專(zhuān)利名稱(chēng)：自作用信號(hào)產(chǎn)生檢測(cè)設(shè)備和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
在下文中，將為闡述背景和介紹引言而描述某些主題。本文所包含的內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的“認(rèn)可”。必要并適當(dāng)時(shí)，申請(qǐng)人明確表示保留證明本文所引用的任何主題在美國(guó)法典第35篇適用的法律規(guī)定下不構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)的權(quán)利。本發(fā)明涉及用于分析物檢測(cè)的新設(shè)備和方法。實(shí)施方案可廣泛用于各領(lǐng)域，包括， 特別是，體外診斷、臨床醫(yī)學(xué)、發(fā)育醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、藥物遺傳學(xué)、國(guó)家安全、軍事/防御、農(nóng)業(yè)化學(xué)、工業(yè)化學(xué)、化妝品、飲食補(bǔ)充劑、基因組學(xué)、毒理學(xué)、代謝組學(xué)、治療學(xué)、應(yīng)急響應(yīng)、整體醫(yī)學(xué)、順勢(shì)療法、基因篩選和通常的產(chǎn)品質(zhì)量保證。目前對(duì)新的、改進(jìn)檢測(cè)方法的需要和要求仍不斷增加，這些方法應(yīng)表現(xiàn)出，例如， 下述一種或多種性質(zhì)(i)精確性，( )高選擇性(即，能正確區(qū)分可能的靶標(biāo)物分子，背景低并且結(jié)果錯(cuò)誤率低-假陽(yáng)性或假陰性)，(iii)高靈敏度，(iv)測(cè)量快速，(ν)易適用于目的靶標(biāo)物，(Vi)成本經(jīng)濟(jì)并且，可選地，(Vii)能便攜式(即，野外)使用。本發(fā)明滿(mǎn)足了上述所有要求，并滿(mǎn)足了檢測(cè)技術(shù)中長(zhǎng)期以來(lái)未能滿(mǎn)足的需要。除了通常對(duì)精確、可靠和靈敏的測(cè)試方法和設(shè)備的需求外，近來(lái)在中國(guó)制造的醫(yī)療和健康護(hù)理相關(guān)產(chǎn)品中出現(xiàn)的質(zhì)量問(wèn)題使對(duì)更高質(zhì)量保證診斷的需要更加迫切。本發(fā)明特別滿(mǎn)足了所有這些標(biāo)準(zhǔn)。為了介紹背景，下文對(duì)各種技術(shù)進(jìn)行討論，幫助理解本發(fā)明的發(fā)展背景。標(biāo)題不意欲限制、包括或排除任何特定的主題，僅用于幫助讀者理解。相關(guān)領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于檢測(cè)較大體量靶標(biāo)物物質(zhì)的材料、設(shè)備、系統(tǒng)和方法。體量或樣品可以是液體或干燥的，但是最終要放置在液體測(cè)試環(huán)境中。本文公開(kāi)和要求權(quán)利的發(fā)明特別適用于檢測(cè)雖以極小濃度存在但必須檢測(cè)的靶標(biāo)物。以初始并且低濃度存在的各種靶標(biāo)物的檢測(cè)，如抗體、孢子、細(xì)菌等，使得可以實(shí)施在延遲檢測(cè)時(shí)不可行的預(yù)防或治療策略。本發(fā)明具有各種成熟檢測(cè)分析方法和試劑的背景，如下所討論。
背景技術(shù)：
ELISA 方法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)是一種廣泛用于測(cè)量流體如血清或尿液中特定分子 (例如，激素或藥物)的濃度的方法。Engvall和Perlman首先在1971年描述了 ELISA方法。盡管表現(xiàn)出了各種缺點(diǎn)和缺陷，但是ELISA方法一直并且繼續(xù)得到了廣泛應(yīng)用。常用的ELISA類(lèi)方法的實(shí)例是所謂的家庭驗(yàn)孕測(cè)試，其作為示例，通常由手持型塑料罩、用包括比色酶系統(tǒng)的一種或多種試劑浸漬的吸附材料組成。尿液可以直接用于設(shè)備，并且液體沿著吸附材料流進(jìn)已知為“側(cè)流”的結(jié)構(gòu)中。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利No. 4，703，017,4, 855，240、 5，356，785,5，468，648,5，656，503,5，766，961,5，837，546,5，989，921,6，475，805, 6，713，308,6, 844，200,7, 045，342,7, 144，742，上述每篇文獻(xiàn)均通過(guò)引用全部并入本文。通過(guò)已經(jīng)“針對(duì)”靶標(biāo)物產(chǎn)生的抗體，即靶標(biāo)物是抗體的抗原，檢測(cè)靶標(biāo)分析物(例如，驗(yàn)孕測(cè)試中的人絨毛促性腺激素(HCG))?？贵w起到固定化靶標(biāo)分析物的作用(如果有的話(huà))，并由此起到酶聯(lián)比色系統(tǒng)的作用。多克隆抗體將識(shí)別并結(jié)合不止一個(gè)表位。單克隆抗體常用于這種免疫分析應(yīng)用中。單克隆抗體經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)，只識(shí)別一個(gè)特定的抗原決定簇或表位，即，與一個(gè)特定的抗原決定簇或表位反應(yīng)或結(jié)合。由于免疫系統(tǒng)和由免疫系統(tǒng)的永生細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體的多樣性(1975年首次由Kohler和Milstein描述(Kohler和Milstein，1975))， 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的免疫技術(shù)可以針對(duì)大量不同抗原而產(chǎn)生抗體。任何試劑都可能由不與其它任何試劑反應(yīng)的特定抗體識(shí)別。ELISA常如下用于實(shí)驗(yàn)室中，用對(duì)待檢測(cè)的特定抗原例如病毒或細(xì)菌有特異性的抗體涂覆容器，比如微孔板，加入疑似包含特定抗原或試劑的樣品，使抗體與抗原結(jié)合，然后加入至少一種其它對(duì)待檢測(cè)的相同試劑的其它區(qū)域有特異性的抗體。使用兩種抗體的方法稱(chēng)作“三明治” ELISA。通常地，使用由顯色或熒光報(bào)告分子標(biāo)記的二抗或者甚至三抗輔助檢測(cè)。過(guò)程包括使用共軛結(jié)合抗體的酶產(chǎn)生可見(jiàn)信號(hào)所需的化學(xué)底物。在各項(xiàng)缺點(diǎn)中，需要多種抗體(不能與其它試劑交叉反應(yīng))，和涉及的溫育步驟意味著很難在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)樣品中的不止一種試劑。此外，多路能力(即，同時(shí)嘗試檢測(cè)一個(gè)樣品中的多個(gè)試劑)受到了能附著于抗體并由此用于區(qū)分不同試劑的標(biāo)記數(shù)目的限制。由產(chǎn)生多種抗體的能力和擁有足夠水平的靶標(biāo)分析物而產(chǎn)生精確并可重復(fù)的樣品而出現(xiàn)了靈敏度問(wèn)題。例如，在驗(yàn)孕測(cè)試中，陰性測(cè)試并不意味著個(gè)體沒(méi)有懷孕，而事實(shí)上，建議個(gè)體在幾周的時(shí)間內(nèi)重復(fù)進(jìn)行測(cè)試，使HCG水平可以到達(dá)ELISA測(cè)試檢測(cè)的閾值。核酸檢測(cè)方法另一種常用的檢測(cè)方法將重點(diǎn)放在檢測(cè)核酸存在和/或核酸的鑒定上。已有幾種檢測(cè)核酸的方法可以使用，包括各種PCR和雜交技術(shù)。PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))在本領(lǐng)域中公知，并且在例如分別屬于Mullis和Mullis 等人的美國(guó)專(zhuān)利No. 4，683，195和4，683，202中描述。PCR用于低水平特定核酸序列的擴(kuò)增和檢測(cè)。PCR可用來(lái)增加低濃度的靶標(biāo)物核酸以獲得更易于檢測(cè)的水平。通常而言，PCR 需要引入過(guò)量的兩個(gè)寡核苷酸引物，其與期望的雙鏈靶序列的兩條鏈上的序列互補(bǔ)。將疑似包含靶序列的樣品加熱和/或進(jìn)行其它處理，使樣品中存在的任何雙鏈DNA序列變性，然后在存在寡核苷酸引物的條件下冷卻，使引物雜交。雜交后，用聚合酶延伸引物，從而形成互補(bǔ)鏈。變性、雜交和聚合酶延伸的步驟可以按需要重復(fù)，以獲得相對(duì)較高濃度的部分期望靶序列。這種技術(shù)的變體是連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，或LCR，其使用可在每個(gè)循環(huán)過(guò)程中連接在一起的多核苷酸。存在其它變體，但是只有PCR得到廣泛接受。PCR需要實(shí)驗(yàn)室條件和設(shè)備， 以及受到良好訓(xùn)練的人員。它不適于野外使用，并且只適用于核酸靶標(biāo)物。PCR經(jīng)常受到非靶序列的非特異性擴(kuò)增的困擾。核酸雜交技術(shù)常需要檢測(cè)兩個(gè)或多個(gè)核酸分子的雜交。這種檢測(cè)可以以各種方式實(shí)現(xiàn)，包括標(biāo)記核酸分子并觀(guān)察由標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)。通過(guò)使用放射活性標(biāo)記而開(kāi)發(fā)了包括例如Northern和Southern印跡在內(nèi)的傳統(tǒng)雜交方法，這些方法不適于自動(dòng)化操作。在大多數(shù)雜交技術(shù)中，放射活性標(biāo)記已經(jīng)大量由熒光標(biāo)記所取代。其它雜交技術(shù)的代表形式包括,例如,“循環(huán)探針?lè)磻?yīng)”、分支DNA方法、Invader 分析CThird Wave Technologies, Inc ； Madison WI),禾口 Hybrid Capture (Digene Corporation ；Gaithersburg MD)。通常，基于熒光的檢測(cè)系統(tǒng)全部受到由偶發(fā)、瞬時(shí)或其它光源引起的背景問(wèn)題的困擾。此外，核酸檢測(cè)技術(shù)局限于檢測(cè)核酸。因此，不包含核酸的試劑如蛋白質(zhì)、藥物、激素、化學(xué)毒素和朊，不能由這些核酸雜交技術(shù)檢測(cè)。生物傳感器通常將生物傳感器定義為包含生物和化學(xué)傳感元件的分析設(shè)備，其與適于將生物相互作用轉(zhuǎn)化成電子信號(hào)的電路整合。生物傳感器的代表性實(shí)例是糖尿病護(hù)理中常用的葡萄糖監(jiān)控設(shè)備。生物傳感器包括多種機(jī)制和形式。相對(duì)常見(jiàn)但不是通用的生物傳感器的特色是使用酶。在這種生物傳感器中，典型的結(jié)構(gòu)包括使用與兩個(gè)電極相連的酶系統(tǒng)，所述電極由膜載體分隔開(kāi)，其中酶系統(tǒng)對(duì)于意欲檢測(cè)的靶標(biāo)物具有特異性(例如，用于檢測(cè)葡萄糖的葡萄糖氧化酶)，并且酶-底物相互作用由此可提供分析方法，檢測(cè)酶的底物。無(wú)線(xiàn)射頻識(shí)別(RFID)無(wú)線(xiàn)射頻識(shí)別(RFID)是一種識(shí)別方法，部分依賴(lài)于使用常稱(chēng)作RFID標(biāo)簽(或發(fā)射機(jī)應(yīng)答器)的設(shè)備儲(chǔ)存并遠(yuǎn)程獲取數(shù)據(jù)。RFID系統(tǒng)通常由多個(gè)組件組成，包括標(biāo)簽、手持式或靜止閱讀器、數(shù)據(jù)輸入單元和系統(tǒng)軟件。RFID提供自動(dòng)(或可自動(dòng)的)方式快速輕松地收集產(chǎn)品、地點(diǎn)、時(shí)間或交易的相關(guān)信息，并且不包括人為錯(cuò)誤的某些因素。RFID提供非接觸式數(shù)據(jù)鏈接，無(wú)需直接看到數(shù)據(jù)，并且相對(duì)地可免除噪音刺耳或骯臟的環(huán)境，這些環(huán)境限制了其它自動(dòng)化ID技術(shù)如條形碼的應(yīng)用。此外，RFID可以提供不止一種識(shí)別設(shè)備。RFID 標(biāo)簽可以用作數(shù)據(jù)載體，信息可以寫(xiě)在標(biāo)簽上并實(shí)時(shí)在標(biāo)簽上更新。常用的RFID標(biāo)簽有各種形狀、尺寸和閱讀范圍，通常以可以附著、并入或者關(guān)聯(lián)產(chǎn)品、動(dòng)物或人的方式/形式配置以追蹤并識(shí)別。代表性的標(biāo)簽包括薄且柔韌的“智能標(biāo)記”，能夾在紙張或塑料之間，以及包含硅芯片的基于芯片的RFID標(biāo)簽，并且經(jīng)常有天線(xiàn)，能接受和/或發(fā)射無(wú)線(xiàn)電波。所謂的被動(dòng)RFID標(biāo)簽無(wú)需內(nèi)部電源，而是由從“閱讀器”發(fā)射的無(wú)線(xiàn)電波獲得能量。所謂的主動(dòng)RFID標(biāo)簽需要內(nèi)部電源。標(biāo)簽還可以是“半主動(dòng)”的—— 依賴(lài)于內(nèi)部和外部電源實(shí)現(xiàn)正確的功能。RFID已經(jīng)用于各個(gè)行業(yè)的多種應(yīng)用。今天，RFID用于如交通和設(shè)備訪(fǎng)問(wèn)控制、汽車(chē)安全(例如，防盜)系統(tǒng)、產(chǎn)品和資產(chǎn)跟蹤，和供應(yīng)鏈自動(dòng)化的應(yīng)用。其它應(yīng)用包括支付和忠誠(chéng)管理、運(yùn)動(dòng)計(jì)時(shí)、寵物和家畜鑒別、認(rèn)證和文檔管理。美國(guó)專(zhuān)利No. 7，241,沈6，公開(kāi)了使用RFID技術(shù)形式的生物傳感器設(shè)備，其通過(guò)嵌入肌肉組織中的電活性聚合物產(chǎn)生裝置為RFID提供能量。與RFID有關(guān)的相關(guān)術(shù)語(yǔ)/概念包括主動(dòng)標(biāo)簽。包含電池和發(fā)射器的RFID標(biāo)簽，可向RFID閱讀器發(fā)送信息，而不是從標(biāo)簽將信號(hào)反射回閱讀器(如被動(dòng)標(biāo)簽)。靈敏讀寫(xiě)器。RFID閱讀器，能以不同頻率或不同交流方案閱讀標(biāo)簽。
空中接口協(xié)議。控制RFID標(biāo)簽和閱讀器如何交流的標(biāo)準(zhǔn)。防沖突。防沖突算法用于在由相同的RFID閱讀器同時(shí)從多個(gè)RFID標(biāo)簽收集數(shù)據(jù)而互不干擾。反向散射。被動(dòng)RFID標(biāo)簽和閱讀器之間的交流方法。由閱讀器發(fā)送的RF信號(hào)從標(biāo)簽反射回閱讀器，所述標(biāo)簽受到調(diào)節(jié)以發(fā)送數(shù)據(jù)。信標(biāo)。經(jīng)過(guò)程序編制來(lái)“喚醒”并以預(yù)定的間隔廣播信號(hào)的主動(dòng)或半被動(dòng)RFID標(biāo)簽。集中器。用于同時(shí)從多個(gè)RFID閱讀器集中數(shù)據(jù)的設(shè)備。電感耦合。RFID閱讀器天線(xiàn)和標(biāo)簽天線(xiàn)各自包括線(xiàn)圈，共同形成磁場(chǎng)。RFID標(biāo)簽由這個(gè)磁場(chǎng)吸取電能，為微芯片提供能量。然后微芯片改變標(biāo)簽天線(xiàn)的電學(xué)性質(zhì)。這些改變由閱讀器天線(xiàn)感應(yīng)并轉(zhuǎn)變?yōu)镽FID標(biāo)簽的序列號(hào)。詢(xún)問(wèn)機(jī)。RFID閱讀器的另一個(gè)名稱(chēng)。被動(dòng)標(biāo)簽。沒(méi)有電源或發(fā)射器的RFID標(biāo)簽。從RFID標(biāo)簽天線(xiàn)收集來(lái)自RFID閱讀器的無(wú)線(xiàn)電波，為標(biāo)簽中的微芯片提供能量。然后標(biāo)簽?zāi)軐⑿酒袃?chǔ)存的信息發(fā)回至閱讀器。諧振電容器。RFID閱讀器。用于與RFID標(biāo)簽交流的設(shè)備。閱讀器具有一個(gè)或多個(gè)天線(xiàn)，發(fā)送無(wú)線(xiàn)電波和接收由標(biāo)簽返回的信號(hào)。閱讀器有時(shí)也稱(chēng)作詢(xún)問(wèn)機(jī)，因?yàn)樗鼤?huì)“詢(xún)問(wèn)”標(biāo)簽。RFID標(biāo)簽。附著于包裝內(nèi)天線(xiàn)上的微芯片。RFID標(biāo)簽最小情況下包含唯一的序列號(hào)，但是通常都包含產(chǎn)品相關(guān)信息。RFID標(biāo)簽可以是被動(dòng)、半被動(dòng)或主動(dòng)的。半被動(dòng)/半主動(dòng)標(biāo)簽。與主動(dòng)RFID標(biāo)簽相似，但是電池通常只用于為RFID芯片提供能量，而不是向閱讀器廣播信號(hào)。轉(zhuǎn)調(diào)器。無(wú)線(xiàn)電頻率發(fā)射器-接收器組合。RFID標(biāo)簽的另一個(gè)術(shù)語(yǔ)。燃料電池術(shù)語(yǔ)“燃料電池”通常指試圖利用催化劑將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能的系統(tǒng)。很多有機(jī)底物可以在氧氣中燃燒或氧化，同時(shí)釋放能量。例如，甲醇、乙醇和葡萄糖，是充足的原材料， 并且是燃料電池反應(yīng)的有吸引力的候選材料。燃料電池通常的概念涉及通過(guò)使用氧化還原部分將電子從催化反應(yīng)吸出。例如， 在使用甲醇作為燃料來(lái)源的燃料電池中，在陽(yáng)極甲醇的氧化可以表示為CH30H+H20 — C02+6H+6e"并且在陰極氧的還原可以表示為02+4H++4e" — 2H20。因此，用“多余”的兩個(gè)電子繼續(xù)進(jìn)行合并反應(yīng)。如果能利用多余的電子，那么能量可用于其它目的，包括，特別是，形成電池。通常類(lèi)別的燃料電池的子類(lèi)，是所謂的“生物燃料電池”-即，依賴(lài)于生物催化劑(例如，酶)的燃料電池系統(tǒng)。(參見(jiàn)，例如，Katz等人，“Biochemical fuel cells", Handbook of Fuel Cells-Fundamentals,Technology and Applications,1,Ch.21 (2003)； Katz, Ε.等人，"A Biofuel Cell Based on Two Immiscible Solvents and Glucose Oxidase and Microperoxidase-I I monolayer-functionalized electrodes，，，NewJ. Chem. , pp. 481-487(1999) ；Katz, E.等人，“A non-compartmentalized glucose I O2 biofuel cell by bioengineered electrode surfacesJournal of Electroanalytical Chemistry, vol.479, pp. 64-68 (1999) ；Palmore, G.等人，“Microbial and Enzymatic Biofuel Cells". Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Ch. 14, pp. 271-290 (1994) ；Palmore, G.等人，“A methanol/dioxygen biofuel cell that uses NAD+-dependent dehydrogenases as catalysts !application of an electro-enzymatic method to regenerate nicotinamide adenine dinucleotide at low overpotentials，，， Journal of Electroanalytical Chemistry, vol. 443, pp. 155—161 (1998 年 2 月 10 日)； Palmore,G.等人,“Electro-enzymatic reduction of dioxygen to water in the cathode compartment of a biofuel cellJournal of Electroanalytical Chemistry,vol. 464, pp. 110-117 (1999) ；Trudeau, F.等人，"Reagentless Mediated Laccase Electrode for the Detection of Enzyme Modulators，，，Anal. Chem.，vol. 69，No. 5，pp. 882-886 (1997年 3 月 1 日)；ffillner, I.等人，"A biofuel cell based on pyrroloquinoline quinine and microperoxidase-I I monolayer-functionalized electrodes，，， Bioelectrochemistry and Bioenergetics, vol.44, pp. 209-214(1998 年 1 月)；Willner，I.等人，“Biofuel cell based on glucose oxidase and microperoxidase-I I monolayer-functionalized electrodes", J. Chem. Soc.，Perkin Trans 2.，vol. 8，pp. 1817—1822 (1998 年 8 月)；美國(guó)專(zhuān)利 No. 4，581,336 ；4，578，323,4, 126,934 和 3，941，135 ；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng) No :20040245101, 每篇文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文)。近來(lái)已經(jīng)公布了各種生物系統(tǒng)中的進(jìn)展，包括可以在葡萄糖、果汁、可樂(lè)等上運(yùn)行的生物燃料電池的制備。參見(jiàn)，例如，http://WWW. slu. edu/xl4605. xmL·生物燃料電池通常包括基于氧化還原的反應(yīng)，其包括由一種或多種膜分隔的電極。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利No. 5，660，940、6，500，571、6，475，661。也報(bào)道了使用膜較少的燃料電池應(yīng)用的實(shí)例。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利No. 7，238，440。