專利名稱：鑒定疾病風(fēng)險因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因組學(xué)、遺傳學(xué)、藥物遺傳學(xué)、和生物信息學(xué)領(lǐng)域，包括基因組分析和DNA序列變異研究。本發(fā)明還涉及DNA序列中的變異與預(yù)報個體對特定疾病、病癥、或疾患的易感性和/或?qū)μ囟ㄋ幬锘蛑委煹捻憫?yīng)之間的關(guān)聯(lián)的研究。
背景技術(shù)：
對與復(fù)雜疾病有關(guān)的遺傳標(biāo)志物的搜索正在進(jìn)行中。用SNP陣列進(jìn)行的基因組尺度掃描研究繼續(xù)突顯ApoE區(qū)是對于阿爾茨海默氏病研究中的調(diào)查而言最重要的區(qū)域(Coon et al. , J. Clin. Psychiatry 68:613-8(2007) ；Li et al. , Arch. Neurol. 65 45-53(2007))ο先前提出ApoE 4同等型與晚期發(fā)作阿爾茨海默氏病形成風(fēng)險升高有強(qiáng)關(guān)聯(lián) (Pericak-Vance et al. , Am. J. Hum. Genet. 48,1034-50 (1991) ；Martin et al·，2000，美國專利 No. 6，027，896，Roses, et al.，美國專利 No. 5，716，828，Roses etal.)。該相關(guān)性是劑量依賴性的(Yoshizawa et al. , 1994 ；Schellenberg, 1995) 就是說，兩種 ApoE 4 等位基因的攜帶者比只有一種ApoE 4等位基因的攜帶者更有可能而且在更早的年齡形成晚期發(fā)作阿爾茨海默氏病(LOAD) (Corder etal.，Science 261,921-3(1993))。不過，E4等位基因只占遺傳性阿爾茨海默氏病的大約50%。一種解釋是ApoE 4 僅僅充當(dāng)附近連鎖不平衡的某物的代替標(biāo)志物?；蛘?，考慮到最近發(fā)現(xiàn)ApoE 4在線粒體毒性中起機(jī)械作用(mechanistic role), ApoE 4的負(fù)面效應(yīng)可能被附近編碼的另一種基因產(chǎn)物消除或加劇(Chang et al.，2005)。由于ApoE狀態(tài)還與冠狀動脈疾病并也有可能與眾多其它疾病和病癥的風(fēng)險有關(guān)，ApoE區(qū)的研究的蘊(yùn)涵不限于阿爾茨海默氏病，而是潛在深遠(yuǎn)的(Mahley et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 =5644-51 (2006)) 0更廣泛而言，對變異序列檢查與已知涉及復(fù)雜疾病過程的其它遺傳區(qū)連鎖不平衡的基因周圍的過程或途徑會提供在解釋那些疾病的機(jī)制中有價值的信息。發(fā)明概述本文中提供的是一種用于鑒定與感興趣疾患形成(例如感興趣疾病的較早或較晚發(fā)作)有關(guān)的遺傳變體的方法，包括(a)根據(jù)含有DNA的生物學(xué)樣品測定由多名人類受試者個體在感興趣遺傳基因座處攜帶的核苷酸序列，其中所述受試者包括(i)受感興趣疾患影響的受試者和(ii)未受感興趣疾患影響的受試者二者；(b)自在所述多名受試者中觀察到的核苷酸序列鑒定所述遺傳基因座處的遺傳變體(例如使用多重序列比對分析)； (c)通過構(gòu)建所述受試者的所述核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹來將所述遺傳變體繪圖，所述樹包含鑒定所述受試者間變體變化(例如同一順反子上的變體變化)的分支；(d)檢查所述樹中作為分支呈現(xiàn)的遺傳變體并確定受影響的與未受影響的受試者之比以鑒定那些導(dǎo)致受影響與未受影響受試者之比變化的變化(優(yōu)選地，其中起點(diǎn)是代表最大數(shù)目受試者的遺傳變體)；并然后(e)鑒定受影響與未受影響受試者之比與所述樹上一種或多種鄰近變體有實(shí)質(zhì)性差異(例如相差至少 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 或90%)的遺傳變體或變體組(單元型)以由此鑒定與所述感興趣疾患形成有關(guān)的遺傳變體。在一些實(shí)施方案中，所有受試者攜帶與所述感興趣疾患有關(guān)的相同已知多態(tài)性。在一些實(shí)施方案中，所述感興趣疾患是神經(jīng)變性疾病、代謝疾病(例如血脂障礙)、心血管疾病、精神病癥、或癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述感興趣疾病是疾病發(fā)病機(jī)制涉及ApoE和/或T0MM40的疾病。在一些實(shí)施方案中，所述感興趣疾患與升高或降低的線粒體功能障礙有關(guān)。在一些實(shí)施方案中，所述感興趣疾患是精神分裂癥。在一些實(shí)施方案中，所述感興趣疾患是冠狀動脈疾病。在一些實(shí)施方案中，所述感興趣疾患是II型糖尿病。在一些實(shí)施方案中，所述感興趣疾患是帕金森氏病。在一些實(shí)施方案中，所述感興趣疾患是阿爾茨海默氏病。在一些實(shí)施方案中，所述已知多態(tài)性風(fēng)險因子是載脂蛋白E等位基因(例如ApoE 2、ApoE 3 或ApoE 4)。在一些實(shí)施方案中，所述感興趣遺傳基因座與所述已知多態(tài)性連鎖不平衡。在一些實(shí)施方案中，所述感興趣遺傳基因座與所述已知多態(tài)性在同一染色體上且相距小于10、 20、30、40、或50千堿基。在一些實(shí)施方案中，所述遺傳基因座是T0MM40。還提供了一種用于確定感興趣疾患形成風(fēng)險升高的方法，包括(a)根據(jù)含有DNA 的生物學(xué)樣品確定由受試者個體攜帶的通過任何前述段落的方法鑒定的遺傳變體；并然后 (b)當(dāng)所述遺傳變體存在時確定所述受試者形成所述感興趣疾患的風(fēng)險升高。進(jìn)一步提供了一種用于確定受試者(例如攜帶至少一種Apo E3等位基因的受試者)中阿爾茨海默氏病形成風(fēng)險升高的方法，包括(a)根據(jù)取自所述受試者的含有DNA的生物學(xué)樣品檢測與阿爾茨海默氏病風(fēng)險升高或降低有關(guān)的T0MM40基因遺傳變體的存在或缺失；并(b)當(dāng)所述遺傳變體存在或缺失時確定所述受試者形成阿爾茨海默氏病風(fēng)險的升高或降低。在一些實(shí)施方案中，確定所述受試者是否是Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/ E4、或E4/E4受試者。在一些實(shí)施方案中，確定所述受試者是否是Apo E3/E3或E3/E4受試者ο在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括下述步驟(C)當(dāng)所述受試者被確定為形成阿爾茨海默氏病的風(fēng)險升高時以治療有效量給所述受試者施用抗阿爾茨海默氏病活性劑。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)與所述遺傳變體不存在或不缺失的受試者相比通過所述遺傳變體的存在或缺失所述受試者被確定為風(fēng)險升高時在較小的年齡在所述受試者中進(jìn)行所述施用步驟(例如，對于ApoE 4/4受試者，開始于45、46、47、48、49、50、51、52或53歲， 且在此后每一年持續(xù)進(jìn)行，而非開始于55歲或更大；對于ApoE 4/3受試者，開始于50、51、 52、53、M、55、56、57或58歲，且在此后每一年持續(xù)進(jìn)行，而非開始于60歲或更大；對于ApoE3/3受試者，開始于55、56、57、58、59、60、61、62或63歲，且在此后每一年持續(xù)進(jìn)行，而非開始于65歲或更大；而對于ApoE 2/3受試者，開始于60、61、62、63、64、65、66、67或68
