專利名稱：定量測量固定的石蠟包埋的組織樣品中靶基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從生物組織樣品中純化RNA、DNA和蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
組織中的基因表達(dá)水平的確定對于人疾病的準(zhǔn)確診斷非常重要，并且越來越多地用于確定患者的治療過程。藥物遺傳學(xué)方法能夠鑒定對特定藥物反應(yīng)的患者，并且為新的治療方法指明方向。
例如，胸苷酸合成酶(TS)是DNA生物合成中的整合酶(integralenzyme)，它催化脫氧尿苷一磷酸(dUMP)還原甲基化為脫氧胸苷一磷酸(dTMP)，并且為細(xì)胞內(nèi)的嘧啶核苷的從頭合成提供唯一的途徑(Johnston等，1995)。胸苷酸合成酶是化療藥，最常見是葉酸拮抗藥5-氟尿嘧啶(5-FU)的靶。作為最有效的結(jié)腸、頭頸和乳腺癌治療的單一藥物，5-FU的主要作用是阻斷TS活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)胸腺嘧啶水平降低，隨后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
已報(bào)道，TS表達(dá)在來自原發(fā)腫瘤(Johnston等，1995；Lenz等，1995)和轉(zhuǎn)移腫瘤(Farrugia等，1997；Leichmann等，1997)的臨床腫瘤樣品中都有顯著變化。例如在結(jié)腸直腸癌中，腫瘤組織中與正常胃腸粘膜組織的TS表達(dá)比為2至10(Ardalan和Zang，1996)。
也已知胸苷酸合成酶在腫瘤耐藥性的發(fā)展中具有臨床重要性，研究證明，在暴露于5-FU后，腫瘤細(xì)胞中的TS蛋白的急性誘導(dǎo)和TS酶水平的增加(Spears等，1982；Swain等，1989)。腫瘤對諸如5-FU的細(xì)胞毒性藥物反應(yīng)引起的急性超量表達(dá)TS的能力可能在氟尿嘧啶耐藥性中起作用。以前的一些研究顯示，TS蛋白的水平直接與5-FU治療的有效性相關(guān)，蛋白和RNA表達(dá)之間直接相關(guān)(Jackman等，1985)，并且TS表達(dá)是結(jié)腸直腸癌和乳腺癌中的有效預(yù)后標(biāo)志(Jackman等，1985；Horikoshi等，1992)。
在晚期轉(zhuǎn)移疾病中，已證明由RT-PCR定量的高TS mRNA，以及高TS蛋白質(zhì)表達(dá)都預(yù)期對結(jié)腸癌(Johnston等，1995；Farrugia等，1997；Leichman等，1997)、胃癌(Lenz等，1995；Alexander等，1995)、頭頸癌(Johnston等，1997)的基于氟嘧啶的治療的弱反應(yīng)。在低TS人群中經(jīng)常存在反應(yīng)者和無反應(yīng)者之間的顯著重疊，但是TS水平高于中值的患者主要是無反應(yīng)者。如果與其他分子特性結(jié)合，TS超量表達(dá)的預(yù)測價(jià)值可以進(jìn)一步增加，所述分子特性如二氫嘧啶脫氫酶(DPD)和胸苷磷酸化酶(TP)的表達(dá)水平、復(fù)制錯(cuò)誤陽性(RER+)狀態(tài)(Kitchens和Berger，1997)和p53狀態(tài)(Lenz等，1997)。目前評價(jià)TS在人類腫瘤中的表達(dá)的研究提示基于人中的TS表達(dá)而預(yù)測反應(yīng)和結(jié)果的能力可以在將來提供機(jī)會(huì)以選擇最有可能受益于TS指導(dǎo)的治療的患者。
至今，包括TS表達(dá)研究在內(nèi)的定量組織基因表達(dá)研究限于反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)從冷凍組織中擴(kuò)增RNA。然而，大多數(shù)病理樣品不是制備成冷凍組織，而通常是制備成福爾馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)，以便于進(jìn)行組織學(xué)分析和檔案存儲(chǔ)。在這種固定的包埋的樣品中，通過使用免疫組織化學(xué)染色監(jiān)測蛋白表達(dá)水平，可以半定量地、間接地監(jiān)測基因表達(dá)水平。由于石蠟包埋的樣品廣泛存在，因此需要快速可靠的方法來從這種樣品中分離核酸，尤其是RNA。
已存在許多從生物樣品中純化RNA的技術(shù)，但沒有一種可靠地從FFPE樣品中分離RNA。例如，Chomczynski(美國專利5,346,994)描述了一種用于從組織中純化RNA的方法，該方法基于使用苯酚和異硫氰酸胍的液相分離。將生物樣品在苯酚和異硫氰酸胍的水溶液中均化，之后將勻漿與氯仿混合。離心后，將勻漿分離為有機(jī)相，界面和水相。蛋白質(zhì)隔離在有機(jī)相中，DNA在界面上，RNA在水相中?？梢詫NA從水相中沉淀出來。這種方法不能可靠地從福爾馬林固定的石蠟包埋的組織樣品中分離RNA。
其他用于分離RNA的已知技術(shù)通常使用胍鹽或苯酚提取，例如Sambrook，J.等，(1989)，pp.7.3-7.24，和Ausubel，F(xiàn).M.等，(1994)，pp.4.0.3-4.4.7中所描述。然而，在從福爾馬林固定的石蠟包埋的組織樣品中分離RNA的方面，還沒有一種已知方法提供可重復(fù)的定量結(jié)果。