近來(lái)報(bào)道了“燃料電池”方法與生物傳感器或可移植的設(shè)備相結(jié)合使用。然而，這些燃料電池的適用性由于，特別是，實(shí)用性(缺少實(shí)用性)、低靈敏度、低效率、嚴(yán)格依賴(lài)于酶底物進(jìn)行檢測(cè)和其它問(wèn)題(參見(jiàn)，例如，7，226，442,7, 236，821,7, 160，637,7, 019，735) 而受到限制，每種問(wèn)題都可以通過(guò)本發(fā)明的設(shè)備和方法克服。生物/診斷檢測(cè)分析方法生物分析方法通常涉及相對(duì)復(fù)雜的系統(tǒng)，其包括大量化合物，因此目前的篩選方法昂貴并且耗時(shí)。在某些分析方法中，使用了參照化合物的放射活性標(biāo)記；然而，由于使用了放射活性材料，所以這些方法昂貴并且需要復(fù)雜的處理方案和專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)室。在其它篩選方法中，使用了熒光標(biāo)記材料，但是這些方法經(jīng)常受到同時(shí)存在假陽(yáng)性、難于檢測(cè)熒光信號(hào)、背景值高、信噪比不可接受和熒光化合物在處理和/或保存過(guò)程中變性的困擾。在其它方法中，使用了比色檢測(cè)。這種比色分析方法容易受到與基于熒光的方法相同或相似的缺點(diǎn)的困擾。假設(shè)只有有限數(shù)量的不同的放射活性標(biāo)記和熒光化合物可以在市場(chǎng)購(gòu)得，那么這些在先方法中，每一種都只能提供有限數(shù)目的唯一標(biāo)識(shí)符用于標(biāo)識(shí)。如上所述，側(cè)流類(lèi)型設(shè)備是生物分析/診斷設(shè)備的常見(jiàn)形式。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利 No. 4，703，017,4, 855，240,5, 356，785,5, 468，648,5, 656，503,5, 766，961,5, 837，546、 5，989，921,6, 475，805,6, 713，308,6, 844，200,7, 045，342,7, 144，742，每篇文獻(xiàn)都通過(guò)引用全部并入本文。理想的檢測(cè)方法應(yīng)兼具抗體識(shí)別的通用性和選擇性、速度、精確性、靈敏度、較寬的適用性、多重和可選地在“野外應(yīng)用”(例如，在研究、分析或臨床實(shí)驗(yàn)室以外)中進(jìn)行這種方法的能力，和/或無(wú)需外部電源或設(shè)施，并克服目前已知檢測(cè)方法所表現(xiàn)出的所有內(nèi)在缺陷。本發(fā)明滿(mǎn)足所有這些目標(biāo)，并滿(mǎn)足檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域中一種或多種長(zhǎng)期存在并尚未得到滿(mǎn)足的需要。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供，特別是，檢測(cè)設(shè)備和方法，其表現(xiàn)出更高的靈敏度，較高的選擇性，并且能以快速模式進(jìn)行測(cè)量，同時(shí)背景值較低或者沒(méi)有。本發(fā)明還提供這些設(shè)備和方法的實(shí)施方案，其可選地，適合和/或能在“野外應(yīng)用”(例如，在研究、分析或臨床實(shí)驗(yàn)室以外)中作用，和/或無(wú)需外部電源或設(shè)施。本發(fā)明教導(dǎo)了用于檢測(cè)一種或多種靶標(biāo)物試劑的設(shè)備和方法。對(duì)于精確、靈敏和快速的生物/化學(xué)分析和/或檢測(cè)方法(其子類(lèi)常稱(chēng)作“診斷分析方法”)的需要一直存在并不斷增長(zhǎng)。對(duì)于速度的需要明顯次于對(duì)于精確度、靈敏度、使用方便和適用于特殊任務(wù)的需要。本發(fā)明提供，特別是，檢測(cè)設(shè)備和方法，其表現(xiàn)出比現(xiàn)有技術(shù)設(shè)備和方法更高的靈敏度、較高的選擇性，和/或更低的背景。本發(fā)明還提供這種設(shè)備和方法的實(shí)施方案，其可選地，適合和/或能在“野外應(yīng)用”(例如，在研究、分析和診斷實(shí)驗(yàn)室以外)中作用，和/或無(wú)需外部電源或設(shè)施。教導(dǎo)了用于檢測(cè)一種或多種靶標(biāo)物試劑的設(shè)備和方法。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及自作用信號(hào)產(chǎn)生(“SASP”)檢測(cè)設(shè)備和方法，其能提供精確而快速的生物和化學(xué)分析和診斷檢測(cè)(在本文中統(tǒng)稱(chēng)為“SASP診斷設(shè)備和方法”)。應(yīng)理解的是，這個(gè)術(shù)語(yǔ)意欲廣義解釋為包括所有適用領(lǐng)域中的所有分析和診斷檢測(cè)方法，包括， 特別是，生物和疾病狀態(tài)的連續(xù)監(jiān)控，體外診斷，食品檢測(cè)/診斷，化妝品應(yīng)用，農(nóng)業(yè)化學(xué)應(yīng)用，工業(yè)化學(xué)應(yīng)用，與國(guó)防相關(guān)的應(yīng)用，國(guó)家安全相關(guān)的應(yīng)用等。本發(fā)明的目的是提供SASP設(shè)備和方法，其在缺乏靶標(biāo)分析物時(shí)不能產(chǎn)生信號(hào)。本發(fā)明的目的是提供具有高靈敏度的SASP設(shè)備和方法。本發(fā)明的目的是提供具有低背景和低假陽(yáng)性率的SASP設(shè)備和方法。本發(fā)明的目的是提供具有低檢測(cè)閾值的SASP設(shè)備和方法。本發(fā)明的目的是提供具有高選擇性的SASP設(shè)備和方法。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案包括SASP設(shè)備和方法，其中通過(guò)生物催化反應(yīng)可直接或間接地生成產(chǎn)生所述信號(hào)所需的部分或全部能量。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述信號(hào)指示在例如診斷檢測(cè)中靶標(biāo)分析物的選擇性結(jié)合。所述信號(hào)包括，特別是，RF信號(hào)(包括，但不限于，RFID)、電子信號(hào)、光電信號(hào)、光反應(yīng)活性信號(hào)和光發(fā)射。在那些從RFID電路產(chǎn)生所述RF的實(shí)施方案中，所述RFID可以是被動(dòng)、主動(dòng)或半主動(dòng)類(lèi)型。特別重要的是，本發(fā)明的實(shí)施方案不限于使用期望的靶標(biāo)分析物為底物的催化系統(tǒng)。即，優(yōu)選的實(shí)施方案的生物催化試劑(例如，酶、酶/氧化還原系統(tǒng)等)不使用靶標(biāo)分析物產(chǎn)生能量?，F(xiàn)有技術(shù)生物催化診斷設(shè)備的重點(diǎn)在于使用靶標(biāo)分析物作為底物的酶系統(tǒng) (例如，用于葡萄糖檢測(cè)和/或監(jiān)控的葡萄糖氧化酶和/或葡萄糖脫氫酶)。形成鮮明對(duì)比的是，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的酶系統(tǒng)優(yōu)選與靶標(biāo)分析物“無(wú)關(guān)”，并且在優(yōu)選的實(shí)施方案中，不能利用靶標(biāo)分析物作為底物。本發(fā)明的這個(gè)方面提供幾個(gè)顯著和非限定的優(yōu)勢(shì)，包括，特別是(1)可以開(kāi)發(fā)出“通用的”模式檢測(cè)，無(wú)論何種靶標(biāo)分析物，從而降低制造成本、 質(zhì)量控制成本、優(yōu)化時(shí)間等，(2)應(yīng)用于未知、易于提供或不存在酶和/或氧化還原系統(tǒng)的靶標(biāo)分析物，(3)能將優(yōu)化的酶系統(tǒng)用于多種分析物，和(4)能開(kāi)發(fā)依賴(lài)于低成本、易于提供和/或相對(duì)豐富的燃料底物的檢測(cè)方法和系統(tǒng)。本發(fā)明的設(shè)備和方法包括，特別是，溶液相、溢流道、毛細(xì)管流和側(cè)流模式。重要的是識(shí)別潛在的方法，其不限于任何特定的流模式或機(jī)制，但是適用于大多數(shù)分析方法。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，SASP設(shè)備和方法包括儀器，所謂的“芯片”(耗材)，和在自動(dòng)化、半自動(dòng)化和/或手動(dòng)測(cè)試設(shè)備中同樣使用的方法。此外，優(yōu)選的實(shí)施方案包括 “便攜式” SASP設(shè)備和方法(即，適合于野外應(yīng)用的實(shí)施方案，包括，特別是，不需要設(shè)備運(yùn)行檢測(cè)/分析方法的實(shí)施方案)。這種便攜式實(shí)施方案特別適合于不能提供電源、不實(shí)用、 不可能或受到其它障礙阻擋的野外使用，并且具體地，在受控或相對(duì)受控(例如，實(shí)驗(yàn)室) 環(huán)境外需要精確度、靈敏度、選擇性和快速測(cè)試的情況。這種便攜式實(shí)施方案在包括，特別是，戰(zhàn)場(chǎng)、沖突區(qū)域、應(yīng)急組織、國(guó)家安全、農(nóng)村地區(qū)、隔離地區(qū)(例如，使用水安全測(cè)試方法的露營(yíng)狀況)、欠發(fā)達(dá)國(guó)家、災(zāi)難區(qū)域(例如，地震、颶風(fēng)等)等環(huán)境中極為有益。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，催化系統(tǒng)與燃料電池類(lèi)設(shè)備的一個(gè)或兩個(gè)電極直接或間接相關(guān)聯(lián)。所述設(shè)備的電極可以與電路(例如，RF產(chǎn)生電路)直接或間接相關(guān)聯(lián)，從而由所述催化系統(tǒng)產(chǎn)生的電子與所述電路連通。所述連通可以是傳導(dǎo)、感應(yīng)、無(wú)線(xiàn)傳遞或其它傳遞方法。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述催化系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)酶與所述電極通過(guò)選擇性化學(xué)聯(lián)合而關(guān)聯(lián)。所述化學(xué)聯(lián)合可以是一種或多種，特別是，核酸部分、抗體部分、配體部分寸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)在存在SASP設(shè)備的條件下選擇性結(jié)合靶標(biāo)分析物從而產(chǎn)生能為RF(例如，RFID)電路提供能量的電子源，由此產(chǎn)生RF信號(hào)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述選擇性結(jié)合與側(cè)流分子關(guān)聯(lián)聯(lián)合發(fā)生。在可植入的實(shí)施方案中，設(shè)備可以?xún)?yōu)選位于皮下，并且能，例如，利用生理溶液產(chǎn)生信號(hào)，從而提供方法用于檢測(cè)特定分子(例如，葡萄糖、代謝物、激素、蛋白質(zhì)等)的存在和/或監(jiān)控特定分子的水平。在某些實(shí)施方案中，SASP檢測(cè)設(shè)備和方法能通過(guò)，特別是，測(cè)定由所用酶系統(tǒng)產(chǎn)生的電子信號(hào)和/或RF脈沖頻率而實(shí)時(shí)監(jiān)控期望靶標(biāo)物的水平(例如，濃度)。例如，在某些實(shí)施方案中，靶標(biāo)分析物的濃度與位于檢測(cè)電路中的酶系統(tǒng)的濃度成正比。因此，對(duì)于基于 RFID的設(shè)備和/或方法，脈沖頻率(S卩，RFID電路帶有和釋放其RF信號(hào)的速率)能說(shuō)明靶標(biāo)分析物的濃度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用標(biāo)準(zhǔn)化的參照/對(duì)照電路，從而精確定量靶標(biāo)分析物。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，SASP設(shè)備和方法包括產(chǎn)生，特別是如下一種或多種的能力⑴RF信號(hào)(包括，但不限于，RFID)，(ii)電子信號(hào)，(iii)光電信號(hào)，(iv)光反應(yīng)活性信號(hào)和(ν)光發(fā)射，無(wú)需使用外部電源。取而代之的是，這些SASP設(shè)備和方法的實(shí)施方案能通過(guò)由催化反應(yīng)，優(yōu)選生物催化反應(yīng)，并且更優(yōu)選生物催化反應(yīng)與關(guān)聯(lián)的氧化還原反應(yīng)相結(jié)合，產(chǎn)生電子流而提供信號(hào)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，SASP檢測(cè)設(shè)備和/或方法中使用一種或多種電子介導(dǎo)部分。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)與電極和/或電極類(lèi)設(shè)備關(guān)聯(lián)的捕捉部分選擇性地“捕捉”樣品中的靶標(biāo)分析物，其中電極和/或電極類(lèi)設(shè)備與電子電路直接或間接連通， 優(yōu)選其中所述電路提供方法，由所述方法可以通過(guò)產(chǎn)生的電子信號(hào)直接或間接地確定是否存在靶標(biāo)物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是對(duì)于期望的靶標(biāo)物和相關(guān)信號(hào)具有高度特異性的SASP檢測(cè)設(shè)備和方法。本發(fā)明提供相對(duì)由于其內(nèi)在設(shè)計(jì)而賦予的化學(xué)/生物特異性而言較高的特異性，并且所述特異性由SASP設(shè)備和方法本質(zhì)上不受污染物干擾而進(jìn)一步得到增強(qiáng)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含能作為低能量輸出的酶/氧化還原系統(tǒng)的SASP檢測(cè)設(shè)備和方法。這種低能量輸出系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)包括，特別是，降低或消除電極處污染物的氧化還原轉(zhuǎn)化，從而增加選擇性信號(hào)傳遞。本發(fā)明的SASP檢測(cè)設(shè)備和方法特別適用于對(duì)于使用需要外部電源的設(shè)備不實(shí)際或不可能的區(qū)域、地點(diǎn)、環(huán)境。本發(fā)明的目的是提供用于組分液體混合物的酶電極系統(tǒng)，用于檢測(cè)是否存在一種或多種選擇的能進(jìn)行酶催化反應(yīng)的組分，測(cè)量組分量和/或監(jiān)控組分水平，其中氧化還原酶，優(yōu)選為固定化狀態(tài)與電子收集器的表面相關(guān)聯(lián)，所述電子收集器優(yōu)選為能用于SASP檢測(cè)設(shè)備/方法的RF電路的電極。另一個(gè)目的是提供與本發(fā)明的SASP檢測(cè)設(shè)備和方法聯(lián)合使用的手持式檢測(cè)器。本發(fā)明的實(shí)施方案滿(mǎn)足至少一個(gè)或多個(gè)前述目標(biāo)、實(shí)施方案、性質(zhì)和/或特色。本發(fā)明不限于概述中所提供的描述，而是包括說(shuō)明的其它部分中所述的其它實(shí)施方案、特定和/或通用方面和/或本發(fā)明的特定或一般特色。在閱讀本說(shuō)明、權(quán)利要求和圖后，前述概述的目標(biāo)、優(yōu)勢(shì)、方面、實(shí)施方案和/或特色以及本發(fā)明的其它目標(biāo)、實(shí)施方案、優(yōu)勢(shì)、方面和特色對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)。


并入本文并構(gòu)成本說(shuō)明一部分的附圖闡述本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，并且，與上述一般描述和下面的詳述部分一起，用于解釋本發(fā)明的特色。因此如上所簡(jiǎn)要概括的已獲得/可獲得本發(fā)明的特色、優(yōu)勢(shì)和目標(biāo)并能詳細(xì)理解的常規(guī)方式、本發(fā)明的更具體描述，可以參照附圖中闡述的實(shí)施方案。然而，應(yīng)該注意的是， 附圖僅闡述本發(fā)明的某些實(shí)施方案，并且因此不認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范疇的限定，因?yàn)楸景l(fā)明可以許可并明確包括，本文未闡述的其它實(shí)施方案。圖1是本發(fā)明檢測(cè)DNA靶標(biāo)物例如編碼特定目的蛋白質(zhì)的DNA的應(yīng)用的示意圖。圖2是本發(fā)明檢測(cè)蛋白質(zhì)靶標(biāo)物例如由目的微生物表達(dá)的特定蛋白質(zhì)的應(yīng)用的示意圖。圖3表示本發(fā)明的實(shí)施方案，其中使用“溢流”類(lèi)型實(shí)施方案。圖4表示生物催化氧化還原電極示意圖。圖5表示另一種生物催化氧化還原電極示意圖。圖6表示包括電極的一次性反應(yīng)室側(cè)視圖，用于本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。圖7表示圖11的反應(yīng)室的正視圖。
圖8表示野外可展開(kāi)設(shè)備的仰視圖，用于接收反應(yīng)室筒體并檢測(cè)在電極之間產(chǎn)生的電勢(shì)。圖9表示野外可展開(kāi)設(shè)備的側(cè)視圖，用于測(cè)定一次性反應(yīng)室的電極之間產(chǎn)生的電勢(shì)。
具體實(shí)施例方式下文概括性地并通過(guò)具體實(shí)施例描述了本發(fā)明。實(shí)施例不意欲限制本發(fā)明，并且不用于確定本發(fā)明的界限，除非后面所附權(quán)利要求中特別指出。同樣地，通過(guò)上述附圖描述了本發(fā)明。圖僅用于代表，意欲為讀者提供本發(fā)明范疇的具體而且細(xì)致的描述。除非在下述權(quán)利要求中特別說(shuō)明，否則本發(fā)明不限于所闡述的任何實(shí)施方案或設(shè)備。本發(fā)明的實(shí)施方式參照附圖將詳細(xì)描述各種實(shí)施方案。圖中盡可能使用相同的參考編號(hào)描述相同或相似的部分。如上所述，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明依賴(lài)于酶及其底物之間的化學(xué)反應(yīng)。 下述的典型氧化還原對(duì)是葡萄糖氧化酶及其底物，葡萄糖。有各種方法來(lái)描述發(fā)生在氧化還原酶及其底物之間的化學(xué)反應(yīng)。酶保持完整，但是在作用于底物時(shí)，通常產(chǎn)生電子和“消化物”或“降解物”或從底物去除一些化學(xué)部分。這個(gè)術(shù)語(yǔ)在本文稱(chēng)為“作用于”。因此，當(dāng)酶在產(chǎn)生電子或電勢(shì)的過(guò)程中接觸底物并改變底物時(shí)，在本文將其描述為酶“作用于”底物這一事件。本發(fā)明某些優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述示意性概述盡管本專(zhuān)利申請(qǐng)的方面來(lái)自多個(gè)具體的實(shí)施方案，但是通?？梢詤⒄栈镜钠胀ㄔb別。本發(fā)明使用可釋放電子的試劑的氧化還原對(duì)，在電路接通(complete)時(shí)提供可檢測(cè)的信號(hào)。概括來(lái)講，一種試劑通常是酶，其僅在靶標(biāo)物存在時(shí)存在。它與其底物混合。 可以使用多種酶/底物對(duì)，但是通常地，使用氧化酶或脫氫酶。因此，葡萄糖可以與葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶一起使用，乳糖可以與乳糖氧化酶或脫氫酶一起使用，等等。參照本申請(qǐng)的圖1，概括來(lái)講，本發(fā)明的檢測(cè)系統(tǒng)、方法和設(shè)備可以用于檢測(cè)多種靶標(biāo)物。一種常用的靶標(biāo)物是特定序列或者一級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA。這種序列決定DNA的作用， 和它是否編碼蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的標(biāo)識(shí)(identity)和作用。因此，靶標(biāo)物DNA的檢測(cè)是本發(fā)明常用并且重要的方面。在本發(fā)明的實(shí)踐中，因?yàn)闄z測(cè)由非常少量的DNA部分產(chǎn)生的信號(hào)是本發(fā)明的核心，所以抑制背景噪音是必需的。在圖1中，通過(guò)用磁場(chǎng)選擇已處理的試劑部分，分離后反復(fù)洗滌試劑，降低了背景噪音。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用其它捕捉方法，包括上文參考的方法。如圖所示，在本發(fā)明的第一或“A”階段，在靶標(biāo)物存在的情況下，使用氧化還原反應(yīng)對(duì)的成員，優(yōu)選氧化酶或脫氫酶，作為電荷或電子產(chǎn)生劑。在示意的具體實(shí)施方案并且通常是優(yōu)選實(shí)施方案中，使用葡萄糖氧化酶(GOx)。這種催化劑與“捕捉寡聚物”或“捕捉寡核苷酸(Capture Oligo) ”偶聯(lián)或共軛結(jié)合。捕捉寡核苷酸的序列在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適條件下可以與部分靶標(biāo)物DNA雜交。用柱純化共軛結(jié)合的GOx，提供系統(tǒng)的一個(gè)必需反應(yīng)物。本發(fā)明的系統(tǒng)中第二種反應(yīng)物或試劑在本發(fā)明方法的第二或B步驟中制備。這是第二種捕捉寡聚物，其在雜交過(guò)程中與部分靶標(biāo)物結(jié)合，結(jié)合部位不同于第一捕捉寡聚物結(jié)合的部分或序列。然后這第二種捕捉寡聚物通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法結(jié)合至磁珠上。通過(guò)磁場(chǎng)收集第二種捕捉寡聚物，并洗滌純化。本發(fā)明的第三個(gè)或反應(yīng)步驟需要將兩個(gè)捕捉寡聚物與樣品混合。這些可以同時(shí)或依次加入，這取決于實(shí)際操作者的愿望。在存在的任何靶標(biāo)物雜交過(guò)程中，當(dāng)捕捉寡聚物在相同的雜交條件下結(jié)合至靶標(biāo)物，并且彼此不會(huì)競(jìng)爭(zhēng)或干擾時(shí)，可以方便地一起加入。