專利名稱：對應(yīng)于轉(zhuǎn)基因事件mon87701的大豆植物和種子及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到轉(zhuǎn)基因大豆事件M0N87701和植物部分及其種子。該事件顯示出對 來自鱗翅目(L印idoptera)昆蟲的昆蟲侵害的抗性。本發(fā)明還涉及檢測所述大豆事件在生 物樣品中的存在的方法，并提供該事件所特有的核苷酸序列。
背景技術(shù)：
大豆是一種重要的農(nóng)作物，并且是世界許多地區(qū)的主要食物來源。生物技術(shù)的方 法已經(jīng)被應(yīng)用于大豆以改進(jìn)農(nóng)藝性狀和產(chǎn)品質(zhì)量。這樣的農(nóng)藝性狀之一是抗蟲性。能夠檢測特定植物的轉(zhuǎn)基因/基因組DNA的存在以確定有性雜交的后代是否含有 目標(biāo)轉(zhuǎn)基因/基因組DNA是有利的。此外，當(dāng)遵守要求進(jìn)入市場前的審批及對源自重組作 物的食品進(jìn)行標(biāo)記的規(guī)定時(shí)，檢測特定植物的方法是有益的。表達(dá)蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis) 6 -內(nèi)毒素的轉(zhuǎn)基因作物使得種植者明 顯減少與施用化學(xué)殺蟲劑相關(guān)的時(shí)間和成本，并且與非轉(zhuǎn)基因商業(yè)植物品種產(chǎn)量大大降低 相比，提高了在嚴(yán)重的昆蟲壓力下生長的轉(zhuǎn)基因植物作物產(chǎn)量。盡管已取得這一成功，但仍 預(yù)計(jì)昆蟲可能進(jìn)化出對轉(zhuǎn)基因作物表達(dá)的蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素的抗性。這些抗性 (假如其廣泛分布)顯然會(huì)限制包含編碼某些蘇云金芽孢桿菌S-內(nèi)毒素的基因的種質(zhì)的 商業(yè)價(jià)值。提高對抗目標(biāo)害蟲的轉(zhuǎn)基因殺蟲劑的效率和同時(shí)減少殺蟲劑抗性害蟲的發(fā)展的 一種可能方法是確保轉(zhuǎn)基因作物表達(dá)高水平的蘇云金芽孢桿菌S-內(nèi)毒素(McGaughey和 ffhalon (1992)，Science 258 1451-55 ；Roush Roush(1994)，Biocontrol. Sci. Technol. 4 501-516)。在許多從蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)鑒定的殺蟲蛋白中，相對 少數(shù)的個(gè)別殺蟲蛋白(如Cryl，s、Cry3，s、VIP3A、Cry34、Cry35和Cry2Ab)已被證實(shí)在植 物中表達(dá)。在Cry2Ab的情況下，為了實(shí)現(xiàn)高水平的植物中(in planta)表達(dá)，這種殺蟲蛋 白(Cry2Ab)必須靶向于葉綠體以避免不希望的植物毒性效應(yīng)。已知外源基因在植物中的表達(dá)受其染色體位置的影響，可能是由于染色質(zhì)結(jié)構(gòu) (如異染色質(zhì))或靠近結(jié)合部位(integration site)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如增強(qiáng)子)的接近 性(Weising等人(1988)，Ann. Rev. Genet 22 :421_477)。基于這個(gè)原因，通常需要篩選大 量的事件以鑒別以引入的目標(biāo)基因的最佳表達(dá)為特征的事件。例如，在植物和其它生物中 已觀察到引入基因的表達(dá)水平在事件之間差異很大。在表達(dá)的空間或時(shí)間特征上也有差 異(例如，轉(zhuǎn)基因在各種不同植物組織中的相對表達(dá)的差異)，其可能與從引入的基因構(gòu)建 體中存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件預(yù)期的特征不對應(yīng)?；谶@個(gè)原因，通常產(chǎn)生數(shù)百至數(shù)千個(gè)不同 的事件，并對事件進(jìn)行篩選以選擇具有所需轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和用于商業(yè)目的的特征的單一 事件。具有轉(zhuǎn)基因表達(dá)的理想水平或特征的事件可以用于通過使用傳統(tǒng)育種方法的有性異交將轉(zhuǎn)基因滲入其它遺傳背景中。這種雜交后代保持原轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征。這一策 略用來確保適當(dāng)?shù)剡m應(yīng)特定的當(dāng)?shù)厣L條件的許多品種中的可靠的基因表達(dá)。有可能通過任何公知的核酸檢測方法(如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或使用核酸探針的 DNA雜交)檢測轉(zhuǎn)基因的存在。這些檢測方法一般集中于經(jīng)常使用的遺傳元件，如啟動(dòng)子、 終止子、標(biāo)記基因等。因此，這些方法可能不能用于區(qū)分不同的事件，特別是使用相同的DNA 構(gòu)建產(chǎn)生的那些事件，除非鄰近插入的DNA的染色體DNA( “側(cè)翼的DNA”)的序列是已知 的。例如，Taverniers 等人(J. Agric. Food Chem. ,53 :3041_3052，2005)討論了事件特異 性的PCR分析方法，其中顯示了對于轉(zhuǎn)基因玉米株系Btll、Btl76和GA21及油菜(canola) 事件GT73的事件特異性的追蹤系統(tǒng)。在這項(xiàng)研究中，事件特異性的引物和探針基于各事件 的基因組/轉(zhuǎn)基因接點(diǎn)的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。轉(zhuǎn)基因植物事件特異性的DNA檢測方法也在美國 專利 6，893，826,6, 825，400,6, 740，488,6, 733，974,6, 689，880,6, 900，014 和 6，818，807 中 描述。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCulture Collection) (ATCC)的具有登錄號PTA-8194的種子的指定為M0N87701的轉(zhuǎn)基因大豆植物。 本發(fā)明的另一方面是大豆事件M0N87701的后代植物、或種子、或植物部分和種子。該植物 部分包括但不限于花粉、胚珠、花、芽、根、莖、葉、莢、種子和分生組織。大豆植物M0N87701 尤其對鱗翅目的昆蟲具有抗性，如藜豆夜蛾(Velvetbean caterpillar) (Anticarsia gemmatalis)、大豆尺蠖(Soybeanlooper) (Pseudoplusia includens)、大豆葉月夜螟蟲 (Epinotia aporema)、黃色熊蛾(Yellow Bear Moth) (Spilosoma virginica)、玉米穗蟲 (earworm) (Helicoverpa zea)、草地粘蟲(Fall armyworm) (Spodoptera frugiperda)禾口向 日葵尺蠖(Rachiplusia nu)等，所有這些都是重要的農(nóng)業(yè)害蟲。本發(fā)明還涉及大豆植物M0N87701的DNA構(gòu)建體和在大豆M0N87701及其后代中的 轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域的檢測。M0N87701基因組和來自M0N87701的產(chǎn)物(如粗粉、面粉、食品、蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑和殘 留在已收獲對應(yīng)于M0N87701的大豆植物的田地中的生物質(zhì))包含的新的遺傳組合物是本 發(fā)明的另外的方面。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了用于檢測命名為M0N87701的新型大豆植物的轉(zhuǎn) 基因/基因組插入?yún)^(qū)域的存在的組合物和方法。提供了包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO 1([A]，對應(yīng)于 SEQ ID NO :6[F]的 5748 位至 5767 位，圖 2)和 SEQ ID N0:2([B]，對應(yīng) 于SEQ ID NO :6[F]的12，174位至12，193位，圖2)及其互補(bǔ)序列的M0N87701接頭序列 (junctionsequence)的DNA序列。接頭序列是跨越插入基因組中的異源DNA與大豆細(xì)胞基 因組DNA連接的點(diǎn)的核苷酸序列。該序列在含有大豆DNA的生物樣品中的檢測可以診斷大 豆事件M0N87701 DNA在所述樣品中的存在。包含這些DNA的分子的大豆事件M0N87701和 大豆種子是本發(fā)明的一方面。包含來自大豆事件M0N87701的新型轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域SEQID N0:3[C]、SEQ ID NO :4[D]和 SEQ ID NO 5 [E]或 SEQ ID NO : 1 [A]、SEQ ID NO :2 [B]和 SEQ ID NO :5 [E] (參見圖2)的DNA序列也是本發(fā)明的方面。包含這些分子的大豆植物和種子是本發(fā)明的另 外的方面。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于DNA檢測方法的兩個(gè)DNA分子。該DNA分子 是具有足夠長度的SEQ ID N0:3或SEQ ID NO :5或其互補(bǔ)序列的連續(xù)核苷酸以用作診斷由 大豆植物M0N87701或其后代提取的DNA的DNA引物或探針。例如，第一 DNA分子包含SEQ IDN0 3或SEQ ID NO 5的轉(zhuǎn)基因區(qū)域的任何部分或其互補(bǔ)序列的11個(gè)或更多連續(xù)聚核苷 酸，且第二 DNA分子包含類似長度的與SEQ ID NO :3的5，側(cè)翼大豆基因組DNA區(qū)域的任 何部分或其互補(bǔ)序列，其中，這些DNA分子一起使用時(shí)用作產(chǎn)生擴(kuò)增子的DNA擴(kuò)增方法中的 DNA引物。當(dāng)擴(kuò)增子包含SEQ ID NO :1時(shí)，在DNA擴(kuò)增方法中使用這些DNA引物產(chǎn)生的擴(kuò) 增子用于診斷大豆事件M0N87701。由與SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :5的任何部分同源或 互補(bǔ)的DNA引物產(chǎn)生的任何擴(kuò)增子及任何包含SEQ ID NO 1的擴(kuò)增子是發(fā)明的一方面。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于DNA檢測方法的兩個(gè)DNA分子。該DNA分子 是具有足夠長度的SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5或其互補(bǔ)序列的連續(xù)核苷酸以用作診斷由 大豆植物M0N87701或其后代提取的DNA的DNA引物或探針。例如，第一 DNA分子包含SEQ IDN0 4或SEQ ID NO 5的轉(zhuǎn)基因區(qū)域的任何部分或其互補(bǔ)序列的11個(gè)或更多連續(xù)聚核苷 酸，且第二 DNA分子包含類似長度的與SEQ ID NO :4的3，側(cè)翼大豆基因組DNA區(qū)域的任何 部分或其互補(bǔ)序列，其中，這些DNA分子一起使用時(shí)用作DNA擴(kuò)增方法中的DNA引物。當(dāng)擴(kuò) 增子包含SEQ ID NO 2時(shí)，在DNA擴(kuò)增方法中使用這些DNA引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子用于診斷大 豆事件M0N87701。由與SEQ ID NO :4和SEQ ID NO 5的任何部分同源或互補(bǔ)的DNA引物 產(chǎn)生的任何擴(kuò)增子及任何包含SEQID N0 2的擴(kuò)增子是發(fā)明的一方面。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于DNA檢測方法的兩個(gè)DNA分子。該DNA分 子是具有足夠長度的SEQ ID NO :6或其互補(bǔ)序列的連續(xù)核苷酸以用作診斷由大豆植物 M0N87701或其后代提取的DNA的DNA引物或探針。當(dāng)在DNA擴(kuò)增方法中一起用作DNA引物 時(shí)，產(chǎn)生包含SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO :2的擴(kuò)增子。產(chǎn)生的擴(kuò)增子用于診斷大豆事 件M0N87701。由與SEQ ID NO :6的任何部分同源或互補(bǔ)的DNA引物產(chǎn)生的任何擴(kuò)增子及 任何包含SEQ ID N0 :1和/或SEQ IDN0 2的擴(kuò)增子是發(fā)明的一方面。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了檢測對應(yīng)于大豆事件M0N87701的DNA在生物樣品 中的存在的方法。這些方法包括(a)將生物樣品與用于來自大豆事件M0N87701的基因組 DNA的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)產(chǎn)生用于診斷大豆事件M0N87701的擴(kuò)增子的引物組接觸；(b)進(jìn) 行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生擴(kuò)增子；和(c)檢測擴(kuò)增子，其中所述擴(kuò)增子包含SEQID N0 :1和 /或SEQ ID NO :2，其中，檢測到這種擴(kuò)增子表明對應(yīng)于大豆事件M0N87701的DNA的存在。根據(jù)本發(fā)明的另一方面檢測對應(yīng)于M0N87701事件的DNA在生物樣品中的存在的 方法，這些方法包括(a)將生物樣品與在嚴(yán)格的雜交條件下與來自大豆事件M0N87701的 基因組DNA雜交和在嚴(yán)格的雜交條件下不與對照大豆植物雜交的探針接觸；(b)使生物樣 品和探針經(jīng)歷嚴(yán)格的雜交條件；和(c)檢測探針與大豆事件M0N87701 DNA的雜交，其中，檢 測到這樣的雜交表明對應(yīng)于M0N87701事件的DNA的存在。優(yōu)選地，探針選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO 2及其互補(bǔ)序列。生物樣品可以包含任何源自大豆細(xì)胞或組織(包括莖、根、葉、花或花的部分、種 子或種莢等)的有機(jī)材料，其包含可檢測量的對應(yīng)于這些有機(jī)材料的核苷酸序列。源自大 豆事件M0N87701的生物樣品包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域，尤其是如SEQ ID NO 1至SEQ IDN0 6及其互補(bǔ)序列所示的在序列表中給出的那些。