從石蠟包埋的組織中分離RNA的技術(shù)在腫瘤組織的基因表達(dá)研究中是尤其需要的。某種受體或酶的表達(dá)水平可以預(yù)示特定治療獲得成功的可能性。
正確的定量TS基因表達(dá)研究限于從冷凍組織RT-PCR，而在固定于載玻片上的檔案病理材料中，可以通過免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行TS蛋白表達(dá)的半定量監(jiān)測。但由于從檔案病理材料中分離RNA的限制，用于從這種樣品測定基因表達(dá)水平的定量技術(shù)迄今仍沒有。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供可靠的用于從生物組織樣品中分離RNA、DNA或蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明還提供用于從包埋于石蠟的組織中分離RNA、DNA或蛋白質(zhì)的簡單、有效和可重復(fù)的方法。
本發(fā)明提供從生物組織樣品中純化RNA的方法，其通過將樣品在有效濃度的離液劑溶液中，在約50℃至約100℃的溫度下加熱約5至約120分鐘而進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，離液劑是胍鎓化合物。然后從所述溶液中回收RNA。例如，可以通過氯仿提取實(shí)現(xiàn)RNA回收。
在本發(fā)明的方法中，RNA分離自檔案病理樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，石蠟包埋的樣品首先脫蠟。示例性的脫蠟方法包括用有機(jī)溶劑，優(yōu)選用二甲苯洗滌石蠟樣品。脫蠟的樣品可以用低級醇的水溶液再水化。合適的低級醇包括甲醇、乙醇、丙醇和丁醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，脫蠟的樣品通過用濃度逐漸降低的低級醇溶液連續(xù)洗滌而再水化。在另一實(shí)施方案中，樣品同時(shí)脫蠟和再水化。
脫蠟的樣品可以用機(jī)械、聲或其他均化方式均化。在一個(gè)實(shí)施方案中，再水化的樣品在包含離液劑，如硫氰酸胍(也以異硫氰酸胍出售)的溶液中均化。
將均化的樣品在包含有效濃度的離液劑的離液溶液中加熱到約50℃至約100℃的溫度范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，離液劑是胍鎓化合物。優(yōu)選的離液劑是硫氰酸胍。
然后通過例如苯酚氯仿提取、離子交換層析或大小排阻層析從溶液中回收RNA。
接著可以采用提取、電泳、層析、沉淀或其他適宜的技術(shù)進(jìn)一步純化RNA。
由本發(fā)明的方法分離的RNA適于分子生物學(xué)中的許多應(yīng)用，包括用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄以提供cDNA文庫。
通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增，純化的RNA可以用于確定福爾馬林固定的石蠟包埋的組織樣品中的基因表達(dá)水平。使用適當(dāng)?shù)腜CR引物，可以通過本發(fā)明的方法確定任何信使RNA的表達(dá)水平。定量RT-PCR技術(shù)允許將石蠟包埋的蛋白表達(dá)水平(通過免疫組織化學(xué)方法)與相同樣品中的基因表達(dá)水平(使用RT-PCR)進(jìn)行比較。
本發(fā)明的方法可用于多種組織和腫瘤類型以及靶基因，因此可以用于治療評價(jià)以及用作多種癌癥，包括乳腺癌、頭頸癌、食管癌、結(jié)腸直腸癌和其他的診斷工具。對于本發(fā)明的方法而言，特別優(yōu)選的基因是胸苷酸合成酶基因。在FFPE組織中，本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了TS基因表達(dá)的可重復(fù)的定量，類似于從冷凍組織獲得的結(jié)果。


圖1顯示不同加熱時(shí)間的β-肌動(dòng)蛋白和TS表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)表明沒有加熱步驟，從石蠟提取的RNA收率最小。
圖2顯示在正常(N)或來自結(jié)腸直腸癌患者的腫瘤(T)組織中的β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)水平，數(shù)據(jù)由在95℃提取0至40分鐘的RNA的定量PCR測得。這些數(shù)據(jù)提示30分鐘是最優(yōu)的加熱時(shí)間。
圖3顯示溫度和時(shí)間對β-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA的收率和DNA的分離的影響。這些數(shù)據(jù)表明，在加熱時(shí)間較長時(shí)(在60至120分鐘之間)，RNA發(fā)生降解，而能夠生成DNA PCR信號(hào)的污染DNA增加。條形代表在所示的各種時(shí)間和溫度下進(jìn)行的三重試驗(yàn)的值。
圖4顯示各種加熱溶液對分離的RNA收率的影響。這些數(shù)據(jù)表明，溶液中的離液劑，在該例中是異硫氰酸胍(GITC)，是RNA提取溶液的必需成分，如果沒有離液劑，提取的RNA的收率至少低10倍。