如果樣品中有任何靶標(biāo)物，當(dāng)在雜交條件下加入樣品時(shí)，靶標(biāo)物會(huì)由存在的寡聚物結(jié)合，在這種情況下，存在的寡聚物是葡萄糖氧化酶，而所述寡聚物與磁珠結(jié)合。磁珠提供純化的簡(jiǎn)單方法。將磁場(chǎng)應(yīng)用于保留雜交混合物的容器，其可以是試管、安瓿、微孔板孔等。洗滌材料(3 次)。通過(guò)使用的磁場(chǎng)可以保留由第二種捕捉寡聚物結(jié)合的任何靶標(biāo)物。然后將洗滌的捕捉靶標(biāo)物加入至少量體積的氧化還原催化劑(在這種情況下是葡萄糖)的底物。靶標(biāo)物的存在確保了 Gox的存在，其與葡萄糖反應(yīng)生成自由電子。因此， 獲得信號(hào)(流經(jīng)產(chǎn)生的電路的電流)的強(qiáng)度與存在的靶標(biāo)物量直接相關(guān)(每個(gè)GOx與一個(gè)靶標(biāo)物部分相關(guān)聯(lián))。定性，確定微量靶標(biāo)物的存在和定量，通過(guò)信號(hào)強(qiáng)度確定存在的靶標(biāo)物的量，則都是可以實(shí)現(xiàn)的。按絕對(duì)值計(jì)算，假定100阿摩爾靶標(biāo)物/1-3ρΜ濃度的1 1 信號(hào)靶標(biāo)物比(使用酶的回轉(zhuǎn)數(shù)或多信號(hào)部分每分子靶標(biāo)物可實(shí)現(xiàn)更高的比值)的閾值檢測(cè)能由本發(fā)明很好地實(shí)現(xiàn)。與檢測(cè)靶標(biāo)物DNA存在的方法相似，如圖2所示，類(lèi)似地檢測(cè)蛋白質(zhì)。不是使用 DNA的雜交能力，而是使用不同種類(lèi)的結(jié)合部分，抗體。如上所討論的，針對(duì)特定靶標(biāo)物可以產(chǎn)生抗體-即，它們優(yōu)先結(jié)合那種靶標(biāo)物。在本發(fā)明的實(shí)踐中，將氧化還原伴侶(redox partner)，在這個(gè)實(shí)施例中仍為葡萄糖氧化酶，與針對(duì)目的靶標(biāo)物具有特異性的抗體共軛結(jié)合。按照常規(guī)純化方法，制備這樣的第一捕捉抗體試劑。與針對(duì)DNA靶標(biāo)物相似，使用第二種捕捉試劑。使用二抗替代寡聚物。在這個(gè)實(shí)施例中將抗體與磁珠共軛結(jié)合。如前所述，無(wú)論在結(jié)合靶標(biāo)物之前還是之后，磁珠使純化更容易，抑制背景噪音。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其它純化方法。本過(guò)程的第二階段或“步驟B” 涉及第二捕捉抗體的純化。第一和第二捕捉抗體結(jié)合靶標(biāo)物的不同部分-不同表位，避免結(jié)合中的競(jìng)爭(zhēng)或干擾。兩個(gè)捕捉抗體同時(shí)或依次與樣品混合。由第一捕捉抗體及其指定表位(其與GOx部分結(jié)合)和第二捕捉抗體(結(jié)合至磁珠并在其指定表位結(jié)合靶標(biāo)物)，結(jié)合樣品中存在的任何靶標(biāo)物。通過(guò)使用磁場(chǎng)由檢測(cè)樣品中分離得到的抗體-靶標(biāo)物-抗體絡(luò)合物，所述磁場(chǎng)可以吸出存在的任何靶標(biāo)物，剩余樣品洗去。將酶底物，在這種情況下是葡萄糖，加入分離出的材料。通過(guò)結(jié)合至磁珠的抗體而結(jié)合的靶標(biāo)物帶有與第一捕捉抗體共軛結(jié)合的葡萄糖氧化酶。加入葡萄糖驅(qū)動(dòng)反應(yīng)進(jìn)行， 釋放電子并驅(qū)動(dòng)可檢測(cè)信號(hào)的產(chǎn)生。為了區(qū)別信號(hào)和空信號(hào)(背景)，期望將電路延遲閉合幾個(gè)測(cè)量循環(huán)，即一到五分鐘。當(dāng)電路閉合時(shí)，建立電勢(shì)，其提供突然的強(qiáng)烈信號(hào)，與從開(kāi)始通過(guò)恒定測(cè)量獲得的信號(hào)相等。延遲測(cè)量的“尖峰”與恒定測(cè)量的曲線(xiàn)下面的面積相等。上述內(nèi)容介紹了均一相或液體檢測(cè)的狀況，其需要將靶標(biāo)物從其余樣品中分離。 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的SASP技術(shù)用于靶標(biāo)物材料的原位檢測(cè)。例如，將氧化還原酶與部分如能選擇性與待測(cè)樣品(例如，組織切片樣品)中的靶標(biāo)物結(jié)合的寡聚物或抗體共軛結(jié)合。然后將樣品放在合適的檢測(cè)室中，優(yōu)選單室反應(yīng)室，其中陰極由合適的聚合物膜(即，Nafthion)涂布，或與陽(yáng)極由合適的聚合物膜分隔開(kāi)。樣品和前述結(jié)合物和底物在反應(yīng)室內(nèi)發(fā)生接觸，并如前面的實(shí)施例一樣測(cè)試是否存在靶標(biāo)物材料。相似地，非均勻樣品中靶標(biāo)物的存在是要研究的關(guān)鍵問(wèn)題(是否存在任何靶標(biāo)物)。在這些實(shí)施方案中，使用單一的捕捉部分-第一捕捉部分，攜帶氧化還原酶或與其共軛結(jié)合。用于分離已結(jié)合靶標(biāo)物的第二捕捉部分不是必需的。本發(fā)明重點(diǎn)在于新的SASP檢測(cè)設(shè)備和方法，能提供精確和快速的生物和化學(xué)檢測(cè)、分析和診斷方法(在本文中統(tǒng)稱(chēng)為“SASP檢測(cè)設(shè)備和方法”)。應(yīng)理解的是，術(shù)語(yǔ)“SASP 檢測(cè)設(shè)備和方法”意欲廣義解釋為包括所有適用領(lǐng)域中的檢測(cè)、分析和診斷方法，包括，特別是，體外診斷、臨床醫(yī)學(xué)、發(fā)育醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、藥物遺傳學(xué)、國(guó)家安全、國(guó)防、農(nóng)業(yè)化學(xué)、工業(yè)化學(xué)、化妝品、飲食添加劑、基因組學(xué)、毒理學(xué)、代謝組學(xué)、療法、應(yīng)急響應(yīng)、整體醫(yī)學(xué)、順勢(shì)療法、基因篩選，和通常的產(chǎn)品質(zhì)量保證應(yīng)用。本發(fā)明的SASP檢測(cè)設(shè)備和方法包括，特別是，產(chǎn)生一種或多種類(lèi)型信號(hào)的能力， 所述信號(hào)包括，但不限于(i)RF信號(hào)(包括，但不限于，RFID)，(ii)電子信號(hào)，(iii)光電信號(hào)，(iv)光反應(yīng)活性信號(hào)和/或(ν)光傳遞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，SASP設(shè)備/方法能無(wú)需外部電源提供產(chǎn)生信號(hào)所需的全部能量即產(chǎn)生所述信號(hào)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的SASP檢測(cè)設(shè)備和方法能通過(guò)由催化劑，更優(yōu)選由生物催化劑，并且更優(yōu)選由一種或多種前述與氧化還原和/或氧化還原類(lèi)反應(yīng)相結(jié)合使用和/或相關(guān)聯(lián)的生物催化劑，產(chǎn)生電流而提供信號(hào)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，氧化還原反應(yīng)包括相關(guān)的生物催化劑。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種或多種電子介導(dǎo)部分與氧化還原反應(yīng)和/或生物催化劑相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的SASP檢測(cè)設(shè)備和方法包括一個(gè)或多個(gè)電子電路，其能通過(guò)，特別是，從催化反應(yīng)，優(yōu)選包括特別是酶氧化還原系統(tǒng)的生物催化反應(yīng)，將電子轉(zhuǎn)移至所述電路，產(chǎn)生本文所述的信號(hào)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，電子電路能產(chǎn)生RF信號(hào)，更優(yōu)選地，RFID信號(hào)。在那些包含RFID電路的實(shí)施方案中，所述RF電路是被動(dòng)、主動(dòng)和/或半主動(dòng)類(lèi)型，其中提供的一些或全部電源通過(guò)，特別是，催化和/或氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，酶和/或氧化還原反應(yīng)，能直接為RFID電路的諧振電容器充電，從而提供RFIC信號(hào)產(chǎn)生所需的能量。在某些實(shí)施方案中，酶和/或氧化還原電勢(shì)可以作為已提供電源如電池或相似裝置的補(bǔ)充。在其它實(shí)施方案中，酶和/或氧化還原電勢(shì)能為電路如開(kāi)關(guān)、FET等供電；因此， 由SASP設(shè)備和/或方法產(chǎn)生的能量，為RFID電路/設(shè)備提供電子信號(hào)，然后通過(guò)產(chǎn)生的系統(tǒng)和/或傳統(tǒng)的供電裝置(例如，RF、感應(yīng)、電池、外部電源等)傳導(dǎo)信號(hào)。在存在低濃度靶標(biāo)分析物的應(yīng)用中優(yōu)選這些類(lèi)型的實(shí)施方案-因此，提供的電源能產(chǎn)生信號(hào)傳導(dǎo)事件所需的部分電勢(shì)，但是不是足以產(chǎn)生信號(hào)的能量(或者本質(zhì)上不充足和/或受到控制(例如，由電阻))。因此，在這種實(shí)施方案中，更低程度(例如，濃度)的靶標(biāo)物結(jié)合能產(chǎn)生信號(hào)傳導(dǎo)事件所需的電勢(shì)。本發(fā)明的SASP檢測(cè)設(shè)備和方法能用于在原位和樣品中(嚴(yán)格按照非限定性實(shí)例) 確定化學(xué)和/或生物靶標(biāo)分析物的存在、濃度和/或標(biāo)識(shí)，所述樣品為環(huán)境、工業(yè)或臨床來(lái)源(例如生物樣品、血液測(cè)試、組織切片、基因材料等)。本發(fā)明的SASP檢測(cè)設(shè)備和方法適合并意欲用于多種檢測(cè)/分析應(yīng)用中，包括，特別是，傳染性疾病、葡萄糖監(jiān)控、基因測(cè)試、癌癥測(cè)試、水測(cè)試、雜質(zhì)篩選和驗(yàn)證、化妝品、發(fā)酵過(guò)程、應(yīng)急響應(yīng)(例如，有毒物質(zhì)泄漏、事故、污染、恐怖事件、化學(xué)/生物戰(zhàn)爭(zhēng))等。本發(fā)明的SASP設(shè)備和方法能選擇性檢測(cè)大多數(shù)分析物，包括，特別是，核酸、蛋白質(zhì)，和/或小分子(例如，毒素、藥物、代謝物、起始材料、污染物等)。由于其內(nèi)在設(shè)計(jì)而引入的化學(xué)/生物特異性，SASP檢測(cè)設(shè)備和方法具有高度的特異性，并且SASP設(shè)備和方法本質(zhì)上不會(huì)受到污染物的干擾這一事實(shí)使其特異性進(jìn)一步增強(qiáng)。按照某些優(yōu)選的實(shí)施方案，用于確定，特別是，液體培養(yǎng)基中包含的靶標(biāo)分析物的存在、濃度和/或標(biāo)識(shí)的系統(tǒng)，包括SASP檢測(cè)設(shè)備/方法和能確定特別是以下各種信號(hào)存在的檢測(cè)器，⑴RF信號(hào)(包括，但不限于，RFID)，(ii)電子信號(hào)(例如，電壓和/或電流)， (iii)光電信號(hào)，(iv)光反應(yīng)活性信號(hào)和/或(ν)光傳遞，無(wú)需使用外部電源。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述信號(hào)由所述SASP檢測(cè)設(shè)備/方法直接或間接地通過(guò)電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)而產(chǎn)生。 本發(fā)明的設(shè)備和方法不限于電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，所述反應(yīng)中靶標(biāo)分析物被氧化或還原，就這點(diǎn)而言，其能廣泛應(yīng)用，并且就其它性質(zhì)而言，顯著優(yōu)于現(xiàn)有的方法和傳感器設(shè)備。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，SASP檢測(cè)設(shè)備/方法包括一個(gè)或多個(gè)能進(jìn)行催化氧化和/或還原的催化劑系統(tǒng)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶和/或氧化還原系統(tǒng)包括一個(gè)或多個(gè)電極，并且更優(yōu)選地，一個(gè)陽(yáng)極和一個(gè)陰極。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個(gè)或兩個(gè)電極直接或間接地與一個(gè)或多個(gè)催化劑(例如一個(gè)或多個(gè)酶)和/或氧化還原部分相關(guān)聯(lián)。 所述催化劑能固定化在一個(gè)或多個(gè)電極上和/或與其相關(guān)聯(lián)(例如，鄰近關(guān)聯(lián)、溶液相等)， 其中，例如對(duì)于酶，所述酶與一個(gè)電極相關(guān)聯(lián)，能催化氧化或還原反應(yīng)，在存在底物時(shí)，其中底物被氧化或還原并且，優(yōu)選地，能將一個(gè)或多個(gè)電子從所述反應(yīng)轉(zhuǎn)移至能催化反應(yīng)的電子轉(zhuǎn)移伴侶，在所述反應(yīng)中，氧化劑被氧化和/或還原劑被還原。本發(fā)明某些優(yōu)選的實(shí)施方案中使用的陽(yáng)極和/或陰極具有多種形狀、形式和結(jié)構(gòu)，并且由多種材料制成。例如，陽(yáng)極和/或陰極可以形成盤(pán)、網(wǎng)眼、線(xiàn)、管或其它形狀的導(dǎo)電材料。(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利7，238，442，通過(guò)引用并入本文)。陽(yáng)極和/或陰極也可以是在基底材料上形成的導(dǎo)電膜。所述導(dǎo)電膜能在所述基底材料上通過(guò)多種方法形成，包括， 例如，濺射、物理氣相沉積、等離子體沉積、化學(xué)氣相沉積、絲網(wǎng)印刷和其它涂敷方法。本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中使用的陽(yáng)極和/或陰極可以使用導(dǎo)電材料形成，比如，例如，金屬、碳、導(dǎo)電聚合物或金屬化合物。合適的導(dǎo)電材料通?？垢g并且包括，例如， 金、玻璃碳、石墨、鉬、二氧化釕和鈀，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它材料。與導(dǎo)電膜一起使用的合適的抗腐蝕基底材料包括塑料和聚合材料，比如，例如，聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯和聚酯。應(yīng)理解的是，任何具體實(shí)施方案中的陽(yáng)極和陰極都不必使用相同材料制成。導(dǎo)電材料和/或可選的抗腐蝕基底材料可以是，例如，無(wú)孔、有孔或微孔的。例如， 導(dǎo)電材料和/或可選的抗腐蝕基底材料可以形成為，例如，網(wǎng)眼、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(例如，網(wǎng)狀石墨)、微孔膜，或可滲透陽(yáng)極還原劑和/或陰極氧化劑的膜。還可以通過(guò)粗化或其它紋理加工而增加電極的表面積。優(yōu)選地，因?yàn)殛?yáng)極和/或陰極為網(wǎng)狀、網(wǎng)眼、粗化、有孔、微孔和/ 或纖維狀，所以陽(yáng)極和/或陰極的實(shí)際接觸表面積大于宏觀(guān)幾何表面積。此外，導(dǎo)電材料和 /或可選的不導(dǎo)電基底材料可以是和/或包括，離子選擇性膜。合適的電極可以由，例如，一種或多種導(dǎo)電和/或半導(dǎo)電材料組成，包括，例如金、鉬、鈀、銀、碳、銅、氧化銦錫(ITO)等。對(duì)于侵入分析，電極優(yōu)選由生物相容性和無(wú)毒材料/ 物質(zhì)構(gòu)成。對(duì)于某些實(shí)施方案，由于易于制備和足夠大的表面積，石墨糊是優(yōu)選的材料。在某些實(shí)施方案中，酶與電極的關(guān)聯(lián)可以通過(guò)混合，例如，石墨粉、硅氧烷-二戊鐵聚合物和葡萄糖氧化酶，并將得到的混合物混成糊而完成，然后將所述糊填入電極外罩基底的孔中， 或涂覆于電極基底板表面。美國(guó)專(zhuān)利4，970，145中討論了示例性的碳基電極，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。優(yōu)選在在電極間沒(méi)有膜的情況下使用本發(fā)明的SASP檢測(cè)設(shè)備和方法，從而提供顯著的益處，并且易于使用和設(shè)計(jì)。按照具體構(gòu)造的需要，次優(yōu)選的實(shí)施方案可以使用一個(gè)或多個(gè)膜和/或膜類(lèi)材料。與優(yōu)選實(shí)施方案的電極相關(guān)聯(lián)的催化劑/酶優(yōu)選地，但不是必要地，是氧化還原類(lèi)型，并且優(yōu)選為氧化還原酶。重要的是識(shí)別依賴(lài)于輔酶的一些氧化還原酶，比如，例如磷酸黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、吡咯并喹啉醌(PQQ)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、磷酸煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADP+)、亞鐵血紅素、鐵硫簇和其它，然而，輔酶是否存在或者是否依賴(lài)于輔酶不是本發(fā)明所必需的。在需要這些輔酶和/或這些輔酶有益的那些實(shí)施方案中， 系統(tǒng)優(yōu)選包括這些輔酶。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，SASP檢測(cè)設(shè)備/方法包括(a)經(jīng)設(shè)置和/或定位使其能電還原氧的陰極，和(b)經(jīng)設(shè)置和/或定位使其能電氧化氫、醇(例如，甲醇)、碳水化合物(例如，葡萄糖)、羧酸(例如，甲酸)或羧酸酯(例如，甲酸甲酯)的陽(yáng)極。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選的是，系統(tǒng)包含一種或多種電解質(zhì)。在使用這些電解質(zhì)時(shí)，電解質(zhì)可以選自，特別是，氧化還原反應(yīng)中常用的電解質(zhì)，特別是，電池、燃料電池、生物燃料電池等。一般地，系統(tǒng)中的電解質(zhì)，比如本發(fā)明某些實(shí)施方案中使用的，例如，其中在陽(yáng)極產(chǎn)生質(zhì)子，促進(jìn)那些質(zhì)子向陰極傳遞，在陰極發(fā)生與氧化劑的反應(yīng)。在包含膜的燃料電池中，質(zhì)子交換膜通常用來(lái)分隔陽(yáng)極和陰極，并且可選地，能用于從一個(gè)電極傳導(dǎo)質(zhì)子到另一個(gè)電極。在無(wú)膜的燃料電池中，電解質(zhì)通常促進(jìn)質(zhì)子移動(dòng)至必需的電極。適用于本發(fā)明的實(shí)施方案中的電解質(zhì)實(shí)例包括，但不限于鹽、酸和堿。電解質(zhì)能以溶解鹽、酸或堿的形式引入和/或存在，例如，可以以聚合鹽、酸或堿的形式引入和/或存在。優(yōu)選的實(shí)施方案包括系統(tǒng)，其中電解質(zhì)，例如鹽，還能作為緩沖液。實(shí)例包括，但不限于，那些包含磷酸、檸檬酸和乙酸的鹽。特別優(yōu)選的是PH范圍在約2-7中的鹽緩沖液。在某些實(shí)施方案中，催化劑/氧化還原部分的功能包括催化陽(yáng)極還原劑或陰極氧化劑的電化學(xué)反應(yīng)。優(yōu)選的氧化還原催化劑可以包括能可逆地轉(zhuǎn)移電子的組分，包括(但不限于)酶和有機(jī)金屬氧化還原絡(luò)合物。優(yōu)選的氧化還原催化劑是酶。合適的酶的代表性實(shí)例包括，但不限于葡萄糖氧化酶(GOx)、乳酸脫氫酶(LDH)、 果糖脫氫酶、膽堿氧化酶、乙醇脫氫酶、氨基酸氧化酶、細(xì)胞色素等。有多種酶可與陰極關(guān)聯(lián)使用，包括，例如用于氧的電還原的漆酶和細(xì)胞色素C氧化酶；和用于過(guò)氧化氫電還原的過(guò)氧化物酶。相似地，可用于陽(yáng)極的酶包括用于氫的電氧化的氫化酶；用于甲醇、其它醇、葡萄糖、乳酸和其它底物的電氧化的氧化酶和脫氫酶；用于甲醇電氧化的醇氧化酶、甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶；用于D-葡萄糖、L-山梨糖和D-木糖的電氧化的吡喃糖氧化酶；和，用于葡萄糖電氧化的葡萄糖氧化酶、寡糖脫氫酶和吡咯并喹啉醌(PQQ)葡萄糖脫氫酶?？捎糜诒景l(fā)明的酶的非限定性列表在美國(guó)專(zhuān)利No. 6，294，281中給出，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。用于本發(fā)明的更優(yōu)選的酶是選自氧化還原酶組的那些酶，該組包含(但不限于) 漆酶、抗壞血酸氧化酶、細(xì)胞色素c氧化酶、多銅氧化酶、膽紅素氧化酶、藍(lán)銅氧化酶、醇氧化酶、甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶、L-乳酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、微生物丙酮酸氧化酶和兒茶酚氧化酶。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，陰極更優(yōu)選漆酶。通常地，漆酶(多酚-氧化酶[EC 1.10.3.2])是多銅氧化酶，其與四個(gè)底物分子的單電子氧化耦合，將二氧經(jīng)過(guò)四電子還原而成為水。因此，漆酶可用于SASP檢測(cè)設(shè)備和方法中將二氧經(jīng)過(guò)生物催化還原成水。已經(jīng)分離并測(cè)序了編碼漆酶不同同等型的幾個(gè)基因 (例如，變色栓菌(Trametes versicolor)、絨毛栓菌(T. pubescens)、毛云芝菌(Coriolus hirsutus)和平菇(Pleurotus ostreatus)；并且，已經(jīng)進(jìn)行了很多工作從生物化學(xué)上鑒別這些酶(Galhaup C.等人，Microbiology，2002 Jul ； 148 (Pt 7) :2159-2169 ；Leitner C.等人，Appl Biochem Biotechnol. 2002 Spring :98-100 :497-507 ；Galhaup C.等人， Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Jul ；56 (1-2) :225-232 ；Gorbatova 0. N.等人，Prikl Biokhim Microbiol. 2000 May-Jun ；36 (3) :272-277)。本發(fā)明使用的底物是能進(jìn)行催化氧化或還原反應(yīng)的那些底物。優(yōu)選地，底物通常是有機(jī)物質(zhì)。代表性底物的實(shí)例包括，特別是，糖分子(例如葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖， 等)；羥基或羧基化合物(例如乳酸、乙醇、甲醇、甲酸，等)、ATP、碳源、氮源、磷源、硫源、氨基酸或任何能作為氧化還原反應(yīng)底物的其它有機(jī)材料，并且更優(yōu)選地，可作為氧化還原類(lèi)型酶的底物。特別優(yōu)選的是，根據(jù)氧化底物的能力選擇酶系統(tǒng)，其表現(xiàn)出下述一種或多種性質(zhì) (i)容易獲取，( )容易進(jìn)行意欲發(fā)生的氧化還原反應(yīng)，和(iii)能從所述氧化還原反應(yīng)獲得多余的電子用于SASP設(shè)備和/或方法。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選的酶是非氧特異性黃素蛋白或醌蛋白，具體為葡萄糖氧化酶和葡萄糖脫氫酶。其它黃素蛋白包括醛氧化酶(醛)、乙醇酸氧化酶(乙醇酸)、谷胱甘肽還原酶(AND (P) H)、乳酸氧化酶(乳酸)、L-氨基酸氧化酶(L-氨基酸)、硫辛酰胺脫氫酶(NADH)、丙酮酸氧化酶(丙酮酸)、肌氨酸氧化酶(肌氨酸)、膽堿氧化酶(膽堿)和黃嘌呤氧化酶(黃嘌呤)，其中括號(hào)內(nèi)注釋了酶的特異性底物。在其它實(shí)施方案中，優(yōu)選的酶是醌蛋白酶如，例如，甲胺脫氫酶(甲胺)和甲醇脫氫酶(甲醇和其它醇)。在其它實(shí)施方案中，優(yōu)選的酶是包含亞鐵血紅素的酶，其能由二茂鐵氧化，比如， 例如，辣根過(guò)氧化物酶(過(guò)氧化氫)、乳酸脫氫酶(乳酸)和酵母細(xì)胞色素C過(guò)氧化物酶(過(guò)