歲，且在此后每一年持續(xù)進(jìn)行，而非開始于70歲或更大)。在一些實(shí)施方案中，所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑，NMDA受體拮抗劑，PPAR激動劑或調(diào)控劑(例如噻唑烷二酮或glitazar類中的藥物)，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子，及其組合。在一些實(shí)施方案中，所述活性劑是羅格列酮或其藥學(xué)可接受鹽。在一些實(shí)施方案中，所述T0MM40遺傳變體是下文所示表1中列出的變體。還提供了一種通過以治療有效量給受試者施用抗阿爾茨海默氏病活性劑來治療受試者(例如具有至少一種ApoE 3等位基因的受試者)阿爾茨海默氏病的方法；改良包括當(dāng)與不攜帶與阿爾茨海默氏病風(fēng)險升高有關(guān)的T0MM40基因遺傳變體的相應(yīng)受試者相比所述受試者攜帶所述遺傳變體時，在較小的年齡給所述受試者施用所述活性劑(例如， 對于ApoE 4/4受試者，開始于45、46、47、48、49、50、51、52、或53歲，且在此后每一年持續(xù)進(jìn)行，而非開始于55歲或更大；對于ApoE 4/3受試者，開始于50、51、52、53、M、55、56、57、 或58歲，且在此后每一年持續(xù)進(jìn)行，而非開始于60歲或更大；對于ApoE 3/3受試者，開始于55、56、57、58、59、60、61、62、或63歲，且在此后每一年持續(xù)進(jìn)行，而非開始于65歲或更大；而對于ApoE 2/3受試者，開始于60、61、62、63、64、65、66、67、或68歲，且在此后每一年持續(xù)進(jìn)行，而非開始于70歲或更大)。在一些實(shí)施方案中，所述受試者是Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4 受試者。在一些實(shí)施方案中，所述受試者是Apo E3/E3或E3/E4受試者。在一些實(shí)施方案中，所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑，NMDA受體拮抗劑，PPAR激動劑或調(diào)控劑(例如噻唑烷二酮或glitazar類中的藥物)，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子，及其組合。在一些實(shí)施方案中，所述活性劑是羅格列酮或其藥學(xué)可接受鹽。在一些實(shí)施方案中，所述T0MM40基因遺傳變體是刪除/插入多態(tài)性(DIP)。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是插入多態(tài)性。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是poly-T刪除/插入多態(tài)性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T)。在一些實(shí)施方案中，所述T0MM40遺傳變體是下文所示表1中列出的變體。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是 rsl0524523o進(jìn)一步提供了一種為有所需要的患者治療感興趣疾患的方法，其中所述感興趣疾患與ApoE和/或T0MM40有關(guān)，所述方法包括下述步驟(a)確定由受試者個體攜帶的通過第1-12段的方法鑒定的遺傳變體的存在或缺失以生成所述患者的遺傳圖譜；并然后，若所述圖譜指示所述患者會對活性劑有響應(yīng)，則(b)以治療有效量給所述受試者施用所述活性劑以治療所述感興趣疾患。在一些實(shí)施方案中，所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑，NMDA受體拮抗劑，PPAR激動劑或調(diào)控劑(例如噻唑烷二酮或glitazar類中的藥物)，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子，及其組合。在一些實(shí)施方案中，所述活性劑是羅格列酮或其藥學(xué)可接受鹽。在一些實(shí)施方案中，所述T0MM40基因遺傳變體是刪除/插入多態(tài)性(DIP)。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是插入多態(tài)性。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是poly-T刪除/插入多態(tài)性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T插入)。
在一些實(shí)施方案中，所述T0MM40遺傳變體是下文所示表1中列出的變體。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是 rsl0524523o還提供了一種在受試者中治療阿爾茨海默氏病的方法，包括(a)自取自所述受試者的含有DNA的生物學(xué)樣品檢測與對活性劑的響應(yīng)性有關(guān)的T0MM40基因遺傳變體的存在或缺失；并若所述遺傳變體存在，則(b)以治療有效量給所述受試者施用所述活性劑以治療所述阿爾茨海默氏病。在一些實(shí)施方案中，所述受試者攜帶至少一種ApoE 3等位基因。在一些實(shí)施方案中，所述受試者是Apo E3/E3或E3/E4受試者。在一些實(shí)施方案中，所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑，NMDA受體拮抗劑，PPAR激動劑或調(diào)控劑(例如噻唑烷二酮或glitazar類中的藥物)，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子，及其組合。在一些實(shí)施方案中，所述活性劑是羅格列酮或其藥學(xué)可接受鹽。在一些實(shí)施方案中，所述T0MM40基因遺傳變體是刪除/插入多態(tài)性(DIP)。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是插入多態(tài)性。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是poly-T刪除/插入多態(tài)性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T)。在一些實(shí)施方案中，所述T0MM40基因遺傳變體是下文所述表1中列出的變體。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實(shí)施方案中，所述 DIP 是rsl0524523。進(jìn)一步提供了抗阿爾茨海默氏病活性劑用于制備藥物的用途，所述藥物用于進(jìn)行依照上文所示段落治療阿爾茨海默氏病的方法。還提供了抗阿爾茨海默氏病活性劑用于進(jìn)行治療阿爾茨海默氏病的方法的用途。提供了一種為處于阿爾茨海默氏病形成風(fēng)險的患者確定預(yù)后的方法，包括獲得患者圖譜，其中所述獲得患者圖譜包括在所述患者的生物學(xué)樣品中檢測至少一種ApoE等位基因的存在或缺失，并檢測位于T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的至少一種T0MM40刪除 /插入多態(tài)性(DIP)的存在或缺失，并然后將所述患者圖譜轉(zhuǎn)換成所述預(yù)后，其中所述ApoE 等位基因的存在及所述至少一種T0MM40 DIP多態(tài)性的存在將所述患者鑒定為處于阿爾茨海默氏病形成風(fēng)險的患者。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是插入多態(tài)性。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是 poly-T刪除/插入多態(tài)性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T)。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是rsl0524523。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/ E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4受試者。在一些實(shí)施方案中，所述受試者是Apo E3/E3或 E3/E4受試者。還提供了一種用于將受試者分層入用于治療阿爾茨海默氏病的療法的臨床試驗(yàn)的亞組的方法，所述方法包括在所述患者的生物學(xué)樣品中檢測至少一種ApoE等位基因的存在或缺失，并檢測位于T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態(tài)性(DIP)的存在或缺失，其中基于所述至少一種ApoE等位基因和/或T0MM40DIP等位基因存在或缺失將所述受試者分層入所述療法的所述臨床試驗(yàn)的所述亞組。