圖5顯示來自六種細(xì)胞系的石蠟包埋的(白色條形)和冷凍的細(xì)胞沉淀(黑色條形)的TS基因表達(dá)的比較。這些數(shù)據(jù)表明，對石蠟提取的RNA的分析可靠地反映新鮮冷凍組織中的基因表達(dá)值。
圖6顯示正?；蛴心[瘤的結(jié)腸和有腫瘤的食管組織中的TS基因表達(dá)水平的比較，所述組織是福爾馬林固定的石蠟包埋的或是冷凍的。
圖7顯示在來自對5-FU/LV的反應(yīng)以前已經(jīng)與TS基因表達(dá)相連的患者的石蠟切片中測得的TS/β-肌動(dòng)蛋白比。
圖8顯示四種惡性標(biāo)記基因(TS；胸苷磷酸酶(TP)；環(huán)加氧酶-2(COX-2)；和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF))在原發(fā)結(jié)腸癌和同一患者一年后復(fù)發(fā)的肝轉(zhuǎn)移癌的FFPE樣品中的表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)表明，如可以預(yù)期的，四種惡性標(biāo)記中的三種在轉(zhuǎn)移腫瘤組織中提高。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的方法涉及從生物樣品中純化RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是石蠟包埋的組織樣品，且該方法包括包埋樣品的脫蠟，脫蠟組織的均化，以及在約50℃至約100℃的溫度范圍內(nèi)，加熱處于包含有效量的胍鎓化合物的離液溶液中的組織，加熱約5分鐘至約120分鐘。加熱步驟增加從樣品擴(kuò)增的cDNA的量，比不經(jīng)加熱的樣品高1000倍。
盡管冷凍組織不是普遍地可以獲得，但手術(shù)后，通常從每種類型的腫瘤制備石蠟塊，從而允許大規(guī)模追溯研究TS表達(dá)和化療反應(yīng)。
此外，該技術(shù)可以應(yīng)用于多種腫瘤類型的任何一種，不限于一定范圍的靶基因。這暗示將來可以制備各腫瘤“基因表達(dá)分布圖”，從而可以確定各患者樣品中已知影響臨床結(jié)果和對各種化療藥反應(yīng)的一系列基因的表達(dá)水平。FFPE樣品的自動(dòng)實(shí)時(shí)PCR允許各腫瘤的靶向治療。
組織樣品使用本發(fā)明的方法，可以從任何生物樣品中分離RNA。生物樣品經(jīng)常用固定劑固定。通常使用醛類固定劑，如福爾馬林(甲醛)和戊二醛。用其他固定技術(shù)如醇浸(Battifora和Kopinski，J.Histochem.Cytochem.(1986)341095)固定的組織樣品也是適宜的。所使用的樣品還包埋在石蠟中。通過本發(fā)明的方法，可以從任何石蠟包埋的生物組織樣品中分離RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是福爾馬林固定的和石蠟包埋的。
樣品脫蠟脫蠟將石蠟的大部分從石蠟包埋的樣品中除去。已知許多用于脫蠟的技術(shù)，且任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)都可以用于本發(fā)明。本發(fā)明的優(yōu)選的方法是用有機(jī)溶劑洗滌來溶解石蠟。這種溶劑能夠有效地從組織樣品中除去石蠟，而不對RNA分離造成不利影響。適合的溶劑可以選自溶劑如苯、甲苯、乙基苯、二甲苯以及它們的混合物。二甲苯是用于本發(fā)明的方法的優(yōu)選溶劑。本發(fā)明的方法中單獨(dú)或組合使用的溶劑優(yōu)選是高純度的，通常純度大于99％。
通常通過用有機(jī)溶劑洗滌，劇烈混合接著離心來除去石蠟。樣品的離心速度足以導(dǎo)致組織在試管內(nèi)沉淀，通常為約10000至約20000xg。在離心后，棄去有機(jī)溶劑上清液。組織學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，所用的有機(jī)溶劑的體積以及所需的洗滌次數(shù)取決于樣品的大小以及要除去的石蠟的量。需要除去的石蠟越多，所需的洗滌次數(shù)越多。通常，樣品洗滌1至約10次，優(yōu)選約2至約4次。對于10μm組織樣品，通常的有機(jī)溶劑體積為約500μl。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他用于脫蠟的方法也可以用于本發(fā)明的方法。這些方法包括直接熔化(Banerjee等，1995)。
樣品在脫蠟以后優(yōu)選再水化。優(yōu)選的再水化方法是用濃度逐漸降低的低級醇水溶液分步洗滌。乙醇是優(yōu)選的用于再水化的低級醇。其他醇也可以適用于本發(fā)明，包括甲醇、異丙醇和其他在C1-C5范圍內(nèi)的類似的醇。樣品交替與醇溶液劇烈混合和離心。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，醇的濃度范圍逐步降低，在約3至5個(gè)步驟中從約100％降至約70％，其中每一步溶液濃度的改變通常小于約10％(即依次為100％，95％，90％，80％，70％)。在另一實(shí)施方案中，使用諸如EZ-DEWAX(BioGenex，San Ramon，CA)的試劑，脫蠟和再水化同時(shí)進(jìn)行。