氧化氫)。在其它實(shí)施方案中，優(yōu)選的酶是銅蛋白酶，例如，半乳糖氧化酶(半乳糖)和金屬黃素蛋白酶一氧化碳氧化還原酶(一氧化碳)。此外，酶可以源自嗜熱生物體，從而增加酶隨時(shí)間和保存過(guò)程中的穩(wěn)定性。在那些使用嗜熱酶的實(shí)施方案中，反應(yīng)可選地在高溫進(jìn)行。通過(guò)在高溫操作，擴(kuò)散速率決定步驟的速度加快，從而獲得更高的靈敏度和產(chǎn)出。來(lái)自嗜熱生物體的酶通常稱(chēng)作熱穩(wěn)定酶。熱穩(wěn)定酶的代表性實(shí)例包括來(lái)自嗜熱真 ^myceliophthora thermophilia 的漆醇、來(lái)自嗜熱細(xì)菌 PS3 禾口 thermus thermophilus 的細(xì)胞色素C過(guò)氧化物酶，來(lái)自大豆的過(guò)氧化物酶，和來(lái)自白腐真菌phlebiopsis gigantea 的吡喃糖氧化酶。其它商業(yè)提供的熱穩(wěn)定酶包括來(lái)自芽孢桿菌的L-乳酸脫氫酶，來(lái)自棲熱菌菌種的蘋(píng)果酸脫氫酶，來(lái)自曲霉的葡萄糖氧化酶，來(lái)自芽孢桿菌的微生物丙酮酸氧化酶和尿酸氧化酶。可將較大的生物分子水解成可電氧化的糖的熱穩(wěn)定酶包括，例如，來(lái)自嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillus stearothermophi lus)的α-淀粉酶，來(lái)自曲霉的β-淀粉酶， 來(lái)自rhizopus niveus的葡聚糖_1，4_ α -葡糖苷酶，來(lái)自黑曲霉的纖維素酶，來(lái)自黑曲霉的內(nèi)切葡聚糖酶，來(lái)自腸膜狀明串珠菌(leuconostoc mesenteroides)的葡聚糖酶，來(lái)自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-葡糖苷酶，來(lái)自caldocellum saccharolyticum的 β-葡糖苷酶，來(lái)自曲霉的β-半乳糖苷酶，來(lái)自酵母的β-呋喃果糖苷酶，和來(lái)自米曲霉的漆酶。此外，無(wú)論酶本質(zhì)是否熱穩(wěn)定，優(yōu)選的酶都可以固定化在絕緣無(wú)機(jī)或有機(jī)聚合物基質(zhì)上來(lái)增加酶的熱穩(wěn)定性。關(guān)于無(wú)機(jī)聚合物基質(zhì)中酶固定化的討論可以在美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，972，199和PCT公開(kāi)WO 98/35053中找到，每篇文獻(xiàn)均通過(guò)引用并入本文。溶劑凝膠聚合過(guò)程通過(guò)在室溫或接近室溫的溫度聚合合適的單體，提供無(wú)機(jī)聚合物基質(zhì)(例如，玻璃)的制備方法。合適的單體包括，例如，金屬和半導(dǎo)電元素的醇鹽和酯，優(yōu)選的金屬和半導(dǎo)電元素包括Si、Al、Ti、^ 和P。這些優(yōu)選的單體包括硅，并且硅和氧的比例從約1 2 至約1 4。例如，酶可以通過(guò)溶劑凝膠過(guò)程固定化在硅聚合物基質(zhì)中，比如通過(guò)水解四甲氧基硅烷或包含一個(gè)或多個(gè)硅原子的其它聚脂肪氧基硅烷。得到的硅醇在存在酶的條件下壓縮，實(shí)現(xiàn)酶的包埋。這個(gè)過(guò)程稱(chēng)作溶劑凝膠固定化。酶在硅或其它由溶劑凝膠形成的無(wú)機(jī)聚合物基質(zhì)中的結(jié)合能使酶穩(wěn)定。葡萄糖氧化酶、糖蛋白在硅溶劑凝膠基質(zhì)中的包埋顯著改善酶的穩(wěn)定性，在水中加熱至98°C 10分鐘仍可保持活性。通過(guò)硅溶劑凝膠基質(zhì)穩(wěn)定的酶可以研磨成細(xì)粉，并分散在硅樹(shù)脂，優(yōu)選彈性硅樹(shù)脂，最優(yōu)選基于水的彈性硅樹(shù)脂前體中。然后對(duì)作為酶粘合劑的陰極進(jìn)行這種分散。粘合劑優(yōu)選包括從環(huán)境提取并儲(chǔ)存氧的材料。由于其溶氧能力和氧滲透性，硅是這層中優(yōu)選的粘合劑。由于有較高的溶氧能力，優(yōu)選彈性硅。酶在無(wú)機(jī)聚合物基質(zhì)中的穩(wěn)定性，至少部分地，依賴(lài)于酶的離子性質(zhì)和固定化，通常是無(wú)機(jī)的聚合物基質(zhì)的性質(zhì)。水合硅凝膠的等電點(diǎn)(Pi)(即，分子上的凈電荷為零時(shí)的 pH)在PH 5附近。已經(jīng)證明葡萄糖氧化酶，pi = 3. 8，經(jīng)過(guò)溶劑凝膠固定化后可以保持活性，并且在水合硅凝膠基質(zhì)中固定時(shí)可以穩(wěn)定，從而使酶在63°C的半衰期增加約200倍。另一方面，乳酸氧化酶(Pi = 4. 6)和乙醇酸氧化酶(pi ^ 9. 6)，在固定化與水合硅凝膠中時(shí)各損失至少70%的活性，并且這兩個(gè)酶的穩(wěn)定性未顯著改善。與單獨(dú)這些酶在水合硅中的活性損失相反，已經(jīng)表明，當(dāng)使用聚(1-乙烯基咪唑) (PVI)(弱堿)或聚(次乙亞胺)(PEI)(更強(qiáng)的堿)在水合硅凝膠中形成加合物時(shí)，乳酸氧化酶(pi = 4. 6)的半衰期在63°C增加超過(guò)100倍，并且酶固定而沒(méi)有活性的顯著損失。加合物可以通過(guò)，例如將乳酸氧化酶溶于含水緩沖液中而形成，其中聚(1-乙烯基咪唑)共溶解，并且乳酸氧化酶-聚(1-乙烯基咪唑)混合物通過(guò)溶劑凝膠過(guò)程固定在硅中，獲得穩(wěn)定、固定化的乳酸氧化酶。穩(wěn)定的乳酸氧化酶可以在水中加熱至90°C 10分鐘，并且仍然保持酶活性。與聚(次乙亞胺)可以形成能保持酶活的相似的加合物。
人們認(rèn)為乳酸和乙醇酸氧化酶的功能上必要的帶正電荷的表面殘基(例如，精氨酸)可以與水合硅的帶負(fù)電荷的聚硅酸陰離子相互作用，使活性在溶劑凝膠固定化后降低。然而，當(dāng)由靈活的聚陽(yáng)離子緩沖液(即，PVI和/或PEI，依賴(lài)于酶的等電點(diǎn))封裝酶表面時(shí)，聚硅酸陰離子可以與陽(yáng)離子緩沖液分子相互作用，而不與酶的陽(yáng)離子殘基作用，從而通過(guò)包裝于硅凝膠中而使酶穩(wěn)定。因此，人們認(rèn)為PVI和PEI形成加合物，作為酶如乳酸氧化酶的聚陽(yáng)離子緩沖液作用。PEI還作為酶如乙醇酸氧化酶的陽(yáng)離子緩沖液作用。人們認(rèn)為PVI對(duì)于乙醇酸氧化酶來(lái)說(shuō)是較不優(yōu)選的緩沖液，可能因?yàn)橐掖妓嵫趸甘歉鼜?qiáng)的堿這一事實(shí)。通常地，在溶劑凝膠固定化之前加入聚陽(yáng)離子，比如，例如，聚(1-乙烯基咪唑)或聚(次乙亞胺)可以使酶穩(wěn)定。優(yōu)選地，加入的聚陽(yáng)離子是比酶堿性更強(qiáng)的聚電解質(zhì)。等電點(diǎn)較高的酶經(jīng)常需要堿性更強(qiáng)的聚電解質(zhì)來(lái)穩(wěn)定。聚(次乙亞胺)比聚(ι-乙烯基咪唑) 的堿性更強(qiáng)。聚(1-乙烯基咪唑)，在pH 7時(shí)的聚陽(yáng)離子，能在這一pH與酶如乳酸氧化酶結(jié)合， 所述酶在PH 7時(shí)為聚陰離子。因此，向特定的酶加入特定的聚合物能增加酶的穩(wěn)定性。對(duì)于乳酸氧化酶，加入聚(次乙亞胺)，其還是聚堿性聚合物，并在PH 7時(shí)多質(zhì)子化，取代聚 (1-乙烯基咪唑)，能改善酶的穩(wěn)定性，盡管改善程度不如加入優(yōu)選的聚合物，聚(ι-乙烯基咪唑)。與單獨(dú)將酶穩(wěn)定與溶劑凝膠中(如果可能的話(huà))相比，這種穩(wěn)定化的酶通常能在更高的溫度使用，和/或使用更長(zhǎng)的時(shí)間。固定并穩(wěn)定化酶的溶劑凝膠基質(zhì)經(jīng)常不是導(dǎo)電體。然而，這種類(lèi)型的基質(zhì)能通過(guò)將氧化還原官能基團(tuán)結(jié)合，通常通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合至基質(zhì)或其前體而修飾。合適的氧化還原官能基團(tuán)的實(shí)例包括，特別是，上述用于氧化還原聚合物中的氧化還原部分，包括，例如，具有配位體的鋨、釕和鈷絡(luò)合物，所述配位體包括一個(gè)或多個(gè)吡啶和/或咪唑環(huán)。此外，這種構(gòu)建體的氧化還原官能基團(tuán)優(yōu)選包括共價(jià)或配位附著于氧化還原官能基團(tuán)的金屬陽(yáng)離子或一個(gè)配合基的間隔臂。間隔臂的一個(gè)末端與，例如，基質(zhì)的硅原子共價(jià)連接。間隔臂的另一個(gè)末端與氧化還原官能基團(tuán)共價(jià)或配位連接。酶可以在這種基質(zhì)中固定化，并且使用與基質(zhì)偶聯(lián)的氧化還原官能基團(tuán)，可以在酶和電極之間交換電子。在一些實(shí)施方案中，在基質(zhì)中安置抗腐蝕的導(dǎo)電顆粒，增加基質(zhì)的導(dǎo)電性；特別地，對(duì)于那些包括附著的氧化還原官能基團(tuán)的基質(zhì)。這種顆粒的實(shí)例包括石墨、炭黑、金和二氧化釕。通常地，這些顆粒的直徑為l.mu.m或更小，并且表面積為lm2/g或更大，優(yōu)選地， 10m2/g或更大，并且，更優(yōu)選地，IOOmVg或更大。或者，可以水解VOCl3形成聚合物基質(zhì)，其在還原時(shí)可以導(dǎo)電。在其它實(shí)施方案中，將酶固定并穩(wěn)定化于溶劑凝膠基質(zhì)中，并且酶催化化合物的反應(yīng)，形成之后在存在與電極電偶聯(lián)的第二酶的情況下電氧化或電還原的產(chǎn)物。例如，葡萄糖可以在存在穩(wěn)定化于溶劑凝膠基質(zhì)中的葡萄糖氧化酶的情況下反應(yīng)形成葡萄糖酸內(nèi)酯和過(guò)氧化氫。過(guò)氧化氫擴(kuò)散出溶劑凝膠基質(zhì)，到達(dá)陰極附近，并由熱穩(wěn)定性酶如大豆過(guò)氧化物酶電還原成水。水，其通常是很多生物系統(tǒng)中主要的物質(zhì)傳遞介質(zhì)，是電絕緣體。盡管很多化合物的溶解能力在水中較高，但是這些化合物在含水介質(zhì)中缺乏電子傳遞的情況下不能電解。 這能通過(guò)各種方法完成，包括，例如，使用氧化還原聚合物，并且具體為氧化還原溶劑凝膠。如果氧化還原聚合物包括可運(yùn)動(dòng)的活性氧化還原官能基團(tuán)，并且能在分析物和電極之間攜帶電子，那么氧化還原聚合物通?？商峁╇娮拥某渥氵\(yùn)輸。例如，氧化還原溶劑凝膠通常包含大量水。水溶性反應(yīng)物和產(chǎn)物經(jīng)常同在水中擴(kuò)散一樣盡快滲透過(guò)氧化還原溶劑凝膠。氧化還原溶劑凝膠中的電子傳導(dǎo)通過(guò)聚合物段之間的電子交換實(shí)現(xiàn)，所述聚合物段在聚合物水合后可運(yùn)動(dòng)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，陽(yáng)極氧化還原聚合物和/或陰極氧化還原聚合物分別沉積在陽(yáng)極和陰極上。通常，氧化還原聚合物包含可電還原和可電氧化的離子、功能、部分或具有氧化還原勢(shì)的其它分子和/或部分體。優(yōu)選地，這些氧化還原勢(shì)定義明確。氧化還原溶劑凝膠的氧化還原勢(shì)通常在使水既不電氧化也不電還原的范圍內(nèi)。在中性PH和25°C， 對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)甘汞電極(SCE)，這個(gè)范圍是從約(_)0.65V至約(+)0. 58V(即，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)氫電極 (SHE)，從約(_)0.42V至約(+)0. 81V)。對(duì)于陽(yáng)極氧化還原聚合物，氧化還原勢(shì)的優(yōu)選范圍是從約-0. 65V至約+0. 05V(SCE)。對(duì)于陰極氧化還原聚合物，氧化還原勢(shì)的優(yōu)選范圍是從約 +0. 3V 至約 +0. 7V (SCE)。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選的氧化還原聚合物包括與隨后能固定在工作電極上的聚合物相結(jié)合的氧化還原物質(zhì)。通常，適用于本發(fā)明的氧化還原聚合物具有在樣品分析期間可防止或基本減少氧化還原物質(zhì)擴(kuò)散損失的結(jié)構(gòu)或電荷。氧化還原物質(zhì)和聚合物之間的結(jié)合可以是共價(jià)、配位或離子型。有用的氧化還原聚合物和用于產(chǎn)生所述聚合物的方法的實(shí)例在美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，262，035 ；5，262，305 ；5，320，725 ；5，264，104 ；5，264，105 ；5，356，786 ； 5，593，852和5，665，222中描述，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。盡管任何有機(jī)或有機(jī)金屬氧化還原物質(zhì)都可以與聚合物結(jié)合并用作氧化還原聚合物，但是優(yōu)選的氧化還原物質(zhì)包括過(guò)渡金屬化合物或絡(luò)合物。在這種實(shí)施方案中，優(yōu)選的過(guò)渡金屬化合物或絡(luò)合物包括鋨、釕、 鐵和鈷化合物或絡(luò)合物。在優(yōu)選的絡(luò)合物中，過(guò)渡金屬配位結(jié)合在一個(gè)或多個(gè)配位體上，并共價(jià)結(jié)合在至少一個(gè)其它配位體上。配位體經(jīng)常是單、二、三或四配位基。更優(yōu)選的配位體是異環(huán)氮化合物，比如，例如，吡啶和/或咪唑衍生物。例如，多配位基配位體通常包括多個(gè)吡啶和/或咪唑環(huán)。或者，可以使用結(jié)合聚合物的金屬茂絡(luò)合物衍生物，比如，例如，二茂鐵。這類(lèi)氧化還原聚合物的實(shí)例是具有增加水中氧化還原聚合物膨脹功能的聚(乙烯基二茂鐵)或聚(乙烯基二茂鐵)的衍生物。另一類(lèi)氧化還原聚合物包含離子結(jié)合氧化還原物質(zhì)。通常，這類(lèi)介體包括與帶相反電荷的氧化還原物質(zhì)偶聯(lián)的帶電荷聚合物。這類(lèi)氧化還原聚合物的實(shí)例包括帶負(fù)電的聚合物如與多個(gè)帶正電的氧化還原物質(zhì)如鋨或釕聚吡啶陽(yáng)離子偶聯(lián)的Nafion (DuPont)。 離子結(jié)合的介體的另一個(gè)實(shí)例是帶正電的聚合物如與帶負(fù)電的氧化還原物質(zhì)如鐵氰化物或亞鐵氰化物結(jié)合的季銨化聚乙烯基吡啶)或聚(1-乙烯基咪唑)。優(yōu)選的離子結(jié)合氧化還原物質(zhì)經(jīng)常是在結(jié)合在帶相反電荷的聚合物中的帶多個(gè)電荷的聚陰離子氧化還原部分?？梢允褂枚喾N方法在電極表面上固定氧化還原聚合物，并且本發(fā)明的實(shí)施方案不限于任何本文所述或本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的特定方法。一個(gè)代表性的方法是吸附固定。這種方法對(duì)于具有相對(duì)較高的分子量的氧化還原聚合物特別有用。聚合物的分子量可以通過(guò)例如交聯(lián)而增加。氧化還原聚合物的聚合物可以包含官能基團(tuán)，比如，例如，酰阱、氨、醇、雜環(huán)氮、乙烯基、烯丙基和羧酸基團(tuán)，其能使用交聯(lián)劑交聯(lián)。這些官能基團(tuán)可以在聚合物或者一個(gè)或多個(gè)共聚物上提供?？蛇x地或此外，可以通過(guò)反應(yīng)如季銨化加入官能基團(tuán)。一個(gè)實(shí)例是用溴乙胺基團(tuán)季銨化的pvp?；蛘?，將酶固定化在不導(dǎo)電的無(wú)機(jī)或有機(jī)聚合物基質(zhì)中，增加酶的熱穩(wěn)定性。關(guān)于酶在無(wú)機(jī)聚合物基質(zhì)中固定化的討論可以在美國(guó)專(zhuān)利No. 5，972，199和PCT公開(kāi)WO 98/35053中找到，所述文獻(xiàn)各自通過(guò)引用并入本文。溶劑凝膠聚合過(guò)程提供通過(guò)將合適的單體在接近室溫的溫度聚合而制備無(wú)機(jī)聚合物基質(zhì)(例如，玻璃)的方法。合適的單體可以包括，例如，金屬和半導(dǎo)電元素的醇鹽和酯，優(yōu)選的金屬和半導(dǎo)電元素包括Si、Al、Ti、& 和P。更優(yōu)選的單體包括硅，并且硅和氧的比例從約1 2至約1 4。例如，酶可以通過(guò)溶劑凝膠過(guò)程固定化在硅聚合物基質(zhì)中，比如通過(guò)水解四甲氧基硅烷或包含一個(gè)或多個(gè)硅原子的其它聚脂肪氧基硅烷。得到的硅醇在存在酶的條件下壓縮，實(shí)現(xiàn)酶的包埋。這個(gè)過(guò)程稱(chēng)作溶劑凝膠固定化。酶在硅或其它由溶劑凝膠形成的無(wú)機(jī)聚合物基質(zhì)中的結(jié)合能使酶穩(wěn)定。葡萄糖氧化酶、糖蛋白在硅溶劑凝膠基質(zhì)中的包埋顯著改善酶的穩(wěn)定性，在水中加熱至98°C 10分鐘仍可保持活性。通過(guò)硅溶劑凝膠基質(zhì)穩(wěn)定的酶可以研磨成細(xì)粉，并分散在硅樹(shù)脂，優(yōu)選彈性硅樹(shù)脂，最優(yōu)選基于水的彈性硅樹(shù)脂前體中。然后作為酶粘合劑的陰極進(jìn)行這種分散。粘合劑優(yōu)選包括從環(huán)境提取并儲(chǔ)存氧的材料。由于其溶氧能力和氧滲透性，硅是這層中優(yōu)選的粘合劑。由于有較高的溶氧能力，優(yōu)選彈性硅。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用雙酶系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含第一酶(El)，催化從反應(yīng)底物RSl產(chǎn)生第一反應(yīng)產(chǎn)物(RPl)的反應(yīng)，和第二酶(E2)，催化從反應(yīng)底物(RS2)產(chǎn)生第二反應(yīng)產(chǎn)物(RP》的反應(yīng)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以選擇這些酶，使其能提供熱動(dòng)力學(xué)有優(yōu)勢(shì)的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，同時(shí)從RSl到電極的過(guò)電壓較低。特別有優(yōu)勢(shì)的是，限制El和 E2部分體的相對(duì)距離和方向。通常，沒(méi)有相對(duì)定位，反應(yīng)將受到擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)的限制-即，受到由El產(chǎn)生的RPl擴(kuò)散至E2并作為RS2作用所需的時(shí)間的限制。這通常是速度決定步驟。優(yōu)選的是，電子轉(zhuǎn)移/產(chǎn)生反應(yīng)所需的酶經(jīng)過(guò)定向，使所有必需的反應(yīng)成分的相互作用接近最大化。優(yōu)選方法包括對(duì)酶進(jìn)行限定。這種限定方法在本領(lǐng)域中已知，并且包括，特別是，使用間隔分子、融合蛋白、絡(luò)合體形成等。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，催化劑/酶經(jīng)過(guò)設(shè)置，使酶電極包含導(dǎo)電底盤(pán)，和與導(dǎo)電底盤(pán)電連接的酶。在某些實(shí)施方案中，酶包含第一酶和第二酶的融合蛋白，所述第一酶催化從第一反應(yīng)底物產(chǎn)生第一反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)反應(yīng)，第二酶催化從第二底物產(chǎn)生第二反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)反應(yīng)，并且至少部分第一反應(yīng)產(chǎn)物與至少部分第二反應(yīng)底物相同。在本發(fā)明某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶電極與用于檢測(cè)底盤(pán)的檢測(cè)部分相關(guān)聯(lián)，并且在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，導(dǎo)電底盤(pán)直接或間接地與RF產(chǎn)生電路的電路電連通，使電流能為所述電路提供能量。在某些實(shí)施方案中，使用具有上述結(jié)構(gòu)的酶電極作為陽(yáng)極。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用雙酶的酶電極，El和E2之間的相對(duì)距離較小，使得從El的RSl到電極的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)有效進(jìn)行。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，氧化還原物質(zhì)可以與一個(gè)或多個(gè)酶催化系統(tǒng)聯(lián)合使用，或者取代一個(gè)或多個(gè)酶催化系統(tǒng)。