專利名稱：心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)檢測芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因多態(tài)性檢測芯片，尤其涉及一種心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)檢測芯片及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病是威脅中老年人的頭號疾病，以其發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高為最典型的三高疾病，給患者以及家庭、社會都帶來了極大的危害。流行病學(xué)調(diào)查顯示世界人口平均心腦血管疾病發(fā)病率為10-20％；全球每年死于心腦血管病的人數(shù)占死亡人數(shù)的52％，為死亡頭號殺手。隨著人們生活的提高，飲食結(jié)構(gòu)、生態(tài)環(huán)境的改變，我國心腦血管疾病患者逐年上升，是全球心腦血管疾病發(fā)病率最高的國家。我國有心腦血管疾病患者3000多萬，其中癱瘓在床者達(dá)1200萬人，每年死亡達(dá)400萬人以上，居各類死亡之首。有效預(yù)防、治療心腦血管疾病刻不容緩。心腦血管疾病的防治，應(yīng)該采取預(yù)防與治療相結(jié)合的方法，從根本入手，選用效果顯著、副作用小、標(biāo)本兼治的藥物，結(jié)合自身狀況酌量服用，才能徹底根治心腦血管疾病。
目前對于高血壓等心腦血管疾病的藥物治療僅是經(jīng)驗性對癥治療，而相同的藥物，不同的種族和個體患者對藥物的反應(yīng)、藥物副作用以及藥物在體內(nèi)的代謝，都存在明顯的個體差異，因此個體化用藥越來越受到重視。心腦血管藥物遺傳學(xué)通過對相關(guān)基因SNPs基因型的研究，臨床試驗可以評估個體對心腦血管藥物治療的反應(yīng)差異，揭示不同個體對心腦血管藥物反應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)，使臨床醫(yī)生可以根據(jù)病人的遺傳背景來選擇合適的藥物和合理的劑量。
1.與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)有關(guān)的基因高血壓是心、腦血管病的重要病因和危險因素，影響心、腦、腎等重要器官的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致這些器官功能衰竭，是心腦血管病死亡的主要原因之一，而且高血壓還引起血脂代謝異常、胰島素抵抗、糖耐量異常等一系列病理綜合征群，嚴(yán)重危害人類生活質(zhì)量及生命安全。RAAS的異常變化在高血壓的發(fā)生、發(fā)展和靶器官損害方面起著重要作用。經(jīng)典的RAAS系統(tǒng)包括腎小球入球動脈的球旁細(xì)胞分泌腎素，激活從肝臟產(chǎn)生的血管緊張素原，生成血管緊張素I，然后經(jīng)肺循環(huán)的ACE生成血管緊張素II(AngII)。AngII是ARRS的主要效應(yīng)物質(zhì)，在血壓的控制，心臟，血管重構(gòu)，腎臟血流動力學(xué)的調(diào)控，心肌收縮力和心肌供血的調(diào)節(jié)及水鹽代謝等方面發(fā)揮著重要的作用。因此，通過對RAAS的研究發(fā)現(xiàn)了一系列與心腦血管疾病相關(guān)的基因。
1.1血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)ACE基因第16內(nèi)含子中存在一段287bp插入/缺失(I/D)多態(tài)性，形成了II、ID、DD三種基因型。不同種族間I/D等位基因頻率不同。Li等人的研究發(fā)現(xiàn)ACE基因的多態(tài)性與ACEI治療高血壓的療效有關(guān)，使用貝那普利治療2月后，發(fā)現(xiàn)DD型基因患者收縮壓和舒張壓降壓效果均比II型基因患者顯著[Li X，Du Y，Du Y，et al.Correlationof angiotensin-converting enzyme gene polymorphism with effect ofantihypertensive therapy by angiotensin-converting enzyme inhibitor.Cardiovasc Pharmacol Ther，2003，825-30]。此外，Sciarrone等的研究發(fā)現(xiàn)，II基因型和DD基因型的高血壓病人平均動脈壓分別降低約10和3.8mmHg，認(rèn)為II基因型患者對利尿劑的降壓反應(yīng)優(yōu)于ID、DD基因型患者[Sciarrone MT，Stella P，Barlassina C，et al.ACE and α-adducin polymorphism as markers of individualresponse to diuretic therapy.Hypertension，2003，41398-403]。
1.2血管緊張素原(Angiotensiongen，AGT)基因AGT基因不僅作為高血壓侯選基因已被廣泛研究，同時也是高血壓藥物遺傳學(xué)研究的主要對象之一。AGT基因多態(tài)性可影響藥物治療效應(yīng)，如在應(yīng)用利尿劑治療高血壓時，美籍非洲裔婦女?dāng)y帶-6位點G等位基因患者收縮壓下降較明顯[Frazier L，Turner ST，Schwartz GL，et al.Multilocus effects of therenin-angiotensin-aldosterone system genes on blood pressure response to athiazide diuretic.Pharmacogenomics，2004，4(1)17-23]。Kurland等[KurlandL，Liljedahl U，Karlsson J，et al.Angiotensinogen gene polymorphismsrelationship to blood pressure response to antihypertensive treatment.Results from the Swedish Irbesartan Left Ventricular HypertrophyInvestigation vs Atenolol (SILVHIA)trial.Hypertension，2004，178-13.]對49名高血壓患者用阿替洛爾單一治療12周后，發(fā)現(xiàn)AGT基因-6A或235T等位基因與收縮壓的下降有明確關(guān)系，這些等位基因攜帶者血壓下降的更多。研究者推測這可能是由于-6A或235T等位基因增加了AGT基因的轉(zhuǎn)錄水平，使腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)活性增強(qiáng)，對阿替洛爾更加敏感。