均化脫蠟再水化的樣品可以用任何標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械、聲或其他適宜的技術(shù)均化。優(yōu)選用機(jī)械組織勻漿器，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行組織均化。許多商品化的勻漿器適用于本發(fā)明，包括Ultra-Turrax勻漿器(IKA-Works，Inc.，Wilmington，NC)；Tissumizer(Tekmar-Dohrmann，Cincinnai，OH)；和Polytron(Brinkmann，Westbury，NY)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品在離液劑的存在下均化。選擇離液劑，使從石蠟包埋的樣品中純化的有效濃度的RNA比離液劑不存在的情況下高約10倍。離液劑包括胍鎓化合物、尿素、甲酰胺、碘化(iodiode)鉀、硫氰酸鉀以及類似的化合物。對本發(fā)明的方法而言，優(yōu)選的離液劑是胍鎓化合物，如異硫氰酸胍(也以硫氰酸胍出售)和鹽酸胍。許多陰離子抗衡離子是有用的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備許多具有這種適當(dāng)陰離子的胍鎓鹽。本發(fā)明使用的胍鎓溶液的濃度通常在約1至約5M的范圍內(nèi)，優(yōu)選值約為4M。如果RNA已經(jīng)存在于溶液中，胍鎓溶液可以是更高的濃度，使其在樣品中的終濃度在約1至約5M的范圍內(nèi)。胍鎓溶液優(yōu)選用合適的生化緩沖液如Tris-Cl緩沖至pH為約3至約6，更優(yōu)選為約4。離液溶液也可以含有還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)和β-巰基乙醇(BME)。離液溶液也可以含有RNAse抑制劑。
加熱樣品在離液溶液中加熱，加熱溫度為約60℃至約100℃，加熱時(shí)間為約5分鐘至約2小時(shí)。或者，樣品在離液溶液中在約50℃至約100℃的溫度下加熱，加熱時(shí)間為約5分鐘至約2小時(shí)。通常選擇加熱時(shí)間，使所純化的RNA的量比不加熱的樣品的高至少100倍，更優(yōu)選高約1000倍。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品在約75℃至約100℃之間加熱約20分鐘。更優(yōu)選地，樣品在約95℃加熱30至60分鐘。
RNA回收在通過導(dǎo)致RNA與離液溶液的至少一種成分分離的適當(dāng)?shù)募夹g(shù)加熱后，可以從離液溶液中回收RNA。將RNA從離液溶液中回收的方法可以是用有機(jī)溶劑提取，氯仿提取、苯酚-氯仿提取，用乙醇、異丙醇或其他低級醇沉淀，層析法，包括離子交換層析、大小排阻層析、硅膠層析和反相層析，或者電泳方法，包括聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說這些方法將是明顯的。優(yōu)選使用苯酚-氯仿提取從離液溶液中回收RNA。
在RNA回收后，RNA可以任選地進(jìn)一步純化。進(jìn)一步純化得到基本上沒有污染DNA或蛋白質(zhì)的RNA。進(jìn)一步純化可以通過前述用于RNA回收的任何技術(shù)進(jìn)行。優(yōu)選通過用低級醇，尤其是乙醇或異丙醇沉淀而純化RNA。沉淀優(yōu)選在促進(jìn)沉淀的載體如糖原的存在下進(jìn)行。
DNA和蛋白質(zhì)回收本發(fā)明的方法也可以用于從組織樣品中純化DNA或蛋白質(zhì)。在樣品與有機(jī)溶劑如氯仿混合后，接著離心，溶液具有三個(gè)相，下層有機(jī)相、界面和上層水相。使用適當(dāng)?shù)碾x液劑，特別是胍鎓化合物，樣品的生物成分將分別進(jìn)入三相。上層水相將含有RNA，界面將含有DNA，而有機(jī)相含有蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的方法適于回收DNA和蛋白質(zhì)相，以及含有RNA的相。通過本發(fā)明的方法，DNA回收得以增加。
純化的RNA通過本發(fā)明的方法純化的RNA適于多種目的和分子生物學(xué)方法，包括但不限于反轉(zhuǎn)錄為cDNA；生產(chǎn)放射性的、熒光的或其它標(biāo)記的cDNA來進(jìn)行基因芯片、寡核苷酸微列陣等的分析；丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳；層析(例如離子交換、硅膠、反相或大小排阻層析)純化；用核酸探針雜交；通過機(jī)械、聲或其它方式破碎。
實(shí)施例材料和方法這些材料和方法是下面的實(shí)施例所共同使用的。
樣品制備人細(xì)胞系SK1、H157、A431、HT29、HCC298和HH30的特征以前已有描述。細(xì)胞通過胰蛋白酶消化從它們的單層移開，通過在3000rpm下離心5分鐘沉淀細(xì)胞。細(xì)胞沉淀可以在-70℃冷凍或者用福爾馬林固定24小時(shí)，然后用石蠟包埋。
腫瘤組織代表性切片在外科手術(shù)時(shí)獲得，通過臨床病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法將其固定于福爾馬林中，并且包埋在石蠟中。用切片機(jī)切下組織橫切片(5μm)。