在一些實(shí)施方案中，所述DIP是插入多態(tài)性。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是 poly-T插入多態(tài)性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T插入)。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是rsl0524523。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/ E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4受試者。在一些實(shí)施方案中，所述受試者是Apo E3/E3或 E3/E4受試者。進(jìn)一步提供了一種用于在阿爾茨海默氏病的治療的臨床試驗(yàn)中鑒定患者的方法， 包括a)鑒定診斷有阿爾茨海默氏病的患者；并b)為所述診斷有阿爾茨海默氏病的患者確定預(yù)后，包括獲得患者圖譜，其中所述獲得患者圖譜包括i)在所述患者的生物學(xué)樣品中檢測至少一種ApoE等位基因的存在或缺失，ii)檢測位于T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態(tài)性(DIP)的存在或缺失，并iii)將所述患者圖譜轉(zhuǎn)換成所述預(yù)后，所述預(yù)后包括對患者是否是阿爾茨海默氏病的所述治療的所述臨床試驗(yàn)的候選者的預(yù)測。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是插入多態(tài)性。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是 poly-T刪除/插入多態(tài)性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T)。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是rsl0524523。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/ E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4受試者。在一些實(shí)施方案中，所述受試者是Apo E3/E3或 E3/E4受試者。提供了一種用于確定受試者是否形成晚期發(fā)作阿爾茨海默氏病的風(fēng)險升高的試劑盒，包括(A)至少一種特異性檢測ApoE 3,ApoE 4、或ApoE 2的試劑，其中所述試劑選自下組選擇性結(jié)合ApoE 3、ApoE 4、或ApoE 2的抗體，和選擇性結(jié)合編碼ApoE 3、ApoE 4、 或ApoE 2的DNA的寡核苷酸探針；⑶至少一種特異性檢測位于T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態(tài)性(DIP)的存在或缺失的試劑；和(C)通過下述步驟確定受試者是否形成晚期發(fā)作阿爾茨海默氏病的風(fēng)險升高的用法說明，(i)用所述至少一種試劑在所述受試者中檢測所述ApoE同等型的存在或缺失；(ii)檢測位于T0MM40 基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態(tài)性(DIP)的存在或缺失；并 (iii)通過觀察用所述至少一種試劑是否檢測到ApoE同等型及所述T0MM40DIP的存在來觀察所述受試者是否形成晚期發(fā)作阿爾茨海默氏病的風(fēng)險升高，其中所述ApoE同等型及所述T0MM40DIP的存在指示所述受試者形成晚期發(fā)作阿爾茨海默氏病的風(fēng)險升高。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種試劑和所述用法說明包裝在一個容器中。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是插入多態(tài)性。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是 poly-T刪除/插入多態(tài)性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T)。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是rsl0524523。在一些實(shí)施方案中，所述確定步驟進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是Apo E2/E2、 E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4或E4/E4受試者。在一些實(shí)施方案中，所述受試者是Apo E3/E3或E3/E4受試者。提供了一種用于確定受試者是否會對用活性劑治療感興趣疾患有響應(yīng)的試劑盒， 其中所述感興趣疾患與ApoE和/或T0MM40有關(guān)，所述試劑盒包括(A)至少一種特異性檢測ApoE 3,ApoE 4、或ApoE 2的試劑，其中所述試劑選自下組選擇性結(jié)合ApoE 3,ApoE 4、 或ApoE 2的抗體，和選擇性結(jié)合編碼ApoE 3, ApoE 4、或ApoE 2的DNA的寡核苷酸探針； (B)至少一種特異性檢測位于T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的至少一種T0MM40刪除 /插入多態(tài)性(DIP)的存在或缺失的試劑；和(C)通過下述步驟確定受試者是否會對用所述感興趣活性劑治療所述感興趣疾患有響應(yīng)的用法說明，(i)用所述至少一種試劑在所述受試者中檢測所述ApoE同等型的存在或缺失；(ii)檢測位于T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態(tài)性(DIP)的存在或缺失；并(iii)通過觀察用所述至少一種試劑是否檢測到所述ApoE同等型及所述T0MM40DIP的存在來確定受試者是否會對治療有響應(yīng)，其中ApoE 3及所述T0MM40DIP的存在指示所述受試者會對用所述活性劑的所述治療有響應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種試劑和所述用法說明包裝在一個容器中。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是插入多態(tài)性。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是 poly-T刪除/插入多態(tài)性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T)。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實(shí)施方案中，所述DIP是rsl0524523。在一些實(shí)施方案中，所述確定步驟進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是Apo E2/E2、 E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、或E4/E4受試者。在一些實(shí)施方案中，所述受試者是Apo E3/ E3或E3/E4受試者。會理解，所有上述實(shí)施方案可以以任何方式和/或組合來組合。與本文一起提供的附圖中及下文所示說明書中更為詳細(xì)地解釋了本發(fā)明的上述和其它目的和方面。附圖簡述

