∷GUS∷NOS，將其連接到植物表達載體pCAMBIA1301的相應位點，構建成植物表達載體pCB212。方法同1.。
(四)擬南芥植物的轉化擬南芥轉基因采用真空滲透法(vacuum infiltrationtransformation)1.擬南芥材料準備將春化(0.05％瓊脂糖浸泡，4℃冰箱中放置3天)后的擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型種子播種在直徑9cm塑料花缽中，基質由1/3草甸土和2/3蛭石組成。培養(yǎng)溫度19～24，前3周生長在短日照下(8/16光/暗)，此后在長日照下促進開花和結實(16/8光/暗)。當二級花序出現時，開始轉化。
2.農桿菌的制備電激法轉化農桿菌從農桿菌菌株GV3101平板上挑取一個單菌落，接種到1ml液體LB培養(yǎng)基(50mg/l利福平，25mg/l慶大霉素)中，28℃，200r/min振蕩培養(yǎng)20～24h；將上述培養(yǎng)液50ml液體LB培養(yǎng)基(50mg/l利福平，25mg/l慶大霉素)中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0.4～0.6，培養(yǎng)條件同上。上述培養(yǎng)液到無菌的50ml離心管中，置冰上放置10min，4℃、5000r/min離心2min；棄上清，用50ml冰預冷的去離子水洗兩次；最后，用殘存在離心管中的液體懸浮菌體即制成農桿菌感受態(tài)細胞。電激轉化時，取0.1μg質粒，加入50μl農桿菌感受態(tài)細胞(在電激轉化杯中)，輕彈混勻，冰浴10min，按BIO-RAD電激轉化儀手冊操作轉化。
挑取含植物表達載體的GV3101農桿菌菌斑，接種在1ml培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，將培養(yǎng)物轉入500ml YEP培養(yǎng)基中(50mg/lrif，25mg/l gen，50mg/l kan)，28℃下振蕩過夜培養(yǎng)，使菌液濃度OD600＞2.0，離心收集菌體，重懸在1L滲透液中。
滲透液(1L)1/2MS鹽+1X B5有機物+50g蔗糖+0.5g MES+0.01mg/L 6-BA+200μl Silwet L-77，用KOH調pH至5.7。
3.擬南芥轉化——真空滲透法將擬南芥倒置，地上部分全部浸入滲透液中；400mm Hg真空5min，取出花缽，簡單地甩去擬南芥上的滲透液，將花缽側放在盤中，用塑料薄膜覆蓋保濕；在培養(yǎng)室培養(yǎng)1天后，揭去薄膜，將花缽立起正常培養(yǎng)。轉化后1個月，停止?jié)菜?，待種子成熟后收獲。
4.轉基因植株的篩選取40μl種子，用70％乙醇消毒10分鐘，無水乙醇脫水3次，在超凈臺上徹底風干，用4ml 0.1％瓊脂糖重懸種子，倒在篩選培養(yǎng)基平板上。4℃春化3天后，移入培養(yǎng)室發(fā)芽(20℃、24光照)，培養(yǎng)10-15天，選擇生長健壯的抗性苗移入土壤中。
篩選平板MS鹽+0.8％瓊脂，pH 5.7，高壓滅菌后，加羧芐青霉素300mg/l，卡那霉素100mg/l，倒在150×15mm平板中。
(五)植物組織GUS染色方法1)X-Gluc溶液100mM磷酸緩沖液(pH7.0)，0.3mM高鐵氰化鉀，0.3mM亞鐵氰化鉀，0.2％Triton-X100，100μg/ml氯霉素，1mM X-Gluc2)將擬南芥葉片或幼苗放入2ml離心管中，加入5適量X-Gluc溶液，使所有組織均被浸沒，37℃溫浴2小時。
3)除去X-Gluc溶液，分別用30％、50％、70％和100％乙醇脫色。
4)70％乙醇保存，用立體顯微鏡觀察照像。
權利要求
1.一種分離的核酸分子，其特征是包含與序列SEQ ID NO1或其互補序列相同的核酸片段。
2.一種分離的核酸分子，其特征是包含序列SEQ ID NO1中至少10個以上連續(xù)的核酸序列或其互補序列。
3.一種啟動子，其特征是包含權利要求1或2所述的核酸分子。
4.根據權利要求1或2所述的核酸分子或權利要求3所述的啟動子，其特征是能夠賦予與之相連的操作基因、結構RNAs、RNAi、hnRNA、mRNA和反義RNA在植物的特定組織中優(yōu)勢表達；所述特定組織指的是莖、葉表皮被毛，種皮毛，棉纖維，植物根系和子葉。
5.一種構建體，包含有權利要求1-4中的一個或多個組合的核酸片段或與其它異源核酸片段組合的核酸片段。
6.一種植物，包含權利要求5中的核酸構建體。
7.根據權利要求6中所述的植物，其特征是所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。
8.一種權利要求書6所述的植物的產生方法，其特征在于包括以下步驟a)在植物細胞的基因組中插入重組DNA分子，該DNA分子包括啟動子、基因和終止子三個可操作連接的片段；啟動子片段包含SEQ ID NO1或其變異體序列，該啟動子與編碼蛋白質或可轉錄為RNA的基因相連，再與在植物中具有轉錄終止功能的終止子相連；其中第一個DNA片段與第二個DNA片段異源。b)得到轉化的植物細胞；c)使上述轉化的植物細胞再生成植株；d)從上述植物中選擇高產類型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能賦予植物啟動子組織特異性表達或在特定組織中優(yōu)勢表達的DNA調控元件，以及對其修飾、制備和應用的方法；利用調控元件與植物的基本啟動子或其它植物啟動子的重組能調節(jié)與之相連的DNA序列的轉錄表達水平，如使其在植物的某些特定組織中轉錄或轉錄增強，而在另一些組織中不轉錄或轉錄水平下調，特別是在植物莖、葉表皮被毛(刺)，種皮毛，棉纖維，植物根系和子葉中特異或優(yōu)勢表達。本發(fā)明包含了含有該調節(jié)元件的合成的或天然的啟動子及其變體，這些啟動子可以應用于棉纖維品質改良、植物抗病或抗蟲基因工程，以及其它的植物遺傳改良工程中。
文檔編號C12N15/82GK101058813SQ200710100469
公開日2007年10月24日 申請日期2007年4月12日 優(yōu)先權日2007年4月12日 公開號200710100469.發(fā)明者崔百明, 彭明, 周鵬, 張秀春 申請人:中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所