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提供了用于檢測大豆事件M0N87701的試劑盒，其使用從SEQ IDNO :3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6設(shè)計(jì)的引物。當(dāng)擴(kuò)增子(1)包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2任一所示的核苷酸序列或(2)包含SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2兩者時(shí)，使用所述試 劑盒產(chǎn)生的擴(kuò)增子用于診斷M0N87701。可以提供試劑盒作為特異性地檢測在生物樣品中僅 當(dāng)前存在的事件M0N87701 DNA的工具，或提供試劑盒作為檢測來自任何數(shù)量的不同生物樣 品的多重的不同轉(zhuǎn)基因事件的工具。在后一種情況中(即，用于檢測多重的不同轉(zhuǎn)基因事 件的試劑盒)，試劑盒可以提供微陣列形式的探針或引物，或任何種類的陣列(無論是否批 準(zhǔn)用于商業(yè)化)，其向試劑盒的用戶提供區(qū)分轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因樣品之間的差異、轉(zhuǎn)基因事 件的接合性(zygosity)和甚至事件的存在與否的能力。使用這種試劑盒檢測或篩選特定 事件的存在與否可以通過熒光、比色、同位素或發(fā)光手段進(jìn)行。本發(fā)明的另一方面是大豆植物或種子，或源自M0N87701的植物或種子的產(chǎn)物，其 中，從大豆植物或種子或產(chǎn)物分離的基因組DNA包含并入了 SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO: 2的DNA分子。優(yōu)選地，其基因組DNA包含基本上由SEQ ID NO 3的大約1位至5757位的 核苷酸序列、SEQ ID NO 5的大約1位至6426位的核苷酸序列和SEQ ID NO 4的大約379 位至2611位的核苷酸序列(其重疊群(contig)作為SEQ IDN0 6)組成的DNA分子。本發(fā)明的另一方面是大豆植物或種子，或源自M0N87701的植物或種子的產(chǎn)物，其 中，基因組DNA包含基本上由SEQ ID NO :6的大約1位至14，416位的核苷酸序列組成的 DNA分子。本發(fā)明的另一方面是大豆植物或種子，或源自M0N87701的植物或種子的產(chǎn)物，其 中，由大豆植物或種子或產(chǎn)物分離的基因組DNA在DNA擴(kuò)增方法中產(chǎn)生擴(kuò)增子，其中，所述 擴(kuò)增子包含SEQ ID NO :1禾口 /或SEQ ID NO :2。本發(fā)明的另一方面是產(chǎn)生昆蟲抗性的大豆植物的方法。該方法包括(a)將 M0N87701的大豆植物與另一大豆植物雜交；(b)獲得至少一個(gè)源自雜交(a)的后代植物； 和(c)選擇包含SEQ ID NO :1和SEQ IDN0 :2的后代。所述選擇包括使由(b)獲得的至少一 個(gè)后代植物進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，其中，選擇產(chǎn)生包含SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ IDNO 5或SEQ ID NO :6的至少一種核苷酸序列的擴(kuò)增子的后代，或者使由(b)獲得的至少一個(gè) 后代植物進(jìn)行核酸雜交反應(yīng)，其中，選擇與在嚴(yán)格條件下與一種或多種選自SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO :2的DNA序列雜交的探針雜交的后代。如此選擇的后代是昆蟲抗性大豆植物。本發(fā)明的另一方面是一種保護(hù)大豆植物免受蟲害的方法。該方法包括在大豆 的鱗翅目害蟲的食物中提供殺蟲有效量的大豆植物M0N87701的細(xì)胞或組織。鱗翅目 害蟲選自干煞夜蛾屬(Anticarsia)、Pseudoplusia、葉小卷蛾屬(Epinotia)、雪燈蛾屬 (Spilosoma)、鈴夜蛾屬(Helicoverpa)、灰翅夜蛾屬(Spodoptera)禾口 Rachiplusia。本發(fā)明的另一方面是源自大豆植物或種子或M0N87701的種子后代的商品。這些 商品包括但不限于完整的或經(jīng)過加工的大豆種子、動(dòng)物蛋白飼料、植物油、粗粉、面粉、無 毒塑料、印刷油墨、潤滑劑、蠟、液壓流體、變壓器流體、溶劑、化妝品、頭發(fā)護(hù)理產(chǎn)品、豆?jié){、 大豆果仁醬、納豆、豆豉、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織化(texturized)大豆蛋 白濃縮物、水解大豆蛋白、植脂奶油(whipped topping)、食用油、色拉油、起酥油、卵磷脂、 可食用全大豆(生的、烤的或作為毛豆(edamamS))、豆奶、大豆酸奶、大豆干酪、豆腐、腐竹 (yuba)和生物柴油(biodiesel)。
本發(fā)明的另一方面是一種測定大豆事件M0N87701的后代的接合性的方法。該方 法包括(a)將大豆樣品與引物對SQ3443(SEQ ID NO 12)和SQ3445 (SEQ ID NO 13)接觸， 所述引物對在用于大豆事件M0N87701的基因組DNA的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)產(chǎn)生用于診斷大 豆事件M0N87701的引物SQ3443和SQ3445組合的擴(kuò)增子；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；(c)檢 測產(chǎn)生的第一擴(kuò)增子；(d)將同樣的樣品與引物對SQ3445 (SEQ ID NO 13)和SQ3446 (SEQ ID NO 14)接觸，所述引物對在用于大豆植物的基因組DNA的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)產(chǎn)生用于 診斷與確認(rèn)為大豆事件M0N87701的轉(zhuǎn)基因插入的大豆基因組區(qū)域同源的野生型大豆基因 組DNA的引物SQ3445和SQ3446的組合的擴(kuò)增子；(e)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；和(f)檢測產(chǎn)生 的第二擴(kuò)增子；其中，同時(shí)檢測到兩種擴(kuò)增子表明大豆樣品對于大豆事件M0N87701 DNA是 雜合的。本發(fā)明的另一方面是一種測定大豆事件M0N87701的后代接合性并進(jìn)一步使用用 熒光團(tuán)標(biāo)記的探針的方法。該方法包括(a)將大豆樣
M0N87701的擴(kuò)增子，從而由引物SQ3443和SQ3445及探針6FAM -標(biāo)記的PB1111的組合釋 放熒光信號；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；(c)檢測產(chǎn)生的第一擴(kuò)增子；(d)將同樣的樣品與引 物對 SQ3445(SEQ ID NO 13)和 SQ3446 (SEQ ID NO 14)及 VIC -標(biāo)記的 PB1112 (SEQ ID NO 16)接觸，這在用于大豆植物的基因組DNA的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)產(chǎn)生用于診斷與確認(rèn)為 大豆事件M0N87701的轉(zhuǎn)基因插入的大豆基因組區(qū)域同源的野生型大豆基因組DNA的擴(kuò)增 子，從而由引物SQ3445和SQ3446及探針VIC -標(biāo)記的PB1112的組合釋放熒光信號；(e) 進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；和(f)檢測產(chǎn)生的第二擴(kuò)增子；其中，檢測到兩種擴(kuò)增子表明包含DNA 的大豆樣品對于確認(rèn)為大豆事件M0N87701的轉(zhuǎn)基因插入是雜合的。通過下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明的上述和其它方面將變得更加明顯。附圖簡述

圖1說明用于產(chǎn)生大豆植物M0N87701的雙元轉(zhuǎn)化載體pM0N53570的圖。圖2說明在大豆事件M0N87701的基因組中的轉(zhuǎn)基因插入片段的組織[A]對應(yīng)于 形成SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 5之間的接頭的SEQID N0 1的相對位置；[B]對應(yīng)于形 成SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5之間的接頭的SEQ ID NO 2的相對位置；[C]對應(yīng)于位于 整合到事件M0N87701的基因組中的表達(dá)盒的任意分配的/指定的5'末端側(cè)翼的大豆基因 組序列SEQ ID NO 3的相對位置；[D]對應(yīng)于位于整合進(jìn)入事件M0N87701的基因組中的表 達(dá)盒的任意分配的/指定的3'末端側(cè)翼的大豆基因組序列SEQ ID N0:4的相對位置；[E] 代表包含SEQ ID NO 5的各種元件，且是插入事件M0N87701的基因組中的表達(dá)盒的序列； 和[F]代表包含如圖中從左至右所代表的SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5和SEQID NO 4的連 續(xù)序列，其中，如上面所示的，并入SEQ ID NO 1和SEQID NO :2，因而這些序列存在于事件 M0N87701的基因組中。序列簡要說明SEQ ID N0:1——代表大豆基因組DNA和整合的表達(dá)盒之間的接頭的20個(gè)核苷酸的序列(見圖2)。該序列對應(yīng)于SEQ ID NO :6的5748位至5767。此外，SEQ ID NO: 1([A])是對應(yīng)于SEQ ID NO :3([C])的5748位至5757位的核苷酸序列，和對應(yīng)于SEQ ID N0:5([E])的1位至10位的TIC107表達(dá)盒的整合右邊界。SEQ ID NO :1也對應(yīng)于5，側(cè)翼 序列的 5748 位至 5767 位，SEQ ID NO :3([C])。SEQ ID N0:2——代表整合的表達(dá)盒和大豆基因組DNA之間的接頭的20個(gè)核苷 酸的序列(見圖2)。該序列對應(yīng)于SEQ ID NO :6([F])的12174位至12193位。此外，SEQ ID NO :2([B])是對應(yīng)于 SEQ ID NO :5([E])的 6417 位至 6426 位和與 SEQ ID NO :4([D]) 的379位至388位對應(yīng)于的3，側(cè)翼序列的核苷酸序列。SEQ ID N0:2([B])也對應(yīng)于3，側(cè) 翼序列的 369 位至 388 位，SEQ ID NO :4([D])。SEQ ID NO 3(圖2的[C])——位于達(dá)到并包含轉(zhuǎn)化DNA(T-DNA)插入?yún)^(qū)域的 M0N87701插入DNA的側(cè)翼的5，序列。SEQ ID NO :4(圖2的[D])——位于達(dá)到并包含T-DNA插入?yún)^(qū)域的M0N87701插入 DNA的側(cè)翼的3，序列。SEQ ID NO :5(圖2的[E])——整合的TIC107表達(dá)盒的序列，包括整合后的左和 右邊界序列。SEQ ID NO :6 (圖2的[F])——代表位于M0N87701的插入DNA的側(cè)翼的5，序列 (SEQ ID NO 3)、整合的表達(dá)盒的序列(SEQ ID NO 5)和位于M0N87701插入DNA的側(cè)翼的 3，序列(SEQ ID NO 4)的重疊群的14，416bp核苷酸序列。SEQ ID NO 7-pM0N53570 的 TIC107 表達(dá)盒。SEQ ID NO 8——TIC107編碼DNA的序列，包括編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸。SEQ ID NO 9——用于鑒定M0N87701事件的引物SQ1135。引物SQ1135與插入的 表達(dá)盒的5'區(qū)域互補(bǔ)，靠近對應(yīng)于SEQ ID NO :6的5790位至5766位和SEQ ID NO :5的 33位至9位的右T-DNA插入邊界。SEQ ID NO 10——用于鑒定M0N87701事件的引物SQ1136。引物SQ1136對應(yīng)于 位于靠近與SEQ ID NO 6的5705位至5732位和SEQ IDN0 3的5705位至5732位對應(yīng)的 右T-DNA插入邊界的插入表達(dá)盒側(cè)翼的5，區(qū)域。使用引物SQ1135和SQ1136的組合產(chǎn)生 的大約86bp的PCR擴(kuò)增子對于事件M0N87701的存在是陽性的。SEQ ID NO 11——用于鑒定M0N87701事件的探針PB63。該探針是6FAM -標(biāo)記的 合成寡核苷酸，其序列與SEQ ID NO :6的5763位至5748位互補(bǔ)。在引物擴(kuò)增反應(yīng)中使用引 物SQ1135和SQ1136與6FAM -標(biāo)記的探針PB63結(jié)合釋放熒光信號用于診斷事件M0N87701。SEQ ID NO 12——用于確定M0N87701事件的接合性的引物SQ3443。引物SQ3443 對應(yīng)于靠近與SEQ ID NO 6的12145位至12168位和SEQ ID NO 5的6388位至6411位對 應(yīng)的左T-DNA邊界的插入表達(dá)盒的區(qū)域。SEQ ID NO 13——用于確定M0N87701事件的接合性的引物SQ3445。引物SQ3445 與位于靠近對應(yīng)于SEQ ID NO :6的12215位至12188位和SEQ ID NO :4的410位至383 位的左T-DNA的插入表達(dá)盒的側(cè)翼的3，區(qū)域互補(bǔ)。使用引物SQ3443和SQ3445在有或沒 有FAM -標(biāo)記的探針PB1111的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增子的檢測對于在接合性分析中事件 M0N87701的存在是陽性的。SEQ ID NO 14——用于確定M0N87701事件的接合性的引物SQ3446。引物SQ3446