圖1顯示依照一些實(shí)施方案鑒定感興趣遺傳基因座中的基因組序列的預(yù)定區(qū)域中可能與感興趣疾患有關(guān)的遺傳變體的一般流程圖。圖2顯示阿爾茨海默氏病發(fā)作的平均年齡圖，作為五種常見ApoE基因型的繼承的函數(shù)，而且呈現(xiàn)ApoE 4作為阿爾茨海默氏病的風(fēng)險因子(1993)。圖3顯示染色體19上的區(qū)域A、B、和C，它們是例示性的感興趣遺傳基因座。 T0MM40基因密切接近ApoE基因且編碼一種指示線粒體外膜的40kD蛋白質(zhì)。T0MM40與ApoE 在線粒體蛋白質(zhì)輸入的調(diào)節(jié)中直接相互作用，而且現(xiàn)在的一種假說是特定T0MM40變體的存在加劇與ApoE 3等位基因的劑量依賴性存在有關(guān)的阿爾茨海默氏病風(fēng)險升高。圖4以示意圖形式顯示如圖3所指示根據(jù)本文中詳述的一些實(shí)施方案構(gòu)建的B區(qū)域的進(jìn)化圖。每一個水平的橢圓代表一個觀察到的序列變體(例如，核苷酸變化)，而橢圓的大小代表其頻率。每一個變體稱為樹上的一個節(jié)點(diǎn)，而一個節(jié)點(diǎn)到另一個節(jié)點(diǎn)通過分支的連接代表觀察到由個體受試者攜帶的成順式的兩個變體。圖5是基于區(qū)域B為T0MM40構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹的示意圖，顯示了這個區(qū)域中 T0MM40變體的兩個主要分組或進(jìn)化枝中ApoE表型的百分比。圖6是T0MM40-ApoE基因座的示意性總覽，包括顯示在探索性(Rl) (23Kb)和驗(yàn)證性(R2) (IOKb)研究中進(jìn)行一級測序的單元型區(qū)段和區(qū)域(NCBIBuild 36. 3)的LD圖。顯示了 Hapmap數(shù)據(jù)的LD圖(CEU分析小組)、實(shí)心脊的單元型區(qū)段定義、具有通過不同線特征呈現(xiàn)的D’ /LOD顏色方案的r2值。圖7顯示系統(tǒng)發(fā)生樹及變體分開的呈現(xiàn)。7A:SNP變體，進(jìn)化枝A對B，E6-E10 代表T0MM40外顯子而垂直線指示SNP的大致位置。兩個主要分支的分開具有強(qiáng)自展 (bootstrap)支持(973/1000)。7B :rsl0524523長度多態(tài)性。為長度多態(tài)性的每個組提供了描述性統(tǒng)計。在樹或很小的進(jìn)化枝中形成各個外類群(outgroup)的數(shù)種長單元型在鑒定為“其余”(Remainder)的組中。圖8 呈現(xiàn)通過 ApoE 基因型 3/3 (8A)、3/4(8B)、和 4/4 (8C)分層的 rs 10524523 長度多態(tài)性的長度的柱狀圖。N =210個單元型(AS群組)。圖9顯示60-86歲之間發(fā)作的患者的AD發(fā)作年齡與rsl0524523多態(tài)性長度之間的關(guān)聯(lián)?？驁D指示95%范圍(垂直線)、中值(框中的水平線)和四分位間范圍(框)。發(fā)明詳述下文更詳細(xì)地解釋了本發(fā)明。此描述并非意圖作為可實(shí)施本發(fā)明的所有不同方式或可添加至本發(fā)明的所有特征的詳細(xì)目錄。例如，關(guān)于一個實(shí)施方案例示的特征可并入其它實(shí)施方案，而且關(guān)于特定實(shí)施方案例示的特征可自該實(shí)施方案刪除。另外，根據(jù)本公開， 對本文中建議的各種實(shí)施方案的不偏離本發(fā)明的眾多變更和添加對于本領(lǐng)域技術(shù)人員會是明顯的。因此，下面的說明意圖例示本發(fā)明的一些特定實(shí)施方案，而非窮盡地規(guī)定所有排列、組合及其變更。如本發(fā)明的說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式“ 一個”、“ 一種，，和“所述”意圖也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另外清楚指明。同樣，如本文中使用的，“和/或”指且涵蓋一個或多個所列項(xiàng)的任何和所有可能組合，以及當(dāng)解釋為擇一(“或”)時組合的排除。本發(fā)明致力于用于揭示因復(fù)雜疾病和病癥而特別感興趣的區(qū)域中的遺傳變異的方法。它還涉及基于與表型信息的關(guān)聯(lián)，最有信息價值的遺傳標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于定位與對特定疾病、病癥、或疾患的易感性有關(guān)的遺傳標(biāo)志物。在另一個實(shí)施方案中，關(guān)于受試者對候選治療或藥物的響應(yīng)的數(shù)據(jù)可包括在關(guān)于與對該治療或藥物的有利響應(yīng)有關(guān)的遺傳標(biāo)志物定位的系統(tǒng)發(fā)生分析中(即藥物遺傳學(xué))。該方法可應(yīng)用于來自特定基因座的遺傳變異的任何數(shù)據(jù)集。見圖1，它是依照本發(fā)明尋找遺傳風(fēng)險因子的辦法的流程圖。在一個方面，遺傳變異分析基于變異序列數(shù)據(jù)。在第二個方面，使用二倍體基因型數(shù)據(jù)揭開結(jié)構(gòu)，由此避免實(shí)驗(yàn)或計算推斷成分單元型的需要(見例如美國專利 No. 6,027,896, Roses et al.)。在另一個方面，本方法可應(yīng)用于源自用實(shí)驗(yàn)規(guī)程查詢靶核酸(這提供存在的序列變異的記錄但是實(shí)際上沒有提供完整序列)的未表征等位基因變異。作為遺傳變異的基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)對于自二倍體基因型數(shù)據(jù)推導(dǎo)組分單元型也是有用的。優(yōu)選且涵蓋本文中描述的方法與本領(lǐng)域知道或記載的用于評估具有疾病或病癥 (例如那些被認(rèn)為涉及線粒體功能障礙的(例如阿爾茨海默氏病或其它神經(jīng)變性疾病))的受試者或用于評估懷疑具有此類疾病形成風(fēng)險的受試者的其它臨床診斷信息聯(lián)合使用。本發(fā)明還可應(yīng)用于其它復(fù)雜疾病、病癥、或疾患的遺傳風(fēng)險因子的發(fā)現(xiàn)。
通過本文中的述及將本文中引用的所有美國專利參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容完整收入本文。1.定義本文中使用了下面的定義“感興趣疾患”指被指派進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生研究和/或后續(xù)診斷或預(yù)后的特定疾患、疾病、或病癥。如本文中使用的，“疾患”包括但不限于與ApoE和/或T0MM40和/或線粒體功能障礙有關(guān)的疾患，例如神經(jīng)變性疾病、代謝疾病、精神病癥、和癌癥。 涉及ApoE和/或T0MM40的疾患的例子包括但不限于心血管疾?。淮x疾??；神經(jīng)變性疾?。簧窠?jīng)學(xué)創(chuàng)傷或疾??；自身免疫疾病(例如多發(fā)性硬化(Pinholt M，et al. Apo E in multiple sclerosis and optic neuritis :the apoE_epsilon4 allele is associated with progression of multiple sclerosis. Mult Scler.11 :511-5(2005) ；Masterman， T. &Hillert，J. The telltale scan :AP0E 4inmultiple sclerosis. Lancet Neurol. 3 331 (2004)).神經(jīng)精神性系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Pullmann Jr. R，et al. Apolipoprotein E polymorphism in patients withneuropsychiatric SLE.Clin Rheumatol.23 97-101 (2004)).等)；病毒感染(例如與丙肝感染有關(guān)的肝病(Wozniak MA, et al. Apolipoprotein E- ε 4protectsagainst severe liver disease caused by hepatitis C virus, !fepatol. 