RNA分離從石蠟包埋的組織中如下分離RNA。將單個(gè)5μm石蠟包埋的組織切片置于Eppendorf管中，用二甲苯洗滌兩次，每次15分鐘，進(jìn)行脫蠟。用級配的乙醇(100％、95％、80％和70％)連續(xù)洗滌15分鐘進(jìn)行再水化。將產(chǎn)生的沉淀懸浮在含有0.5％肌氨酸和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的4M異硫氰酸胍中。均化懸浮液，然后在約50℃至約95℃下加熱0至60分鐘；每一樣品都有零加熱時(shí)間點(diǎn)作為對照。加入醋酸鈉(pH 4.0)至0.2M，溶液用苯酚/氯仿提取，并用異丙醇和10mg糖原沉淀。在離心(13000rpm，4℃，15分鐘)后，RNA沉淀用1ml75％的乙醇洗滌兩次，然后重新懸浮在無RNase的水中。
反轉(zhuǎn)錄(RT)在加熱后，使用隨機(jī)六聚體將全部RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。RT條件與以前描述的用于冷凍組織的條件(Horikoshi等，1992)相同。每一樣品都有不加反轉(zhuǎn)錄酶(No-RT)的對照。
TS和β-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR定量使用Perkin ElmerCetus 7700PCR儀(Taqman)。mRNA水平的定量使用基于以前描述的熒光檢測方法(Heid等，1996；Eads等，1999)的實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行。CDNA如上述制備。將感興趣的cDNA和參考cDNA分別擴(kuò)增，擴(kuò)增使用具有5′-熒光報(bào)道染料(6FAM)和3′-淬滅染料(TAMRA)的探針。TAQ聚合酶的5′-核酸外切酶活性使探針斷裂，釋放出報(bào)道分子，其熒光用ABI Prism測序系統(tǒng)(Taqman)檢測。在越過熒光檢測臨界值后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號(hào)與產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物量成比例。起始模板濃度由熒光信號(hào)越過臨界值進(jìn)入PCR反應(yīng)指數(shù)期的循環(huán)數(shù)確定。相對基因表達(dá)基于所感興趣的基因和參考基因的臨界循環(huán)數(shù)而確定。參考基因的使用避免了直接定量RNA的需要，而RNA直接定量是誤差的主要來源。
引物和探針的序列如下TSSEQ ID NO1GGC CTC GGT GTG CCT TT；SEQ ID2AAC ATC GCC AGC TAC GCC CTG；SEO ID NO3GAT GTG CGC AAT CAT GTA CGT。
β-肌動(dòng)蛋白SEQ ID NO4TGA GCG CGG CTA CAG CTT；SEQ ID NO5ACC ACC ACG GCC GAG CGG；SEQ ID NO6TCC TTA ATG TCA CGC ACG ATT T。
如上所討論，對于實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)，報(bào)道寡核苷酸(SEQ ID NOS2和5)5′端用6FAM標(biāo)記，3′端用TAMRA標(biāo)記。
每一PCR還包括“無反轉(zhuǎn)錄酶”(NRT或No-RT)對照。這樣做的目的是矯正來源于殘余基因組DNA污染的任何背景擴(kuò)增。因此，每一TS和β-肌動(dòng)蛋白的總值是RT值減去NRT值(RT-NRT)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析進(jìn)行均值非參數(shù)對照檢驗(yàn)來確定同一腫瘤的冷凍組織和FFPE樣品間TS水平的差異是顯著性的或非顯著性的。
實(shí)施例1常規(guī)RNA分離步驟通過下述步驟從石蠟包埋的組織中提取RNAA.切片的脫蠟和再水化(1)將約10μM的切片部分置于1.5ml塑料離心管中；(2)加入600μl二甲苯，在室溫下(約20-25℃)將混合物劇烈震蕩約10分鐘。
(3)在室溫下將樣品離心約7分鐘，離心速度為臺(tái)式離心機(jī)的最大速度(約10-20000xg)。
(4)重復(fù)步驟2和3，直到大多數(shù)石蠟溶解。通常需要兩次或更多次，取決于原始樣品部分中包含的石蠟量。
(5)通過與低級醇，優(yōu)選是100％乙醇(約600μl)一起劇烈震蕩約3分鐘，將二甲苯溶液移去。
(6)將試管步驟(3)中一樣離心7分鐘。將上清液輕輕移出并棄去。沉淀變成白色。
(7)用連續(xù)稀釋的乙醇溶液重復(fù)步驟5和6先用約95％的乙醇，接著用約80％的，最后用約70％的。
(8)樣品如在步驟(3)中一樣在室溫下離心7分鐘。棄去上清，使沉淀在室溫下干燥約5分鐘。
B.用苯酚-氯仿分離RNA(1)加入包含0.5％肌氨酸和8μl 1M二硫蘇糖醇的400μl異硫氰酸胍。
(2)然后用組織勻漿器(Ultre-Turrax，IKA-Works，Inc.，Wilmington，NC)將樣品均化約2至3分鐘，同時(shí)從低速(速度1)到高速(速度5)逐漸提速。
(3)然后樣品在約95℃下加熱約5至20分鐘。優(yōu)選在加熱前用細(xì)針刺穿含有樣品的管的蓋子。或者，管蓋也可以用塑料夾子或?qū)嶒?yàn)?zāi)?laboratory film)固定。