合適的氧化還原物質(zhì)包括，例如，與下述組成絡(luò)合物的鋨陽(yáng)離子(a)兩個(gè)二配位基配位體，比如2，2’ - 二吡啶、1，10-鄰二氮雜菲，或它們的衍生物(兩個(gè)配位體不必相同)，(b) 一個(gè)三配位基配位體，比如2，2’，2”-三聯(lián)吡啶和2，6-二(咪唑-2-基)_吡啶，或(C) 一個(gè)二配位基配位體和一個(gè)三配位基配位體。合適的鋨過(guò)渡金屬絡(luò)合物包括，例如，[(bpy)20sCl]+/2\ [(dimet)20sCl]+/2\ [ (dmo)20sCl]+/2\ [ter0sCl2]+/2\ [triOsCl2]+0/+禾口 [ (ter) (bpy) 0s]+2/+3，其中 bpy 是 2，2，-二吡啶，dimet 是 4，4，- 二甲基 _2，2，- 二吡啶，dmo 是 4，4，- 二甲氧基-2，2，- 二吡啶，ter 是 2，2，，2”-三聯(lián)吡啶，并且trimet是4，4，，4” -三甲基-2，2，，2” -三聯(lián)吡啶。氧化還原物質(zhì)經(jīng)?？焖俚卦诒舜撕碗姌O之間交換電子，使絡(luò)合物快速被氧化和/ 或還原。通常，鐵絡(luò)合物比釕絡(luò)合物更容易氧化，然后，其比鋨絡(luò)合物更容易氧化。此外，氧化還原勢(shì)通常隨配位雜環(huán)數(shù)目增加。通常地，用作氧化還原聚合物的聚合物具有含氮雜環(huán)，比如吡啶、咪唑，或它們的衍生物，用于作為配位體與氧化還原物質(zhì)結(jié)合。合適的與氧化還原物質(zhì)如上述過(guò)渡金屬絡(luò)合物形成絡(luò)合物的聚合物，包括，例如，聚(1-乙烯基咪唑)(稱(chēng)作“PVI”)和聚乙烯基吡啶)(稱(chēng)作“PVP”)的聚合物和共聚物，以及聚(丙烯酸)或聚丙烯酰胺的聚合物和共聚物，其已經(jīng)通過(guò)加入含氮側(cè)雜環(huán)如吡啶和咪唑而修飾。聚(丙烯酸)的修飾可以通過(guò)至少部分羧酸官能團(tuán)與氨烷基吡啶或氨烷基咪唑如4-乙基氨吡啶反應(yīng)形成氨基化合物而進(jìn)行。 PVI、PVP和聚(丙烯酸)的合適的共聚物替代物包括丙烯腈、丙烯酰胺、丙烯酰阱和取代或季銨化N-乙烯基咪唑。共聚物可以是隨機(jī)或嵌段共聚物。過(guò)渡金屬絡(luò)合物通常與聚合物的含氮雜環(huán)(例如，咪唑和/或吡啶)共價(jià)或配位結(jié)合?；蛘?，過(guò)渡金屬絡(luò)合物可以包含乙烯基官能基團(tuán)，通過(guò)所述基團(tuán)，絡(luò)合物能與乙烯雜環(huán)、氨基化合物、亞硝酸、羧酸、硫酸或其它常用的乙烯化合物共聚合，特別是對(duì)于那些聚合物已知可溶于水或在水中膨脹的化合物。通常，鋨或釕過(guò)渡金屬絡(luò)合物與咪唑和/或吡啶基團(tuán)的比例從1 10至1 1，優(yōu)選從1 2至1 1，并且更優(yōu)選地從3 4至1 1。通常，溶劑凝膠的氧化還原勢(shì)，至少部分地，依賴(lài)于聚合物，氧化還原勢(shì)的順序?yàn)榫?丙烯酸)< PVI < PVP?？梢允褂枚喾N方法在電極表面上固定氧化還原聚合物。一種方法是吸附固定。這種方法對(duì)于分子量相對(duì)較高的氧化還原聚合物特別有用。可以通過(guò)例如交聯(lián)而增加聚合物的分子量。氧化還原聚合物的聚合物可以包含官能基團(tuán)，比如，例如，酰阱、氨、醇、雜環(huán)氮、 乙烯基、烯丙基和羧酸基團(tuán)，其能使用交聯(lián)劑交聯(lián)。這些官能基團(tuán)可以在聚合物或者一個(gè)或多個(gè)共聚物上提供。可選地或此外，可以通過(guò)反應(yīng)如季銨化加入官能基團(tuán)。一個(gè)實(shí)例是用溴乙胺基團(tuán)季銨化PVP。合適的交聯(lián)劑包括，例如，具有兩個(gè)或多個(gè)環(huán)氧化物的分子(例如，聚(乙二醇) 二縮水甘油醚(PEGDGE))、醛、氮雜環(huán)丙烷、烷基鹵化物和疊氮化物官能基團(tuán)，或它們的組合。交聯(lián)劑的其它實(shí)例包括可活化羧酸或其它酸性官能基團(tuán)以與氨或其它氮化合物縮合的化合物。這些交聯(lián)劑包括碳二亞胺或具有活性N-羥基琥珀酸亞胺或咪唑官能基團(tuán)的化合物。交聯(lián)劑的其它實(shí)例是醌(例如，四氯苯醌和四氰基苯醌二甲烷)和氰尿酰氯。也可以使用其它交聯(lián)劑。在一些實(shí)施方案中，不需要額外的交聯(lián)劑。進(jìn)一步的討論和交聯(lián)與交聯(lián)劑的實(shí)例可以在美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，262，035 ；5，262，305 ；5，320，725 ；5，264，104 ；5，264，105 ； 5，356，786和5，593，852中找到，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)電極表面的功能化然后將氧化還原聚合物化學(xué)結(jié)合， 經(jīng)常是共價(jià)結(jié)合至電極表面的官能基團(tuán)，從而將氧化還原聚合物固定化。這類(lèi)固定化的實(shí)例首先是聚G-乙烯基吡啶)。聚合物的吡啶環(huán)部分地與可還原/可氧化的物質(zhì)如
"2+形成絡(luò)合物，其中bpy是2，2’ - 二吡啶。部分吡啶環(huán)通過(guò)與2-溴乙胺反應(yīng)而季銨化。然后將聚合物交聯(lián)，例如，使用二環(huán)氧化物，比如聚(乙二醇)縮水甘油醚。可以修飾碳表面以附著酶/氧化還原物質(zhì)或聚合物，例如，通過(guò)重氮鹽的電還原。 說(shuō)明性地，將對(duì)氨基苯甲酸重氮化后形成的重氮鹽還原，用苯基羧酸官能基團(tuán)修飾碳表面。 這些官能基團(tuán)可以通過(guò)碳二亞胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺氯化物 (EDC)活化?？梢栽谌剂想姵氐闹辽俨糠蛛姌O上形成可選的防污涂層，通常所述部分接觸反應(yīng)化合物。防污涂層防止或阻礙大分子如分子量為5000道爾頓或更多的蛋白質(zhì)滲透進(jìn)入 SASP設(shè)備的電極。這可以使用聚合物膜或涂層完成，所述膜或涂層的孔尺度分別小于待排除或具有陰離子和/或陽(yáng)離子官能基團(tuán)的生物分子，所述基團(tuán)可抵制陰離子或陽(yáng)離子大分子。這種生物分子可將電極和/或電解層弄臟，從而降低SASP設(shè)備的效率，并改變預(yù)期的電能產(chǎn)生。電極污染還可能降低SASP設(shè)備的有效期。例如，SASP設(shè)備的電極可以完全或部分用防污涂層涂布在外層上。優(yōu)選的防污涂層是聚合物，比如溶劑凝膠，其在用包含分析物的流體平衡時(shí)包含至少重量百分比為20% 的流體。合適聚合物的實(shí)例在美國(guó)申請(qǐng)No. 5，593，852中描述，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文，并且包括交聯(lián)的聚氧化乙烯，比如聚氧化乙烯四丙烯酸酯和二丙烯酸酯。例如，通常為 8-18千道爾頓的聚氧化乙烯(“ΡΕ0”)鏈最終用反應(yīng)活性基團(tuán)修飾，比如丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯。此外，PEO的二酯可以與星形聚合物PEO聚氨反應(yīng)，形成防污涂層。由于氧化還原類(lèi)型酶的氧化還原中心本質(zhì)上難以接近，所以?xún)?yōu)選使用一個(gè)或多個(gè)電子介體(mediator)。所述電子介體能由任何已知方法產(chǎn)生，包括，但不限于，將介體與酶物理混合，介體直接或間接與酶關(guān)聯(lián)，增強(qiáng)電子從反應(yīng)物或期望底物-酶絡(luò)合物到電極的轉(zhuǎn)移。對(duì)于使用葡萄糖作為底物的酶系統(tǒng)，合適的電子介體的代表性實(shí)例包括電子受體，比如二茂鐵衍生物(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利No. 4，545，382和4，711，245)、鐵朊和/或鐵朊，順鉬和相似的化合物、膠體金化合物和/或衍生物、醌、各種有機(jī)染料、有機(jī)氧化還原聚合物(例如聚苯胺)、無(wú)機(jī)氧化還原基質(zhì)(例如，普魯士藍(lán))等。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選的介體化合物是金屬茂絡(luò)合物，其為包含兩個(gè)有機(jī)環(huán)結(jié)構(gòu)的有機(jī)金屬化合物，所述有機(jī)環(huán)結(jié)構(gòu)各自具有共軛不飽和性，并且在環(huán)中間夾有金屬原子，使金屬原子與不飽和環(huán)共電子接觸。二茂鐵和取代的二茂鐵化合物特別適用，因?yàn)槎F能為各種酶介導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移。二茂鐵(環(huán)二戊烯鐵)和取代的二茂鐵化合物是特別有效的介體，其具有依賴(lài)于 PH的電化學(xué)可逆單電子氧化還原性質(zhì)，依賴(lài)于pH的氧化還原勢(shì)，還原形式自氧化較慢，不存在任何已知的毒性或致癌問(wèn)題，氧化還原勢(shì)足夠低，以避免過(guò)多地受到競(jìng)爭(zhēng)性的、氧化還原勢(shì)較高的反應(yīng)的干擾，氧不靈敏性令人滿(mǎn)意，以避免過(guò)多地受到氧的干擾，和共價(jià)附著于聚合物骨架的能力。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物中不存在低分子量二茂鐵物質(zhì)，因?yàn)檫@種物質(zhì)能作為自由擴(kuò)散的電子轉(zhuǎn)移介體作用。二茂鐵介導(dǎo)化合物的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是能通過(guò)取代環(huán)戊二烯環(huán)上的電子供給或吸取基團(tuán)而在廣泛的范圍內(nèi)控制氧化還原勢(shì)。優(yōu)選的取代二茂鐵包括，但不限于，1，1’-二甲基二茂鐵、乙烯基二茂鐵、羥乙基二茂鐵、1，1’ -雙(羥甲基)二茂鐵、羧基二茂鐵、二茂鐵基單羧酸、1，1’ - 二羧基二茂鐵和三甲基氨二茂鐵。其它優(yōu)選的介體化合物包括二茂釕、二苯鉻、吩嗪和吩嗪衍生物、紫羅堿、核黃素、 對(duì)苯醌和萘醌。通常，相對(duì)于SCE，優(yōu)選能共價(jià)附著與聚合物骨架并且氧化還原勢(shì)在-0. 2至
0.6V之間的氧化還原化合物。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，供體/受體中繼共價(jià)附著于彈性聚合物骨架上。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過(guò)硅氧烷聚合物提供彈性聚合物骨架。聚硅氧烷骨架獨(dú)特的彈性，其旋轉(zhuǎn)時(shí)幾乎沒(méi)有能量阻礙，使得這些中繼部分與酶分子緊密地相互作用，并實(shí)現(xiàn)與電子轉(zhuǎn)移部分緊密的接觸。通常，各種實(shí)施方案中使用的催化劑包含標(biāo)準(zhǔn)還原勢(shì)大于+0. 4伏特的有機(jī)金屬陽(yáng)離子(電催化劑)。示例性的電催化劑是過(guò)渡金屬絡(luò)合物，比如鋨、釕、鐵、鎳、銠、錸和鈷絡(luò)合物。為獲得較大的電子自交換速率，優(yōu)選的使用這些絡(luò)合物的有機(jī)金屬陽(yáng)離子包括大的有機(jī)芳香基配位體。通常，電催化劑(電子轉(zhuǎn)移介體或氧化還原聚合物)是可通過(guò)降低電介體的標(biāo)準(zhǔn)還原勢(shì)而促進(jìn)導(dǎo)電體釋放電子的物質(zhì)。優(yōu)選的是，使用時(shí)，電催化劑存在的濃度可以促進(jìn)電子的有效轉(zhuǎn)移。優(yōu)選地，電催化劑存在的濃度使酶固定化材料導(dǎo)電。具體地，電催化劑存在的濃度從約IOOmM至約3M，更優(yōu)選地從約250mM至約2. 25M，更優(yōu)選地從約500mM至約2M，并且最優(yōu)選地從約1. OM至約
1.5M。在其它實(shí)施方案中，可以使用經(jīng)過(guò)氧化還原聚合物修飾的離子交換膜，其進(jìn)一步經(jīng)過(guò)修飾，包含電子轉(zhuǎn)移介體(例如，鋨或釕絡(luò)合物，或芳香基有機(jī)陽(yáng)離子)。很多電子轉(zhuǎn)移介體或氧化還原聚合物，其可用于本發(fā)明的實(shí)踐中，在本領(lǐng)域中已知或者在美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，262，035 ；5，262，305 ；5，320，725 ；5，264，105 ；5，356，786 ；5，593，852 ；5，665，222 ； 6，294，281和6，531，239中描述，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。醌分子衍生物是特別適合的電子介體。優(yōu)選的是，在為本目的而使用時(shí)，分子具有醌骨架，并且此外，具有能使其與聚合物或酶關(guān)聯(lián)的官能基團(tuán)(“介體絡(luò)合物”)。優(yōu)選的醌骨架包括萘醌分子衍生物。此外，更優(yōu)選由蒽醌-2-磺酸鈉(A0Q衍生物或2-甲基-1， 4-萘醌(VK3)衍生物組成的介體。另一個(gè)優(yōu)選的電子介體是2，2’ -次偶氮基雙(3-乙基苯并二氫噻唑-6-磺酸)和它的衍生物。用于關(guān)聯(lián)電子介體基團(tuán)的優(yōu)選的聚合物具有彈性骨架，例如，聚硅氧烷、聚磷腈、 聚(環(huán)氧乙烷)和聚(氧化丙烯)和/或選自下組的兩個(gè)或多個(gè)官能基團(tuán)氨基、羧基、甲?；⒘u基、鹵素基團(tuán)、二氫_2，5-呋喃二酮-1-基基團(tuán)和環(huán)氧丙基。合適的聚合物的實(shí)例包括，特別是，聚乙烯基咪唑、聚賴(lài)氨酸、聚烯丙基氨、聚乙烯基吡啶、聚吡咯、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚丙烯和順丁烯二酸酐的接枝共聚物，和鄰甲酚熱塑性環(huán)氧酚醛樹(shù)脂。介體優(yōu)選用選自下組的官能基團(tuán)修飾氨基、羧基、氯甲?；?、琥珀酰亞胺氧羰基、烷基金屬磺基琥珀酰亞胺氧羰基、五氟苯基氧羰基、對(duì)硝基苯氧羰基、羥基、甲?；Ⅺu素基團(tuán)、馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)、 異硫氰酸基團(tuán)和環(huán)氧乙基。美國(guó)專(zhuān)利No. 4，224，125公開(kāi)了酶電極，其中水溶性介體為聚合物形式，以保持固定化于電極表面附近，使電極表面過(guò)大而難于通過(guò)保留的膜滲透入溶液主體。在包含氧化還原介體位置的附近，通過(guò)酶催化過(guò)程還原聚合物氧化還原介體，并通過(guò)電極將其再氧化。有用的氧化還原聚合物和用于產(chǎn)生所述氧化還原聚合物的方法的實(shí)例在美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，262，035 ；5，262，305 ；5，320，725 ；5，264，104 ；5，264，105 ；5，356，786 ；5，593，852 和5，665，222中描述，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。優(yōu)選的是，使用的介體對(duì)于干擾物質(zhì)的存在，特別是氧，相對(duì)不夠靈敏。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，介體附著于電極或與電極關(guān)聯(lián)，附著或關(guān)聯(lián)的方式使其不溶于待分析的溶液，從而防止介導(dǎo)物質(zhì)從電極表面擴(kuò)散。根據(jù)與使用的酶系統(tǒng)正確相互作用的需要，介體分子(或下文的介體絡(luò)合物)可以是親水或疏水的。兩個(gè)或多個(gè)種類(lèi)的介體部分可以聯(lián)合使用，而不會(huì)削弱本發(fā)明的效果。此外，可以在官能基團(tuán)和介導(dǎo)分子之間提供間隔臂，保持中間具有合適的距離。依賴(lài)于聚合物或酶的種類(lèi)，間隔分子的具體長(zhǎng)度可以適當(dāng)?shù)馗淖?，介體分子可以與所述聚合物或酶結(jié)合而不損害其介體的功能。間隔分子的實(shí)例包括烴鏈、聚氧乙烯、聚乙二醇、聚丙二醇、肽等。間隔分子的長(zhǎng)度優(yōu)選在約3-50個(gè)碳原子之間。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，陰極與能催化氧化劑，優(yōu)選氧，還原成水的酶或酶裝配體關(guān)聯(lián)，并且可選地，和可增強(qiáng)陰極與酶之間電接觸的介體關(guān)聯(lián)。這種酶或酶裝配體的實(shí)例是漆酶和由細(xì)胞色素c/細(xì)胞色素氧化酶(COx)形成的絡(luò)合物。對(duì)于漆酶，例如，電子最終轉(zhuǎn)移至氧化劑(例如，分子氧(02)，產(chǎn)生水。在這個(gè)實(shí)例中，酶儲(chǔ)存四個(gè)電子，而在O2還原途徑中不釋放中間體。對(duì)于細(xì)胞色素c/細(xì)胞色素氧化酶(COx)，細(xì)胞色素c介導(dǎo)的電子向細(xì)胞色素氧化酶的轉(zhuǎn)移還導(dǎo)致氧的四電子還原，生成水。應(yīng)該注意的是，本文所述實(shí)施方案，包括附圖中所描述的，可以在陽(yáng)極和陰極之間有或者沒(méi)有膜的情況下操作。沒(méi)有膜的操作可以用本發(fā)明的實(shí)施方案提供顯著的優(yōu)勢(shì)。
SASP檢測(cè)設(shè)備/方法能，特別是，針對(duì)使用的具體應(yīng)用而以多種形式使用。下述示例性的實(shí)施方案意欲闡述本發(fā)明，而不應(yīng)理解為以任何方式對(duì)本發(fā)明的范疇的限定。實(shí)施例實(shí)施例1參照?qǐng)D示SASP設(shè)備的圖3，其能可選地用于儀器中，并使用溢流“芯片”設(shè)計(jì)。然而，必須承認(rèn)并理解的是，基于本發(fā)明的概念可以制造很多其它裝配體/形式。圖3描述根據(jù)本發(fā)明的“溢流”類(lèi)實(shí)施方案類(lèi)型的代表性實(shí)例(未按比例)。液體能從進(jìn)入口 40 (其與流路30連通)流至進(jìn)入口 50 (其與流路30連通)。位于流路30中的，是一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)區(qū)00)(圖6中所述代表性實(shí)例)。反應(yīng)區(qū) (20)包括多個(gè)電極之一，其代表性、非限定性實(shí)例在圖7中描述。在操作中，疑似包含靶標(biāo)分析物的樣品(未給出)與包含第一抗體的試劑(未給出)接觸，所述第一抗體與本發(fā)明的酶/氧化還原反應(yīng)的必要組分共軛結(jié)合(例如，葡萄糖氧化酶“GOx”)?？蛇x地，可以按需要混合其它試劑。將共軛結(jié)合Gox的抗體，其與存在的靶標(biāo)分析物(未給出)結(jié)合，通過(guò)進(jìn)入口 40引入芯片10。樣品穿過(guò)流路30，通過(guò)進(jìn)入口 50流出。在穿過(guò)流路期間，樣品量穿過(guò)反應(yīng)區(qū)20。反應(yīng)區(qū)O0)的數(shù)目依賴(lài)于待進(jìn)行的測(cè)試和進(jìn)行這些測(cè)試的應(yīng)用，并且可以根據(jù)需要變化。反應(yīng)區(qū)的數(shù)目可以在1-1000，優(yōu)選在 1-100，更優(yōu)選在1-50，更優(yōu)選在1-25，更優(yōu)選在2-20并且最優(yōu)選在1_10或2_10或者可選地，在1-5或2-5的范圍之間。