10對應(yīng)于野生型基因組DNA的區(qū)域，其中，發(fā)生用于M0N87701的表達(dá)盒的插入。使用引物 SQ3445和SQ3446在有或沒有VIC -標(biāo)記的探針PB1112的情況下進(jìn)行PCR擴(kuò)增子的檢測 對于野生型等位基因的存在是陽性的SEQ ID NO 15——用于確定M0N87701事件的接合性的探針PB1111。該探針是 6FAM -標(biāo)記的合成寡核苷酸，其序列對應(yīng)于SEQ IDN0 6的12172位至12187位。使用引物 SQ3443和SQ3445產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增子導(dǎo)致使用探針PB1111的熒光信號釋放，這在M0N87701 事件的接合性分析中對于事件M0N87701的存在是陽性的。SEQ ID NO 16——用于確定M0N87701事件的接合性的探針PB1112。該探針是 VIC -標(biāo)記的合成寡核苷酸，其序列對應(yīng)于在事件M0N87701的表達(dá)盒的插入點(diǎn)緊跟著與引 物SQ3446同源的區(qū)域的野生型基因組DNA區(qū)域。使用引物SQ3445和SQ3446產(chǎn)生的PCR 擴(kuò)增子導(dǎo)致使用探針PB1112的熒光信號釋放，這對于在M0N87701事件的接合性分析中野 生型等位基因的存在是陽性的。通過在使用引物SQ3443、SQ3445和SQ3446的擴(kuò)增反應(yīng)中 使用探針PB1111和PB1112對兩種不同擴(kuò)增子的熒光檢測證明M0N87701事件的雜合性。優(yōu)選實(shí)施方式詳述提供下面的定義和方法以更好地定義本發(fā)明并指導(dǎo)本領(lǐng)域的技術(shù)人員實(shí)施本發(fā) 明。除非另有說明，可以根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解術(shù)語。分子生物 學(xué)中的常用術(shù)語的定義也可以在以下文獻(xiàn)中找到Rieger等人，Glossary of Genetics Classical and Molecular,第 5 版，Springer-Verlag :New York, 1991 ；禾口 Lewin, Genes V, OxfordUniversity Press :New York,1994。如本文所用，術(shù)語“大豆”是指大豆(Glycine max)，且包括可用于大豆培育的所 有植物品種，包括野生大豆種以及那些屬于允許物種之間品種選育的野生大豆(Glycine soja)的植物。如本文所用，術(shù)語“包括”指“包括但不限于”。術(shù)語“草甘膦”指N-膦?；谆拾彼峒捌潲}。N-膦?；谆拾彼崾枪膶?于大范圍植物物種具有活性的除草劑?！吧唐贰敝溉魏斡稍醋源蠖够虼蠖褂偷牟牧辖M成的且向消費(fèi)者出售的產(chǎn)品。加工的 大豆是世界上蛋白質(zhì)飼料和植物油的最大來源。大豆植物M0N87701可用于生產(chǎn)通常是由 大豆獲得的商品。M0N87701大豆可以加工成粗粉、面粉，以及用作用于陸生動(dòng)物和水生動(dòng) 物的動(dòng)物飼料的蛋白質(zhì)源。M0N87701的大豆和大豆油可以用于生產(chǎn)許多不同的產(chǎn)品，不限 于無毒塑料、印刷油墨、潤滑劑、蠟、液壓流體、變壓器流體、溶劑、化妝品和頭發(fā)護(hù)理產(chǎn)品。 M0N87701的大豆和大豆油適用于由全大豆制造的多種大豆食物，如豆奶、大豆果仁醬、納豆 和豆豉；和由加工的大豆和大豆油制造的各種大豆食物，包括大豆粗粉、大豆面粉、大豆蛋 白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織化大豆蛋白濃縮物、水解大豆蛋白、植脂奶油、食用油、色 拉油、起酥油和卵磷脂。全大豆也是可食用的，且通常銷售給消費(fèi)者的是生的、烤的或毛豆。 通常是由浸泡和磨碎全大豆生產(chǎn)的豆奶可以不經(jīng)其它加工而食用，可以噴霧干燥，或加工 成大豆酸奶、大豆干酪、豆腐或腐竹。M0N87701大豆油可以用來制造生物柴油。生物柴油在傳統(tǒng)的柴油發(fā)動(dòng)機(jī)中使用 和石油柴油燃料相比導(dǎo)致如硫酸鹽、一氧化碳和顆粒物的污染物的大幅減少，且在校車中 的使用可極大地減少與有毒的柴油機(jī)廢氣的接觸。通常通過以下步驟獲得生物柴油提取、
11過濾和精煉大豆油以除去游離的脂肪和磷脂，然后用甲醇對油進(jìn)行酯交換以形成脂肪酸的 甲基酯(參見，例如，美國專利5，891，203)。產(chǎn)生的大豆甲酯通常被稱為“生物柴油”。源 自M0N87701的油也可以不形成甲酯而用作柴油機(jī)燃料，例如，通過混合縮醛和油(參見， 例如，美國專利6，013，114)?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法鑒定用于制造所述油的M0N87701種 子。預(yù)計(jì)從M0N87701事件種子或其中一部分或所有是M0N87701的種子混合物純化的油 相對地沒有可用于測試的DNA。然而，從中提取油的種子可以由本發(fā)明的方法表征以鑒定 M0N87701事件在用于制造所述油的種子群中的存在。此外，用于制造所述油的工藝產(chǎn)生的 植物廢物可以用于本發(fā)明的方法中以鑒定M0N87701事件在進(jìn)行加工以制造所述油的種子 混合物中的存在。同樣，在制造商品之后剩下的或在收獲大豆種子后遺留的植物碎片可以 由本發(fā)明的方法表征以鑒定M0N87701事件在用于制造所述商品的原料中的存在。轉(zhuǎn)基因“事件”是通過用異源DNA(即，包括目標(biāo)轉(zhuǎn)基因的核酸構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化植物 細(xì)胞、再生由轉(zhuǎn)基因插入植物的基因組中產(chǎn)生的植物群體和選擇由插入特定的基因組位置 為特征的特定植物產(chǎn)生的。術(shù)語“事件”指包含異源DNA的原始轉(zhuǎn)化體和該轉(zhuǎn)化體的后代。 術(shù)語“事件”也指通過轉(zhuǎn)化體和包含異源DNA的另一品種之間的有性異交產(chǎn)生的后代。甚 至在與回交親本(recurrent parent)反復(fù)回交后，來自轉(zhuǎn)化的親本的插入DNA和側(cè)翼DNA 在雜交后代中存在于同一染色體位置。術(shù)語“事件”也指來自包含插入DNA和緊鄰插入DNA 的側(cè)翼基因組序列的原始轉(zhuǎn)化體的DNA，其預(yù)期由于包含由包含插入DNA的親本株系(例 如，原始轉(zhuǎn)化體和由自交產(chǎn)生的后代)和不包含插入DNA的親本株系的有性雜交而轉(zhuǎn)移到 接受了包含目標(biāo)轉(zhuǎn)基因的插入DNA的后代中。本發(fā)明涉及事件M0N87701的DNA、植物細(xì)胞、 組織、種子和源自M0N87701的加工產(chǎn)品。也可以理解兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物也可以配種以產(chǎn)生包含兩個(gè)獨(dú)立地隔離加 入的外源基因的后代。適當(dāng)?shù)暮蟠淖越豢梢援a(chǎn)生對于兩種加入的外源基因是純合的 植物。也包括與親本植物的回交和與非轉(zhuǎn)基因植物的異交，如無性繁殖。通常用于不同 性狀和作物的其它育種方法的描述可以在幾種參考文獻(xiàn)中的某一種中找到，例如，F(xiàn)ehr, BreedingMethods for Cultivar Development, Wilcox J.編 輯，American Society ofAgronomy, Madison WI(1987)。如本文中提及“分離的DNA分子”時(shí)，意思是DNA分子是單獨(dú)或與其它成分組合存 在的、但不存在于其自然環(huán)境中的分子。例如，在大豆基因組DNA中天然存在的編碼序列、 內(nèi)含子序列、未翻譯的前導(dǎo)序列、啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止序列等，只要它們存在于大豆基因 組內(nèi)，不被認(rèn)為與大豆基因組分離。但是，只要結(jié)構(gòu)和組分不在大豆基因組內(nèi)，那么這些組 分和這些組分的子部分中的各個(gè)在本發(fā)明的范圍內(nèi)是“分離的”。同樣，只要核苷酸序列不 在首次觀察到該結(jié)構(gòu)的蘇云金芽孢桿菌的DNA內(nèi)，那么編碼蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白或該 蛋白的殺蟲變異體的核苷酸序列是分離的核苷酸序列。編碼與天然的蘇云金芽孢桿菌核苷 酸序列編碼的相同氨基酸序列或基本上相同的氨基酸序列的人工核苷酸序列被認(rèn)為是為 了本發(fā)明的目的而分離。為了本發(fā)明的目的，任何轉(zhuǎn)基因核苷酸序列，即插入大豆植物事件 M0N87701的細(xì)胞基因組中的DNA的核苷酸序列，被認(rèn)為是分離的核苷酸序列，不論它是否 存在于用于轉(zhuǎn)化引起M0N87701事件的大豆細(xì)胞的質(zhì)粒中，存在于M0N87701事件的基因組 中，以可檢測的量存在于源自事件M0N87701的組織、后代、生物樣品或商品中。因此，如果 DNA分子可以從來自植物或種子或植物器官的細(xì)胞或組織或勻漿中提取，或者可以作為從來自植物或種子或植物器官細(xì)胞或組織或勻漿(上述任一種都是源自由事件M0N87701獲 得的材料)提取的DNA或RNA的擴(kuò)增子產(chǎn)生，那么核苷酸序列或任何源自其的片段被認(rèn)為 是分離的或可分離的。對于這個(gè)問題，SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2所示的接頭序列和源 自包含這些接頭序列的事件M0N87701的核苷酸序列被認(rèn)為是分離的或可分離的，不論這 些序列是否存在于事件M0N87701的基因組中或以可檢測的量存在于源自事件M0N87701的 組織、后代、生物樣品或商品中。“探針”是其上附有常規(guī)可檢測的標(biāo)記或報(bào)告分子(如放射性核素、配體、化學(xué)發(fā) 光劑或酶)的分離的核酸。這種探針與靶核酸的鏈互補(bǔ)，在本發(fā)明的情況中與大豆事件 M0N87701的基因組DNA的鏈互補(bǔ)，不論來于自大豆植物或來自包含事件的DNA的樣品。本 發(fā)明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括特異性地結(jié)合靶DNA序列的聚酰 胺和其它材料，且這種結(jié)合可用于檢測靶DNA序列的存在?！耙铩笔欠蛛x的核酸，其通過核酸雜交與互補(bǔ)的靶DNA鏈退火以形成引物和靶 DNA鏈的雜交體，然后通過聚合酶(例如，DNA聚合酶)沿著靶DNA鏈延伸。本發(fā)明的引物對 指它們用于靶核酸序列的擴(kuò)增，例如，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或其它常規(guī)核酸擴(kuò)增方法。探針和引物長度一般為11個(gè)或更多個(gè)核苷酸，優(yōu)選18個(gè)或更多個(gè)核苷酸，更優(yōu)選 24個(gè)或更多個(gè)核苷酸，最優(yōu)選30個(gè)或更多個(gè)核苷酸。這種探針和引物在高嚴(yán)格雜交條件下 特異性地與靶序列雜交。優(yōu)選地，雖然可以通過傳統(tǒng)方法設(shè)計(jì)不同于靶序列而保留與靶序 列雜交的能力的探針，但本發(fā)明的探針和引物具有與靶序列的完全序列相似性。制備和使用探針和引物的方法在以下文獻(xiàn)中描述，例如，MolecularCloning A Laboratory Manual,第 二 版，第 1-3 卷，Sambrook 等人編著，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY，1989(下面簡稱為〃 Sambrook等人，1989〃 )； Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等人編著，Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York，1992 (定期更新)(以下簡稱 “Ausubel 等人，1992”)；及 Innis 等人，PCRProtocols :A Guide to Methods and Applications, Academic Press SanDiego, 1990。