專利名稱：一種制備核酸分子量標的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及核酸分子量標的制備。
背景技術：
目前，國內(nèi)外核酸分子量標的生產(chǎn)是使用酶切的方法，根據(jù)所需marker的 大小選擇不同的核酸內(nèi)切酶并對不同質(zhì)粒進行切割，然后將酶切產(chǎn)物按照一定 比例混合后加入適量loading buffer制成產(chǎn)品。然而，隨著市場需求的增多，需 要多次重復這一步驟以置備出足夠的產(chǎn)物來滿足生產(chǎn)、消費的需要。增加了生 產(chǎn)成本與勞動時間。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術中生產(chǎn)核酸分子量標步驟繁瑣、生產(chǎn)效率低的缺點。本發(fā)明 的主要目的在于提供一種制作簡單、覆蓋范圍廣、成本低廉的核酸分子量標生 產(chǎn)方法，可以更高效的完成整個制作過程，且性能滿足要求。
為達到上述目的、本發(fā)明解決方案是
一種制備核酸分子量標的方法，其步驟如下 (1 )設計并合成兩條單鏈核苷酸作為聚合酶鏈反應PCR的模板，
(2) 對上述核苷酸進行退火處理，
(3) 采用基因工程技術將退火后的雙鏈核苷酸連接到載體上，
(4) 采用引物和DNA聚合酶對上述步驟得到的雙鏈核苷酸進行多重PCR 擴增，得到不同分子量片斷的標記物，即為所需要的核酸分子量標marker。
如上所述的方法,，其中步驟(l)-(4)之后還包括
(5) 將步驟(3)得到的重組載體保存或者將載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中保存； (6)搖細菌、抽質(zhì)粒并再次酶切后又可插入更多oligo、多重PCR擴增之
后獲得不同分子量片斷的標記物，即為所需要的分子量標marker。
如上所述的方法，其中插入片斷oligo序列中含有限制性內(nèi)切酶識別位點； 插入片斷oligo序列兩端為同尾序列，使其能夠直接在連接到載體上的同時使原 有酶切位點消失。所謂同尾序列就是能夠與質(zhì)粒載體上酶切后的殘端互補的序 列。
如上所述的方法，其中插入片斷oligo中，在同尾序列的伺時又加入了原先
內(nèi)切酶的酶切位點，使得每次酶切都只需使用同樣的兩個內(nèi)切酶。
如上所述的方法，其中步驟(1 )所用的插入片斷oligo的大小根據(jù)不同marker 的需要而設計；各個插入片斷oligo的長度一致，或者不一致。
如上所述的方法，其中步驟(1)所用的插入片斷oligo是通過常規(guī)酶切、 連接技術連接到載體上的。
如上所述的方法，其中步驟(3)所用的引物， 一條是固定在某一位置上的， 而另一條隨著插入片斷oligo的插入而不斷增加結(jié)合位點。
如上所述的方法，其中步驟(3)中多重PCR所需的DNA聚合酶為缺失5，-3， 內(nèi)切酶活性的DNA聚合酶；優(yōu)選VentRexo-DNA Polymerase M0257V,NEB。
如上所述的方法，其中插入片斷oligo中含有啟動子序列，可以通過轉(zhuǎn)錄成 RNA后制備RNA分子量標marker。
如上所述的方法，其中多重PCR擴增所使用的條件為PCR擴增儀上的默認 條件。
進一步，上述的聚合酶鏈反應(PCR)的模板包含多條插入片斷oligo;如 果這些插入片斷oligo都相同，則得到的marker的梯度是一樣的；如果插入片斷 oligo的不相同，則可制備梯度不同的marker。
具體而言，插入片斷是由兩條單鏈寡核苷酸(序列可以靈活掌握)退火形 成的雙鏈DNA，通過酶切、連接等簡單操作將該外源片斷逐個連接到載體上， 插入片斷本身含有艱制性內(nèi)切酶識別位點，可以再次作為下次克隆的酶切位點， 循環(huán)往復連接更多的雙鏈片斷插入片斷，插入片斷在長度上可以不同，但是他 們的引物結(jié)合部位以及所包含的酶切位點相同。最后得到的是含有若干條插入 片斷的大腸桿菌克隆，易于保存和擴增。
其特征在于巧妙的設計與質(zhì)粒酶切位點互補的序列，使其能夠直接在連 接到載體上的同時使原有酶切位點消失，而插入片斷中引入的酶切位點又可以 進行下輪的基因工程。
本發(fā)明相關的聚合酶鏈反應(PCR)所需的引物與插入片斷中的序列互補， 在dNTP、 DNA聚合酶及其緩沖液存在的條件下，依照一定循環(huán)條件進行擴增。 退火溫度根據(jù)不同模板、不同引物的GC比值而定。產(chǎn)物濃度可以通過增大PCR 體系來實現(xiàn)。