到達(dá)反應(yīng)區(qū)20時(shí)，樣品中存在的任何靶標(biāo)分析物分子可由第二抗體捕捉，從而 “固定化”帶有標(biāo)記的“三明治”。區(qū)20中的這種三明治固定化，將酶定位在區(qū)20中接近電極的位置，從而使氧化還原催化得以進(jìn)行，并產(chǎn)生電流，其隨后成為能量，直接或間接地，在存在酶底物(未給出)的時(shí)候產(chǎn)生信號(hào)傳導(dǎo)事件。加入酶底物(未給出)，優(yōu)選通過(guò)進(jìn)入口 40加入。與例如現(xiàn)有技術(shù)中的葡萄糖生物傳感器和其它診斷設(shè)備相反，反應(yīng)區(qū)20中酶/氧化還原元件的三明治捕捉明顯地不是為了檢測(cè)捕捉到的酶的底物。在這個(gè)實(shí)例中，與抗體共軛結(jié)合的Gox的定位不檢測(cè)葡萄糖的存在或存在的量，而是用作原位產(chǎn)生的生物燃料電池，其在加入葡萄糖時(shí)(例如，通過(guò)進(jìn)入口 40)，酶氧化還原系統(tǒng)能產(chǎn)生電流，并且從而，直接或間接地，得到能按照本發(fā)明的各種實(shí)施方案產(chǎn)生信號(hào)的系統(tǒng)。因此，不加入酶底物時(shí)， 信號(hào)傳導(dǎo)事件不能發(fā)生(或者可選地，相對(duì)于存在底物時(shí)，發(fā)生的水平足夠低，從而獲得可區(qū)分的信號(hào))。在優(yōu)選的操作中，將包含(或疑似包含)靶標(biāo)分析物的樣品懸浮于針對(duì)使用的具體系統(tǒng)合適的緩沖液中，并引入(手動(dòng)或自動(dòng)方法)流通芯片中。通過(guò)與所述RF電路關(guān)聯(lián)的捕捉部分捕捉底物。合適的捕捉部分包括能選擇性捕捉靶標(biāo)物/酶系統(tǒng)的任何部分，其捕捉方式能將反應(yīng)定位于RF電路/電極絡(luò)合物附近。優(yōu)選的捕捉部分包括抗體，并且更優(yōu)選地包括單克隆抗體。捕捉絡(luò)合物優(yōu)選經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)，可將靶標(biāo)分析物與酶絡(luò)合物(或其組分) 即電極/電路絡(luò)合物相關(guān)聯(lián)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可選地沖洗流通芯片以去除未結(jié)合的試劑。然后向流通芯片入口(50)加入酶/氧化還原絡(luò)合物的特異性底物，從而通過(guò)催化劑 /氧化還原反應(yīng)催化產(chǎn)生電子。因此，在存在靶標(biāo)分析物時(shí)，獲得的絡(luò)合物將包括與電極/ RF電路絡(luò)合物關(guān)聯(lián)的所有必需的催化劑/氧化還原系統(tǒng)組分，并且從而導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測(cè)的 RF信號(hào)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以過(guò)量的摩爾數(shù)提供酶/氧化還原底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以10倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以100倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以1000倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以10000倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以100000倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以1000000倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以10000000倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。實(shí)施例2與例如現(xiàn)有技術(shù)中的葡萄糖生物傳感器和其它診斷設(shè)備相反，反應(yīng)區(qū)中酶/氧化還原元件的三明治捕捉明顯地不是為了檢測(cè)捕捉到的酶的底物。在這個(gè)實(shí)例中，與抗體共軛結(jié)合的GOx的定位不檢測(cè)葡萄糖是否存在或存在的量，而是用作原位產(chǎn)生的生物燃料電池，其在加入葡萄糖時(shí)，酶氧化還原系統(tǒng)能產(chǎn)生電流，并且從而，直接或間接地，得到能按照本發(fā)明的各種實(shí)施方案產(chǎn)生信號(hào)的系統(tǒng)。因此，不加入酶底物時(shí)，信號(hào)傳導(dǎo)事件不能發(fā)生 (或者可選地，相對(duì)于存在底物時(shí)，發(fā)生的水平足夠低，從而獲得可區(qū)分的信號(hào))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)區(qū)包含與RF電路關(guān)聯(lián)的電極，其關(guān)聯(lián)方式允許電子通過(guò)氧化還原酶系統(tǒng)從底物的所述還原/氧化轉(zhuǎn)移，使電流用于提供RF電路所需的poser，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以過(guò)量的摩爾數(shù)提供酶/氧化還原底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以10倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以100倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以1000倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以10000倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以100000倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以1000000倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)手持式檢測(cè)器檢測(cè)RF信號(hào)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中， 通過(guò)由電池提供能量的手持式檢測(cè)器檢測(cè)RF信號(hào)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)腕表式檢測(cè)器檢測(cè)RF信號(hào)。實(shí)施例3在優(yōu)選的操作中，將包含(或疑似包含)靶標(biāo)分析物的樣品懸浮于針對(duì)使用的具體系統(tǒng)合適的緩沖液中，并引入(手動(dòng)或自動(dòng)方法)流通設(shè)備主體中。通過(guò)與電極直接或間接關(guān)聯(lián)從而與電路(例如，RF電路)直接或間接關(guān)聯(lián)的捕捉部分，在反應(yīng)區(qū)內(nèi)捕捉底物。 合適的捕捉部分包括能選擇性捕捉靶標(biāo)物/酶系統(tǒng)的任何部分，其捕捉方式能將反應(yīng)定位于RF電路/電極絡(luò)合物附近。優(yōu)選的捕捉部分包括核酸和/或抗體，并且更優(yōu)選地包括單克隆抗體。捕捉絡(luò)合物優(yōu)選經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)，可將靶標(biāo)分析物與酶絡(luò)合物(或其組分)即電極/ 電路絡(luò)合物相關(guān)聯(lián)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可選地沖洗流通芯片以去除未結(jié)合的試劑。然后通過(guò)設(shè)備加入酶/氧化還原絡(luò)合物的特異性底物，從而通過(guò)催化劑/氧化還原反應(yīng)催化產(chǎn)生電子。因此，在存在靶標(biāo)分析物時(shí)，獲得的絡(luò)合物將包括與電極/RF電路絡(luò)合物關(guān)聯(lián)的所有必需的催化劑/氧化還原系統(tǒng)組分，并且從而導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測(cè)的RF信號(hào)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以過(guò)量的摩爾數(shù)提供酶/氧化還原底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以10倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以100倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以1000倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以10000倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以100000倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以1000000倍過(guò)量的摩爾數(shù)提供底物。實(shí)施例4在這個(gè)具體的實(shí)施方案中，在陽(yáng)極進(jìn)行葡萄糖的氧化反應(yīng)，并且在陰極進(jìn)行氧的還原反應(yīng)。葡萄糖氧化所需的酶(在這種情況下是葡萄糖氧化酶(GOx))和介體在陽(yáng)極作用，將由葡萄糖的氧化反應(yīng)釋放的電子從系統(tǒng)帶出。GOx通過(guò)反應(yīng)活性區(qū)的SASP反應(yīng)與陽(yáng)極關(guān)聯(lián)(參見(jiàn)，例如，圖1的元件20)。通過(guò)所示電路將電子從系統(tǒng)帶出，所述電路能根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生多種信號(hào)，包括，特別是，RF信號(hào)。在本實(shí)施例中使用葡萄糖作為“燃料”。實(shí)施例5在這個(gè)具體的實(shí)施方案中，在陽(yáng)極進(jìn)行葡萄糖的氧化反應(yīng)，并且在陰極進(jìn)行氧的還原反應(yīng)。葡萄糖氧化所需的酶(在這種情況下是葡萄糖脫氫酶(GDH))、輔酶(NADH)、心肌黃酶和介體在陽(yáng)極作用，將由葡萄糖的氧化反應(yīng)釋放的電子從系統(tǒng)帶出。GDH通過(guò)反應(yīng)活性區(qū)的SASP反應(yīng)與陽(yáng)極關(guān)聯(lián)(參見(jiàn)，例如，圖1的元件20)。通過(guò)所示電路將電子從系統(tǒng)帶出，所述電路能根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生多種信號(hào)，包括，特別是，RF信號(hào)。在本實(shí)施例中使用葡萄糖作為“燃料”。在本發(fā)明的SASP設(shè)備和方法優(yōu)選的陽(yáng)極，包括，例如，圖8和9的系統(tǒng)，生物系統(tǒng)中常見(jiàn)的一種或多種糖，醇，和/或羧酸被電氧化。用于陽(yáng)極還原劑電氧化的優(yōu)選的陽(yáng)極酶包括，例如，葡萄糖脫氫酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、果糖脫氫酶、醌血紅素蛋白醇脫氫酶、吡喃糖氧化酶、寡糖脫氫酶和乳酸氧化酶。使用高表面積石墨纖維/炭黑電極，使用聚丙烯或聚四氟乙烯作為粘合劑，形成陽(yáng)極的一個(gè)實(shí)施方案。然后將陽(yáng)極氧化還原聚合物和陽(yáng)極酶沉積在陽(yáng)極上?？梢酝ㄟ^(guò)下述限制陽(yáng)極電勢(shì)(a)陽(yáng)極酶的氧化還原勢(shì)，(b)陽(yáng)極處陽(yáng)極還原劑的濃度，和(c)陽(yáng)極氧化還原聚合物的氧化還原勢(shì)。已知的陽(yáng)極酶已報(bào)道的氧化還原勢(shì)相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)甘汞電極(SCE)為從約-0. 4V至約-0. 5V。通常，優(yōu)選的陽(yáng)極氧化還原聚合物的氧化還原勢(shì)至少比陽(yáng)極酶的氧化還原勢(shì)高約0. IV。因此，優(yōu)選的陽(yáng)極氧化還原聚合物的氧化還原勢(shì)可以為，例如，約-0. 3V至-0. 4V(SCE)，然而，陽(yáng)極氧化還原聚合物的電勢(shì)可以略高或略低，其至少部分依賴(lài)于陽(yáng)極氧化還原酶的氧化還原勢(shì)。在一些實(shí)施方案中，在陽(yáng)極附近提供一種或多種額外的酶，或者將其沉積在陽(yáng)極上。額外的酶將淀粉、纖維素、多糖和寡糖、二糖，和三糖，分解成可用作底物的糖、醇，和/ 或羧酸。這種催化劑的實(shí)例包括來(lái)自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶，來(lái)自曲霉的β-淀粉酶，來(lái)自rhizopus nineus的葡聚糖-I，4_ α -葡糖苷酶，來(lái)自黑曲霉的纖維素酶，來(lái)自黑曲霉的內(nèi)切-1-3⑷-β-葡聚糖酶，來(lái)自腸膜狀明串珠菌的β-葡糖苷酶，來(lái)自曲霉的β-半乳糖苷酶，來(lái)自酵母的β -呋喃果糖苷酶，和來(lái)自米曲霉的漆酶。實(shí)施例6可以參照?qǐng)D6和7，這兩張圖由側(cè)視圖和前視圖一起表示本發(fā)明的示例性一次性反應(yīng)室筒體。考慮到本發(fā)明能使用其作為自供電設(shè)備的特色，在野外，使用一次性筒體或相似的低成本、易操作的反應(yīng)室很重要。如圖6所示，反應(yīng)室固定在凸緣150上，其上附著反應(yīng)室隔離區(qū)130。隔離區(qū)，其與凸緣150的前表面一起，確定了反應(yīng)室的位置，所述隔離區(qū)便利地由低成本的模壓或擠壓塑料制成。更完整地如圖7所述，由圍封罩130和安裝凸緣150確定的反應(yīng)室體積很小。本發(fā)明的一個(gè)重要方面是測(cè)試少量樣品和靶標(biāo)物并產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的能力。將陰極110和陽(yáng)極 120涂布在凸緣150的表面上，或者安裝在上面，并延伸進(jìn)入反應(yīng)室。它們可以受到膜140 的保護(hù)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，陰極110在膜的覆蓋下，所述膜能?chē)娡炕蛲坎忌?，比如由質(zhì)子交換膜所制備的，如Nafion 。實(shí)施例7在本發(fā)明的很多實(shí)施方案中，期望在野外使用圖6和7中的一次性反應(yīng)室讀數(shù)，在其中獲得樣品，并且其中的信號(hào)可以反映是否存在靶標(biāo)物以及靶標(biāo)物的量。就此目的而言， 可以部署自供電設(shè)備，其包含必要的硬件并提供合適的軟件，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)以接收?qǐng)D6和7的一次性反應(yīng)室，比如圖8中下面所示。這個(gè)設(shè)備200由粗糙塑料制成，并且通過(guò)相似材料的帽子(圖9的330)連接，它們一起容納并保護(hù)必要的硬件、軟件和固件，包括儀表或傳感設(shè)備，以檢測(cè)陰極110和陽(yáng)極120之間電勢(shì)或電流。為了這個(gè)目的，檢測(cè)設(shè)備200的下半部分通過(guò)夾具(螺絲、螺栓、鉚釘?shù)?固定在頂部的330上，如圖9所示。如圖所示，設(shè)備200配有入口沈0，管道由此與多種輔助裝置相連，比如RFID設(shè)備M0，或計(jì)算機(jī)(臺(tái)式或iTouch 或相似的PDA或移動(dòng)電話(huà))250。信號(hào)可以保存或通過(guò)輔助設(shè)備廣播至遠(yuǎn)處，所述信號(hào)可以直接由設(shè)備200中提供的儀表讀出。設(shè)備200帶有插座或開(kāi)口 220，其意欲接收一次性反應(yīng)室100。如圖所示，插座或槽提供硬件連接的電接觸，以接收來(lái)自陰極110和陽(yáng)極120的電流。這些可以傳送至儀表或缺口電勢(shì)測(cè)量設(shè)備，或者如所指出的那樣，傳送至更復(fù)雜的設(shè)備，比如計(jì)算機(jī)，或者數(shù)據(jù)儲(chǔ)存裝置，然后可以訪(fǎng)問(wèn)所述裝置獲得檢測(cè)到的信號(hào)，或者可以傳播信號(hào)和相關(guān)數(shù)據(jù)，可以通過(guò)簡(jiǎn)單的電子連接件如USB電纜而連接。圖9中闡述了用于在向反應(yīng)室加入底物后即接收、測(cè)量并發(fā)送信號(hào)的完整的可部署于野外的設(shè)備，其中所述設(shè)備表示為300。320，帶有插入筒體的底盤(pán)，如圖所示，套有耐損傷蓋330。這些三明治結(jié)構(gòu)保護(hù)設(shè)備內(nèi)部，包括導(dǎo)線(xiàn)、軟件和以電勢(shì)為檢測(cè)信號(hào)的必要的硬件，通常表示為310。管道可以從設(shè)備340和350延伸，用于與輔助設(shè)備的相互連接。實(shí)施例8在一個(gè)實(shí)施方案中，陰極還原氣態(tài)02，其通常溶于生物流體或來(lái)自空氣。在燃料電池的另一個(gè)實(shí)施方案中，在陰極上或不在陰極上，在非酶催化的電極反應(yīng)或酶催化的反應(yīng)中形成過(guò)氧化氫，然后過(guò)氧化氫在陰極電還原。用于還原A和H2A的優(yōu)選的陰極酶包括， 例如，酪氨酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、大豆過(guò)氧化物酶、其它過(guò)氧化物酶、漆酶和/或細(xì)胞色素 C過(guò)氧化物酶。陰極的一個(gè)實(shí)施方案包括在至少部分陰極上形成的多孔膜。多孔膜具有可滲透& 和/或H2A的疏水外表面和可滲透O2和/或H2A的親水內(nèi)表面。在另一個(gè)實(shí)施方案中，陰極包括疏水修飾的多孔硅碳復(fù)合材料的外層，其由烷基三烷氧矽硅前體和炭黑形成。內(nèi)層是親水的硅-碳復(fù)合材料。在另一個(gè)實(shí)施方案中，電極是微孔的Teflon PTFE結(jié)合乙炔/ 炭黑電極。內(nèi)表面是經(jīng)過(guò)處理使其親水的等離子體。將氧化還原聚合物和酶沉積在陰極的內(nèi)表面上。當(dāng)陰極接觸來(lái)自血液或體液中的化時(shí)，陰極可以只包括與A傳遞生物流體接觸的親水表面?？梢酝ㄟ^(guò)下述限制陰極電勢(shì)(a)陰極酶的氧化還原勢(shì)，(b)陰極處陰極氧化劑的濃度，和(c)陰極氧化還原聚合物的氧化還原勢(shì)。已知的O2還原酶已報(bào)道的氧化還原勢(shì)相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)甘汞電極(SCE)為從約+0. 3V至約+0. 6V。通常，優(yōu)選的陰極氧化還原聚合物的氧化還原勢(shì)至少比酶的氧化還原勢(shì)高約0. IV。因此，優(yōu)選的氧化還原聚合物的氧化還原勢(shì)可以為，例如，約+0. 4V至+0. 5V (SCE)，然而，陰極氧化還原聚合物的電勢(shì)可以略高或略低，其至少部分依賴(lài)于陰極氧化還原酶的氧化還原勢(shì)。對(duì)于用作陰極氧化還原聚合物的鋨絡(luò)合物，通常，中心鋨原子的至少四個(gè)，經(jīng)常， 至少五個(gè)，并且，常常，全部六個(gè)可能的配位位點(diǎn)由氮原子占據(jù)?；蛘撸瑢?duì)于用作陰極氧化還原聚合物的釕絡(luò)合物，通常，可能的配位位點(diǎn)中的四個(gè)或更少，并且，經(jīng)常，三個(gè)或更少，由氮原子占據(jù)?；诮宦?lián)氧化還原聚合物的酶電極系統(tǒng)有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)。第一，使用電極表面上的交聯(lián)膜可以不再需要常規(guī)系統(tǒng)中經(jīng)常需要的膜，所述膜用于將酶限制在接近電極表面的少量體積。因此，使用交聯(lián)氧化還原膜往往可以簡(jiǎn)化酶電極的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。第二，產(chǎn)生電極的過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，可重復(fù)，并且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。第三，可以通過(guò)酶與聚合物基質(zhì)的相互作用使其穩(wěn)定，因此使熱變性減慢。而且，可以進(jìn)行物理保護(hù)，防止受到溶液中蛋白酶的攻擊，所述蛋白酶太大，難以通過(guò)聚合物膜擴(kuò)散。第四，這些材料的通用性使其可以針對(duì)具體應(yīng)用定制性質(zhì)。例如，交聯(lián)方法可以調(diào)整聚合物上的氧化還原勢(shì)、疏水性和電荷。第五，通過(guò)對(duì)聚合物進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑O(shè)計(jì)，可以阻礙干擾性電反應(yīng)活性物質(zhì)傳遞至電極表面和/或在這些表面上的吸附。第六，得到的電極通常堅(jiān)固并且在儲(chǔ)存過(guò)程中常表現(xiàn)出優(yōu)秀的穩(wěn)定性。第七，盡管已知酶可以在很多表面上快速變性，但是聚合物顯然意欲保護(hù)酶不在電極表面上快速變性。因此，這些酶電極事實(shí)上可以使用任何電極表面。此外，這些聚合物通常表現(xiàn)為基本生物相容。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用水溶性交聯(lián)劑聚乙二醇二縮水甘油醚(PEG-DGE， 圖3)與帶有氨基功能的氧化還原化合物和酶的賴(lài)氨酸組的氨基功能反應(yīng)。環(huán)氧化物和氨基之間的反應(yīng)特別有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榉磻?yīng)(1)不釋放低分子量物質(zhì)；(2)不顯著改變局部pH ； (3)不顯著改變氧化還原聚合物或酶上的電荷；和(4)與很多不同的酶相容。商業(yè)提供多種鏈長(zhǎng)的PEG-DGE。PEG-DGE和氨基之間的反應(yīng)在稀釋的水溶液中進(jìn)行得非常緩慢。因此， 在可顯著簡(jiǎn)化電極生產(chǎn)的應(yīng)用步驟之前，所有反應(yīng)物可以合并在一種溶液中。然后在溶液在電極表面上干燥時(shí)可以進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)直至反應(yīng)完全。室溫時(shí)膜的固化時(shí)間是M至48小時(shí)。實(shí)施例9固定化酶的示例性方案如下，本實(shí)施例中酶為葡萄糖氧化酶A.碳二亞胺處理1.從ftOtotech電極材料片上切下合適大小的電極片。2.將電極浸入乙醇約5分鐘，確保PTFE包被的粘合劑和襯里徹底潤(rùn)濕。3.從乙醇中取出電極，并用蒸餾水徹底洗滌，去除所有痕量乙醇。4.制備5ml (或者更少)的0. 15M 1_環(huán)己基_3_(2_嗎啉代)碳二亞胺對(duì)甲基甲苯磺酸在0. IM pH 4. 5乙酸緩沖液中的溶液，并在室溫將電極放入其中90分鐘?？梢允褂脵C(jī)械振蕩器輕輕攪拌。使電極漂浮在溶液表面上，不徹底潤(rùn)濕，并且由步驟2開(kāi)始重復(fù)進(jìn)行處理。5.取出電極并用蒸餾水徹底洗滌。將它們?cè)谑覝胤胖迷谛迈r制備的葡萄糖氧化酶 (5. Omg/ml)的pH 5. 6乙酸緩沖液溶液中90分鐘，輕輕進(jìn)行機(jī)械震蕩。6.從酶溶液中取出電極，并將其完全浸入0. IM乙酸緩沖液中。現(xiàn)在電極隨時(shí)可以使用。7.在4°C，在0. IM pH 5. 6乙酸緩沖液中保存電極。B.羰基二咪唑處理1.進(jìn)行上述步驟1并略去步驟2和3。2.制備N(xiāo)，N’ -羰基二咪唑的無(wú)水二甲基甲酰胺溶液(40mg/ml)。3.將溶液中的電極在室溫放置90分鐘，必要時(shí)輕輕機(jī)械攪拌。4.從溶液取出電極，干燥除去多余的羰基二咪唑溶液，然后在新鮮制備的葡萄糖氧化酶溶液中再放置90分鐘。5.進(jìn)行上述步驟6和7。C. DFDNB 處理1.進(jìn)行上述A中的步驟1-3。2.在硼酸鈉緩沖液(0. 1M，pH 8. 5)中徹底洗滌電極。3.制備1，6-二硝基-3，4-二氟基苯的甲醇溶液(0. 1021g/5ml)，并在室溫將電極在其中放置10分鐘。
4.取出電極，并用硼酸緩沖液徹底洗滌，然后在室溫在葡萄糖氧化酶溶液中再放置90分鐘。5.進(jìn)行上述A中的步驟6和7。其它類(lèi)型的偶聯(lián)劑可用于固定化過(guò)程，包括各種鏈長(zhǎng)的雙官能試劑，例如二亞酰
胺，比如二甲基丙二亞酰胺或二甲基辛二亞酰胺?？蛇x地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酶在結(jié)合樹(shù)脂的鍍鉬或鍍鈀碳粉支撐體上簡(jiǎn)單的吸收，即不交聯(lián)，對(duì)于一些酶有效，并且特別是對(duì)于葡萄糖氧化酶有效。通常地，但不是必需的，通過(guò)應(yīng)用適當(dāng)多孔的例如聚碳酸酯薄膜或膜，物理保護(hù)固定化酶的表面層，所述薄膜或膜當(dāng)然必須可以透過(guò)待測(cè)定的酶底物(葡萄糖)。這種膜在增加傳感器響應(yīng)時(shí)間上略占優(yōu)勢(shì)，但雖然如此，使用這種膜時(shí)，傳感器的響應(yīng)時(shí)間與常規(guī)酶電極可比，并且在很多情況下基本好于常規(guī)酶電極。與其它優(yōu)選的實(shí)施方案結(jié)合使用的代表性電極的物理維度，以及操作參數(shù)，比如輸出功率和電壓，至少部分地，是SASP設(shè)備組分的函數(shù)。SASP設(shè)備的開(kāi)路電壓能從例如0. 5 伏特至1. 2伏特，然而，本發(fā)明的SASP設(shè)備還能產(chǎn)生更大或者更小的電壓。最大功率點(diǎn)的電壓可以從例如0. 4至0. 8伏特。此外，兩個(gè)或多個(gè)燃料電池可以串聯(lián)和/或并聯(lián)，形成電壓和/或電流更大的復(fù)合SASP設(shè)備。SASP設(shè)備的體積輸出功率密度可以從例如約0. 5mff/ cm3至約5mW/cm3，然而，還能形成體積輸出功率密度更高或更低的SASP設(shè)備。重量輸出功率密度可以從例如約5mW/g至約50W/g，然而，還可以形成重量輸出功率密度更高或更低的燃料電池。輸出功率密度依賴(lài)于流經(jīng)SASP設(shè)備的流體。通常地，增加流速可增加輸出功率