36 :456-463(2004))、HIV 疾病(Burt TD，et al. Apolipoprotein (apo) E4 enhances HIV-I eellentry in vitro, and the APOE epsilon4/epsilon4 genotype accelerates HIV diseaseprogression.Proc Natl Acad Sci USA. 105 8718-23(2008))、等)；髖骨折 / 骨質(zhì)疏松(Pluijm SM, et al. Effects of gender and age on the association ofapolipoprotein E epsilon4 with bone mineral density, bone turnover and the riskof fractures in older people. Osteoporos Int. 13 701-9(2002))；線粒體疾病(Chang S，et al. Lipid-and receptor-binding regiohs of apolipoprotein E4fragments act in concert to cause mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 102 :18694-9(2005))；衰老(Schachter F，et al. Geneticassociations with human longevity at the APOE and ACE loci. Nat Genet. 6 :29-32(1994) ；Rea IM, et al.，Apolipoprotein E alleles in nonagenarian subjectsin the Belfast Elderly Longitudinal Free-living Ageing Study (BELFAST). Mech.Aging and Develop. 122 :1367-1372(2001))；炎癥(Li L，et al.，Infection inducesa positive acute phase apolipoprotein E response from a negative acute phasegene :role of hepatic LDL receptors. J Lipid Res. 49 :1782-93(2008))； 禾口記憶功會邑障石尋(Caselli RJ, et al. Longitudinal modeling of age-related memory declineand the APOE epsilon4 effect. N Engl J Med. 361 :255-630009))。
如本文中使用的，“心血管疾病”指涉及心和/或血管的疾病，包括但不限于冠狀動脈疾病(Song Y，et al. Meta-analysis :apolipoprotein E genotypes andrisk for coronary heart disease.Ann Intern Med. 141 137-47 (2004)； Bennet AM，et al.，Association of apolipoprotein E genotypes with lipid levels and coronaryrisk. JAMA 298 :1300-11 (2007))、動脈粥樣硬化(Norata GD， et al.Effects ofPCSK9 variants on common carotid artery intima mediathickness and relation toApoE alleles. Atherosclerosis (2009)Jun 27. [Epub ahead of print]，doi :10. 1016/j.atherosclerosis 2009.06.023 ；Paternoster L， et al. AssociationBetween Apolipoprotein E Genotype and Carotid Intima-Media Thickness MaySuggest a Specific Effect on Large Artery Atherothrombotic Stroke. Stroke39 :48-54 (2008)) Λ 缺血性心臟病(Schmitz F，et al.，Robust association of theAPOE 4 allele with premature myocardial infarction especially in patientswithout hypercholesterolaemia the Aachen study.Eur. J. Cl in. Investigation 37 106-108 (2007))、血管病諸如缺血性發(fā)作(Peck G，et al. The genetics of primaryhaemorrhagic stroke， subarachnoid haemorrhage and ruptured intracranialaneurysms in adults.PLoS One.3 :e3691 (2008) ；Paternoster L, et al. AssociationBetween Apolipoprotein E Genotype and Carotid Intima-Media Thickness MaySuggest a Specific Effect on Large Artery Atherothrombotic Stroke. Stroke39 :48-54^008))、血管性癡呆(Bang OY，et al. Important link between dementiasubtype and apolipoprotein E :a meta-analysis. Yonsei Med J. 44 401-13 (2003) ；Baum L，et al. Apolipoprotein E epsilon4 allele is associated with vasculardementia. Dement Geriatr Cogn Disord. 22 :301-5(2006))等。如本文中使用的，“神經(jīng)變性疾病”指阿爾茨海默氏病(Corder EH, et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer' s disease inlate onset families. Science 261:921-3 (1993) ；Corder EH, et al.There is apathologic relationship between ApoE-epsilon 4and Alzheimer ' s disease. ArchNeurol. 52 :650-1 (1995))、巾白金森氏病(Huang X， et al. Apolipoprotein E anddementia in Parkinson disease :a meta-analysis. Arch Neurol. 63 :189-93 (2006)； Huang X et al. APOE-[epsiIon]2alIele associated with higher prevalence ofsporadic Parkinson disease.Neurology 62 :2198-202 (2004) ；Martinez, M. et al. Apolipoprotein E4is probably responsible for the chromosome 191inkage peakfor Parkinson ' s disease. Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet. 136B， 172-174^00 )、亨廷頓氏病和多種不太常見的引起神經(jīng)元減退的疾病和病癥例如老年性黃斑變性(age-related mascular degeneration) (Thakkinstian A，etal. Association between apolipoprotein E polymorphisms and age-related maculardegeneration A HuGE review and meta-analysis. Am J Epidemiol. 