1.3血管緊張素II1型受體(AT1R)基因AT1R常見單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)A1166C是高血壓的獨(dú)立危險因素，可能參與高血壓發(fā)生及其靶器官的損害過程。研究發(fā)現(xiàn)A1166C多態(tài)性增加機(jī)體對Ang II的反應(yīng)能力，且純合子C等位基因可能是高血壓患者心血管疾病危險性增加的一個可能原因。血管緊張素II受體阻滯劑(ARB)直接作用于血管緊張素II I型受體(AT1R)，阻斷血管緊張素II的縮血管作用，并抑制其刺激醛固酮的產(chǎn)生。ARB最大的特點是與藥物有關(guān)的不良反應(yīng)很少，且不引起刺激性干咳，所以持續(xù)治療的依從性較高，不僅是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)不良反應(yīng)的替換藥，更具有自身療效的價值，廣泛應(yīng)用于高血壓、充血性心力衰竭、冠心病及高血壓引起的腦血管意外等疾病的治療，是臨床上應(yīng)用較廣的心血管藥之一。國內(nèi)李海濤等[李海濤，王曉春。原發(fā)性高血壓患者血管緊張素II 1型受體基因多態(tài)性及其對拮抗劑的藥物作用反應(yīng)，中國綜合臨床，2004，20978-980]的研究亦表明ARB對AT1R基因A1166C多態(tài)性的各基因型患者均有良好降壓作用，沒有選擇性。
1.4醛固酮合成酶(CYP11B2)基因雖然CYP11B2基因多態(tài)性與高血壓的關(guān)系的研究結(jié)果不一致，但大多學(xué)者認(rèn)為SNPT-344C與血漿腎素的降低和醛固酮水平的增高有關(guān)，而這將影響高血壓藥物治療效應(yīng)。國內(nèi)學(xué)者[吳壽嶺，李云，劉克儉，等。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶和醛固酮合成酶基因多態(tài)性與氫氯噻嗪降壓療效的關(guān)系，中華心血管病雜志，2005，33(7)595-598]報道，高血壓患者服用氫氯噻嗪后，CYP11B2基因CC型患者收縮壓、舒張壓和平均動脈壓下降值均高于TT、TD型患者，但這種差別在三種基因型間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而把ACE基因型與CYP11B2基因型多態(tài)性聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，DD+CC基因型患者對氫氯噻嗪的降壓反應(yīng)可能優(yōu)于其他基因型組合患者。該SNP也影響ACEI的療效，TT和CT基因型的高血壓患者的降壓效果明優(yōu)于CC基因型高血壓患者[Yu HM，Lin SG，Liu GZ，et al.Associations between CYP11B2 gene polymorphisms and the response toangiotensin-converting enzyme inhibitors.Clin Pharmacol Ther.2006，79(6)581-589]。
2.β-腎上腺素受體(Beta-adrenergic receptor，β-AR)基因β-受體阻滯劑是抗高血壓的首選藥物之一，主要通過抑制心肌收縮力和減少腎素及其后產(chǎn)物的分泌來降低血壓。此外還具有拮抗RAAS系統(tǒng)而用于慢性充血性心力衰竭的降低RAS基礎(chǔ)張力用藥，并具有負(fù)性頻率作用而用于快速心律失常的治療。但是不同的個體對β-受體阻滯劑的反應(yīng)也存在很大的差異，其中遺傳因素是這種差異的重要影響因素之一。遺傳因素主要是β1-腎上腺素受體(β1-AR)基因和β2-腎上腺素受體(β2-AR)基因的遺傳變異。
2.1 β1-AR基因β1-腎上腺素受體基因最常見的多態(tài)位點是Gly389Arg，患者服用美托洛爾后，Arg/Arg型患者收縮壓下降值高于Gly/Gly型患者[Liu J，Liu ZQ，Tan ZR，et al.Gly389Arg polymorphism of β1-adrener gic receptor is associated with thecardiovascular response to metoprolol.Clin Pharmacol Ther，2003，74372-379]。同時Johnson等[Johnson JA，Zineh I，Puckett BJ，et al.Beta1-adrenergic receptor polymorphisms and antihypertensive response tometoprolol.Clin Pharmacol Ther，2003，7444-52]在一項臨床試驗研究中，用美托洛爾對40名高血壓患者治療4周，并在治療前后監(jiān)測動態(tài)血壓，結(jié)果顯示Arg/Arg型患者白天的舒張壓下降的比Gly/Gly型患者更明顯。在中國人中的一項研究顯示，49Ser389Arg/49Ser389Arg和49Ser389Arg/49Gly389Arg高血壓患者美托洛爾治療效果良好，收縮壓下降幅度大于49Ser389Arg/49Gly389Arg高血壓患者，并且49Ser389Gly/49Gly389Arg和49Ser389Gly/49Ser389Gly高血壓患者對美托洛爾治療無反應(yīng)[Liu J，Liu ZQ，Yu BN，et al.Betal-Adrenergic receptor polymorphismsinfluence the response to metoprolol monotherapy in patients with essentialhypertension.Clin Pharmacol Ther.2006，80(1)23-32.]。
2.2 β2-腎上腺素受體(β2-AR)基因β2-AR基因2個常見SNP(Arg16Gly和Gln27Glu)可引起β2-AR與兒茶酚胺類的親和力降低，導(dǎo)致舒血管反應(yīng)降低。Tomaszewski等在歐洲人群中研究顯示Arg16Gly和Gln27Glu多態(tài)性與高血壓沒有關(guān)聯(lián)，但發(fā)現(xiàn)染色體5q31.1-5區(qū)域與高血壓相關(guān)。Etzel等也認(rèn)為β2-AR基因突變不是美國人群中高血壓易感的主要因素。但是有研究者報告[Lee YW，Oh VM，Garcia E，et al.Haplotypes of the beta2-adrenergic receptorgene are associated with essential hypertension in a Singaporean Chinesepopulation.Hypertension，2004，22(11)2111-2116.]，β2-AR突變是新加坡華人和英國人對高血壓易感的一個遺傳因素。β2-AR可能是中國人高血壓的相關(guān)基因。Liljedahl等認(rèn)為β2-AR、AGT和Appo B等基因的遺傳變異可用來預(yù)測抗高血壓治療左心室質(zhì)量(left ventricular mass)的改變[Liljedahl U，Kahan T，MalmqvistK，et al.Single nucleotide polymorphisms predict the change in leftventricular mass in response to antihypertensive treatment.J Hypertens.2004Dec；22(12)2321-2328]。
3.G蛋白β3-亞單位(GNB3)基因Gs蛋白α亞基的遺傳變異與β-腎上腺素受體阻斷劑療效無關(guān)，但GNB3的C825T與atenolol的療效反應(yīng)存在相關(guān)性，CC基因型的女性高血壓患者的降壓效果明顯優(yōu)于CT和TT基因型[Filigheddu F，Reid JE，Troffa C，et al.Genetic polymorphisms ofthe beta-adrenergic systemassociationwith essential hypertension andresponse to beta-blockade.Pharmacogenom J 2004；4154-160]。另外，TT基因型亦與鹽敏感高血壓相關(guān)[Turner ST，Schwartz GL，Chapman AB，Boerwinkle E.C825T polymorphism of the G protein b3-subunit and antihypertensive responseto a thiazide diuretic.Hypertension 2001；37739-743]，825T等位基因與氫氯噬嗦的降血壓作用相關(guān)，與CC型純合子相比，TT型純合子病人平均收縮壓和舒張壓的降低更為顯著[王喆，蘇瑞斌。遺傳多態(tài)性和抗高血壓藥物治療間的藥物基因相互作用，國外醫(yī)學(xué)(藥學(xué)分冊)，2005，32162-164]。