目前市售的任一種質(zhì)粒均可用于該項發(fā)明，但是原則上還是推薦使用分子 量相對小一些的質(zhì)粒，因為隨著外源片斷的不斷插入，質(zhì)粒的分子量會越來越 大，這是沒有必要的。引物序列視質(zhì)粒和插入序列的設計而定，長度控制在20bp 左右。酶切位點依據(jù)不同的質(zhì)粒而定，原則上，任何酶都可以用于該項發(fā)明。 作為一種分子量標，在PCR后得到的各片斷的比例不應懸殊過大，所以循環(huán)時 的退火溫度不應過高，通常采用PCR儀的默認循環(huán)條件即可。PCR所需的DNA 聚合酶應該缺失5'-3'內(nèi)切酶活性，因為普通Taq酶在PCR延伸過程中，會將小 片斷消化掉，導致只能產(chǎn)生一條擴增片斷。
在生產(chǎn)時，將質(zhì)粒作為模板擴增出marker,也可以將連接了若干條插入片 斷的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將得到的陽性克隆用甘油保存于-8(TC中，當現(xiàn)有質(zhì)粒 用盡時，只需搖細菌抽質(zhì)粒就可以得到新的模板，而不用像傳統(tǒng)技術那樣重新 酶切。
由于采用上述方案，可以快速、大量生產(chǎn)出不同規(guī)格的marker,同一規(guī)格 的marker只需經(jīng)過幾次基因工程便可以置備出可以重復擴增的模板，節(jié)省了人 力，提高了效率。


圖1是實施例1中質(zhì)粒載體的多克隆酶切位點圖。 圖2是實施例1中載體連接上一個oligo的示意圖。 圖3是實施例1中制備的DNA marker電泳圖。 圖4是實施例2中載體連接上兩個不同oligo的示意圖。
具體實施例方式
圖1是psp72質(zhì)粒的多克隆酶切位點，在此次試驗中選用了 1和Bam// I這兩個酶切位點，酶切1.5h后回收得到雙酶切后的載體。
合成的序列是單鏈寡核苷酸，是公司按照設計后的序列合成的(上海生工 生物工程技術服務有限公司，LotNo: AA26474, AA26475)兩條鏈互補，在正 式進行基因工程之前應該先退火成雙鏈。退火條件如下
95°CX2min每40秒下降0.5。C，降至25。C后4i:保存(annealing buffer是
碧云天公司產(chǎn)品)
正如圖2所示，圖中粗斜體部分是載體雙酶切后的序列末端，黑色方框內(nèi) 是oligo序列，由于在設計時就加上了與酶切末端互補的序列(陰影部分)，所 以可以直接連接到載體上，連接上之后原來的酶切位點消失。空心字部分是插 入序列oligo中設計的1和^m//1酶切位點，成為下一次連接的酶切位點， 在此次試驗中共連接了 6個相同的oligo。(而其余5個oligo同樣通過酶切和連 接的基因工程操作引入載體中)下劃線部分是SP6啟動子序列，這一設計使制 作RNAmarker成為可能。其余部分是隨機設計的序列，可以根據(jù)不同的需要做
實施例1
Nuclease畫free H20 5 X annealing buffer DNA oligoA DNA oligoB
40ul 20ul
相應調(diào)整。波浪線表示引物結(jié)合位點，可以發(fā)現(xiàn)引物是分別結(jié)合在質(zhì)粒載體和 oligo上的，隨著oligo的插入，引物的結(jié)合位點也不斷增多，在熱循環(huán)過程中，
與錨定在另一端引物實現(xiàn)多重擴增。
所用引物序列
Primer+:CAGCTGAAGCTTGCATGCCT; Primer-: AGTCCTCGGCCACATTGTGA 所用DNA聚合酶是VentR exo- DNA Polymerase (M0257V，NEB) 循環(huán)條件
94 °C5min
94 °C30sec
55 °C30sec
72 °C30sec
72 °C7min
4°Coo
結(jié)果如圖3所示，landl為市售的DNA marker (100bp)， land2和land3都 是此次制備的DNA marker (50bp)?？梢郧宄目吹?0bp、 lOObp、 150bp、 200bp、 250bp以及300bp這6條帶。擴增體系25ul，上樣量為5ul，在實際生產(chǎn)過程中 可以擴大PCR體系來調(diào)節(jié)濃度，增加產(chǎn)量。加入溴酚藍后得到marker產(chǎn)品。
在生產(chǎn)時，將質(zhì)粒作為模板擴增出marker,可以將連接了若干條插入片斷 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將得到的陽性克隆用甘油保存于-8(TC中，當現(xiàn)有質(zhì)粒用 盡時，只需搖細菌抽質(zhì)粒就可以得到新的模板，經(jīng)過一次多重PCR擴增后獲得 大量的marker 。
實施例2
圖4所示采用不同長度的插入片段制作marker,可以在原有的插入片斷中 隨機加入若干堿基，在本實施例中，是在原有基礎上又加入了50個堿基(小寫 字母部分)，使引物之間的序列長度達到150bp，而原有的酶切位點與引物結(jié)合 位點保持不變。由此可見，只需設計合成不同長度的插入序列就可以生產(chǎn)出多 種分子量的marker,省時省力。