164 :813-22 (2006) ；Bojanowski CM，et al. An apolipoprotein E variant may protect againstage-related macular degeneration through cytokine regulation. Environ MolMutagen. 47 :594_602(2006))?！吧窠?jīng)學(xué)創(chuàng)傷或疾病”包括但不限于頭部損傷后的后果(Zhou W，et al. Meta-analysis of AP0E4 allele and outcome after traumatic brain injury. JNeurotrauma. 25 :279-90(2008) ；Lo TY, et al. Modulating effect ofapolipoprotein E polymorphisms on secondary brain insult and outcome afterchildhood brain trauma. Childs Nerv Syst. 25 :47-54(2009))(Gupta R, etal. Polymorphism in apolipoprotein E among migraineurs and tension-typeheadache subjects. J Headache Pain. 10 :115-2(K2009))、血管性水月中(James ML，et al. Apolipoprotein E modifiesneurological outcome by affecting cerebraledema but not hematoma size after intracerebral hemorrhage in humans. J StrokeCerebrovasc Dis. 18 :144-9(2009)； James ML, et al. Pharmacogenomic effects ofapolipoprotein e on intracerebral hemorrhage. Stroke 40 :632-9(2009))等。如本文中使用的，“代謝疾病”包括但不限于血脂障礙(Wilier CJ, et al. Newly identified loci that influence lipid concentrations and risk of coronaryartery disease. Nat Genet. 40 :161-9(2008) ；Bennet AM，et al.，Association ofapolipoprotein E genotypes with lipid levels and coronary risk. JAMA298 1300-11 (2007))、末期腎病(Oda H，et al. Apolipoprotein E polymorphismand renal disease. Kidney Int Suppl.71 :S25_7(1999) ；Hubacek JA, et al. Apolipoprotein E Polymorphism in Hemodialyzed Patients and Healthy 對照 s.Biochem Genet. (2009) Jun 30. [Epub ahead of print]D0I10. 1007/sl0528-009_9266-y·)、慢性腎病 (Yoshida T，et al. Association of apolymorphism of the apolipoprotein E gene with chronic kidney disease injapanese individuals with metabolic syndrome. Genomics 93 :221-6(2009) ；LeivaE，et al. Relationship between Apolipoprotein E polymorphism and nephropathyin type_2diabetic patients.Diabetes Res Clin Pract. 78 :196-201 (2007))Λ 膽囊病(Boland LL, et al.Apolipoprotein E genotype and gallbladder disease risk in alarge population-based cohort. Ann Epidemiol. 16 :763-9 (2006) ；Andreotti G，etal. Polymorphisms of genes in the lipid metabolism pathway and risk of biliarytract cancers and stones :a population-based case-對照 study in Shanghai, China. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 17 :525-34(2008))、糖尿病(II 型)(Elosua R，et al. Obesity Modulates the Association among APOE Genotype, Insulin，andGlucose in Men. Obes Res. 11 1502-1508(2003) ；Moreno JA, et al.TheApolipoprotein E Gene Promoter(-219G/ T)Polymorphism Determines InsulinSensitivity in Response to Dietary Fat in Healthy Young Adults. J. Nutr. 135 :2535_254(K2005))、代謝綜合征、膽石癥(Abu Abeid S， et al.Apolipoprotein-E genotype and the risk of developing cholelithiasis followingbariatric surgery :a clue to prevention of routine prophylactic cholecystectomy. Obes Surg. 12 :354-7(2002))等。如本文中使用的，“精神病癥”指精神分裂癥(Kampman 0，et al. Apolipoprotein E polymorphism is associated with age of onset in schizophrenia. J Hum Genet. 49 355-9(2004) ；Dean B. et al. ,Plasma apolipoprotein E isdecreased in schizophrenia spectrum and bipolar disorder. Psychiatry Res. 158 :75-78 (2008))Λ 強(qiáng)制性障礙 (0CD)、成癮性行為(吸煙成癮、酒精成癮等)、雙相型障礙(Dem B.et al. , Plasma apolipoprotein E is decreased inschizophrenia spectrum and bipolar disorder. Psychiatry Res. 158 :75-78 Q008))、和精神性質(zhì)的其它疾病、病癥、或疾患。如本文中使用的，“疾患形成”指疾病、病癥、或其它醫(yī)學(xué)疾患的初始診斷，或受試者已診斷的現(xiàn)有疾病、病癥、或醫(yī)學(xué)疾患的加劇。如本文中使用的，“診斷”或“預(yù)后”指基于與共享共同核苷酸序列、癥狀、征候、家族史或考慮患者健康狀況有關(guān)的其它數(shù)據(jù)的多數(shù)個體的比較，使用信息(例如遺傳信息或來自對生物學(xué)樣品的其它分子測試的數(shù)據(jù)、征候和癥狀、身體檢查發(fā)現(xiàn)、認(rèn)知性能結(jié)果等) 來預(yù)料最有可能的后果、時幀和/或?qū)τ糜诮o定疾病、病癥或疾患的特定處理的響應(yīng)。如本文中使用的，“生物學(xué)樣品”指懷疑含有感興趣核酸的材料。含有DNA的生物學(xué)樣品包括毛發(fā)、皮膚、頰拭樣和生物學(xué)流體諸如血液、血清、血漿、痰、淋巴液、精液、陰道粘液、糞便、尿液、脊髓液等等。