4.內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因G894T是eNOS基因的常見SNP，導(dǎo)致第298位谷氨酸轉(zhuǎn)換成天門冬氨酸，損害了eNOS的NO釋放功能，與心肌梗死和高血壓相關(guān)[Persu A，Vinck WJ，EI Khattabi O，et al.Influence of the endothelial nitric oxide synthase gene on conventional andambulatory blood pressuresib-pair analysis and haplotype study.Hypertension，2005，23759-765]。此外日本學(xué)者研究表明eNOS基因另一突變T-786C與冠狀動脈痙攣有關(guān)，-786C使eNOS的mRNA水平下降，從而導(dǎo)致eNOS表達(dá)減少。臨床實驗結(jié)果顯示CC型等位基因攜帶者比其他基因型的收縮壓高，而且在高血壓患者中CC型等位基因過度表達(dá)。華琦等[華琦，李東寶，皮林等。T786C多態(tài)性與纈沙坦降壓療效的關(guān)系，高血壓雜志，2004，12331-334]等發(fā)現(xiàn)T786C多態(tài)性與高血壓有關(guān)，C等位基因攜帶者對纈沙坦的治療反應(yīng)較好。
5.α-內(nèi)皮蛋白(alpha-adducin，ADD)基因α-ADD基因的多態(tài)性會影響整個腎小管細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力，從而引起腎功能的變化，其變異與高血壓有統(tǒng)計學(xué)上的聯(lián)系[Lanzani C，Citterio L，Jankaricova M，et al.Role of the adducin family genes in human essentialHypertension.Hypertension，2005，23(3)543-549]。利尿劑藥物遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)T等位基因與收縮壓和平均動脈壓的下降相關(guān)，TT基因型患者的降壓療效最顯著[Sciarrone MT，Stella P，Barlassina C，et al.ACE and α-adducinpolymorphism as markers of individual response to diuretic therapy.Hypertension，2003，41398-403；吳壽嶺，李冬青，李宏芬等。α-內(nèi)收蛋白基因多態(tài)性與氫氯噻嗪降壓療效的相關(guān)性研.中華心血管病雜志，2005，33(10)880-884]。
6.胰島素受體底物1(IRS1)基因高血壓病常伴有代謝異常如胰島素抵抗(IR)，約50％高血壓患者中存在糖耐量異常或非胰島素依賴型糖尿病。IR和繼發(fā)性高胰島素血癥可能會導(dǎo)致血壓升高，參與高血壓的發(fā)生、發(fā)展。胰島素發(fā)揮其功能必須以胰島素受體介導(dǎo)，胰島素受體的結(jié)構(gòu)和功能決定了細(xì)胞對胰島素作用的反應(yīng)，是胰島素抵抗的重要原因之一。在中度以上的IR伴高血壓病人中?？蓹z測出胰島素受體(Insulin Receptor，INSR)基因突變，提示INSR基因可能是高血壓的候選基因之一。IRS1基因SNP G6244A與血漿AGT濃度升高有關(guān)，此多態(tài)可能參與高加索人群高血壓的發(fā)生。
7.噻嗪化物敏感的Na+-Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(thiazide-sensitive Na+，Cl--cotransporter，TSC)基因目前發(fā)現(xiàn)主要存在C1784T及G2736A等多態(tài)性。其中C1784T位于第1內(nèi)含子，本身不影響TSC的功能，也未發(fā)現(xiàn)其上游啟動子區(qū)有相關(guān)連鎖功能基因存在。G2736A位于細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的C末端，其出現(xiàn)的Arg→Gln的替換導(dǎo)致陽離子蛋白向陰離子蛋白的轉(zhuǎn)變而影響功能。Matsuo等[Matsuo A，Katsuya T，Ishikawa K，et al.G2736Apolymorphism of thiazide-sensitive Na-Cl cotransporter gene predisposes tohypertension in young women.Hypertension，2004，222123-2127]研究發(fā)現(xiàn)在日本婦女中TSC基因的G2736A多態(tài)性是高血壓的一個遺傳易感因子，可能是由于2736A等位基因攜帶者易導(dǎo)致體內(nèi)雌激素水平升高，從而加劇此類女性鈉水潴留而發(fā)生高血壓及容量負(fù)荷增加誘發(fā)充血性心力衰竭。
目前對高血壓等心腦血管疾病的藥物治療僅是經(jīng)驗性對癥治療，而相同的藥物，不同的種族和個體患者對藥物的反應(yīng)、藥物副作用以及藥物在體內(nèi)的代謝，都存在明顯的個體差異，因此個體化用藥越來越受到重視。但是，由于心腦血管疾病相關(guān)基因的高度多態(tài)性，每個基因所涉及的遺傳變異在幾十至幾百不等，顯然傳統(tǒng)的檢測方法因通量水平低，難以應(yīng)用于個性化醫(yī)療中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)檢測芯片，能有效檢測心腦血管疾病相關(guān)基因的多態(tài)性，輔助醫(yī)生及時找到治療包括高血壓的心腦血管疾病的正確用藥方案。為此，本發(fā)明還要提供應(yīng)用該芯片檢測心腦血管疾病相關(guān)基因多態(tài)性的方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)檢測芯片，包括固相載體和探針，所述探針與待測的心腦血管疾病藥物遺傳學(xué)相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。
本發(fā)明中所述固相載體可選用領(lǐng)域周知的載體，只要所述載體與所述反應(yīng)物相容，不會影響檢測結(jié)果就可以。優(yōu)選的，本發(fā)明所述固相載體選材為玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的任意組合。
所述待測心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)相關(guān)基因包括ACE、AGT、AT1R、CYP11B2、ADRB1、ADRB2、GNB3、eNOS、ADD1、IRS1和TSC基因。