PCR引物對可以源自已知的序列，例如，通過使用用于該目的的計(jì)算機(jī)程 序，如 Primer(Version 0.5, 1991, Whitehead Institutefor Biomedical Research, Cambridge, MA)。本文公開的基于側(cè)翼DNA和插入序列的引物和探針可以用于通過常規(guī)方法(例 如，通過再克隆和測序這樣的序列)確認(rèn)(且如果必要，校正)公開的序列。本發(fā)明的核酸探針和引物在嚴(yán)格條件下與靶DNA序列雜交。任何常規(guī)的核酸雜交 或擴(kuò)增方法可以用于鑒定在樣品中來自轉(zhuǎn)基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段在某 些情況下能夠特異性地與其它核酸分子雜交。如本文所用，如果兩個(gè)核酸分子能夠形成反 平行雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，那么這兩個(gè)分子被認(rèn)為能夠特異性地彼此雜交。如果它們表現(xiàn)出完全 的互補(bǔ)性，則一核酸分子被認(rèn)為與另一核酸分子“互補(bǔ)”。如本文所用，當(dāng)一個(gè)分子的每個(gè) 核苷酸都與另一分子的核苷酸互補(bǔ)時(shí)，則該分子被認(rèn)為顯示出“完全的互補(bǔ)性”。如果兩個(gè) 分子以足夠的穩(wěn)定性互相雜交以允許它們在至少常規(guī)的“低嚴(yán)格”條件下保持彼此退火，那 么這兩個(gè)分子被認(rèn)為是“最低限度互補(bǔ)的”。類似地，如果分子以足夠的穩(wěn)定性互相雜交以 允許它們在常規(guī)的“高嚴(yán)格”條件下保持彼此退火，那么分子是“互補(bǔ)的”。Sambrook等人， 1989 與Haymes 等人，In :Nucleic Acid Hybridization, APractical Approach, IRL Press，Washington, DC (1985)描述了常規(guī)的嚴(yán)格性條件。因而偏離完全互補(bǔ)性是允許的，只要這 種偏離沒有完全消除該分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。為了使核酸分子用作引物或探針，只需 要在序列中充分互補(bǔ)以在所采用的特定的溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。如本文所用，“基本上同源的序列”是在高嚴(yán)格條件下與所比照的核酸序列的互補(bǔ) 序列特異性雜交的核酸序列。促進(jìn)DNA雜交的合適的嚴(yán)格條件，例如，大約45°C的6. Ox氯 化鈉/檸檬酸鈉(350，接著501的2.(^ SSC洗滌，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，或可以在 Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. ,1989,6.3.1-6. 3. 6 中找到。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以從50°C的大約2. Ox SSC的低嚴(yán)格條件到50°C的 大約0.2x SSC的高嚴(yán)格條件中選擇。另外，洗滌步驟中的溫度可以從室溫(大約22°C) 的低嚴(yán)格條件增加到大約65°C的高嚴(yán)格條件。溫度和鹽都可以變化，或者溫度或鹽濃度 中的一種可以保持恒定，而另一個(gè)變量發(fā)生變化。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的核 酸分子在中等嚴(yán)格條件(例如，大約2. Ox SSC和大約65°C )下特異性地與SEQ ID NO 1 和SEQ ID NO :2所示的核酸分子或其互補(bǔ)序列或其中任一個(gè)的片段中的一個(gè)或多個(gè)雜交。 在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸在高嚴(yán)格條件下特異性地與SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO :2所示的核酸分子或互補(bǔ)序列或其中任一個(gè)的片段中的一個(gè)或多個(gè)雜交。在本 發(fā)明的一方面，本發(fā)明的優(yōu)選標(biāo)記核酸分子具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核酸 序列或其互補(bǔ)序列或其中任一個(gè)的片段。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的優(yōu)選標(biāo)記核酸分 子與SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核酸序列或其互補(bǔ)序列或其中任一個(gè)的片段共 有 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%和100%的序列同一性。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明 的優(yōu)選標(biāo)記核酸分子與SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核酸序列或其互補(bǔ)序列或其 中任一個(gè)的片段共有95%、96%、97%、98%、99%禾口 100%的序列同一性。SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO :2可以在植物育種方法中用作標(biāo)記以鑒定類似于"DNA markers protocols, applications, and overviews (1997) 173-185，Cregan 等人編著，Wiley-LissNY"中簡單 序列重復(fù)DNA標(biāo)記分析所描述的方法的遺傳雜交的后代；本文通過引用引入所有這些?？?以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的多種方法檢測探針與的靶DNA分子的雜交，這些可以包括 但不限于，熒光標(biāo)簽、放射性標(biāo)簽、基于抗體的標(biāo)簽和化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽。關(guān)于使用特定擴(kuò)增引物對進(jìn)行靶核酸序列的擴(kuò)增(例如，通過PCR)，“嚴(yán)格條件” 是使得引物對僅與具有對應(yīng)的野生型序列(或其互補(bǔ)序列)的引物與之結(jié)合的靶核酸酸序 列雜交的條件，并優(yōu)選在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生唯一的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增子。術(shù)語“對于(靶序列)特異性的”表示探針或引物在嚴(yán)格雜交條件下只與包含靶 序列的樣品中的靶序列雜交。如本文所用，“擴(kuò)增的DNA”或“擴(kuò)增子”指作為核酸模板的部分的靶核酸序列的核 酸擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，為了確定有性雜交產(chǎn)生的大豆植物是否含有來自本發(fā)明大豆植物的轉(zhuǎn) 基因事件基因組DNA，從大豆植物組織樣品提取的DNA可以使用包含源自與插入的異源DNA 的插入位點(diǎn)鄰近的植物基因組的側(cè)翼序列的引物和源自插入的異源DNA的第二引物的引 物對執(zhí)行核酸擴(kuò)增方法，以產(chǎn)生用于診斷事件DNA的存在的擴(kuò)增子。該擴(kuò)增子具有特定長 度，且具有也用于診斷事件的序列。擴(kuò)增子的長度范圍為引物對加上1個(gè)核苷酸堿基對的 組合長度，優(yōu)選加上大約50個(gè)核苷酸堿基對，更優(yōu)選加上大約250個(gè)核苷酸堿基對，甚至更優(yōu)選加上大約450個(gè)核苷酸堿基對?？蛇x擇地，引物對可以源自插入DNA兩側(cè)的側(cè)翼序列， 從而產(chǎn)生包含完整的插入核苷酸序列的擴(kuò)增子。源自植物基因組序列的引物對的成員可能 位于距離插入的DNA分子一定距離的位置，該距離范圍可以是從1個(gè)核苷酸堿基對到高達(dá) 大約兩萬個(gè)核苷酸堿基對。術(shù)語“擴(kuò)增子”的使用明確排除可能在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中形成 的引物二聚體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的各種核酸擴(kuò)增方法(包括聚合酶連鎖反應(yīng)(PCR))中的任 何一種實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增。多種擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域已知的且在文獻(xiàn)中有描述，特別是美國專 利 4，683，195 禾口 4，683，202 及 PCRProtocols :A Guide to Methods and Applications, Innis等人(編)，AcademicPress，San Diego，1990。已經(jīng)開發(fā)了 PCR擴(kuò)增方法以擴(kuò)增高達(dá) 22kb 的基因組 DNA 和高達(dá) 42kb 的噬菌體 DNA (Cheng 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 5695-5699，1994)。這些方法以及DNA擴(kuò)增領(lǐng)域內(nèi)已知的其它方法可以用于實(shí)施本發(fā)明?？?以通過使用源自本發(fā)明提供的序列的引物擴(kuò)增來自所述事件的這種序列，接著通過PCR擴(kuò) 增子或克隆的DNA的標(biāo)準(zhǔn)DNA測序來驗(yàn)證(如果必要，校正)來自作為ATCCPTA-8194保藏 的種子樣品的大豆事件M0N87701的異源DNA插入序列或側(cè)翼序列?？梢酝ㄟ^多種技術(shù)檢測通過這些方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子。一種這樣的方法是遺傳位分 析(Genetic Bit Analysis) (Nikiforov等人，Nucleic Acid Res. 22 :4167_4175，1994)，其 中設(shè)計(jì)了與相鄰的側(cè)翼基因組DNA序列和插入的DNA序列重疊的DNA寡核苷酸。將該寡核 苷酸固定在微孔板的孔中。繼目標(biāo)區(qū)域的PCR(使用插入序列中的一個(gè)引物和相鄰的側(cè)翼 基因組DNA序列中的一個(gè)引物)之后，可以將單鏈PCR產(chǎn)物與固定的寡核苷酸雜交，并用作 使用DNA聚合酶和對于預(yù)期的下一堿基特異性的標(biāo)記ddNTP的單堿基延伸反應(yīng)的模板。讀 數(shù)可以是熒光或基于ELISA。由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸，信號表明插入/側(cè)翼序 列的存在。另一種方法是Winge (Innov. Pharma. Tech. 00 18-24，2000)所描述的焦磷酸 測序技術(shù)(Pyrosequencing technique)。在該方法中，寡核苷酸設(shè)計(jì)為與相鄰的基因 組DNA和插入DNA的接頭重疊。將寡核苷酸與來自目標(biāo)區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(插入序列 中的一個(gè)引物和側(cè)翼基因組序列中的一個(gè)引物)雜交，并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶 (sulfurylase)、螢光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase)、腺苷5，磷酰硫酸(adenosine 5' phosphosulfate)和螢光素的存在下孵育。單個(gè)地加入dNTP，且摻入產(chǎn)生進(jìn)行測量的光 信號。由于成功的擴(kuò)增、雜交或多堿基延伸，光信號表明轉(zhuǎn)基因插入/側(cè)翼序列的存在。如Chen，等人(Genome Res. 9 =492-498,1999)所述的熒光偏振是一種可用于檢測 本發(fā)明的擴(kuò)增子的方法。使用此方法，設(shè)計(jì)與基因組側(cè)翼DNA和插入DNA的接頭重疊的寡 核苷酸。將該寡核苷酸與目標(biāo)區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(插入DNA中的一個(gè)引物和側(cè)翼基因組 序列的一個(gè)引物)雜交，并在DNA聚合酶和熒光標(biāo)記的ddNTP的存在下孵育。單堿基延伸 導(dǎo)致ddNTP的摻入。可以因?yàn)槠褡兓褂脽晒庥?jì)測量摻入。由于成功的擴(kuò)增、雜交或 單堿基延伸，偏振的改變表明轉(zhuǎn)基因插入/側(cè)翼序列的存在。TAQMAN (PE Applied Biosystems,Foster City，CA)被描述為一種檢測和定量 DNA序列的存在的方法，且根據(jù)制造商提供的說明書可以完全理解。簡單地說，設(shè)計(jì)與基因 組DNA和插入DNA的接頭重疊的FRET寡核苷酸探針。FRET探針和PCR引物(插入DNA序 列中的一個(gè)引物和側(cè)翼基因組序列中的一個(gè)引物)在耐熱聚合酶和dNTP的存在下循環(huán)。