也/又。實(shí)施例10提供下述非限定性的碳化實(shí)例。因?yàn)樘挤劭梢允褂萌魏魏线m的碳或石墨粉末， 其容易進(jìn)行之后的酶固定化，并且為此，相對(duì)于與酶的結(jié)合很弱的玻璃狀和玻璃質(zhì)的碳相比，應(yīng)當(dāng)使用在表面上具有高密度官能團(tuán)比如羧酸、氨基和含硫基團(tuán)的碳粉。粒度可以從 3-50nm,更通常地為5_30nm?？梢砸匀魏伪憷姆绞綄f(或鈀)沉積在碳顆粒上，例如氣相沉積、電化學(xué)沉積或簡(jiǎn)單地從膠體懸浮液吸附(對(duì)于某些實(shí)施方案優(yōu)選)，使基于碳的重量，鉬基團(tuán)金屬負(fù)荷占重量百分比的1-20%，優(yōu)選5-15%。然而，這些限定很實(shí)用但并非關(guān)鍵。鉬基團(tuán)金屬小于約時(shí)，除非使用非常靈敏的設(shè)備，否則輸出信號(hào)下降至在實(shí)踐中過(guò)低而無(wú)法測(cè)定的水平。高于約20%時(shí)，鉬金屬基團(tuán)負(fù)荷變得不經(jīng)濟(jì)，根據(jù)響應(yīng)時(shí)間、靈敏度等得到的額外的效益很小。事實(shí)上金屬負(fù)荷極高時(shí)，靈敏度開(kāi)始下降。在優(yōu)選的技術(shù)中，通過(guò)鉬或鈀化合物如氫氯鉬酸的氧化分解，或者更優(yōu)選鉬或鈀與可氧化配體的絡(luò)合物的氧化分解，在存在碳粉的情況下將碳粉鍍鉬或鍍鈀，從而以例如GB-A-1，357，494、美國(guó)專(zhuān)利No. 4，044，193和 4，166，143中教導(dǎo)的方式，將膠體尺度的鉬或鈀直接沉積在碳顆粒表面。在鍍鉬或鍍鈀后，使用合適的防水結(jié)合樹(shù)脂將鍍鉬或鍍鈀的碳粉鑄制成型，優(yōu)選使用氟碳樹(shù)脂如聚四氟乙烯，形成完全自支持的多孔模制結(jié)構(gòu)，其基本由結(jié)合鍍鉬或鍍鈀碳粉顆粒的所述樹(shù)脂組成，或者更通常地，這種結(jié)合樹(shù)脂的顆粒的多孔模制表面層與可導(dǎo)電的例如金屬、碳或石墨的基質(zhì)相結(jié)合。對(duì)于模制、結(jié)合樹(shù)脂的鍍鉬碳層的特別優(yōu)選的基質(zhì)材料是如美國(guó)專(zhuān)利No. 4，229，490所教導(dǎo)的碳紙，或者如美國(guó)專(zhuān)利No. 4，293, 396所教導(dǎo)的開(kāi)口碳布。為了保持最大的孔隙度，用作粘合劑的樹(shù)脂的量應(yīng)該是提供電極層的機(jī)械完整性和穩(wěn)定性所需的最小量，這種電極層的厚度經(jīng)常不超過(guò)約0. 1-0. 5mm，盡管也可以使用更大的厚度。由于受到結(jié)構(gòu)完整性、機(jī)械強(qiáng)度和孔隙度需要的限制，結(jié)合樹(shù)脂的量不重要，并且基于鍍鉬或鍍鈀碳粉的量可以低至重量百分比5或10 %，高達(dá)80 %，但是量更通常地在重量百分比30-70%的范圍內(nèi)?？梢允褂酶鞣N樹(shù)脂，包括導(dǎo)電或半導(dǎo)電的樹(shù)脂，但是優(yōu)選合成氟碳樹(shù)脂，特別是聚四氟乙烯。考慮到氧化過(guò)程中需要少量但是必需的氧，粘合劑必需可透過(guò)氧?？蛇x地，如美國(guó)專(zhuān)利No. 4，293, 396中所公開(kāi)的，將鍍鉬碳顆粒灌注入預(yù)制成的多孔碳布中并使用氟碳樹(shù)脂優(yōu)選聚四氟乙烯與其結(jié)合。然而，可以理解的是，本發(fā)明不限于使用Prototech材料，而是包括包含結(jié)合樹(shù)脂和模制的鍍鉬或鍍鈀碳顆粒的其它相似基質(zhì)材料。具體地，也期望使用如美國(guó)專(zhuān)利No. 4，2 ，490中公開(kāi)的燃料電池電極類(lèi)型的材料，即包含碳紙支撐膜的碳紙電極類(lèi)型，優(yōu)選用防水樹(shù)脂如聚四氟乙烯灌注的類(lèi)型，并在其上，例如，通過(guò)絲網(wǎng)印刷，沉積結(jié)合樹(shù)脂的催化劑層，其中包含鉬黑和與防水樹(shù)脂優(yōu)選聚四氟乙烯結(jié)合的碳或石墨顆粒的均一混合物。可以使用多種建立成熟的固定化技術(shù)進(jìn)行酶在結(jié)合樹(shù)脂的、鍍鉬或鍍鈀碳基質(zhì)上的固定化，例如，與碳二亞胺或羰基二咪唑試劑共價(jià)結(jié)合，與1，6- 二硝基-3，4- 二氟基苯 (DFDNB)共價(jià)結(jié)合，或用戊二醛交聯(lián)。實(shí)施例11使用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)(TriLinkBioTechnologies, Inc. San Diego, CA)合成捕捉2寡核苷酸#100003_15_氨基(5’氨基經(jīng)過(guò)修飾，長(zhǎng)15個(gè)核苷酸)。 5， -AGGATGACACCTAGA-3，然后使用NAP-5柱(NaHC03/NaCl的0. 1M/0. 15M緩沖液，pH 8. 3)純化寡核苷酸。 將0. 2ml寡核苷酸#100003_15_氨基的IOOuM水溶液載入到柱上。在推入0. 3ml后，收集 0. 8ml洗脫液并定量。根據(jù)A26tl讀數(shù)，觀(guān)察到回收率超過(guò)90%。然后使用琥珀酰亞氨基4-甲?；妆剿狨?C6-SFB)對(duì)純化的寡核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾。將790 μ 1純化的寡核苷酸與 36 μ 1 C6-SFB (20mM的DMF溶液)混合，并在室溫溫育2小時(shí)。使用5ml HiTrap (GE)脫鹽柱凈化反應(yīng)產(chǎn)物，并收集1. 5ml洗脫液。根據(jù)A26tl讀數(shù)， 觀(guān)察到寡核苷酸-C6-SFB的回收率超過(guò)80%。使用NAP-5柱(IXPBS緩沖液，pH 7. 2)純化來(lái)自黑曲霉的葡萄糖氧化酶(Fluka， 49180)。將0. 25ml葡萄糖氧化酶(5mg/ml)載入到柱上。在推入0. 25ml后，收集Iml洗脫液并定量。根據(jù)A28tl讀數(shù)，觀(guān)察到葡萄糖氧化酶的回收率為1. 25mg/ml (7. 8uM)。然后使用琥珀酰亞氨基4-酰基煙酸丙酮腙(C6-SANH)對(duì)純化的葡萄糖氧化酶進(jìn)行化學(xué)修飾。將950 μ 1 7. 8uM葡萄糖氧化酶與10. 4 μ 1 C6-SANH(10mM的DMF溶液)混合 (1 20的比例)，并在室溫溫育30分鐘。使用5ml HiTrap (G^脫鹽柱凈化反應(yīng)產(chǎn)物，并收集 1. 25ml 洗脫液。使用 BCA/BSA(BCA 分析來(lái)自 Pierce,目錄號(hào) 23225/23227 ；Bradford 分析來(lái)自Pierce，目錄號(hào)23236)分析確定回收的葡萄糖氧化酶-C6-SANH的濃度(通常約 lmg/ml，得率高于95% )。通常通過(guò)以1 2的摩爾比例混合1010 μ 1葡萄糖氧化酶-C6-SANH和750 μ 1寡核苷酸-C6-SFB并在室溫過(guò)夜溫育而實(shí)現(xiàn)葡萄糖氧化酶和寡核苷酸的共軛結(jié)合。在TBE/ UREA凝膠上分析得到的共軛結(jié)合物，并使用MiniQ FPLC純化。采用標(biāo)準(zhǔn)梯度方法，使用 MiniQ 4. 6/50PE 柱(GE Healthcare,目錄號(hào) 17-5177-01)，流速 0. 25ml/分鐘，在 ^Onm 檢測(cè)。緩沖液 A :20mM Tris/HCl, pH 8. 1，緩沖液 B :20mM Tris/HCl, NaCl 1M, pH 8. 1。使用 BCA/BSA分析方法確定回收的葡萄糖氧化酶-捕捉2寡核苷酸共軛結(jié)合物的濃度(約3ml 洗脫液，0. 15mg/ml)。實(shí)施例12DNA-酶共軛結(jié)合物的制備使用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)(TriLinkBioTechnologies, Inc. San Diego, CA)合成捕捉2寡核苷酸#100003_15_氨基(5’氨基經(jīng)過(guò)修飾，長(zhǎng)15個(gè)核苷酸)。 5， -AGGATGACACCTAGA-3，然后使用NAP-5柱(NaHC03/NaCl的0. 1M/0. 15M緩沖液，pH 8. 3)純化寡核苷酸。將0. 2ml寡核苷酸#100003_15_氨基的IOOuM水溶液載入到柱上。在推入0. 3ml后， 收集0.8ml洗脫液并定量。根據(jù)A26tl讀數(shù)，觀(guān)察到回收率超過(guò)90%。然后使用商業(yè)提供的 Lightning-Link葡萄糖氧化酶共軛試劑盒 Qnnova Biosciences Ltd,Cambridge,UK.目錄號(hào)706-0010)，按照略作修改的生產(chǎn)商規(guī)程，使純化的寡核苷酸與葡萄糖氧化酶共軛結(jié)合。 簡(jiǎn)而言之，向40 μ 1經(jīng)過(guò)氨基酸修飾的寡核苷酸(50uM的水溶液)中加入4 μ 1改性劑。將得到的44μ 1溶液加入1/2小瓶的LL-Gox中，并在室溫于暗處過(guò)夜溫育。溫育后，向反應(yīng)混合物中加入5 μ 1猝滅劑，并在室溫于暗處溫育30分鐘。然后通過(guò)Micron YM-100離心柱(Millipore，USA)純化得到的共軛結(jié)合物，除去過(guò)量的氨基修飾寡核苷酸。簡(jiǎn)而言之，將50 μ 1結(jié)合物載入柱中，并以SOOOrpm離心8分鐘。 棄去流通液。向柱中加入200 μ 1 IX (50mM)PBS (50mM, pH 7. 5)，并以8000rpml離心8分鐘。棄去流通液。向柱中加入50μ1 IX PBS (torn mM, pH 7. 5)，使用旋渦震蕩仔細(xì)混合幾秒鐘，并以2000rpm離心2分鐘。50 μ 1純化的捕捉1寡核苷酸。收集酶共軛結(jié)合物，并在 4°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例13固定DNA-寡核苷酸(dT)M磁珠的制備使用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)CTriLink BioTechnologies, Inc. San Diego, CA)合成捕捉 1 寡核苷酸 #100003_19_polyA (長(zhǎng) 36 個(gè)核苷酸)。5，-GTGATCGGGAGTGTGTCCAAAAAAAAAA AAAAAAAA-3，然后使用NAP-5柱(NaHC03/NaCl的0. 1M/0. 15M緩沖液，pH 8. 3)純化寡核苷酸。 將0. 2ml寡核苷酸#100003_15_氨基的IOOuM水溶液載入到柱上。在推入0. 3ml后，收集 0.8ml洗脫液并定量。根據(jù)A26tl讀數(shù)，觀(guān)察到回收率超過(guò)90%。然后用寡核苷酸((11%5磁珠(Dynabeads Oligo (dT)25, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA.目錄號(hào) 610)將純化的寡核苷酸退火。簡(jiǎn)而言之，用1 X 結(jié)合緩沖液(20mM Tris_HCl，pH 7. 5，1. OM LiCl，2mM EDTA)將 30 μ 1 磁珠懸浮液洗滌兩次。每次均使用磁性顆粒濃縮儀(Dynal MPCtm-S, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA.目錄號(hào)120. 20D)分離磁珠。在最后一次洗滌后，將磁珠懸浮于30 μ 1結(jié)合緩沖液中，并與2. 6 μ 1捕捉1寡核苷酸#100003_19_polyAQ6皮摩爾)混合。通過(guò)加入水和0. 01 % Tween20，使最終的反應(yīng)體積達(dá)到45 μ 1終體積，并在室溫連續(xù)旋轉(zhuǎn)溫育(約30-45分鐘)。溫育后，使用磁性顆粒濃縮儀將退火的磁珠分離，棄去上清液。然后用洗滌緩沖液B(10mM Tris-HCl,pH 7.5,0. 15M LiCl，ImM EDTA)洗滌磁珠(3次)，用儲(chǔ)存緩沖液寡核苷酸(dT)25 ( 2 5 0mM Tris-HCl，pH 7. 5， 20mM EDTA，0. 1% Tween-20,0. 02% NaN3)洗滌一次，再懸浮于30 μ 1儲(chǔ)存緩沖液寡核苷酸 (dl%5中，并保持于4°C備用。實(shí)施例14靶標(biāo)物劑的結(jié)合與去除多余的DNA-酶共軛結(jié)合物(模型系統(tǒng)研究)使用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)(TriLinkBioTechnologies, Inc. San Diego, CA)合成DNA 靶標(biāo)物劑，寡核苷酸100003_39 (長(zhǎng)39個(gè)核苷酸)，并如實(shí)施例11所述純化。5’_TGGACACA CTCCCGATCACCACGATCTAGGTGTCATCCT-3'根據(jù)實(shí)施例11或者作為替代方法的實(shí)施例12中描述的共軛結(jié)合過(guò)程，將捕捉2 寡核苷酸#100003_15_氨基與來(lái)自黑曲霉的葡萄糖氧化酶(Fluka，49180)共軛結(jié)合。通常獲得0. 15mg/ml共軛結(jié)合物。平行地，根據(jù)實(shí)施例13中描述的退火過(guò)程制備捕捉1寡核苷酸固定化寡核苷酸 (dl%5磁珠。為了重構(gòu)IOOfmol靶標(biāo)物劑的模型系統(tǒng)，將寡核苷酸100003_39作為標(biāo)準(zhǔn)， 和0.5pmol捕捉2寡核苷酸-葡萄糖氧化酶共軛結(jié)合物一起加入Iyg人基因組 DNA(Clontech，Palo Alto, CA.目錄號(hào)#636401)中。將得到的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移進(jìn)包含 0. 5pmol已洗滌并干燥的捕捉1寡核苷酸固定化-寡核苷酸(dl%5磁珠的管中并輕輕混合。 在室溫連續(xù)旋轉(zhuǎn)進(jìn)行1小時(shí)雜交。通過(guò)用6XSSPE(0. 9M NaCl,60mM NaH2PO4,6mM EDTA)洗滌(3次)而去除未結(jié)合的捕捉2寡核苷酸-葡萄糖氧化酶共軛結(jié)合物。每次均施用磁性顆粒濃縮儀(Dynal MPCtm-S, Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA.目錄號(hào) 120. 20D)分離磁珠。在最后一次洗滌后， 仔細(xì)去除上清液，將剩余的磁珠再懸浮于ΙΟμΙ 2Μ磷酸鉀緩沖液(ρΗ 6.0)中并在4°C保存。 結(jié)合靶標(biāo)物劑的捕捉2寡核苷酸-葡萄糖氧化酶共軛結(jié)合物保留在磁珠上并可進(jìn)行檢測(cè)。平行地，作為陰性對(duì)照，用未加入靶標(biāo)物劑的1 μ g人基因組DNA建立相似的反應(yīng)。實(shí)施例15結(jié)合靶標(biāo)物劑的磁珠的檢測(cè)(模型系統(tǒng)研究)根據(jù)實(shí)施例14中描述的捕捉過(guò)程制備結(jié)合DNA靶標(biāo)物劑的磁珠。用100 μ 1 2Μ 磷酸鉀緩沖液(PH 6. 0)洗滌O次)得到的10 μ 1結(jié)合靶標(biāo)物劑的磁珠。每次均施用磁性顆粒濃縮儀(DynalMPCtm-S, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA.目錄號(hào)120. 20D)分離磁珠。在最后一次洗滌后，仔細(xì)去除上清液，將剩余的磁珠再懸浮于2-5 μ 1包含2M磷酸鉀緩沖液(ρΗ 6. 0)和0. ImMDCPIP (2,6- 二氯靛酚， 0. 1 μ g/ μ 1 BSA)的緩沖液中。平行地組裝檢測(cè)電池。檢測(cè)電池包含由NAFION膜N_117(FuelCellMore，San Diego, USA)分隔開(kāi)的2個(gè)反應(yīng)室(陽(yáng)極和陰極反應(yīng)室；參見(jiàn)，例如，圖44)。每個(gè)反應(yīng)室中插入金電極。金電極與具有iTrendCapture的Fluke 289 True-RMS工業(yè)萬(wàn)用表(Fluke，Everett, WA, USA)相連，進(jìn)行電勢(shì)或電流測(cè)定。向每個(gè)反應(yīng)室中加入20μ 1工作緩沖液(2M磷酸鉀緩沖液(pH 6. 0),0. ImM dcph^2，6-二氯靛酚))。 μ ι結(jié)合靶標(biāo)物的磁珠與ι μ IiM葡萄糖混合，并轉(zhuǎn)移進(jìn)陽(yáng)極反應(yīng)室(例如，圖44所示設(shè)備的頂部腔室)。連續(xù)或每隔5分鐘進(jìn)行電勢(shì)測(cè)定。通過(guò)測(cè)定電勢(shì)的增加(l-55mV范圍)而檢測(cè)DNA靶標(biāo)物劑的存在。在測(cè)定陰性對(duì)照反應(yīng)(無(wú)靶標(biāo)物劑；參見(jiàn)實(shí)施例14)期間檢測(cè)不到電勢(shì)。實(shí)施例16抗體-酶共軛結(jié)合物的制備使用NAP-5 柱(NaHC03/NaCl 的 0. 1M/0. 15M 緩沖液，pH 8. 3)純化捕捉抗體 2，一種抗小鼠a -人IL-8單克隆抗體(ICC，BD Pharmingen目錄號(hào)550419)，載入0. 5ml，推入 0. Iml并收集0. 7ml。根據(jù)A28tl讀數(shù)，觀(guān)察到小鼠α -人IL-8單克隆抗體回收率為0. 45mg/ ml ο然后使用琥珀酰亞氨基4-甲?；妆剿狨?C6-SFB)對(duì)純化的捕捉抗體2寡核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾。將660 μ 1純化的抗體與30 μ 1 C6-SFB (20mM的DMF溶液)混合(比例為 1 40)，并在室溫溫育2小時(shí)。使用5ml HiTrap (G^脫鹽柱凈化反應(yīng)產(chǎn)物，并收集1. 5ml 洗脫液。根據(jù)A26tl讀數(shù)，觀(guān)察到捕捉抗體2-C6-SFB的回收率超過(guò)80%。使用NAP-5柱(IXPBS緩沖液，pH 7. 2)純化來(lái)自黑曲霉的葡萄糖氧化酶(Fluka， 49180)。將0. 25ml葡萄糖氧化酶(5mg/ml)載入到柱上。在推入0. 25ml后，收集Iml洗脫液并定量。根據(jù)A28tl讀數(shù)，觀(guān)察到葡萄糖氧化酶的回收率為1. 25mg/ml (7. 8uM)。然后使用琥珀酰亞氨基4-酰基煙酸丙酮腙(C6-SANH)對(duì)純化的葡萄糖氧化酶進(jìn)行化學(xué)修飾。將950 μ 1 7. 8uM葡萄糖氧化酶與10. 4 μ 1 C6-SANH(10mM的DMF溶液)混合 (1 20的比例)，并在室溫溫育30分鐘。使用5ml HiTrap (G^脫鹽柱凈化反應(yīng)產(chǎn)物，并收集 1. 25ml 洗脫液。使用 BCA/BSA(BCA 分析來(lái)自 Pierce,目錄號(hào) 23225/23227 ；Bradford 分析來(lái)自Pierce，目錄號(hào)23236)分析確定回收的葡萄糖氧化酶-C6-SANH的濃度(通常約 lmg/ml，得率高于95% ) 通常通過(guò)以3 1的摩爾比例混合500 μ 1葡萄糖氧化酶-C6-SANH和750 μ 1捕捉抗體2-C6-SFB并在室溫過(guò)夜溫育，實(shí)現(xiàn)葡萄糖氧化酶和捕捉抗體2的共軛結(jié)合。在TBE/ UREA凝膠上分析得到的結(jié)合物，并使用MiniQ FPLC純化。采用標(biāo)準(zhǔn)梯度方法，使用MiniQ 4. 6/50ΡΕ柱(GE Healthcare,目錄號(hào) 17-5177-01)，流速 0.25ml/分鐘，在 ^Onm 檢測(cè)。緩沖液 A:20mM Tris/HCl, pH 8.1，緩沖液B :20mM Tris/HCl, NaCl 1M，pH 8. 1。使用BCA/BSA分析確定回收的葡萄糖氧化酶-捕捉抗體2結(jié)合物的濃度(約3ml洗脫液，0. lmg/ml)。實(shí)施例17抗體固定化磁珠的制備使用NAP-5 柱(NaHC03/NaCl 的 0. 1M/0. 15M 緩沖液，pH 8. 3)純化捕捉抗體 1，一種抗小鼠a -人IL-8單克隆抗體(ELISA捕捉，BD Pharmingen目錄號(hào)554716)，載入0. 5ml， 推入0.1ml并收集0.7ml。根據(jù)A28tl讀數(shù)，觀(guān)察到小鼠α _人IL-8單克隆抗體回收率為 0. 45mg/ml0平行地，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，用水溶性雙同官能團(tuán)NHS(N_羥基-琥珀酰亞氨基)-酯活化由伯胺衍生的磁珠(Dynabeads M-270 Amine, Invitrogen Corporation, Carlsbad,CA.目錄號(hào)610)。簡(jiǎn)而言之，將磁珠再懸浮于包含0. 15M NaCl的0. IM磷酸鈉緩沖液，PH 7. 4中。將NHS-酯，DTSSP(3，3，- 二硫雙磺基琥珀酰亞胺丙二酸)(Pierce，Rockford，IL, USA;目錄號(hào)21578)溶于水中，并直接加入至磁珠中。最終體積與從小瓶中初始移取的磁珠體積相等?；旌戏磻?yīng)物，并在室溫以緩慢的傾斜旋轉(zhuǎn)溫育30分鐘。溫育后，將管放在磁性顆粒濃縮儀(Dynal MPCtm-S, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA.目錄號(hào) 120. 20D)上 4分鐘，并去除上清液。用上述緩沖液再將磁珠洗滌2次。最后依次用冰冷的ImM HCl和冰冷的水洗滌NHS-酯活化的磁珠。然后加入0. 7ml捕捉抗體1，并以緩慢的傾斜旋轉(zhuǎn)在4°C 溫育2小時(shí)。(與待固定化的抗體量相比，通常使用摩爾量10倍過(guò)量的NHS-酯交聯(lián)劑。對(duì)于Dynabeads M-270 Amine的抗體涂層，建議使用3 μ g純抗體每IO7磁珠，并且終濃度為1-2 X IO9磁珠每ml)。溫育后，將管放在磁性顆粒濃縮儀上4分鐘并去除上清。加入0. 05M TrispH 7并在室溫以緩慢的傾斜旋轉(zhuǎn)溫育15分鐘，猝滅未反應(yīng)基團(tuán)。在包含PBS和0. 5% BSA的緩沖液中將磁珠洗滌4次。最后一次洗滌后，將有涂層的磁珠再懸浮于PBS和0. 1 % BSA中至1 X IO9磁珠/ml。為了保存涂布捕捉抗體1的磁珠，加入0. 02%疊氮化鈉并在4°C保存。實(shí)施例18靶標(biāo)物劑的結(jié)合與去除多余的DNA-酶共軛結(jié)合物(模型系統(tǒng)研究)根據(jù)實(shí)施例16中所述的共軛結(jié)合過(guò)程，將捕捉抗體2，一種抗小鼠α -人IL_8 單克隆抗體(用于ICC，BD Pharmingen目錄號(hào)550419)與來(lái)自黑曲霉的葡萄糖氧化酶 (Fluka,49180)共軛結(jié)合。根據(jù)實(shí)施例17中所述的固定化過(guò)程，制備由捕捉抗體1，一種抗小鼠α-人IL-8單克隆抗體(ELISA捕捉，BD Pharmingen目錄號(hào)554716)固定化氨基衍生的磁珠(Dynabeads M-270Amine, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA.目錄號(hào) 610)。上述單克隆抗體代表一對(duì)可識(shí)別重組人IL-8的兩種不同表位的抗體。為了重構(gòu)模型系統(tǒng)，將0.5yg靶標(biāo)物劑、重組人IL-8(BD Wiarmingen目錄號(hào) 554609,0. lmg/ml)作為標(biāo)準(zhǔn)，和捕捉抗體2-葡萄糖氧化酶共軛結(jié)合物(通常使用20 μ g) 一起加入FBS (胎牛血清白蛋白)。通過(guò)與胎牛血清白蛋白在室溫混合45分鐘而封閉15μ g(30y 1)捕捉抗體1固定化的磁珠。將得到的反應(yīng)混合物放在磁性顆粒濃縮儀上并棄去上清。將上述重構(gòu)的模型系統(tǒng)(人IL-8和捕捉抗體2-葡萄糖氧化酶共軛結(jié)合物)加入至已洗滌的捕捉抗體1-磁珠中，并且加PBS至反應(yīng)混合物終體積為500 μ 1。加入至BSA至終濃度為lmg/ml后，將反應(yīng)混合物在室溫以緩慢的傾斜旋轉(zhuǎn)溫育。通過(guò)用PBS洗滌(7次)而去除未結(jié)合的捕捉抗體2-葡萄糖氧化酶共軛結(jié)合物。在最后一次洗滌后，仔細(xì)去除上清，將剩余的磁珠再懸浮于10μ 1 2Μ磷酸鉀緩沖液(ρΗ 6.0) 中并在4°C保存。結(jié)合靶標(biāo)物劑的捕捉抗體2-葡萄糖氧化酶共軛結(jié)合物保留在磁珠上，并用于檢測(cè)。