所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要能完成與目的核苷酸序列特異性結(jié)合。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長度以15-25個堿基對之間的為最佳。所述探針的自身互補(bǔ)序列最好少于6個堿基對，以免影響雜交效率。
本發(fā)明檢測芯片的探針為DNA，包括(1)與待測ACE基因雜交的(a)SEQ ID NO1～SEQ ID NO3所示序列，(b)SEQ ID NO1～SEQ ID NO3所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO1～SEQ ID NO3所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(2)與待測AGT基因雜交的(a)SEQ ID NO4～SEQ ID NO15所示序列，(b)SEQ IDNO4～SEQ ID NO15所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO4～SEQ ID NO15所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(3)與待測AT1R基因雜交的(a)SEQ ID NO16～SEQ ID NO21所示序列，(b)SEQID NO16～SEQ ID NO21所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO16～SEQID NO21所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(4)與待測CYP11B2基因雜交的(a)SEQ ID NO22～SEQ ID NO24所示序列，(b)SEQID NO22～SEQ ID NO24所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO22～SEQID NO24所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(5)與待測ADRB1基因雜交的(a)SEQ ID NO25～SEQ ID NO30所示序列，(b)SEQID NO25～SEQ ID NO30所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO25～SEQID NO30所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(6)與待測ADRB2基因雜交的(a)SEQ ID NO31～SEQ ID NO36所示序列，(b)SEQID NO31～SEQ ID NO36所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO31～SEQID NO36所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(7)與待測GNB3基因雜交的(a)SEQ ID NO37～SEQ ID NO39所示序列，(b)SEQID NO37～SEQ ID NO39所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO37～SEQID NO39所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(8)與待測eNOS基因雜交的(a)SEQ ID NO40～SEQ ID NO42所示序列，(b)SEQID NO40～SEQ ID NO42所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO40～SEQID NO42所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(9)與待測ADD1基因雜交的(a)SEQ ID NO43～SEQID NO45所示序列，(b)SEQID NO43～SEQ ID NO45所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO43～SEQID NO45所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(10)與待測IRS1基因雜交的(a)SEQ ID NO46～SEQ ID NO48所示序列，(b)SEQID NO46～SEQ ID NO48所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO46～SEQID NO48所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(11)與待測TSC基因雜交的(a)SEQ ID NO49～SEQ ID NO54所示序列，(b)SEQID NO49～SEQ ID NO54所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO49～SEQID NO54所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列。
優(yōu)選的，本發(fā)明檢測芯片的探針選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO54所示序列。
所述探針序列可包含1～10個錯配堿基，較佳地，可包含1～5個錯配堿基，更佳地，可包含1～2個錯配堿基。
本發(fā)明檢測芯片還包括至少一種對照探針，所述對照探針選自陰性對照探針、陽性對照探針、雜交對照探針和固定化對照探針。
所述探針可通過連接臂固定于固相載體上。連接臂可以為探針形成雙鏈的部分提供一個自由的空間以減少空間位阻，有助于雜交反應(yīng)的進(jìn)行[Afanassiev V，HanemannV，Wolfl S.Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slidescoated with an agarose film.Nucleic Acids Res.2000，28e66；USA Patent No.5556752]。連接臂越長，雜交效率越高。典型的連接臂包括15～30個功能基團(tuán)長度。連接臂可以選用適當(dāng)形式的功能基團(tuán)，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇與Poly T(A、C或G)的嵌合體、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其組合物。
所述探針或連接臂通過連接分子固定于固相載體上。探針固定到載體上可以通過C-C鍵實現(xiàn)，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷鍵(玻璃或二氧化硅作支持物時使用)。硅氧烷鍵鍵合可以通過支持物和連接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基團(tuán)反應(yīng)完成。氨基烷基硅烷、輕基烷基硅烷、2一輕乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、輕乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或輕丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基團(tuán)。
所述探針可以被修飾，修飾方法可以是5’-NH2修飾、5’-SH修飾、5’-Poly T(A、C或G)修飾、5’-生物素修飾、3’-NH2修飾、3’-SH修飾、3’-Poly T(A、C或G)修飾和3’-生物素修飾等。