15FRET探針的雜交導(dǎo)致熒光部分從FRET探針上的淬滅部分切割和釋放。由于成功的擴(kuò)增和 雜交，熒光信號表明側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。如Tyangi 等人(Nature Biotech. 14 =303-308,1996)所述，分子信標(biāo)被描述用 于序列檢測。簡單地說，設(shè)計(jì)與側(cè)翼基因組和插入DNA的接頭重疊的FRET寡核苷酸探針。 FRET探針的獨(dú)特結(jié)構(gòu)導(dǎo)致它含有保持熒光部分和淬滅部分緊密接近的二級結(jié)構(gòu)。FRET探 針和PCR引物(插入DNA序列中的一個(gè)引物和側(cè)翼基因組序列的一個(gè)引物)在耐熱聚合酶 和dNTP的存在下循環(huán)。繼成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后，F(xiàn)RET探針與靶序列的雜交導(dǎo)致探針二 級結(jié)構(gòu)喪失及熒光和淬滅部分的空間分離，其隨之導(dǎo)致熒光信號的產(chǎn)生。熒光信號表明由 于成功的擴(kuò)增和雜交而存在側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入序列。其它描述的方法，如微流體技術(shù)(美國專利公開2006068398、美國專利 6，544，734)提供了分離和擴(kuò)增DNA樣品的方法和設(shè)備。用于檢測和定量特定的DNA分子的 光染料(W0/05017181)；包含用于檢測DNA分子的電子傳感器的納米管裝置(W0/06024023) 或結(jié)合特定的DNA分子然后可以被檢測的納米珠?？梢允褂帽景l(fā)明公開的組合物和DNA檢測領(lǐng)域公知的方法開發(fā)DNA檢測試劑盒。 該試劑盒可用于鑒定樣品中的大豆事件M0N87701DNA，且可以應(yīng)用于培育含有適當(dāng)?shù)氖录?DNA的大豆植物的方法。試劑盒可以包含與SEQ ID N0:1至SEQ ID NO :6同源或互補(bǔ)的 DNA引物或探針，或與轉(zhuǎn)基因插入序列中包含的遺傳元件的DNA序列同源或互補(bǔ)的DNA引 物或探針。這些DNA序列可以用作DNA擴(kuò)增反應(yīng)中的引物或DNA雜交方法中的探針。如 圖2所示的M0N87701大豆基因組中包含的基因組DNA，和轉(zhuǎn)基因遺傳元件的序列由來自根 癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的右邊界區(qū)域(RB)的一部分組成，源自擬南芥 (Arabidopsis)核酮糖1，5_ 二磷酸羧化酶小亞基基因的啟動(dòng)子序列(本發(fā)明稱為位于SEQ ID NO 5的155位至1850位的P_RbcS4)可操作地連接源自擬南芥核酮糖1，5- 二磷酸羧 化酶小亞基基因的非翻譯前導(dǎo)序列(本發(fā)明稱為位于SEQ ID NO 5的1851位至1877位的 L-RbcS4)，所述非翻譯前導(dǎo)序列可操作地連接昆蟲毒素編碼序列TIC107(其由源自擬南芥 核酮糖1，5_二磷酸羧化酶小亞基基因的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和源自CrylAc的昆蟲 毒素(本發(fā)明稱為TIC107，分別為SEQ ID NO 5上位于1889位至2141位的轉(zhuǎn)運(yùn)肽和位于 2142位至5678位的毒素編碼序列)組成)，且可操作地連接源自大豆7S a ’ 3伴大豆球 蛋白(conglycinin)儲(chǔ)存蛋白基因的3’終止區(qū)域(本發(fā)明稱為位于SEQ ID NO :5的位置 5688至6126的T-Sphas)和來自根癌土壤桿菌的左邊界(LB)區(qū)域的一部分。用作DNA擴(kuò) 增方法中的引物的DNA分子可以源自M0N87701事件包含的轉(zhuǎn)基因插入序列的遺傳元件序 列。這些引物分子可以用作引物組的部分，其還包括源自SEQ ID NO :3的堿基1至5747和 SEQ ID NO :4的堿基389至2611給出的位于事件M0N87701轉(zhuǎn)基因插入序列的側(cè)翼的基因 組的DNA引物分子。通過土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的自交大豆株系用質(zhì)粒構(gòu)建體 pM0N53570(如圖1所示)轉(zhuǎn)化的方法產(chǎn)生大豆植物M0N87701。所用的轉(zhuǎn)化方法類似于美 國專利5，914，451所描述的方法。質(zhì)粒構(gòu)建體PM0N53570包含與大豆植物細(xì)胞中TIC107 蛋白表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)遺傳元件連接的植物表達(dá)盒。大豆細(xì)胞再生為完整的大豆植物，并 從顯示出植物表達(dá)盒的完整性和對鱗翅目昆蟲的幼蟲取食損害的抗性及未連鎖的草甘膦 抗性選擇盒的喪失的植物群體中選擇單個(gè)植物。在其基因組中包含連接的PM0N53570植物表達(dá)盒的大豆植物是本發(fā)明的一個(gè)方面。插入大豆植物M0N87701基因組中的質(zhì)粒DNA通過詳細(xì)的分子分析鑒定。這些分 析包括插入序列的數(shù)目(大豆基因組中整合位點(diǎn)的數(shù)目)、拷貝數(shù)(一個(gè)基因座中T-DNA 的拷貝數(shù))和插入的基因盒的完整性。使用包括完整的TIC107編碼區(qū)域及其相應(yīng)的調(diào)控 元件、啟動(dòng)子、內(nèi)含子和植物表達(dá)盒的多腺苷酸化序列及質(zhì)粒PM0N53570的骨架DNA區(qū)域的 DNA分子探針。數(shù)據(jù)顯示，M0N87701包含具有TIC107表達(dá)盒的一個(gè)拷貝的單T-DNA插入。 在M0N87701基因組中沒有檢測到來自轉(zhuǎn)化載體PM0N53570的與完整基因盒連接或未連接 的另外的元件。最后，進(jìn)行反向PCR和DNA序列分析以確定5’和3’的插入序列-植物基 因組接頭，證實(shí)元件在插入序列中的組織(圖2)，并確定大豆植物M0N87701中的插入序列 的完全DNA序列(SEQ ID NO :5)。本發(fā)明涉及包含SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2或其互補(bǔ)序列的核苷酸序列的DNA分 子。DNA 分子優(yōu)選包含 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 或其互補(bǔ) 序列的核苷酸序列。更優(yōu)選DNA分子基本上由SEQ ID NO 3的1位至5757位的核苷酸序 列、SEQ IDN0 :5的1位至6426位的核苷酸序列和SEQ ID NO 4的379位至2611位的核苷 酸序列或其互補(bǔ)序列組成，或者基本上由SEQ ID NO :6或其互補(bǔ)序列的核苷酸序列組成。本發(fā)明還涉及包含該DNA分子的大豆植物或其部分或種子。本發(fā)明還提供源自本發(fā)明的大豆植物或其部分的組合物。這種組合物包含可檢測 量的所述DNA分子，且所述組合物是選自大豆粗粉、大豆面粉、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白 分離物、組織化大豆蛋白濃縮物、水解大豆蛋白、大豆油和植脂奶油的商品。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種產(chǎn)生昆蟲抗性的大豆植物的方法。該方法包括(a)將 M0N87701的大豆植物與另一大豆植物雜交；(b)獲得至少一個(gè)源自(a)的雜交的后代植物； 和(c)選擇包含SEQ ID NO :1和SEQ IDN0 2的核苷酸序列的后代。所述選擇包括使由(b) 獲得的至少一個(gè)后代植物進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，其中，選擇產(chǎn)生包含SEQ ID N0:3、SEQ IDN0 4、SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6中的至少一種核苷酸序列的擴(kuò)增子的后代，或者使由(b) 獲得的至少一個(gè)后代植物進(jìn)行核酸雜交反應(yīng)，其中，選擇與在嚴(yán)格條件下與一種或多種選 自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2的DNA序列雜交的探針雜交的后代。如此選擇的后代是昆 蟲抗性的大豆植物。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及一種保護(hù)大豆植物免受蟲害的方法。該方法包括在大豆 的鱗翅目害蟲的食物中提供殺蟲有效量的大豆植物M0N87701的細(xì)胞或組織。鱗翅目 害蟲選自干煞夜蛾屬(Anticarsia)、Pseudoplusia、葉小卷蛾屬(Epinotia)、雪燈蛾屬 (Spilosoma)、鈴夜蛾屬(Helicoverpa)、灰翅夜蛾屬(Spodoptera)禾口 Rachiplusia。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含第一 DNA分子和第二 DNA分子的DNA分子對，其中，該DNA 分子是SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5或其互補(bǔ)序列、或SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5或其 互補(bǔ)序列、或SEQ ID NO :6或其互補(bǔ)序列的足夠長度的連續(xù)核苷酸以用作診斷由大豆植物 M0N87701或其后代提取的DNA的DNA引物或探針。例如，DNA分子對中的第一 DNA分子包含SEQ ID NO 3或SEQ IDN0 5的轉(zhuǎn)基因區(qū) 域的任何部分或其互補(bǔ)序列的11個(gè)或更多連續(xù)核苷酸，且DNA分子對的第二 DNA分子包含 類似長度的SEQ ID NO :3的5，側(cè)翼大豆基因組DNA區(qū)域或其互補(bǔ)序列。一個(gè)具體的例子 是第一 DNA分子包含SEQ ID NO :9，且第二 DNA分子包含SEQ ID N0:10。
另一個(gè)例子是，DNA分子對中的第一 DNA分子包含SEQ ID NO :4或SEQ ID NO 5 的轉(zhuǎn)基因區(qū)域的任何部分或其互補(bǔ)序列的11個(gè)或更多連續(xù)核苷酸，且DNA分子對中的第二 DNA分子包含類似長度的SEQ IDN0:4的3，側(cè)翼大豆基因組DNA區(qū)域或其互補(bǔ)序列。一個(gè) 具體的例子是，第一 DNA分子包含SEQ ID NO 12，且第二 DNA分子包含SEQ IDN0 :13。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及一種檢測選自SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5和 SEQ ID NO :6的DNA分子在生物樣品中的存在的方法，該方法包括(a)將生物樣品與包含 具有足夠長度的SEQ ID NO 3或其互補(bǔ)序列、SEQ ID NO :4或其互補(bǔ)序列、SEQ ID N0:5或 其互補(bǔ)序列、或SEQ ID NO :6或其互補(bǔ)序列的連續(xù)核苷酸的DNA引物分子的DNA引物對接 觸，所述DNA引物對用作診斷由大豆植物M0N87701或其后代提取的DNA的DNA引物或探 針；(b)提供核酸擴(kuò)增反應(yīng)條件；(c)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生DNA擴(kuò)增子分子；和(d) 檢測如此產(chǎn)生的DNA擴(kuò)增子分子。檢測到包含SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2及其互補(bǔ)序列 中至少一個(gè)的擴(kuò)增子表明該DNA分子在生物樣品中存在。生物樣品可以包含任何源自大豆細(xì)胞或組織(包括莖、根、葉、花或花的部分、種 子或種莢等)的有機(jī)材料，其包含可檢測量的對應(yīng)于這些有機(jī)材料的核苷酸序列。源自大 豆事件M0N87701的生物樣品包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域，尤其是那些在序列表 中如SEQ IDN0:1至SEQ ID NO :6所示的區(qū)域及其互補(bǔ)序列。例如，適用于本發(fā)明的生物樣 品可以是大豆粗粉、大豆面粉、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織化大豆蛋白濃縮物、 水解大豆蛋白和植脂奶油。被測試的生物樣品可以是從大豆植物提取的DNA樣品。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及一種檢測選自SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5和 SEQ ID NO :6的DNA分子在生物樣品中的存在的方法。這種方法包括(a)將生物樣品與在 嚴(yán)格的條件下與所述DNA分子雜交且在嚴(yán)格條件下不與不包含所述DNA分子的生物樣品雜 交的DNA探針接觸；(b)使生物樣品和DNA探針經(jīng)歷嚴(yán)格的雜交條件；和(c)檢測DNA探針 與生物樣品的雜交。檢測到雜交表明DNA分子在生物樣品中存在。例如，被測試的生物樣 品可以是從大豆植物提取的DNA樣品。在上述檢測方法中使用的探針可以包含SEQ ID N0 :1或SEQ IDN0 2或其互補(bǔ)序 列，或包含SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :15。這種探針的具體例子包括SEQ ID N0:11或 SEQ ID N0:15。這種探針可以進(jìn)一步用至少一種熒光團(tuán)標(biāo)記。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及DNA檢測試劑盒，包括至少一個(gè)與SEQ IDN0 :3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6同源或互補(bǔ)的足夠長度的連續(xù)核苷酸的DNA分子，以用作 對于大豆事件M0N87701和/或其后代特異性的DNA引物或探針。該至少一個(gè)DNA分子可以 包含SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2或其互補(bǔ)序列。這種DNA分子的具體例子是SEQ ID NO 1、SEQ ID NO :2或其互補(bǔ)序列。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及測定大豆樣品中包含大豆事件M0N87701的大豆植物基因組 的DNA的接合性的方法。該方法包括(a)將樣品與SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13的第 一引物對接觸，所述引物對在大豆事件M0N87701 DNA的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中一起使用時(shí)產(chǎn)生 用于診斷大豆事件M0N87701的擴(kuò)增子；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；(c)檢測如此產(chǎn)生的第一 擴(kuò)增子；(d)將樣品與SEQ ID N0:13和SEQ ID NO 14的第二引物對接觸，所述引物對在 除了大豆事件M0N87701 DNA之外的大豆基因組DNA的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中一起使用時(shí)產(chǎn)生用 于診斷大豆事件M0N87701 DNA之外的大豆基因組DNA的擴(kuò)增子；(e)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；