平行地，作為陰性對(duì)照，不向FBS(胎牛血清)中加入靶標(biāo)物劑(人IL-8)而建立相似的反應(yīng)。實(shí)施例19結(jié)合蛋白靶標(biāo)物劑的磁珠的檢測(cè)(模型系統(tǒng)研究)根據(jù)實(shí)施例18中描述的捕捉過(guò)程制備結(jié)合蛋白靶標(biāo)物劑的磁珠。用100 μ 1 2Μ 磷酸鉀緩沖液(PH 6. 0)洗滌O次)得到的10 μ 1結(jié)合靶標(biāo)物劑的磁珠。每次均使用磁性顆粒濃縮儀(DynalMPCtm-S, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA.目錄號(hào)120. 20D)分離磁珠。在最后一次洗滌后，仔細(xì)去除上清液，將剩余的磁珠再懸浮于2-5 μ 1包含2M磷酸鉀緩沖液(ρΗ 6. 0)和0. ImMDCPIP (2,6- 二氯靛酚， 0. 1 μ g/ μ 1 BSA)的緩沖液中。平行地組裝檢測(cè)電池。檢測(cè)電池包含由NAFION膜N_117(FuelCellMore，San Diego, USA)分隔開(kāi)的2個(gè)反應(yīng)室(陽(yáng)極和陰極反應(yīng)室；參見(jiàn)，例如，圖44)。每個(gè)反應(yīng)室中插入金電極。金電極與具有iTrendCapture的Fluke 289True-RMS 工業(yè)萬(wàn)用表(Fluke，Everett，WA，USA)相連，進(jìn)行電勢(shì)或電流測(cè)定。向每個(gè)反應(yīng)室中加入20μ 1工作緩沖液(2M磷酸鉀緩沖液(pH 6. 0),0. ImM DCPIPOj-二氯靛酚))。Ιμ 結(jié)合靶標(biāo)物的磁珠與Ιμ IM葡萄糖混合，并轉(zhuǎn)移進(jìn)陽(yáng)極反應(yīng)室。連續(xù)或每隔5分鐘進(jìn)行電勢(shì)測(cè)定。通過(guò)測(cè)定電勢(shì)的增加(l_55mV范圍)而檢測(cè)蛋白靶標(biāo)物劑是否存在。在測(cè)定陰性對(duì)照反應(yīng)(無(wú)靶標(biāo)物劑；參見(jiàn)實(shí)施例18)期間檢測(cè)不到電勢(shì)。具體操作實(shí)施方式通過(guò)本發(fā)明基本試劑和過(guò)程的討論，可以獲得關(guān)于本發(fā)明性能的詳細(xì)信息。如同上文討論的每個(gè)實(shí)例，其依賴(lài)于電勢(shì)的產(chǎn)生，電勢(shì)可通過(guò)本發(fā)明的便攜式測(cè)試單元的工作電池檢測(cè)。該測(cè)試單元能接收測(cè)試模塊(一次性)，其包括膜，或無(wú)膜的測(cè)量腔室。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)試腔室是塑料孔，得到垂直法蘭的支撐，垂直法蘭上涂布兩個(gè)電極，電極間隔可操作的距離，可以通過(guò)關(guān)閉電路測(cè)定該距離之間的電勢(shì)。電極可以涂布在測(cè)試腔室支撐物上，并且可以?xún)?yōu)選地由金制成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，陰極用相似聚合材料的Nafion 膜覆蓋。試劑與測(cè)試過(guò)程A.試劑。下述試劑為SASP測(cè)試中使用的標(biāo)準(zhǔn)試劑。所有試劑均為商業(yè)提供。樣品制備(使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù))所需時(shí)間占完成檢測(cè)分析所需時(shí)間的95%。通過(guò)自動(dòng)化和機(jī)械化優(yōu)化樣品制備能顯著減少檢測(cè)分析的時(shí)間。寡核苷酸和其它列出的核酸序列意欲用作模型/對(duì)照試劑。1.第一配位(“FC”)寡核苷酸 #100003_19_polyA(36 個(gè)核苷酸)5， -GTGATCGGGAGTGTGTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3，第二配位(“SC” )寡核苷酸#100003_15_氨基(5，-NH2修飾的15個(gè)核苷酸)5， -AGGATGACACCTAGA-3，靶標(biāo)物特異性(“TS” )寡核苷酸100003_39 (39個(gè)核苷酸)5’ -TGGACACACTCCCGATCACCACGATCTAGGTGTCATCCT-3’Dynabeads Oligo (dT)25 磁珠
Dynabeads M-270AmineDynal MPCtm-S磁性顆粒濃縮儀來(lái)自黑曲霉的葡萄糖氧化酶D-葡萄糖DCPIP (2,6- 二氯酚靛酚)Lightning-Link葡萄糖氧化酶共軛試劑盒人基因組DNAssM13mpl8NAFION 膜 N-117液體Nafion，LIQGUI0N 溶液產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)緩沖液和溶液所需的所有其它化學(xué)品和材料，購(gòu)自Sigma-Aldrich， Pierce Biotechnologies 禾口 / 或 VWR0標(biāo)準(zhǔn)緩沖液1. IX 結(jié)合緩沖液(20mM Tris-HCl, pH 7. 5，1. OM LiCl，2mM EDTA)。2.洗滌緩沖液 B(10mM Tris-HCl, pH 7. 5,0. 15M LiCl, 1 mM EDTA)。3.儲(chǔ)存緩沖液 O50mM Tris-HCl, pH 7. 5,20mM EDTA, 0. 1 % Tween-20,0. 02 %
NaN3) οB.測(cè)試過(guò)程。提供下述過(guò)程用于“兩步”雜交。然而，已經(jīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)證明，一步雜交(即，在一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行雜交步驟)較為有益。1.實(shí)驗(yàn)方案a.按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用NAP-5柱(NaHC03/NaCl的0. 1M/0. 15M緩沖液，pH 8. 3) 純化FC寡核苷酸。將0. 2ml寡核苷酸#100003_15_氨基的IOOuM水溶液載入到柱上。在推入0. 3ml后，收集0. 8ml洗脫液并定量。根據(jù)A26tl讀數(shù)，觀(guān)察到回收率超過(guò)90%。b.用寡核苷酸(dl%5磁珠將純化的FC寡核苷酸退火。c.用 IX 結(jié)合緩沖液(20mM Tris_HCl，pH 7. 5,1. OM LiCl，2mM EDTA)將 30 μ 1 前述磁珠懸浮液洗滌兩次。每次洗滌后使用磁性顆粒濃縮儀分離磁珠。d.在最后一次洗滌后，將磁珠再懸浮于30 μ 1結(jié)合緩沖液中，并與2. 6 μ IFC寡核苷酸(26皮摩爾)混合。通過(guò)加入DDI水/0. 01 % Tween 20將最終的反應(yīng)物體積調(diào)至45 μ 1 終體積，并連續(xù)旋轉(zhuǎn)在室溫溫育( 30-45分鐘)。e.溫育后，使用磁性顆粒濃縮儀分離退火的磁珠，并棄去上清液。用洗滌緩沖液 BdOmM Tris-HCl, pH 7. 5,0. 15M LiCl, ImM EDTA)洗滌磁珠(3次)，用儲(chǔ)存緩沖液寡核苷酸(dT)MQ50mM Tris-HCl,pH 7. 5,20mM EDTA，0. 1% Tween-20,0. 02% NaN3)洗滌一次，并再懸浮于30 μ 1儲(chǔ)存緩沖液寡核苷酸(dT)M中。將最終的溶液于4°C保存?zhèn)溆谩?.測(cè)試池調(diào)整預(yù)先調(diào)整測(cè)試池，通過(guò)用(1Η20(10Χ50μ 1)洗滌池，然后池“短路”(通過(guò)腳本調(diào)試完成)120秒，從而去除陽(yáng)性背景。3.樣品檢測(cè)a.如針對(duì)FC寡核苷酸所述，使用相同的方案純化SC寡核苷酸。使用商業(yè)提供的 Lightning-Link葡萄糖氧化酶共軛試劑盒，按照經(jīng)過(guò)細(xì)微修改的生產(chǎn)商建議的方案，將純化的SC寡核苷酸與葡萄糖氧化酶共軛結(jié)合。簡(jiǎn)而言之，向40 μ 1用氨基修飾的SC寡核苷酸(50uM的水溶液)加入4 μ 1改性劑。將得到的溶液與1/2小瓶的LL-Gox混合，并在沒(méi)有背景光的條件下，室溫過(guò)夜溫育。過(guò)夜溫育后，向反應(yīng)混合物加入5 μ 1猝滅劑，并在沒(méi)有背景光的條件下，室溫溫育30分鐘。b.通過(guò)Micron YM-100離心柱(Millipore，USA)離心而純化得到的共軛結(jié)合物， 去除未反應(yīng)的氨基修飾寡核苷酸。為了獲得最佳的結(jié)果，將50μ 1獲得的共軛結(jié)合物載入柱上，并以8000rpm離心8分鐘。棄去流經(jīng)液體并向柱加入200 μ 1 1 X (50mM)PBS (50mM, pH 7. 5)，并以8000rpm離心8分鐘。再次棄去流經(jīng)液體并向柱加入50 μ 1 lXPBS(50mM, PH 7.5)，使用旋渦震蕩仔細(xì)混合5-10秒，然后以2000rpm離心2分鐘。收集得到的50μ1 純化SC寡核苷酸-酶共軛結(jié)合物，并在4°C保存?zhèn)溆?。c.以與上述FC和SC寡核苷酸相似的方式純化TS寡核苷酸。d.向包含0.5皮摩爾共軛結(jié)合物的Iyg人基因組DNA (或ssM13mpl8質(zhì)粒DNA) 加入TS寡核苷酸(0. 5-100fmol)。總反應(yīng)體積應(yīng)約30 μ 1(6XSSPE，0. 01% Tween 20)。將得到的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移進(jìn)包含0. 5pmol洗滌并干燥的FC固定化-寡核苷酸(dT)M磁珠的管中并輕輕混合。在室溫以連續(xù)旋轉(zhuǎn)進(jìn)行1小時(shí)雜交。e.使用適當(dāng)?shù)拇艌?chǎng)，通過(guò)用 6XSSPE(0. 9M NaCl,60mM NaH2PO4,6mM EDTA)洗滌(3 次)而去除未結(jié)合的共軛結(jié)合物。洗滌后，通過(guò)移取而小心地去除上清，并用100 μ 1 2Μ磷酸鉀緩沖液(PH 6. 0)洗滌O次)靶標(biāo)物-磁珠絡(luò)合物(“絡(luò)合物”)，并再懸浮于包含2Μ 磷酸鉀緩沖液(pH 6. 0)，0. ImMDCPIP (2,6- 二氯酚基靛酚，0. 1 μ g/ μ 1 BSA)的2-5 μ 1緩沖液中。f.與前述步驟平行地，制備陰性對(duì)照，其中不包括TS寡核苷酸和人基因組DNA(或 ssM13mpl8質(zhì)粒DNA)而進(jìn)行反應(yīng)。g.使用檢測(cè)池(1類(lèi))，向每個(gè)(陽(yáng)極和陰極)反應(yīng)室加入30 μ 1工作緩沖液(2Μ 磷酸鉀緩沖液(PH 6. 0),0. ImM DCPIP 0，6-二氯酚基靛酚)。為了檢測(cè)是否存在靶標(biāo)物物質(zhì)，向陽(yáng)極反應(yīng)室加入1 μ 1絡(luò)合物和1 μ IlM葡萄糖，并徹底混合。h.使反應(yīng)物溫育5分鐘，然后連續(xù)或每隔30-180秒進(jìn)行測(cè)量。由電勢(shì)增加的信號(hào) (0. 4-2. 2V范圍)代表存在靶標(biāo)物物質(zhì)。(參見(jiàn)，下文的代表性輸出圖2)。為便攜式使用而優(yōu)化的設(shè)備如同已指出的，由本發(fā)明使其成為可能的檢測(cè)方法易于在多種設(shè)備中實(shí)踐。特別期望的設(shè)備是便攜式，用于野外部署。下文通過(guò)示例方式而不是限制性的，描述了一個(gè)這樣的設(shè)備。除了本發(fā)明的設(shè)備，替代設(shè)備對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的?；瘜W(xué)證明單元工作站軟件控制計(jì)時(shí)和測(cè)量記錄。本文檔僅描述工作站軟件，而不是完整的系統(tǒng)。PC工作站通過(guò)USB連接至數(shù)據(jù)獲取板(數(shù)據(jù)獲取DT9812)。所述數(shù)據(jù)獲取板使用數(shù)字輸出和類(lèi)似的輸入控制對(duì)放大器電路的讀數(shù)。電路連接至化學(xué)電池筒體，其中封裝入GOX電池。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)液體樣品中靶標(biāo)物的分析系統(tǒng)，其中所述分析系統(tǒng)包括與所述樣品中存在的任何靶標(biāo)物結(jié)合的第一捕捉部分，所述第一捕捉部分與酶氧化還原反應(yīng)組分形成絡(luò)合體；由所述酶識(shí)別的底物，所述底物在受到所述酶作用時(shí)釋放電子；和電路，所述電路檢測(cè)在所述底物被所述酶消化時(shí)通過(guò)從該底物釋放電子而產(chǎn)生的電勢(shì)或電流的存在。
2.權(quán)利要求1的分析系統(tǒng)，其中所述靶標(biāo)物包含氨基酸序列，并且所述第一捕捉部分包含在指定表位與所述靶標(biāo)物結(jié)合的抗體。
3.權(quán)利要求1的分析系統(tǒng)，其中所述靶標(biāo)物包含核酸序列，并且所述第一捕捉部分通過(guò)與所述序列的一部分雜交而與所述靶標(biāo)物結(jié)合。
4.權(quán)利要求1的分析系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包括與所述第一捕捉部分同時(shí)跟所述樣品中存在的任何所述靶標(biāo)物相結(jié)合的第二捕捉部分，所述第二捕捉部分?jǐn)y帶用于收集與所述靶標(biāo)物相結(jié)合的所有這種第二捕捉部分的收集部分。
5.權(quán)利要求4的分析系統(tǒng)，其中所述收集部分包括磁珠。
6.權(quán)利要求4的分析系統(tǒng)，其中所述收集部分包括與柱結(jié)合的化學(xué)標(biāo)簽，樣品在與所述第一和第二捕捉部分混合后通過(guò)所述柱。
7.權(quán)利要求1的分析系統(tǒng)，其中所述酶氧化還原反應(yīng)組分是所述底物的氧化酶或脫氫酶。
8.權(quán)利要求5的分析系統(tǒng)，其中所述底物選自下組葡萄糖、乳糖、果糖、甘露糖、膽堿、 甲醇和乙醇。
9.權(quán)利要求6的分析系統(tǒng)，其中所述底物是葡萄糖并且所述酶氧化還原反應(yīng)組分是葡萄糖氧化酶。
10.權(quán)利要求1的分析系統(tǒng)，其還包括反應(yīng)室，在該反應(yīng)室中所述第一捕捉部分與所述酶氧化還原反應(yīng)組分偶聯(lián)，所述第二捕捉部分與收集部分結(jié)合，所述樣品與所述底物混合， 所述分析系統(tǒng)還包括與所述反應(yīng)室連接的陽(yáng)極和陰極，其中由于通過(guò)所述酶氧化還原反應(yīng)組分對(duì)所述底物作用產(chǎn)生電子而在所述陽(yáng)極和陰極之間產(chǎn)生電勢(shì)或電流，檢測(cè)所述電勢(shì)或電流作為所述樣品中存在靶標(biāo)物的證據(jù)。
11.權(quán)利要求1的分析系統(tǒng)，其中所述分析系統(tǒng)包括用于呈現(xiàn)所述電勢(shì)檢測(cè)的顯示器。
12.權(quán)利要求11的分析系統(tǒng)，其中所述顯示器包括計(jì)算機(jī)、發(fā)光二極管、液晶二極管和計(jì)量器中的至少一種。
13.用于檢測(cè)樣品中存在靶標(biāo)物的分析方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1的分析系統(tǒng)，其中與酶氧化還原反應(yīng)組分絡(luò)合的所述第一捕捉部分，在允許所述第一捕捉部分與所述樣品中所述靶標(biāo)物結(jié)合的條件下，與所述樣品結(jié)合，并隨后將所述底物加入到所述已結(jié)合的靶標(biāo)物中，其中檢測(cè)由所述酶氧化還原反應(yīng)組分與所述底物之間的反應(yīng)產(chǎn)生的任何電勢(shì)或電流作為反映所述樣品中存在所述靶標(biāo)物的信號(hào)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述方法還包括加入與收集部分結(jié)合的第二捕捉部分， 在允許所述第一和第二捕捉部分同時(shí)結(jié)合所述樣品的條件下，所述第二捕捉部分與所述樣品結(jié)合，通過(guò)所述收集部分保留與所述第一和第二捕捉部分結(jié)合的所述樣品中的任何所述靶標(biāo)物，同時(shí)將所有其余材料沖洗掉，將所述保留的靶標(biāo)物再懸浮于液體中，并向所述液體加入所述底物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述靶標(biāo)物包含核酸序列，并且所述第一和第二捕捉部分包含與所述靶標(biāo)物同時(shí)雜交的不同寡聚物。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述靶標(biāo)物包含氨基酸序列，并且所述第一和第二捕捉部分包含在不同表位與所述靶標(biāo)物結(jié)合的不同抗體。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述收集部分包含磁珠，并且通過(guò)施加磁場(chǎng)而保留通過(guò)所述第二捕捉部分與所述靶標(biāo)物結(jié)合的所述收集部分。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所述酶氧化還原反應(yīng)組分是所述底物的氧化酶或脫氫酶。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述底物是葡萄糖并且所述酶氧化還原反應(yīng)組分是葡萄糖氧化酶。
20.權(quán)利要求14的方法，其中向所述樣品依序加入所述第一捕捉部分和第二捕捉部分。
21.權(quán)利要求14的方法，其中向所述樣品同時(shí)加入所述第一捕捉部分和第二捕捉部分。
22.權(quán)利要求13的方法，其中所述信號(hào)傳送至儲(chǔ)存所述信號(hào)的計(jì)算機(jī)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述計(jì)算機(jī)將信號(hào)傳送至第三方。
24.權(quán)利要求13的方法，其中所述信號(hào)的強(qiáng)度與所述樣品中存在的所述靶標(biāo)物的量相關(guān)。
25.權(quán)利要求13的方法，其中在向所述分離的靶標(biāo)物加入所述底物后至少一分鐘的時(shí)間段內(nèi)不測(cè)量所述信號(hào)。
26.用于測(cè)量通過(guò)權(quán)利要求13的方法產(chǎn)生的信號(hào)的設(shè)備，所述設(shè)備包括一次性筒體， 所述筒體包括反應(yīng)室，在該反應(yīng)室中所述樣品與所述第一捕捉部分混合，陽(yáng)極和陰極與所述反應(yīng)室處于物理接觸狀態(tài)，所述筒體能插入設(shè)備主體，使所述筒體與顯示器接觸，在向所述反應(yīng)室加入所述底物后，所述顯示器可測(cè)量所述陽(yáng)極和所述陰極之間的電勢(shì)，其中由所述顯示器檢測(cè)的信號(hào)反映所述靶標(biāo)物的存在或濃度。
27.權(quán)利要求沈的設(shè)備，其中所述陽(yáng)極和所述陰極由半滲透膜隔開(kāi)。
28.權(quán)利要求27的設(shè)備，其中所述半滲透膜是離子交換膜。
29.權(quán)利要求觀(guān)的設(shè)備，其中所述離子交換膜是質(zhì)子交換膜。
30.權(quán)利要求27的設(shè)備，其中所述膜覆蓋在所述陰極上。
31.權(quán)利要求沈的設(shè)備，其中所述陽(yáng)極和陰極與RFID設(shè)備相連接，所述RFID設(shè)備發(fā)射與通過(guò)所述酶氧化還原反應(yīng)組分消化所述底物所產(chǎn)生的電勢(shì)相關(guān)的信號(hào)。
全文摘要
提供具有高靈敏度和便攜性的分析系統(tǒng)，其中，樣品中特殊靶標(biāo)物的存在，以及靶標(biāo)物濃度(定性與定量)可由封閉電路中的電勢(shì)或電壓檢測(cè)，所述檢測(cè)過(guò)程建立在氧化還原反應(yīng)基礎(chǔ)上。如下產(chǎn)生反應(yīng)將捕捉部分與酶法氧化還原反應(yīng)伴侶結(jié)合，使捕捉部分與樣品中的任何靶標(biāo)物結(jié)合，并洗滌任何這種已結(jié)合靶標(biāo)物。如果未固定化，可以通過(guò)使用第二捕捉部分將已結(jié)合靶標(biāo)物固定化。然后加入酶的底物。酶在底物上作用釋放電子，在由膜分開(kāi)的陽(yáng)極和陰極之間產(chǎn)生電勢(shì)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102308206SQ200880116453
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2008年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月17日
發(fā)明者喬治·G·喬克哈茲, 馬克·R·拉布戈?duì)柕?申請(qǐng)人:紅象牙有限責(zé)任公司