上述的對實施例的描述是為便于該技術領域的普通技術人員能理解和應用 本發(fā)明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改， 并把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此， 本發(fā)明不限于這里的實施例，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，對于本發(fā)明 做出的改進和修改都應該在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權利要求
1、一種制備核酸分子量標的方法，其步驟如下(1)設計并合成兩條單鏈核苷酸作為聚合酶鏈反應PCR的模板，(2)對上述核苷酸進行退火處理，得到雙鏈的插入片斷oligo，(3)采用基因工程技術將退火后的插入片段連接到載體上，(4)采用引物和DNA聚合酶對上述步驟得到的雙鏈核苷酸進行多重PCR擴增，得到不同分子量片斷的標記物，即為所需要的核酸分子量標marker。
2、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(l)-(4)之后還包括(5) 將步驟(3)得到的重組載體保存或者將載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中保存；(6) 搖細菌、抽質(zhì)粒并再次酶切后又可插入更多oligo、多重PCR擴增之 后獲得不同分子量片斷的標記物，即為所需要的分子量標marker。
3、 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于插入片斷oligo序列中含 有限制性內(nèi)切酶識別位點；插入片斷oligo序列兩端為同尾序列。
4、 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述的同尾序列是能與質(zhì)粒 載體上酶切后的殘端互補的序列；并能在連接到載體上的同時使原有酶切位點 消失。
5、 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于插入片斷oligo中，在同尾序 列的同時又加入了原先內(nèi)切酶的酶切位點，使得每次酶切都只需使用同樣的兩 個內(nèi)切酶。
6、 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(1)所用的插入 片斷oligo的大小根據(jù)不同marker的需要而設計；各個插入片斷oligo的長度一 致，或者不一致。
7、 根據(jù)權利要求1或2或5所述的方法，其特征在于步驟(1)所用的插入片斷oligo是通過常規(guī)酶切、連接技術連接到載體上的。
8、 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(3)所用的引物， 一條是固定在某一位置上的，而另一條隨著插入片斷oligo的插入而不斷增加結(jié) 合位點。
9、 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(3)中多重PCR 所需的DNA聚合酶為缺失5'-3，內(nèi)切酶活性的DNA聚合酶；優(yōu)選VentR exo-DNA Polymerase 。
10、 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于單鏈核苷酸中含有啟動 子序列，通過轉(zhuǎn)錄成RNA后制備RNA分子量標marker。
11、 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于多重PCR擴增所使 用的條件為PCR擴增儀上的默認條件；所用的載體為質(zhì)粒；所用的宿主菌為大 腸桿菌。
全文摘要
一種制備核酸分子量標的方法，通過一次聚合酶鏈反應(PCR)擴增出完整marker所需的所有條帶。將合成的兩條單鏈核苷酸退火，使其形成雙鏈后再利用帶有的同尾末端序列依次連接到載體上。經(jīng)過轉(zhuǎn)化等常規(guī)步驟得到大腸桿菌克隆。在引物、dNTP、DNA聚合酶及其緩沖液存在的情況下，根據(jù)一定的循環(huán)條件進行PCR擴增。循環(huán)數(shù)量和擴增體系均可根據(jù)不同的需要調(diào)節(jié)。將得到的產(chǎn)物加入適量的溴酚藍后即可制備出成品。下一次生產(chǎn)時只需將保種的細菌裂解后作為模板(或者直接用質(zhì)粒)再次PCR擴增就可以快速、高效、大量的制備出產(chǎn)品，節(jié)省了人力、物力、財力。
文檔編號C12P19/00GK101177697SQ20071003694
公開日2008年5月14日 申請日期2007年1月30日 優(yōu)先權日2007年1月30日
發(fā)明者軍 張, 陸海瑛 申請人:同濟大學