(4)然后用50μl 2M醋酸鈉在pH 4.0，以及600μl苯酚/氯仿/異戊醇(10∶1.93∶0.036)提取樣品，所述苯酚/氯仿/異戊醇是通過混合18ml苯酚和3.6ml 1∶49的異戊醇∶氯仿溶液而新鮮配制的。溶液劇烈震蕩約10秒鐘，在冰上冷卻約15分鐘。
(5)溶液在最高速度下離心約7分鐘。將上層(水)相轉(zhuǎn)移到新的試管中。
(6)在-20℃下，用約10μl糖原和400μl異丙醇沉淀RNA 30分鐘。(7)在臺(tái)式離心機(jī)中以最高速度離心約7分鐘，將RNA沉淀；將上清液輕輕移走并棄去；沉淀物用約500μl約70％至75％的乙醇洗滌。
(8)再次以最高速度離心樣品7分鐘。將上清液輕輕移走，風(fēng)干沉淀。然后將沉淀溶解在適當(dāng)?shù)木彌_液(例如50μl 5mM Tris-Cl，pH8.0)中，用于進(jìn)一步試驗(yàn)。
實(shí)施例2加熱時(shí)間本實(shí)施例說明加熱時(shí)間對RNA收率的影響。
如圖1中所示，在沉淀和反轉(zhuǎn)錄之前，在95℃下加熱離液溶液顯著提高TS和β-肌動(dòng)蛋白靶的檢測效率。當(dāng)不包括加熱步驟時(shí)，TS和β-肌動(dòng)蛋白都未能檢測到(0分鐘時(shí)間點(diǎn))。20分鐘后在95℃，兩種轉(zhuǎn)錄物都可檢測；繼續(xù)加熱到60分鐘，TS的檢測靈敏度增加3倍，β-肌動(dòng)蛋白的檢測靈敏度增加4.5倍。(NRT＝無反轉(zhuǎn)錄酶對照；RT-NRT＝總相對基因表達(dá)水平，即反轉(zhuǎn)錄酶減去無反轉(zhuǎn)錄酶)。
圖2顯示β-肌動(dòng)蛋白基因在正常(N)和腫瘤(T)組織中的RNA表達(dá)量。樣品在95℃下加熱0至40分鐘。從大多數(shù)樣品觀察到，優(yōu)選的加熱時(shí)間為約30分鐘。
圖3顯示加熱時(shí)間大于約60分鐘，提取的RNA的量開始下降，提示RNA的熱降解，而提取的DNA的量開始增加。這是不希望的，因?yàn)镈NA的存在在一些情況下可能給出假PCR信號(hào)。
實(shí)施例3加熱溶液本實(shí)施例說明在離液劑的存在下加熱RNA溶液對于獲得RNA高收率是重要的。這是RT-PCR試驗(yàn)，將β-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)檢測用作從各種溶液中分離的RNA的相對量的量度。
根據(jù)前述方法處理食管癌FFPE組織樣品的臨床樣品，但是脫蠟后獲得的初始沉淀溶解或懸浮在4M異硫氰酸胍(GITC)，4M異硫氰酸胍+100μMβ-巰基乙醇(GITC+BME)，4M異硫氰酸胍+20μM二硫蘇糖醇(GITC+DTT)或Tris-Cl緩沖液(10mM，pH 7.5)或Tris-Cl緩沖液+20μM DTT(Tris/Cl+DTT)。接著將樣品在95℃加熱30分鐘或不加熱(0分鐘，95℃)。然后Tris/Cl樣品用4M異硫氰酸胍處理。通過RT-PCR和實(shí)時(shí)PCR檢測β-肌動(dòng)蛋白確定RNA水平。如圖4所示，在加熱時(shí)，離液劑異硫氰酸胍的存在對于RNA的高收率回收是重要的。還原劑如DTT或BME的存在不是RNA高收率回收所必需的。4M異硫氰酸胍溶液含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)、25mM EDTA和0.5％肌氨酸。
實(shí)施例4在相同來源的FFPE和冷凍組織中測定的基因表達(dá)值的比較本實(shí)施例表明，本發(fā)明的方法提供的來自福爾馬林固定的石蠟包埋的樣品的基因表達(dá)值與從冷凍組織獲得的相當(dāng)。
來自六種細(xì)胞系的樣品采用本發(fā)明的方法進(jìn)行FFPE處理和TS定量(包括在95℃加熱30分鐘)。獲得的相對TS值(圖5)與用已知方法從冷凍細(xì)胞沉淀獲得的值比較。冷凍細(xì)胞中的相對TS表達(dá)水平是3.0-19.5(平均＝8.5)，而FFPE樣品為3.0-25.0(平均＝9.0)。對兩個(gè)均值之間的差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示p值為0.726，表明從使用原先的RT-PCR方法的冷凍細(xì)胞沉淀獲得的TS值與從使用本發(fā)明的方法的FFPE細(xì)胞沉淀獲得的TS值沒有顯著性差異。
無論樣品是福爾馬林固定的石蠟包埋的，還是冷凍的，腫瘤組織樣品中的RNA表達(dá)水平和正常(無腫瘤的)組織樣品也是相當(dāng)?shù)?。?個(gè)正常結(jié)腸組織、6個(gè)腫瘤結(jié)腸組織和4個(gè)食管腫瘤組織進(jìn)行對比的石蠟包埋的和冷凍組織(FT)的TS基因表達(dá)的比較。結(jié)果顯示在圖6中。沒有發(fā)現(xiàn)同一組織的冷凍組織樣品和FFPE樣品的TS水平有顯著性差異。這在結(jié)腸和食管組織類型中都是真的(結(jié)腸FT樣品平均＝3.46，結(jié)腸FFPE樣品平均＝3.06，p＝0.395；食管FT樣品平均＝13.9，食管FFPE樣品平均＝15.93，p＝0.21)。