自此類樣品分離DNA是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。依照一些實(shí)施方案的“受試者”指其基因型或單元型要與個體的狀況(即疾病或病癥狀態(tài))和/或?qū)蜻x藥物或治療的響應(yīng)聯(lián)合來確定并記錄的個體。使用來自多數(shù)受試者的核苷酸序列來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，并然后可以出于診斷或預(yù)后目的將來自受試者個體的同源核苷酸序列與系統(tǒng)發(fā)生樹上的那些比較。如本文中使用的，“基因”指含有用于RNA產(chǎn)物的受調(diào)節(jié)生物合成的所有信息的 DNA區(qū)段，包括啟動子、外顯子、內(nèi)含子和控制表達(dá)的其它非翻譯區(qū)。如本文中使用的，“遺傳基因座”或“基因座”指染色體或DNA分子上的位置，常常對應(yīng)于基因或身體或表型特征或特定核苷酸或核苷酸串?；蜃挠⑽膯螖?shù)形式是locus， 復(fù)數(shù)形式是loci。如本文中應(yīng)用于核酸的，“擴(kuò)增”指任何導(dǎo)致核酸的一個或多個拷貝形成的方法， 其中優(yōu)選擴(kuò)增是指數(shù)式的。一種用于酶促擴(kuò)增特定DNA序列的此類方法稱作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，如記載于 &iiki et al.，1986，Science230 :1350_1354。PCR 中使用的引物正常情況長度變化自約10個至50個或更多個核苷酸，而且通常選擇為至少約15個核苷酸以確保足夠的特異性。生成的雙鏈片段叫作“擴(kuò)增子”，而且長度變化可自少至約30個核苷酸至 20, 000個或更多個核苷酸。如本文中使用的，“標(biāo)志物”或“遺傳標(biāo)志物”指特定基因座處的已知DNA序列變異。變異可以由于突變或遺傳而存在于個體中。遺傳標(biāo)志物可以是短DNA序列，諸如單個堿基對變化(單核苷酸多態(tài)性，SNP)周圍的序列，或長DNA序列，像微衛(wèi)星。標(biāo)志物可用于研究遺傳病與其遺傳原因(例如導(dǎo)致缺陷或其它不想要形式蛋白質(zhì)的特定基因突變)之間的相關(guān)性。如本文中使用的，“遺傳風(fēng)險因子”指與對疾患、疾病、或病癥的易感性升高有關(guān)的遺傳標(biāo)志物。它還指與對感興趣的選定藥物或治療的特定響應(yīng)有關(guān)的遺傳標(biāo)志物。如本文中使用的，“與...有關(guān)的”指兩項(xiàng)或更多項(xiàng)特征的一起發(fā)生比預(yù)期會偶然單獨(dú)發(fā)生更常見。關(guān)聯(lián)的一個例子涉及白血球表面上稱作HLA(HLA代表人白細(xì)胞抗原)的一項(xiàng)特征。一種特定HLA類型，即HLA B-27型，與多種疾病包括強(qiáng)直性脊柱炎的風(fēng)險升高有關(guān)。強(qiáng)直性脊柱炎在具有HLAB-27的人中比在一般群體中發(fā)生的可能性高至87倍。由于遺傳風(fēng)險因子而“疾患發(fā)生風(fēng)險的升高的”受試者指易患疾患、對疾患具有遺傳易感性和/或比缺乏所述遺傳風(fēng)險因子的受試者更有可能形成疾患的受試者。例如，由于存在一個或兩個ApoE 4等位基因而“阿爾茨海默氏病形成的風(fēng)險升高的“受試者”比不攜帶ApoE 4等位基因的受試者更有可能形成阿爾茨海默氏病。如本文中使用的，“多態(tài)性”指基因組DNA中的特定基因座處存在兩種或更多種不同核苷酸序列。多態(tài)性可充當(dāng)遺傳標(biāo)志物，而且還可稱作遺傳變體。多態(tài)性包括核苷酸替代、插入、刪除和微衛(wèi)星，而且可以但非必然導(dǎo)致基因表達(dá)或蛋白質(zhì)功能的可檢測差異。多態(tài)性位點(diǎn)指基因座內(nèi)至少一名群體中的個體的核苷酸序列與參照序列不同的核苷酸位置。如本文中使用的，“刪除/插入多態(tài)性”或“DIP”指一種型式(version)的序列中相對于另一種插入一個或多個核苷酸。如果已知哪種等位基因代表次要等位基因，那么在次要等位基因是核苷酸刪除時使用術(shù)語刪除，而且在次要等位基因是核苷酸添加時使用術(shù)語 “插入”。還在有多種形式或長度且次要等位基因不明顯時使用術(shù)語“刪除/插入多態(tài)性”。 例如，對于本文中描述的poly-T多態(tài)性，觀察到多種長度的多態(tài)性。如本文中使用的，“多態(tài)性數(shù)據(jù)”指關(guān)于特定基因的下面一項(xiàng)或多項(xiàng)的信息多態(tài)性位點(diǎn)的位置；那些位點(diǎn)處的序列變異；一個或多個群體中多態(tài)性的頻率；對于基因確定的不同基因型和/或單元型；一個或多個群體中一種或多種這些基因型和/或單元型的頻率；和性狀與基因的基因型或單元型之間的任何已知關(guān)聯(lián)。如本文中使用的，“單元型”指個體中至少一條染色體上攜帶的遺傳變體或變體組合。單元型常常包括多個毗鄰多態(tài)性基因座。如本文中使用的，單元型的所有部分存在于染色體或單倍體DNA分子的同一拷貝上。如無沒有相反證據(jù)，則假設(shè)單元型代表有可能在減數(shù)分裂期間一起遺傳的多個基因座的組合。每個人攜帶任何給定遺傳基因座的一對單元型，由在來自雙親的同源染色體上繼承的序列組成。這些單元型可以是相同的，或者可以代表給定基因座的兩種不同遺傳變體。單元型定型指用于確定個體中的一種或多種單元型的過程。單元型定型可以包括使用家族系譜、分子技術(shù)和/或統(tǒng)計推斷。如本文中使用的，“變體”、“變異”、或“遺傳變體”指群體中單元型的特定同等型， 即基因的序列內(nèi)在至少一個并通常超過一個的變異位點(diǎn)或核苷酸的序列與同一單元型的其他形式不同的特定形式。這些在基因的不同等位基因間不同的變異位點(diǎn)處的序列稱作 “基因序列變體”、“等位基因”、“變異”或“變體”。術(shù)語“可變形式”指通過在基因序列內(nèi)具有至少一個并通常超過一個的變異位點(diǎn)，能與其它等位基因區(qū)分的等位基因。本領(lǐng)域已知的等同于“變異”或“變體”的其它術(shù)語包括突變和單核苷酸多態(tài)性(SNP)。提到存在變異意味著特定變異，即特定多態(tài)性位點(diǎn)處的特定核苷酸，而非僅僅是存在基因的任何變異。如本文中使用的，“同等型”指基因、mRNA、cDNA或由其編碼的蛋白質(zhì)的特定形式， 通過其特定序列和/或結(jié)構(gòu)而與其它形式區(qū)分。例如，載脂蛋白E的ApoE 4同等型對ApoE 2或ApoE 3同等型。如本文中使用的，“順反子”指在單一染色體上發(fā)現(xiàn)的含有單一多肽的遺傳密碼且發(fā)揮遺傳單元的功能的DNA區(qū)段。順反子包括涉及單一功能單元(即基因)的外顯子、內(nèi)含子和調(diào)節(jié)元件。該術(shù)語衍生自經(jīng)典的順反測試，其用于確定遺傳元件，是在無論它們是否位于同一 DNA分子上時均能夠在功能上相互作用(“反式”互補(bǔ))或者是只在它們位于同一 DNA分子上時能夠在功能上相互作用(“順式”作用元件)。在本發(fā)明的語境中，術(shù)語“基因型”指基因的特定等位基因形式，其可以通過特定位點(diǎn)處的核酸序列中存在的特定核苷酸來定義?；蛐鸵部梢灾敢粋€或多個多態(tài)性基因座處存在的等位基因?qū)?。對于二倍體生物體，諸如人類，兩個單元型構(gòu)成基因型?；蛐投ㄐ椭赣糜诖_定個體的基因型的任何過程，例如通過核酸擴(kuò)增、抗體結(jié)合或其它化學(xué)分析。所得基因型可以是未定相的(imphased)，意味著不知道找到的序列衍生自哪條親本染色體。如本文中使用的，“連鎖不平衡”指兩個或更多個基因座處的等位基因的非隨機(jī)關(guān)聯(lián)。連鎖不平衡描述如下的情況，其中等位基因或遺傳標(biāo)志物的一些組合在群體中發(fā)生的頻率比基于等位基因的頻率預(yù)期會自等位基因隨機(jī)形成單元型的頻率更高或更低。不同基因座處的多態(tài)性間的非隨機(jī)關(guān)聯(lián)通過連鎖不平衡的程度來測量。如本文中使用的，“多重序列比對”或“MSA”指來自自多名個體衍生的基因組DNA 的三條或更多條核苷酸序列的比對，以確定序列間的同源性和異源性。