18和(f)檢測如此產(chǎn)生的第二擴(kuò)增子。檢測到用于診斷大豆事件M0N87701的擴(kuò)增子和用于 診斷大豆事件M0N87701 DNA之外的大豆基因組DNA的擴(kuò)增子表明所述樣品對于大豆事件 M0N87701 DNA是雜合的。優(yōu)選，第一引物對進(jìn)一步與SEQ ID NO 15的探針一起使用，和/ 或第二引物對進(jìn)一步與SEQ ID NO :16的探針一起使用。本文包括下面的實(shí)施例來顯示本發(fā)明的特定優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)施例。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員應(yīng)該理解，下面的實(shí)施例中公開的技術(shù)代表了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在實(shí)施本發(fā)明中運(yùn)用良 好的技術(shù)，因此可以被認(rèn)為構(gòu)成了實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本 公開內(nèi)容應(yīng)該理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對公開的具體實(shí)施方案 進(jìn)行許多改變，而且仍然獲得相同或類似的結(jié)果。
實(shí)施例實(shí)施例1 用pM0N53570轉(zhuǎn)化大豆A5547和事件選擇大豆細(xì)胞用源自pM0N53570 (圖1)的DNA片段通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生成轉(zhuǎn)基 因大豆植物M0N87701。雙元植物轉(zhuǎn)化載體pM0N53570包含兩個(gè)植物轉(zhuǎn)化盒或T-DNA。每個(gè) 盒分別在轉(zhuǎn)化盒的5’和3’末端與右邊界和左邊界序列側(cè)接。顯示為SEQ ID N0:7的表達(dá) 盒用于昆蟲毒素的表達(dá)。表達(dá)盒由源自擬南芥核酮糖1，5_ 二磷酸羧化酶小亞基基因的啟 動(dòng)子和前導(dǎo)序列(P_RbcS4，Krebbers 等人，(1988)Plant Mol. Biol. 11 :745_759)組成，其 直接克隆到昆蟲毒素編碼序列TIC107的上游，TIC107依次直接克隆到源自大豆7S a ‘ ^ 伴大豆球蛋白儲(chǔ)存蛋白基因的3’終止序列(T-Sphas，參見，例如Schuler等人，(1982) Nucleic AcidsRes. 10 =8225-8244)的上游。昆蟲毒素編碼序列 TIC107 顯示為 SEQ IDN0 8。如SEQ ID NO 8所示的核酸序列是編碼源自Cry 1 Ac (美國專利5，880，275)的殺蟲毒素 的合成或人工序列，源自擬南芥核酮糖1，5_ 二磷酸羧化酶小亞基基因的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編 碼序列直接克隆到昆蟲毒素編碼序列的上游。通過電穿孔動(dòng)員植物轉(zhuǎn)化載體pM0N53570進(jìn)入卸甲的(disarmed)根癌土壤桿菌 菌株ABI中，并基于壯觀霉素和氯霉素進(jìn)行選擇。使用類似于美國專利5，914，451中描述 的方法，用PM0N53570轉(zhuǎn)化來自Asgrow大豆品種A5547的外植體。從種子開始萌發(fā)和通過 超聲損傷時(shí)的14小時(shí)內(nèi)混合大豆外植體和含有pM0N53570的誘導(dǎo)根癌土壤桿菌。損傷后， 將外植體放置于培養(yǎng)基中2至5天，之后將它們轉(zhuǎn)移到含有用于選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的草 甘膦和抗生素的選擇培養(yǎng)基上。允許轉(zhuǎn)基因苗的選擇和形成繼續(xù)進(jìn)行6至8周。對發(fā)育的苗取樣，并使用基于 TIC107表達(dá)盒序列的引物通過PCR對TIC107盒的存在進(jìn)行分析。產(chǎn)生大約100個(gè)R0轉(zhuǎn) 化事件，并測試轉(zhuǎn)基因盒的單拷貝的存在。用作第一遍篩選的Southern分析采用切割表 達(dá)盒一次的限制性內(nèi)切酶。單EcoRV位點(diǎn)正好插入到表達(dá)盒的右邊界內(nèi)。這種酶在大豆基 因組中以足夠的頻率切割，從而通常使多拷貝事件中緊密連接的轉(zhuǎn)基因拷貝分離。也如下 所述進(jìn)行TAQMAN 分析以確認(rèn)R0代中的拷貝數(shù)。42個(gè)R0事件表現(xiàn)轉(zhuǎn)基因盒的單拷貝插 入，并使其自花授粉以產(chǎn)生F1后代。從來自選擇的42個(gè)R0事件的各個(gè)事件的種子培育出 75個(gè)F1植物。向所有的F1后代施用非致死的草甘膦噴霧。其中抗草甘膦盒未連鎖的那 些F1后代變黃，證明草甘膦選擇盒的缺失。115個(gè)植物鑒定為未連鎖事件。使得該115個(gè) F1植物由草甘膦施用中恢復(fù)，然后測試在R1和R7生長階段對飼喂梨豆夜蛾(Anitcarsia
19gemmatalis)和大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)的昆蟲抗性。所有事件通過小于10% 的干煞夜蛾屬(Anitcarsia)和Pseudoplusia飼喂的生物測定標(biāo)準(zhǔn)。對115個(gè)選定的F1植物進(jìn)行Southern分析以確認(rèn)表達(dá)盒的存在和來自轉(zhuǎn)化載體 的不需要的核苷酸序列的不存在。從115個(gè)的集合中選擇12個(gè)事件作為最適合的事件以 通過Southern分析對于拷貝數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的F1評價(jià)。也如下所述對于選擇的F1事件進(jìn) 行TAQMAN 和接合性分析。在12個(gè)F1選擇的事件中，9個(gè)通過初步Southern分析顯示了 毒素表達(dá)盒的單拷貝。將來自9個(gè)事件的幾個(gè)株系進(jìn)行到(carriedforward to)F2和F3 代以進(jìn)行進(jìn)一步的昆蟲試驗(yàn)和遺傳鑒定。選擇來自各個(gè)株系的僅單一 F1植物以產(chǎn)生后續(xù) 世代的種子。在F3代，對4個(gè)選擇的株系進(jìn)行更詳細(xì)的Southern分析以建立更詳細(xì)的插入的 表達(dá)盒的限制性酶圖譜。在9個(gè)事件中，1個(gè)事件完全不含骨架、草甘膦抗性盒和質(zhì)粒復(fù)制 起點(diǎn)。后來發(fā)現(xiàn)這一事件具有兩個(gè)未連接的昆蟲毒素表達(dá)盒并產(chǎn)生幾個(gè)后代株系?；谄?性能特征和分子鑒定在F3代選擇了命名為M0N87701的后代株系。如下所述使用反向PCR 生成各個(gè)選擇的F3代株系的側(cè)翼序列。如下所述，使用通過轉(zhuǎn)化的和野生型株系的反向 PCR推導(dǎo)的序列進(jìn)行R0事件選擇和F1接合性分析。實(shí)施例2 使用反向PCR的側(cè)翼序列的分離jiffi Ochman ^X, 1990 (PCR Protocols :A guide to Methods andApplications, Academic Press, Inc.)所描述的反向PCR確定M0N87701中位于T-DNA插入側(cè)翼的序列。 從來自溫室條件下生長的組織的AsgrOWA5547和轉(zhuǎn)基因株系分離植物基因組DNA以用于 Southern分析和TAQMAN 分析。大約1克的幼三出復(fù)葉(trifoliate leaf)組織與液氮 混合，并使用研缽和研杵磨成細(xì)粉。根據(jù)制造商的方案使用Nucleon PlantDNA提取試劑盒 (RPN8511, Amersham,Piscataway,NJ)提取DNA。最后的沉淀步驟后將DNA再懸浮于0. 5毫 升的TE(10mM的Tris-HCl，pH值8. 0，lmM的EDTA)中。這種方法可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員 改良以從任何大豆的組織(包括但不限于種子)提取DNA。用基于T-DNA的限制分析選擇的限制性內(nèi)切酶消化DNA的等分試樣。經(jīng)過限制性 片段的自身連接(self-ligation)，使用從T-DNA序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增由T-DNA 的5’和3’端延伸的序列。通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并使用QIAGEN凝膠純化 試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)純化。直接使用標(biāo)準(zhǔn)測序方案對隨后的產(chǎn)物測序。延伸到 TIC107表達(dá)盒T-DNA的右邊界序列中的5，側(cè)翼序列表示為SEQ ID NO :3 ([C]，參見圖2)。 延伸到TIC107表達(dá)盒T-DNA的左邊界序列中的3，側(cè)翼序列表示為SEQ ID NO :4([D]，參 見圖2)。完全整合進(jìn)入A5547基因組DNA中的TIC107表達(dá)盒DNA(SEQ ID NO :7)的部分 表示為SEQ ID NO :5([E]，參見圖2)。將分離的序列與T-DNA序列進(jìn)行比較，以鑒定側(cè)翼序列和共分離的T-DNA片段。通 過使用基于推導(dǎo)的側(cè)翼序列數(shù)據(jù)和已知的T-DNA序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR以確認(rèn)表達(dá)盒的 存在。使用由M0N87701中的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)的引物分離對應(yīng)于T-DNA整合到轉(zhuǎn)化株系中的 同一區(qū)域的A5547野生型序列。使用Elongase擴(kuò)增系統(tǒng)(Invitrogen, Carlsbad, CA)進(jìn) 行PCR反應(yīng)。相對于多個(gè)核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分析M0N87701中的側(cè)翼序列和A5547野 生型序列。該信息用于檢查轉(zhuǎn)基因與植物基因組的關(guān)系，并尋找插入位點(diǎn)的完整性。側(cè)翼 序列和野生型序列用于設(shè)計(jì)用于如實(shí)施例3所述的鑒定事件和確定接合性的TaqMan⑧端點(diǎn)分析的引物。實(shí)施例3 事件特異性的端點(diǎn)TAQMAN 和接合性分析在事件特異性的端點(diǎn)TAQMAN PCR中描述了用來鑒定樣品中的事件M0N87701的 方法，表1和表2描述了端點(diǎn)TAQMAN PCR的條件的例子。用于端點(diǎn)分析中的DNA引物 是引物 SQ1135(SEQ ID NO :9)、SQ1136 (SEQ ID NO: 10)和 6FAM 標(biāo)記的引物 PB63 (SEQ ID NO 11) o 6FAM 是連接到 DNA 引物上的 Applied Biosystems (Foster City, CA)的熒光染 料產(chǎn)品。對于TAQMAN MGB探針，Taq DNA聚合酶的5’核酸外切酶活性在熒光團(tuán)和猝滅 劑之間從5’ -端切割探針。當(dāng)與靶DNA鏈雜交時(shí)，猝滅劑和熒光團(tuán)充分分離以產(chǎn)生熒光信 號，從而釋放熒光。當(dāng)用于這些PB63(SEQ ID NO 11)的反應(yīng)方法中時(shí)，SQ1135 (SEQID NO :9)和 SQ1136(SEQ ID NO 10)產(chǎn)生用于診斷事件M0N87701 DNA的DNA擴(kuò)增子。