實(shí)施例5反應(yīng)和無反應(yīng)腫瘤組織中的TS水平比較冷凍組織和對比的FFPE樣品中的TS水平與IV期結(jié)腸癌中的對5-FU/甲酰四氫葉酸的相關(guān)性。先前的基于來自冷凍組織的RT-PCR數(shù)據(jù)的報(bào)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，腫瘤中的高TS水平(相對基因表達(dá)≥4.0)指示對TS治療的弱反應(yīng)。有反應(yīng)的腫瘤以TS低水平表達(dá)為特征。確定了來自17個(gè)患者的石蠟切片的TS/β-肌動(dòng)蛋白比，之前這17個(gè)患者對5FU/LV的反應(yīng)已經(jīng)通過分析冷凍組織樣品與TS基因表達(dá)有關(guān)(圖7)。在這17個(gè)患者中，已知有6個(gè)對TS有反應(yīng)，11個(gè)對TS治療反應(yīng)不佳。發(fā)現(xiàn)對比的石蠟組織的TS結(jié)果也預(yù)示對這種治療的反應(yīng)(平均反應(yīng)者FT＝2.87，平均反應(yīng)者FFPE＝2.37，P＝0.641；平均無反應(yīng)者FT＝7.66，平均無反應(yīng)者FFPE＝7.84，P＝0.537)。來自冷凍組織的TS水平和來自對比的FFPE的TS水平間沒有顯著性差異。
實(shí)施例6原發(fā)結(jié)腸癌和肝轉(zhuǎn)移中的TS基因表達(dá)水平本實(shí)施例顯示來自同一患者的原發(fā)結(jié)腸癌和復(fù)發(fā)的肝轉(zhuǎn)移中的TS和其他基因表達(dá)的分析。
圖8顯示來自同一患者的原發(fā)結(jié)腸癌和一年后復(fù)發(fā)的肝轉(zhuǎn)移(met)的FFEP樣品中4種基因的表達(dá)水平TS；TP；環(huán)加氧酶-2(COX-2)；以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。結(jié)果表明，雖然原發(fā)腫瘤對5-FU治療敏感(TS＝2.32)，但轉(zhuǎn)移腫瘤將是難治的(TS met＝11.58)。COX-2和VEGF表達(dá)水平與已經(jīng)公布的結(jié)果相關(guān)，即它們在攻擊性疾病中表達(dá)增加，并且是相互調(diào)控的(coregulate)。(COX-2原發(fā)＝1.35；COX-2met＝5.4；VEGF原發(fā)＝5.02；VEGF met＝14.4)。如上所述將RNA從原發(fā)結(jié)腸癌的5μM FFPE切片和肝轉(zhuǎn)移的FFPE切片中分離出來。在有反應(yīng)的原發(fā)腫瘤中相對TS基因表達(dá)是2.32，而在轉(zhuǎn)移疾病中是11.58(圖8)。通過這里所報(bào)導(dǎo)的RT-PCR方法確定的TS表達(dá)的5倍增加表明繼發(fā)疾病對5-FU無反應(yīng)，提示其他治療如CPT-11可能是合適的。
本文引用的所有參考文獻(xiàn)均引入本文作參考。
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權(quán)利要求
1.一種用于定量測量固定的石蠟包埋的組織樣品中靶基因的基因表達(dá)的方法，其包括(a)將所述樣品脫蠟，以獲得脫蠟樣品；(b)如下從所述脫蠟樣品中分離mRNA首先將所述組織樣品在包含有效濃度的離液劑的離液溶液中加熱至約50℃～約100℃的溫度并持續(xù)約5分鐘～約120分鐘的時(shí)間，并從所述離液溶液中回收所述mRNA，以產(chǎn)生分離的mRNA；和(c)用能夠擴(kuò)增所述靶基因mRNA的區(qū)域的一對寡核苷酸引物對所述分離的mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得擴(kuò)增樣品；(d)測定來自所述分離的mRNA的靶基因mRNA的量與內(nèi)控基因mRNA的量的比值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其還包括在加熱前將所述樣品再水化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其還包括在加熱前均化所述樣品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用水不溶性有機(jī)溶劑回收所述分離的mRNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述水不溶性有機(jī)溶劑包含氯仿。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過乙醇沉淀法從所述離液溶液中回收所述分離的mRNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述時(shí)間為約10分鐘～約60分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述時(shí)間為約30分鐘～約60分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述溫度為約85℃～約100℃。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述時(shí)間為約30分鐘～約60分鐘。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述離液劑為胍鎓化合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述胍鎓化合物為鹽酸胍。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述胍鎓化合物為異硫氰酸胍。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述異硫氰酸胍的濃度為約2M～約5M。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述異硫氰酸胍的濃度為約4M。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述離液溶液的pH值為約3～約6。