所述探針可以有一條或幾條，甚至全部都是經(jīng)過標(biāo)記的，所述標(biāo)記包括熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記、酶標(biāo)記和熒光共振能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種應(yīng)用上述芯片對心腦血管疾病進(jìn)行藥物遺傳學(xué)檢測的方法，包括如下步驟(1)在固相載體表面點載與待測心腦血管疾病相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交的探針；(2)抽提待測樣品的核酸；(3)制備待測心腦血管疾病藥物遺傳學(xué)相關(guān)基因的目的核苷酸序列；
(4)標(biāo)記步驟(3)的目的核苷酸序列；(5)在適于與步驟(1)所述的點載在固相載體上的探針進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的目的核苷酸序列，并使其反應(yīng)足夠時間；(6)檢測雜交反應(yīng)的結(jié)果。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種應(yīng)用上述芯片對心腦血管疾病進(jìn)行藥物遺傳學(xué)檢測的方法，包括如下步驟(1)標(biāo)記與待測心腦血管疾病藥物遺傳學(xué)相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交的探針；(2)抽提待測樣品的核酸；(3)制備待測心腦血管疾病藥物遺傳學(xué)相關(guān)基因的目的核苷酸序列；(4)在固相載體表面點載步驟(3)所述的目的核苷酸序列；(5)在適于與步驟(4)所述的點載在固相載體上的目的核苷酸序列進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的探針，并使其反應(yīng)足夠時間；(6)檢測雜交反應(yīng)的結(jié)果。
所述目的核苷酸序列的制備可包括擴(kuò)增的步驟，用分離的靶樣本中含核酸的細(xì)胞直接擴(kuò)增，也可用抽提的靶核酸直接擴(kuò)增。如用磁珠從全血中分離白細(xì)胞，直接用分離的白細(xì)胞或用全血抽提的核酸作模板，擴(kuò)增目的核酸序列。擴(kuò)增得到的單鏈或雙鏈的DNA或RNA可含有熒光或生物素標(biāo)記，標(biāo)記的DNA或RNA可不經(jīng)純化直接用于雜交。與本發(fā)明中所述芯片雜交的優(yōu)選靶核苷酸分子是單鏈核酸分子，雙鏈核酸分子經(jīng)過變性等處理后也于本發(fā)明所述芯片雜交。
目的核苷酸序列可使用任何適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法進(jìn)行富集，如聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，多重PCR，連接酶鏈反應(yīng)(ligase chainreaction，LCR)，滾環(huán)擴(kuò)增(rolling cycle amplification，RCA)，基于核酸序列的擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，鏈置換擴(kuò)增(stranddisplacement amplification，SDA)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(transcription medicatedamplification，TMA)等。
在本發(fā)明的一個實施例中，目的核苷酸序列的制備采用PCR擴(kuò)增方法，該方法所用引物含有SEQ ID NO55～SEQ ID NO80所示序列的核苷酸鏈或其互補(bǔ)鏈。
所述探針或目的核苷酸序列都適合用于標(biāo)記。探針在合成引入標(biāo)記，目的核苷酸序列可以在擴(kuò)增中引入標(biāo)記，或者擴(kuò)增后用合適的方法引入標(biāo)記。
合適的標(biāo)記包括熒光標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記、發(fā)色團(tuán)、發(fā)光體、FRET、酶、生物素或有特殊結(jié)合配體的配基。
本發(fā)明方法的雜交可在任何適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行，如25℃～65℃，所述雜交時間為2分鐘～18小時。可以改變雜交條件以提高或降低雜交的嚴(yán)謹(jǐn)程度、雜交特異性。
本發(fā)明心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)檢測芯片及其應(yīng)用，使醫(yī)務(wù)人員及時掌握高血壓等心腦血管疾病患者大量遺傳信息，并指導(dǎo)其合理用藥，實現(xiàn)個體化醫(yī)療，提高治療的有效性和減少藥物的毒副作用。對于醫(yī)藥企業(yè)，本發(fā)明的檢測芯片可使其選擇合適的臨床試驗人群，從而提高藥物療效，降低藥物的無效率和毒副作用，縮短藥物的研發(fā)周期。


圖1是本發(fā)明的實施例1中多重PCR擴(kuò)增后的電泳檢測結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明的實施例1中PCR產(chǎn)物片段化后的電泳檢測結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明實施例1的心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)檢測芯片的雜交結(jié)果圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
實施例1 反向雜交1.基因芯片的制備(1)探針溶解將SEQ ID NO1～SEQ ID NO54所示序列探針的每條探針用TE溶液稀釋，終濃度為10mM。將濃度為10mM的探針與濃度為200mM的PBS溶液于384孔板中等體積混合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心，-20℃保存，以備點樣使用。
(2)點樣將預(yù)先設(shè)計并合成好的探針通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片、硅片等材質(zhì)的固相載體片基上。片基采用Cell Associates CSS-100醛基片基，(GeneMachine公司的Ominigrid 100型號的點樣儀，在濕度65-75％(以FullMoon片基為準(zhǔn))，溫度為25℃的條件下點樣，點樣完畢后，放置半小時后，將芯片取出，室溫干燥保存。
2.待測樣品的處理和標(biāo)記
(1)人基因組DNA抽提及目的基因的擴(kuò)增采用FlexiGene DNA Kit(250)(QIAGEN，Cat.No.51206)試劑盒抽提人外周血中基因組DNA。取1ul進(jìn)行電泳(1％瓊脂糖凝膠，0.5×TBE，EB，80MV，1.5小時電泳)，在FR-200紫外與可見分析裝置上拍攝照片，并對照marker(LambdaDNA/EcoRI+HindIII)進(jìn)行定量。