用于此分析的對 照應(yīng)包括來自包含事件M0N87701DNA的大豆的陽性對照、來自非轉(zhuǎn)基因大豆的陰性對照和 不包含模板DNA的陰性對照。優(yōu)化這些測試以用于Applied Biosystems GeneAmp PCR System9700 或 Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 或 EppendorfMastercycler Gradient熱循環(huán)儀。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的產(chǎn)生鑒定事件M0N87701 DNA的擴(kuò)增子的其 它方法和儀器在本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解的范圍內(nèi)。使用以下循環(huán)參數(shù)在 Stratagene Robocycler 或 MJ Engine 或 Perkin-Elmer 9700 或 Eppendorf Mastercycler Gradient 熱循環(huán)儀或 AppliedBiosystems GeneAmp PCR System 9700 或 MJ Research DNA EnginePTC-225 熱循環(huán)儀中進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增。當(dāng)在 Eppendorf MastercyclerGradient或MJ Engine中運(yùn)行PCR時(shí)，熱循環(huán)器應(yīng)該以計(jì)算的模 式運(yùn)行。當(dāng)在Perkin-Elmer 9700中運(yùn)行PCR時(shí)，以設(shè)定為最大的變溫速度運(yùn)行熱循環(huán)儀。表1.大豆M0N87701事件特異性的端點(diǎn)TAQMAN PCR 表2.端點(diǎn)TAQMAN 熱循環(huán)儀條件 使得表現(xiàn)出TIC107表達(dá)盒存在的R0植物發(fā)育為完全成熟的植物。使用已知不切 入TIC107表達(dá)盒和草甘膦抗性基因表達(dá)盒兩個(gè)盒和質(zhì)粒PacI中的各個(gè)盒之間的區(qū)域中的 DNA限制性內(nèi)切酶進(jìn)行的Southern分析，對于R0植物評估TIC107表達(dá)盒和草甘膦抗性基 因表達(dá)盒之間的連鎖是否存在。基于PM0N53570中的草甘膦抗性盒、TIC107盒和位于兩個(gè) 表達(dá)盒之間的復(fù)制起點(diǎn)(OR-Ec. oriV-RK2)的序列設(shè)計(jì)的探針用于探測Southern雜交以確 定連鎖。也使用Southern分析和端點(diǎn)TAQMAN 的結(jié)合對于R0植物評估TIC107表達(dá)盒的 拷貝數(shù)。使表現(xiàn)出草甘膦抗性盒和TIC107表達(dá)盒之間的未連鎖關(guān)系的R0植物自身授粉并 產(chǎn)生F1后代。對于F1植物分析由于在來自未連鎖的自身授粉R0轉(zhuǎn)化事件的F1群體中發(fā)生隔 離而導(dǎo)致的草甘膦抗性盒的缺失。向F1個(gè)體非致死性地施用草甘膦。那些由于隔離導(dǎo)致 抗性盒缺失的植物表現(xiàn)由施用草甘膦導(dǎo)致的損傷。使得這些植物恢復(fù)并正常生長。如下所 述，使用TAQMAN 端點(diǎn)分析對F1植物進(jìn)行TIC107表達(dá)盒的接合性分析。在事件特異性的接合性端點(diǎn)TAQMAN PCR中描述了用來確定樣品中事件 M0N87701的接合性的方法，表3和表4描述了用于接合性端點(diǎn)TAQMAN PCR的條件的例 子。用于接合性分析的DNA引物是引物SQ3443(SEQ ID NO 12)、SQ3445 (SEQ ID N0:13)、 SQ3446 (SEQ IDN0 :14)、6FAM _ 標(biāo)記的引物 PB1111 (SEQ ID NO : 15)和 VIC -標(biāo)記的引物 PB1112(SEQ ID NO :16)。6FAM 和 VIC 是連接到DNA 引物上的 Applied Biosystems (Foster City, CA)的熒光染料產(chǎn)品。對于TAQMAN MGB探針，Taq DNA聚合酶的5’核酸外切酶活 性在熒光團(tuán)和猝滅劑之間從5’ -端切割探針。當(dāng)與靶DNA鏈雜交時(shí)，猝滅劑和熒光團(tuán)充分 分離以產(chǎn)生熒光信號，從而釋放熒光。當(dāng)用于這些PB1111(SEQ ID NO :15)的反應(yīng)方法中時(shí)，SQ3443(SEQID NO 12)禾口 SQ3445 (SEQ ID NO 13)產(chǎn)生用于診斷事件M0N87701DNA的DNA擴(kuò)增子。用于此分析的對 照應(yīng)包括來自包含事件M0N87701 DNA的大豆的陽性對照、來自非轉(zhuǎn)基因大豆的陰性對照和 不包含模板DNA的陰性對照。當(dāng)用于這些PB1112(SEQ ID NO :16)的反應(yīng)方法中時(shí)，SQ3445 (SEQID NO 13)禾口 SQ3446 (SEQ ID NO 14)產(chǎn)生用于診斷野生型等位基因的DNA擴(kuò)增子。通過由兩個(gè)探針PB1111和PB1112的熒光信號釋放證明兩種擴(kuò)增子的存在而確定
雜合性。優(yōu)化這些分析方法以用于Applied Biosystems GeneAmp PCR System9700 或 Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 或 EppendorfMastercycler Gradient熱循環(huán)儀。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的產(chǎn)生鑒定事件M0N87701 DNA的擴(kuò)增子的其 它方法和儀器在本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解的范圍內(nèi)。jiffi L^TflifStratagene Robocycler,MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 g Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環(huán)儀或AppliedBiosystems GeneAmp PCR System 9700 或 MJ Research DNA EnginePTC-225 熱循環(huán)儀中進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增。當(dāng)在 EppendorfMastercyclerGradient或MJ Engine中運(yùn)行PCR時(shí)，應(yīng)該以計(jì)算模式運(yùn)行熱循環(huán)儀。當(dāng)在 Perkin-Elmer 9700中運(yùn)行PCR時(shí)，以設(shè)定為最大的變溫速度運(yùn)行熱循環(huán)儀。表3.大豆M0N87701事件特異性的接合性端點(diǎn)TAQMAN PCR 表4.接合性端點(diǎn)TAQMAN 熱循環(huán)儀條件 也對事件M0N87701 F1植物進(jìn)行抗干煞夜蛾屬(Antiarsia)和Pseudoplusia的 抗性檢測。抗性定義為在R1和R7生長階段中小于10%的進(jìn)食。使用Southern分析和已 知切割到TIC107表達(dá)盒的一個(gè)單位置中的限制性內(nèi)切酶EcoRV，進(jìn)一步對選擇的F1個(gè)體進(jìn) 行拷貝數(shù)分析。按照制造商的方案，使用蛋白質(zhì)測試條(EnviroLogix，用于CrylAc葉和種 子的 QuickStix Kit, Cat. #AS 003, Portland, Maine 04103)確認(rèn) TIC107 蛋白在 F1 群體 中的表達(dá)。對F3群體中選擇的事件進(jìn)行Southern分析以確認(rèn)單個(gè)完整T-DNA插入序列的 存在。最終的株系選擇是基于野外試驗(yàn)的性能特征、蛋白質(zhì)表達(dá)和分子特征。實(shí)施例4 在任何M0N87701育種事件中的事件M0N87701的鑒定下面的實(shí)施例描述如何使用M0N87701大豆鑒定在任何育種事件的后代中的 M0N87701 事件。DNA事件引物對用于產(chǎn)生用于診斷大豆事件M0N87701的擴(kuò)增子。用于診斷 M0N87701的擴(kuò)增子包含至少一個(gè)接頭序列SEQ ID NO 1或SEQ ID NO :2(分別如圖2所 示的[A]和[B])。SEQ ID N0 :1 (圖2的[A])是對應(yīng)于5，側(cè)翼序列(SEQ ID NO :3[C]的5748位至5757位，參見圖2)和TIC107表達(dá)盒的整合右邊界(SEQ ID NO :5[E]的1位至 10位，參見圖2)的接頭的核苷酸序列。SEQ ID NO :1也對應(yīng)于5，側(cè)翼序列，SEQ ID NO: 3 ([C]，參見圖2)的5748位至5767位。SEQ ID NO :2 ([B]，參見圖2)是對應(yīng)于TIC107表 達(dá)盒的整合左邊界(SEQ ID NO :5[E]的6417位至6426位，參見圖2)和3，側(cè)翼序列(SEQ ID N0:4[D]的379位至388位，參見圖2)的接頭的核苷酸序列。SEQ ID N0:2([C]，參見 圖2)也對應(yīng)于3，側(cè)翼序列，SEQ ID NO :4([D]，參見圖2)的369位至388位。
產(chǎn)生M0N87701的診斷擴(kuò)增子的事件引物對包括基于側(cè)翼序列和插入的TIC107表 達(dá)盒的引物對。為了獲得其中發(fā)現(xiàn)有SEQ ID NO :1的至少11個(gè)核苷酸的診斷擴(kuò)增子，設(shè)計(jì) 基于SEQ ID NO 3的堿基1至5747的正向引物和基于TIC107插入表達(dá)盒，SEQ ID NO 5 的10位至6416位的反向引物。為了獲得其中發(fā)現(xiàn)有SEQ ID NO :2的至少11個(gè)核苷酸的 診斷擴(kuò)增子，設(shè)計(jì)基于TIC107插入表達(dá)盒，SEQ ID NO :5的10位至6416位的正向引物和基 于3’側(cè)翼序列，SEQ ID NO :4的堿基389至2611的反向引物。從實(shí)踐上來看，應(yīng)設(shè)計(jì)產(chǎn)生 有限的大小范圍、優(yōu)選200至1000堿基的擴(kuò)增子的引物。較小大小的擴(kuò)增子一般在PCR反 應(yīng)中更可靠地產(chǎn)生，允許更短的循環(huán)時(shí)間，并且可以容易地分離和在瓊脂糖凝膠上可視化 或適用于端點(diǎn)TAQMAN 樣的分析中。此外，使用所述引物對產(chǎn)生的擴(kuò)增子可以克隆到載體 中，增殖，分離并測序，或者可以用本領(lǐng)域沿用已久的方法直接測序。源自SEQ ID N0:3和 SEQ ID NO 5的組合或SEQ ID NO :4和SEQ ID NO 5的組合的用于DNA擴(kuò)增方法以產(chǎn)生用 于診斷M0N87701或其后代的擴(kuò)增子的任何引物對是本發(fā)明的一方面。任何用于DNA擴(kuò)增 方法中以產(chǎn)生用于診斷M0N87701或其后代的擴(kuò)增子的包含SEQ ID NO :3或其互補(bǔ)序列的 至少11個(gè)連續(xù)核苷酸的單個(gè)分離的DNA多核苷酸引物分子是本發(fā)明的一方面。任何用于 DNA擴(kuò)增方法中以產(chǎn)生用于診斷M0N87701或其后代的擴(kuò)增子的包含SEQID N0 4或其互補(bǔ) 序列的至少11個(gè)連續(xù)核苷酸的單個(gè)分離的DNA多核苷酸引物分子是本發(fā)明的一方面。任 何用于DNA擴(kuò)增方法中以產(chǎn)生用于診斷M0N87701或其后代的擴(kuò)增子的包含SEQ ID NO 5 或其互補(bǔ)序列的至少11個(gè)連續(xù)核苷酸的單個(gè)分離的DNA多核苷酸引物分子是發(fā)明的一方表5和表6描述了用于這種分析的擴(kuò)增條件的例子。然而，對于這些方法或與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或產(chǎn)生用于診斷M0N87701的擴(kuò)增子的M0N87701轉(zhuǎn)基因插入序列 (SEQ ID N0:5)中包含的遺傳元件的DNA序列同源或互補(bǔ)的DNA引物的用途的任何改進(jìn)都 屬于本領(lǐng)域的范圍。診斷擴(kuò)增子包含與至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因/基因組接頭DNA(SEQ IDN0:1或 SEQ ID N0:2)或其實(shí)質(zhì)部分同源或互補(bǔ)的DNA分子。對于事件M0N87701植物組織樣品的分析應(yīng)包括來自事件M0N87701的陽性組織對 照、來自不是事件M0N87701的大豆植物的陰性對照(例如但不限于A5547)和不包含大豆 基因組DNA的陰性對照。擴(kuò)增內(nèi)源性大豆DNA分子的引物對用作DNA擴(kuò)增條件的內(nèi)部控 制。另外的引物序列可以由DNA擴(kuò)增方法領(lǐng)域中的技術(shù)人員從SEQ IDN0:3、SEQ ID NO 4 或SEQ ID NO 5中選擇，且通過表5和表6所示的方法產(chǎn)生擴(kuò)增子所選擇的條件可能會(huì)有 所不同，但產(chǎn)生用于診斷事件M0N87701 DNA的擴(kuò)增子。對根據(jù)表5和表6的方法進(jìn)行改良 而使用這些DNA引物序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。由源自SEQ ID N0:3、SEQ IDN0 :4或SEQ ID NO 5的至少一個(gè)DNA引物序列產(chǎn)生的用于診斷M0N87701的擴(kuò)增子是本發(fā)明的一方面。包含至少一個(gè)源自SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 5 的 DNA 引物的 DNA