17.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述離液溶液的pH值為約4。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述離液溶液還包含還原劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述還原劑為β-巰基乙醇。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述還原劑為二硫蘇糖醇。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述組織樣品為福爾馬林固定和石蠟包埋的(FFPE)。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中測定相對基因表達(dá)水平包括使用RT-PCR。
23.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中無論所述組織樣品為福爾馬林固定和石蠟包埋的或是冷凍的，所述組織樣品中靶基因mRNA的相對量都是相同的。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述內(nèi)控基因?yàn)棣?肌動(dòng)蛋白。
25.一種用于測定固定的石蠟包埋的組織樣品中靶基因表達(dá)水平的方法，其包括(a)將所述樣品脫蠟，以獲得脫蠟樣品；(b)如下從所述脫蠟樣品中分離mRNA首先將所述脫蠟組織樣品在包含有效濃度的離液劑的溶液中加熱至約50℃～約100℃的溫度，并從所述溶液中回收所述mRNA；和(c)測定所述靶基因mRNA的量與內(nèi)控基因mRNA的量的比值。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中加熱進(jìn)行約5分鐘～約120分鐘。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中測定相對基因表達(dá)水平包括RT-PCR。
28.一種用于定量測量固定的石蠟包埋的組織樣品中靶基因的基因表達(dá)的方法，其包括(a)將所述組織樣品脫蠟，以獲得包含DNA和RNA的脫蠟樣品；(b)如下從所述脫蠟樣品中分離mRNA首先將所述組織樣品在包含有效濃度的離液劑的溶液中加熱至約50℃～約100℃的溫度并持續(xù)約5分鐘～約120分鐘的時(shí)間，并從所述離液溶液中回收所述mRNA，以產(chǎn)生分離的mRNA；和(c)用能夠擴(kuò)增所述靶基因mRNA的區(qū)域的一對寡核苷酸引物對所述分離的mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得擴(kuò)增樣品；(d)測定來自所述分離的mRNA的靶基因mRNA的量與內(nèi)控基因mRNA的量的比值。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中回收分離的mRNA包括選自提取、電泳、層析、沉淀及它們的組合的回收技術(shù)。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中測定相對基因表達(dá)水平包括RT-PCR。
31.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所分離的mRNA不含樣品中存在的DNA。
32.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所分離的mRNA不含樣品中存在的DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于定量測量固定的石蠟包埋的組織樣品中靶基因的基因表達(dá)的方法。其包括(a)將所述樣品脫蠟，以獲得脫蠟樣品；(b)如下從所述脫蠟樣品中分離mRNA首先將所述組織樣品在包含有效濃度的離液劑的離液溶液中加熱至約50℃～約100℃的溫度并持續(xù)約5分鐘～約120分鐘的時(shí)間，并從所述離液溶液中回收所述mRNA，以產(chǎn)生分離的mRNA；和(c)用能夠擴(kuò)增所述靶基因mRNA的區(qū)域的一對寡核苷酸引物對所述分離的mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得擴(kuò)增樣品；(d)測定來自所述分離的mRNA的靶基因mRNA的量與內(nèi)控基因mRNA的量的比值。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1891836SQ200610093878
公開日2007年1月10日 申請日期2000年10月31日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月20日
發(fā)明者凱瑟林·達(dá)南伯格, 彼得·達(dá)南伯格, 史蒂文·斯溫森 申請人:南加利福尼亞大學(xué)