用ACE的引物(SEQ ID NO55、56)、AGT的引物(SEQ ID NO57、58)、AT1R的引物(SEQ ID NO59、60)、CYP11B2的引物(SEQ ID NO61、62)、ADRB1的引物(SEQID NO63～66)、ADRB2的引物(SEQ ID NO67、68)、GNB3的引物(SEQ ID NO69、70)、eNOS的引物(SEQ ID NO71、72)、ADD1的引物(SEQ ID NO73、74)、IRS1的引物(SEQ ID NO75、76)和TSC的引物(SEQ ID NO77～80)進(jìn)行目的核苷酸序列的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增用30μl反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)體系是0.3mM dNTP、10mM Tri s-HCl、50mM KCl、2mM MgCl2、20％ Q solution(Qiagen)、上游和下游引物的濃度0.16μM、基因組DNA 10ng，Taq酶0.6U(Takara)。應(yīng)用Touch-down PCR反應(yīng)程序[Don RH，CoxPT，Wainwright BJ，Baker K，Mattick JS.’Touchdown’PCR to circumvent spuriouspriming during gene amplification.Nucleic Acids Res.1991，194008]94℃變性5min；94℃變性40s，64℃退火1min，每個循環(huán)降低0.5℃，72℃延伸50s，共10個循環(huán)；然后94℃變性40s，59℃退火40s，72℃延伸50s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR結(jié)束后用1.5％瓊脂糖凝膠檢測擴(kuò)增結(jié)果。
當(dāng)進(jìn)行多重PCR反應(yīng)時，將SEQ ID NO55～SEQ ID NO80所示序列的引物放入一個反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，體系為50μl。多重PCR的反應(yīng)體系為每種dNTP 0.3μmol/L，Tricine-KOH(PH8.7)40mmol/L，KCl 16mmol/L，MgCl23.5mmol/L，BSA 3.75μg/ml，每條引物2μmol/L，DNA 80ng和2.2×Titanium Taq DNA聚合酶(Clontech，USA)。多重PCR反應(yīng)條件95℃變性3min；95℃變性30s，66℃退火2min，68℃延伸4min，共40個循環(huán)；最后68℃延長10min。PCR擴(kuò)增后，取3μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見圖1。這些PCR產(chǎn)物經(jīng)處理后可用于下面的雜交步驟。
(2)PCR產(chǎn)物純化和片段化每個樣品的所有PCR產(chǎn)物混合，用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)純化。純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)測定濃度后，用DNase I進(jìn)行片段化。片段化的反應(yīng)體系包括30μl純化PCR產(chǎn)物(10μg)，4μl的10×DNase I緩沖液，0.12μl的DNase I，5.88μl的ddH2O。反應(yīng)條件為37℃溫浴5min，然后95℃ 15min。片段化后的產(chǎn)物跑4％瓊脂糖凝膠，保證絕大多數(shù)的片段處于30-200個堿基對，電泳檢測結(jié)果如圖2所示。
(3)熒光素標(biāo)記利用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在3’末端進(jìn)行熒光素標(biāo)記，標(biāo)記的40μl反應(yīng)體系包括25μl片段化PCR產(chǎn)物，8μl的5×脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶緩沖液，1μl的CY3-N6-ddCTP(1mM)，3μl的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(20U/μl)，3μl的ddH2O。反應(yīng)條件為37℃溫浴120min，然后95℃加熱15min。
3.雜交、洗滌和結(jié)果檢測熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物95℃變性10min，立即置于冰上，用于雜交，雜交反應(yīng)20μl體系包括熒光素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物15μl，20×SSPE 1.2μl，1％ Triton 0.2μl，10×Denhandts 0.9μl，甲酰胺0.5μl，ddH2O 2.2μl。反應(yīng)條件為48℃溫浴120min，然后相繼用1×洗滌緩沖液I(5×SSC，0.1％ SDS)、1×洗滌緩沖液II(2×SSC，0.1％ SDS)和1×洗滌緩沖液III(1×SSC)在42℃各洗滌10min，最后用ddH2O洗滌0.5min。
洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀進(jìn)行掃描(也可以用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到的雜交結(jié)果如圖3所示，再用GenePix Pro處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析就可以得到心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)結(jié)果，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)生為患者選擇合適的藥物和合理的劑量。
實施例2 正向雜交1.心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)相關(guān)基因的擴(kuò)增和芯片制備用ACE的引物(SEQ ID NO55、56)、AGT的引物(SEQ ID NO57、58)、AT1R的引物(SEQ ID NO59、60)、CYP11B2的引物(SEQ ID NO61、62)、ADRB1的引物(SEQID NO63～66)、ADRB2的引物(SEQ ID NO67、68)、GNB3的引物(SEQ ID NO69、70)、eNOS的引物(SEQID NO71、72)、ADD1的引物(SEQ ID NO73、74)、IRS1的引物(SEQ ID NO75、76)和TSC的引物(SEQ ID NO77～80)擴(kuò)增基因。PCR擴(kuò)增用100μl反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)體系是0.3mM dNTP，10mM Tris-HCl，50mM KCl，2mM MgCl2，20％ Q solution(Qiagen)，0.01μM SHV-F，0.2μM SHV-R，100ng基因組DNA，3U Ex Taq酶(Takara)。循環(huán)參數(shù)94℃變性5min；94℃變性40s，65℃退火1min，72℃延伸1min，共40個循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)純化。將純化的PCR產(chǎn)物濃度調(diào)整至400ng/μl。