26檢測試劑盒是本發(fā)明的一方面，當(dāng)該至少一個(gè)DNA引物用于DNA擴(kuò)增方法時(shí)，產(chǎn)生用于診斷 M0N87701或其后代的擴(kuò)增子。其中其基因組在DNA擴(kuò)增法中檢測時(shí)產(chǎn)生用于診斷M0N87701 的擴(kuò)增子的大豆植物或種子是本發(fā)明的一方面?？梢酝ㄟ^使用AppliedBiosystems GeneAmp PCR System 9700 或Stratagene Robocycler 或MJEngine或Perkin-Elmer 9700 或Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環(huán)儀或任何其它可以用于如表6所示產(chǎn)生診斷 M0N87701的擴(kuò)增子的擴(kuò)增系統(tǒng)對M0N87701擴(kuò)增子進(jìn)行分析。表5.大豆M0N87701事件特異性的PCR分析 表6.大豆M0N87701事件熱循環(huán)儀條件
( 已根椐布達(dá)佩斯條約在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110 進(jìn)行了 上文公開的并在權(quán)利 要求中提到的大豆事件MON87701種子的保藏。ATCC登錄號為 PTA-8194。該保藏將在保藏中心保存30年或在最后請求后的5年或?qū)＃?br> 利的有效期間，以較長者為準(zhǔn)，并在此期間按需要更換。J 上面已經(jīng)說明并描述了本發(fā)明的原理，但對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是 可以在不背離這種原理的情況下在配置和細(xì)節(jié)方面對本發(fā)明進(jìn)行修改。我們要求保護(hù)在所 附的權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的所有的修改。
權(quán)利要求
包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或其互補(bǔ)序列的核苷酸序列的DNA分子。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，包含SEQID NO :3、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO :6或其 互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA分子，基本上由SEQID NO 3從1位至5757位的核苷酸 序列、SEQ ID NO 5從1位至6426位的核苷酸序列和SEQ ID NO 4從379至2611位的核 苷酸序列或其互補(bǔ)序列組成。
4.如權(quán)利要求2所述的DNA分子，基本上由SEQID NO :6或其互補(bǔ)序列的核苷酸序列 組成。
5.大豆植物或其部分，包含權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)所述的DNA分子。
6.如權(quán)利要求5所述的大豆植物的種子，其中，所述種子包含所述DNA分子。
7.源自權(quán)利要求5所述的大豆植物或其部分的組合物，其中，所述組合物包含可檢測 量的所述DNA分子，且其中，所述組合物是選自大豆粗粉、大豆粉、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋 白分離物、組織化大豆蛋白濃縮物、水解大豆蛋白、大豆油和植脂奶油的商品。
8.—種產(chǎn)生昆蟲抗性的大豆植物的方法，該方法包括(a)將權(quán)利要求5所述的大豆植物與另一大豆植物雜交；(b)獲得至少一個(gè)源自雜交(a)的后代植物；和(c)選擇包含SEQID N0:1和SEQ ID NO :2的核苷酸序列的后代，其中，所選擇的后代 是昆蟲抗性的大豆植物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述選擇步驟(c)包括對由(b)獲得的所述至少 一個(gè)后代植物進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，其中，選擇產(chǎn)生包含SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6的至少一種核苷酸序列的擴(kuò)增子的后代，或者對由(b)獲得的所述至 少一個(gè)后代植物進(jìn)行核酸雜交反應(yīng)，其中，選擇與在嚴(yán)格條件下與選自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2的一種或多種DNA序列雜交的探針雜交的后代。
10.一種保護(hù)大豆植物免受昆蟲侵害的方法，包括在大豆的鱗翅目害蟲的食物中提供 殺蟲有效量的權(quán)利要求5所述的大豆植物或其部分的細(xì)胞或組織。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述鱗翅目害蟲選自干煞夜蛾屬(Anticarsia)、 Pseudoplusia、葉小卷蛾屬(Epinotia)、雪燈蛾屬(Spilosoma)、鈴夜蛾屬(Helicoverpa)、 灰翅夜蛾屬(Spodoptera)禾口 Rachiplusia。
12.DNA分子對，包含第一 DNA分子和第二 DNA分子，其中，所述DNA分子是SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5或其互補(bǔ)序列的足夠長度的連續(xù)核苷酸，以用作診斷由大豆植物 M0N87701或其后代提取的DNA的DNA引物或探針。
13.DNA分子對，包含第一 DNA分子和第二 DNA分子，其中，所述DNA分子是SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5或其互補(bǔ)序列的足夠長度的連續(xù)核苷酸，以用作診斷由大豆植物 M0N87701或其后代提取的DNA的DNA引物或探針。
14.DNA分子對，包含第一DNA分子和第二DNA分子，其中，所述DNA分子是SEQID NO: 6或其互補(bǔ)序列的足夠長度的連續(xù)核苷酸，以用作診斷由大豆植物M0N87701或其后代提取 的DNA的DNA引物或探針。
15.如權(quán)利要求12至14中的任一項(xiàng)所述的DNA分子對，其中，所述第一DNA分子包含 SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5的轉(zhuǎn)基因區(qū)域的任何部分或其互補(bǔ)序列的11個(gè)或更多連續(xù)核苷酸，且所述第二 DNA分子包含類似長度的SEQ ID N0:3的5，側(cè)翼大豆基因組DNA區(qū)域 或其互補(bǔ)序列。
16.如權(quán)利要求15所述的DNA分子對，其中，所述第一DNA分子包含SEQ ID N0:9，且 所述第二 DNA分子包含SEQ ID NO :10。
17.如權(quán)利要求12至14中的任一項(xiàng)所述的DNA分子對，其中，所述第一DNA分子包含 SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5的轉(zhuǎn)基因區(qū)域的任何部分或其互補(bǔ)序列的11個(gè)或更多連續(xù) 核苷酸，且所述第二 DNA分子包含類似長度的SEQ ID NO :4的3，側(cè)翼大豆基因組DNA區(qū)域 或其互補(bǔ)序列。
18.如權(quán)利要求17所述的DNA分子對，其中，所述第一DNA分子包含SEQ ID N0:12，且 所述第二 DNA分子包含SEQ ID NO :13。
19.一種檢測選自 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 的 DNA 分子在生物樣品中的存在的方法，該方法包括(a)將所述生物樣品與包含具有足夠長度的SEQID NO: 3或其互補(bǔ)序列、SEQ ID NO 4 或其互補(bǔ)序列、SEQ ID NO 5或其互補(bǔ)序列、或SEQID NO 6或其互補(bǔ)序列的連續(xù)核苷酸的 DNA引物分子的DNA引物對接觸，所述DNA引物對用作診斷由大豆植物M0N87701或其后代 提取的DNA的DNA引物或探針；(b)提供核酸擴(kuò)增反應(yīng)條件；(c)進(jìn)行所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生DNA擴(kuò)增子分子；和(d)檢測所述DNA擴(kuò)增子分子，其中，檢測到包含SEQID N0:1、SEQ ID NO :2及其互補(bǔ) 序列中至少一個(gè)的擴(kuò)增子表明所述DNA分子在所述生物樣品中存在。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述生物樣品是從大豆植物提取的DNA樣品。
21.一種檢測選自 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 的 DNA 分子在生物樣品中的存在的方法，該方法包括(a)將所述生物樣品與DNA探針接觸，所述DNA探針在嚴(yán)格的條件下與所述DNA分子雜 交，且在嚴(yán)格的雜交條件下不與不包含所述DNA分子的生物樣品雜交；(b)使所述生物樣品和DNA探針經(jīng)歷嚴(yán)格的雜交條件；和(c)檢測所述DNA探針與所述生物樣品的雜交，其中，檢測到雜交表明所述DNA分子在 所述生物樣品中存在。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述生物樣品是從大豆植物提取的DNA樣品。
23.如權(quán)利要求21或22所述的方法，其中，所述DNA探針包含SEQID NO :1或SEQ ID NO 2或其互補(bǔ)序列。
24.如權(quán)利要求21或22所述的方法，其中，所述DNA探針包含SEQID N0:11或SEQ ID NO :15。
25.如權(quán)利要求21至24所述的方法，其中，所述DNA探針用至少一種熒光團(tuán)標(biāo)記。
26.如權(quán)利要求19或21所述的方法，其中，所述生物樣品選自大豆粗粉、大豆粉、大豆 蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織化大豆蛋白濃縮物、水解大豆蛋白和植脂奶油。
27.DNA檢測試劑盒，包括至少一個(gè)具有足夠長度的與SEQ IDN0 :3、SEQ ID NO :4、 SEQ ID NO :5或SEQ ID NO 6同源或互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸的DNA分子，以用作對于大豆事件 M0N87701和/或其后代特異性的DNA引物或探針。
28.如權(quán)利要求27所述的DNA檢測試劑盒，其中，所述至少一個(gè)DNA分子包含SEQID N0:1、SEQ ID NO: 2或其互補(bǔ)序列。
29.如權(quán)利要求28所述的DNA檢測試劑盒，其中，所述至少一個(gè)DNA分子是SEQID NO: 1、SEQ ID NO 2或其互補(bǔ)序列。
30.一種測定在大豆樣品中包含大豆事件M0N87701的大豆植物基因組DNA的接合性的 方法，包括(a)將所述樣品與SEQID N0:12和SEQ ID NO 13的第一引物對接觸，所述引物對在 核酸擴(kuò)增反應(yīng)中與大豆事件M0N87701DNA —起使用時(shí)，產(chǎn)生用于診斷大豆事件M0N87701的 擴(kuò)增子；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；(c)檢測產(chǎn)生的第一擴(kuò)增子；(d)將所述樣品與SEQID N0:13和SEQ ID NO 14的第二引物對接觸，所述引物對在 核酸擴(kuò)增反應(yīng)中與大豆事件M0N87701 DNA之外的大豆基因組DNA—起使用時(shí)，產(chǎn)生用于診 斷大豆事件M0N87701 DNA之外的大豆基因組DNA的擴(kuò)增子；(e)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；和(f)檢測產(chǎn)生的第二擴(kuò)增子；其中，同時(shí)檢測到用于診斷大豆事件M0N87701的擴(kuò)增子 和用于診斷大豆事件M0N87701 DNA之外的大豆基因組DNA的擴(kuò)增子表明所述樣品對于大 豆事件M0N87701 DNA是雜合的。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述第一引物對進(jìn)一步與SEQID N0:15的探針 一起使用，和/或其中，所述第二引物對進(jìn)一步與SEQ ID NO :16的探針一起使用。
全文摘要
本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因大豆事件MON87701及包含用于診斷該大豆事件的DNA的細(xì)胞、種子和植物。本發(fā)明還提供了包含用于診斷生物樣品中所述大豆事件的核苷酸序列的組合物、用于檢測診斷生物樣品中所述大豆事件的存在的核苷酸序列的引物和探針，及用于檢測生物樣品中所述大豆事件核苷酸序列的存在的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了培育具有這種大豆事件的種子成為大豆植物的方法，和產(chǎn)生包含用于診斷該大豆事件的DNA的大豆植物的育種方法。
文檔編號C12Q1/68GK101861392SQ200880116188
公開日2010年10月13日 申請日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日
發(fā)明者A·S·托伊德巴施, A-G·高, F·J·佩爾拉克, J·A·米克羅斯, K·H·科拉克茲, M·S·帕拉戴斯, T·C·麥克雷 申請人:孟山都技術(shù)公司