將濃度為400ng/μl的PCR產(chǎn)物與100％的DMSO于384孔板中等體積混合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心。將200ng/μl的PCR產(chǎn)物通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片、硅片等材質(zhì)的固相載體片基上。采用GeneMachine公司的Ominigrid 100型號的點樣儀，在濕度65-75％(以FullMoon片基為準(zhǔn))，溫度為25℃的條件下點樣，點樣完畢放置半小時后，將芯片放于飽和食鹽水盒中，37℃水化過夜，次日取出，600mJ交聯(lián)，交聯(lián)完畢之芯片即可使用。
2.芯片雜交雜交反應(yīng)體系包括2nM熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針(SEQ ID NO1～SEQ ID NO54)，1.2μl 20×SSPE，0.2μl 1％ Triton，0.9μl 10×Denhandts，0.5μl甲酰胺，2.2μl ddH2O。反應(yīng)條件為50℃溫浴2小時，然后相繼用1×洗滌緩沖液I(5×SSC，0.1％ SDS)、1×洗滌緩沖液II(2×SSC，0.1％ SDS)和1×洗滌緩沖液III(1×SSC)在42℃各洗滌10min，最后用ddH2O洗滌10秒。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，用GenePix4000B共聚焦激光掃描儀進(jìn)行掃描(也可以用其他的激光掃描儀)。
序列表<110>上海生物芯片有限公司<120>心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)檢測芯片及其應(yīng)用<130>NP-07-11240<160>80<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1tgctgggatt acaggcgt 18<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2ctgctgccta tacagtcact t 21<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3ctgctgccac agtcactt 18<210>4<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>4cctgcaccgg ctcact16<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>5cctgcaccag ctcactc 17<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>6cctgcacctg ctcactc 17<210>7<211>15
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<221>misc_feature<223>引物<400>69ctgacccact tgccacccgt20<210>70<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>70ccttacccac acgctcagac tt 22<210>71<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>71catgaggctc agccccagaa c 21<210>72<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>72cagtcaatcc ctttggtgct cac23<210>73<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>73ctagtgacgg tgattcgggc a 21<210>74<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>74agagactgca gcaagggttt cac23<210>75<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>75aaaggtggac acagctgctc a 21<210>76<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>76gggacaactc atctgcatgg t 21<210>77<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>77gcgcagtggt gcaggtcagt20<210>78<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>78agtcagagct gagcctggat g 21<210>79<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>79gtccacatcc tccctgacat caa23<210>80<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>80gaacctgcca ttggtcactg cta2權(quán)利要求
1.一種心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)檢測芯片，包括固相載體和探針，其特征在于，所述探針與待測心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測芯片，其特征在于，所述待測心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)相關(guān)基因包括ACE、AGT、AT1R、CYP11B2、ADRB1、ADRB2、GNB3、eNOS、ADD1、IRS1和TSC基因。
3.如權(quán)利要求1或2所述的檢測芯片，其特征在于，所述探針為DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其衍生物。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測芯片，其特征在于，所述探針為DNA，包括(1)與待測ACE基因雜交的(a)SEQ ID NO1～SEQ ID NO3所示序列，(b)SEQ IDNO1～SEQ ID NO3所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO1～SEQ ID NO3所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(2)與待測AGT基因雜交的(a)SEQ ID NO4～SEQ ID NO15所示序列，(b)SEQ IDNO4～SEQ ID NO15所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO4～SEQ ID NO15所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(3)與待測AT1R基因雜交的(a)SEQ ID NO16～SEQ ID NO21所示序列，(b)SEQID NO16～SEQ ID NO21所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO16～SEQID NO21所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(4)與待測CYP11B2基因雜交的(a)SEQ ID NO22～SEQ ID NO24所示序列，(b)SEQID NO22～SEQ ID NO24所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO22～SEQID NO24所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(5)與待測ADRB1基因雜交的(a)SEQ ID NO25～SEQ ID NO30所示序列，(b)SEQID NO25～SEQ ID NO30所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO25～SEQID NO30所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(6)與待測ADRB2基因雜交的(a)SEQ ID NO31～SEQ ID NO36所示序列，(b)SEQID NO31～SEQ ID NO36所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO31～SEQID NO36所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(7)與待測GNB3基因雜交的(a)SEQ ID NO37～SEQ ID NO39所示序列，(b)SEQID NO37～SEQ ID NO39所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO37～SEQID NO39所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(8)與待測eNOS基因雜交的(a)SEQ ID NO40～SEQ ID NO42所示序列，(b)SEQID NO40～SEQ ID NO42所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO40～SEQID NO42所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(9)與待測ADD1基因雜交的(a)SEQ ID NO43～SEQ ID NO45所示序列，(b)SEQID NO43～SEQ ID NO45所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO43～SEQID NO45所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(10)與待測IRS1基因雜交的(a)SEQ ID NO46～SEQ ID NO48所示序列，(b)SEQID NO46～SEQ ID NO48所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO46～SEQID NO48所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(11)與待測TSC基因雜交的(a)SEQ ID NO49～SEQ ID NO54所示序列，(b)SEQID NO49～SEQ ID NO54所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO49～SEQID NO54所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測芯片，其特征在于，所述探針選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO54所示序列。
6.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述芯片對心腦血管疾病進(jìn)行藥物遺傳學(xué)檢測的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)在固相載體表面點載權(quán)利要求1所述的探針；(2)抽提待測樣品的核酸；(3)制備待測的心腦血管疾病藥物遺傳學(xué)相關(guān)基因的目的核苷酸序列；(4)標(biāo)記步驟(3)的目的核苷酸序列；(5)在適于與步驟(1)所述的點載在固相載體上的探針進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的目的核苷酸序列，并使其反應(yīng)足夠時間；(6)檢測雜交反應(yīng)的結(jié)果。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述目的核苷酸序列的標(biāo)記采用包括熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記或酶標(biāo)記。
8.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述芯片對心腦血管疾病進(jìn)行藥物遺傳學(xué)檢測的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)標(biāo)記權(quán)利要求1所述的探針；(2)抽提待測樣品的核酸；(3)制備待測的心腦血管疾病藥物遺傳學(xué)相關(guān)基因的目的核苷酸序列；(4)在固相載體表面點載步驟(3)所述的目的核苷酸序列；(5)在適于與步驟(4)所述的點載在固相載體上的目的核苷酸序列進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的探針，并使其反應(yīng)足夠時間；(6)檢測雜交反應(yīng)的結(jié)果。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述的探針標(biāo)記采用包括熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、熒光共振能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記或酶標(biāo)記。
10.如權(quán)利要求6或8所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)的目的核苷酸序列的制備包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)，該反應(yīng)所用引物含有SEQ ID NO55～SEQ ID NO80所示序列的核苷酸鏈或其互補(bǔ)鏈。
11.如權(quán)利要求6或8所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中的雜交溫度為25℃～65℃，雜交時間為2分鐘～18小時。
12.權(quán)利要求1所述的檢測芯片在指導(dǎo)心腦血管疾病患者合理用藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因多態(tài)性檢測芯片，公開了一種心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)檢測芯片，包括固相載體和探針，所述探針與待測心腦血管疾病的藥物遺傳學(xué)相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。本發(fā)明還公開了應(yīng)用所述芯片對心腦血管疾病進(jìn)行藥物遺傳學(xué)檢測的方法。本發(fā)明的檢測芯片能使醫(yī)務(wù)人員及時掌握高血壓等心腦血管疾病患者的遺傳信息，并指導(dǎo)其合理用藥，實現(xiàn)個體化醫(yī)療。
文檔編號C12N15/11GK101067152SQ20071003718
公開日2007年11月7日 申請日期2007年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日
發(fā)明者盛海輝, 姜瀟, 占伊揚(yáng), 肖華勝 申請人:上海生物芯片有限公司, 江蘇省人民醫(yī)院