一般地，假設(shè)查詢序列的輸入集具有進(jìn)化相關(guān)性，由此它們共享一個譜系且遺傳自共同祖先。計算機(jī)算法最常用于實(shí)施對比對序列的分析。參照例示方法的框圖(例如圖1)描述了本發(fā)明的一些實(shí)施方案，它們可以包括由計算機(jī)和/或計算機(jī)程序產(chǎn)品執(zhí)行的步驟。會理解，框圖和/或操作例示的每一個框，及框圖和/或操作例示的框組合可以由模擬和/或數(shù)字硬件和/或計算機(jī)程序指令來執(zhí)行。可以給通用計算機(jī)、專用計算機(jī)、ASIC和/或其它可編程數(shù)據(jù)處理裝置的處理器提供這些計算機(jī)程序指令，使得經(jīng)由計算機(jī)和/或其它可編程數(shù)據(jù)處理裝置的處理器執(zhí)行的指令創(chuàng)建用于執(zhí)行框圖和/或操作例示中規(guī)定的功能/作用的手段。因而，會領(lǐng)會，框圖和操作例示支持裝置、方法和計算機(jī)程序產(chǎn)品。還可以包括其它軟件，諸如操作系統(tǒng)。會進(jìn)一步領(lǐng)會，多重序列比對模塊、作圖模塊和/或本文中描述的其它模塊的功能性可以(至少部分地)使用分立硬件組件、一個或多個特定用途集成電路(ASIC)和/或一個或多個特殊用途數(shù)字處理器和/或計算機(jī)來實(shí)現(xiàn)。如本文中使用的，“作圖”指創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)生樹，即給觀察到的每種新核苷酸序列變體指派節(jié)點(diǎn)，將該節(jié)點(diǎn)連接至代表由同一個體攜帶于同一染色體或順反子上的已知序列的另一節(jié)點(diǎn)，并對每個節(jié)點(diǎn)處代表的每種類型的受試者數(shù)目計數(shù)。見圖4，它是以這種方式建立的系統(tǒng)發(fā)生樹的一個例子?！跋到y(tǒng)發(fā)生”指涉及物種內(nèi)各組生物體或個體間的進(jìn)化聯(lián)系的研究。在易于獲得遺傳信息之前，系統(tǒng)發(fā)生主要基于表型觀察。如本文中使用的，“系統(tǒng)發(fā)生作圖”指使用 DNA序列數(shù)據(jù)來連接由多個個體攜帶的相關(guān)序列變體以確定進(jìn)化聯(lián)系和分歧的時間順序 (chronology)。“系統(tǒng)發(fā)生樹”是對變體間聯(lián)系作圖的成果。如本文中使用的，“節(jié)點(diǎn)”指系統(tǒng)發(fā)生樹上代表由至少一名受試者攜帶的實(shí)際變異序列的多態(tài)性數(shù)據(jù)點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)通過分支連接至另一節(jié)點(diǎn)，后者代表由同一個體攜帶于同一染色體上及同一順反子中的但位于順反子內(nèi)不同遺傳基因座處的變異序列。存在節(jié)點(diǎn)指示至少一名受試者攜帶由該節(jié)點(diǎn)指代的序列以及由通過分支與其連接的鄰近節(jié)點(diǎn)代表的序列二者。如本文中使用的，“分支”指代表兩種不同變異序列或單元型的兩個節(jié)點(diǎn)之間的連接，其中所述兩種變體位于來自受試者個體的同一染色體上和同一順反子中?！胺种c(diǎn)”指延伸出超過兩個分支的任何節(jié)點(diǎn)，但是它在本文中尤其用于指延伸出三個或更多個節(jié)點(diǎn)的根節(jié)點(diǎn)?！案?jié)點(diǎn)，，代表共同進(jìn)化祖先的遺傳序列，遺傳分歧自其產(chǎn)生各種各樣由連接的節(jié)點(diǎn)代表的附近序列變體。如本文中使用的，“迭代”指反復(fù)計算一個系列中每個特征的值。例如，分析系統(tǒng)發(fā)生樹上的每個節(jié)點(diǎn)以計算受感興趣疾患(諸如阿爾茨海默氏病)影響的受試者數(shù)目與對照未受影響受試者之比；將該比與連接的節(jié)點(diǎn)比較以定位與感興趣疾病、病癥、或疾患形成風(fēng)險升高或降低的關(guān)系。一個節(jié)點(diǎn)與下一個之間該比的實(shí)質(zhì)性變化指示存在升高或降低較早代檢查遺傳變體”指分析開始于代表由最多數(shù)目受試者個體共享的序列的節(jié)點(diǎn)并連續(xù)分析自該節(jié)點(diǎn)延伸出的分支連接的節(jié)點(diǎn)，接著是第二水平的節(jié)點(diǎn)，依此類推。然后，分析總體上自樹的根部向樹的外部分支和節(jié)點(diǎn)移動。如本文中使用的，“治療”包括任何試圖實(shí)現(xiàn)受試者健康的特定方面的變化(即致力于特定疾病、病癥或疾患)的藥物、方法、生活方式改變或引入的其它調(diào)整。如本文中使用的，“藥物”指給人施用來治療或預(yù)防或控制疾病或疾患的化學(xué)實(shí)體或生物學(xué)產(chǎn)品，或化學(xué)實(shí)體或生物學(xué)產(chǎn)品的組合。如本文中使用的，術(shù)語“藥物”與術(shù)語 “藥”、“藥劑”、“治療性干預(yù)”、或“藥學(xué)產(chǎn)品”同義。最優(yōu)選地，藥物得到政府機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于治療至少一種特定疾病或疾患。“疾病”、“病癥”、和“疾患”是本領(lǐng)域普遍公認(rèn)的，而且指個體或患者中存在一般公認(rèn)為異常和/或不想要的征候和/或癥狀。疾病或疾患可以基于病理變化來診斷和歸類。 疾病或疾患可以為選自標(biāo)準(zhǔn)教科書諸如Harrison，sPrinciples of Internal Medicine, 1997 或 Robbins Pathologic Basis of Disease，1998 中列出的疾病類型。如本文中使用的，“線粒體功能障礙”指細(xì)胞內(nèi)線粒體的任何有害異常。本領(lǐng)域現(xiàn)在已知與線粒體功能障礙有關(guān)的一些疾病、病癥、或疾患包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病和其它神經(jīng)變性疾病、中風(fēng)和心臟病發(fā)作中的缺血-再灌注損傷、癲癇、糖尿病和衰老。本領(lǐng)域已經(jīng)將許多其它疾病、病癥和疾患與線粒體功能障礙關(guān)聯(lián)起來。確實(shí)，線粒體對于大多數(shù)細(xì)胞類型的正常機(jī)能是至關(guān)重要的，而且線粒體減退常常導(dǎo)致細(xì)胞死亡。通過損害ATP 生成、破壞鈣穩(wěn)態(tài)和提高氧化應(yīng)激，這種線粒體功能障礙引起細(xì)胞損傷和死亡。此外，通過引起細(xì)胞色素c和其它促凋亡因子釋放入細(xì)胞質(zhì)，線粒體損傷可導(dǎo)致凋亡性細(xì)胞死亡(綜述見Wallace，1999 ；Schapira，2006)。關(guān)于本文中發(fā)現(xiàn)的一個特定例子，假設(shè)ApoE 3和 ApoE 4同等型經(jīng)由與T0MM40的相互作用來引起線粒體功能障礙。一些T0MM40變體可以與ApoE 3同等型協(xié)同作用來加速線粒體減退。認(rèn)為這種線粒體機(jī)制促成多種復(fù)雜遺傳性疾病、病癥和疾患。如本文中使用的，“受試者”優(yōu)選但不限于人類受試者。受試者可以是男性或女性，而且可以是任何人種或種族，包括但不限于白人(Caucasian)、非洲裔美國人 (African-American)、非洲人、亞洲人、西班牙語裔(Hispanic)、印第安人等。受試者可以是任何年齡，包括新生兒、嬰兒、幼兒、兒童、青少年、成人和老人。受試者還可以包括動物受試者，特別是哺乳動物受試者，諸如犬、貓、牛、山羊、馬、綿羊、豬、嚙齒類(例如大鼠和小鼠)、 兔類、靈長類(包括非人靈長類)等，其經(jīng)篩選用于獸醫(yī)用藥或藥學(xué)藥物開發(fā)目的。如本文中使用的，“治療”或“處理”指對罹患疾病的患者給予好處(包括患者的疾患(例如一種或多種癥狀)的改善、疾病的發(fā)作或進(jìn)展的延遲等)的任何類型的措施。如本文中使用的，“晚期發(fā)作阿爾茨海默氏病”或“LOAD”是本領(lǐng)域已知的，而且是阿爾茨海默氏病在65歲后發(fā)作或診斷的情況中使用的分類。它是阿爾茨海默氏病的最常見形式。2.用于鑒定遺傳變體的方法雖然自基因組尺度掃描推導(dǎo)的關(guān)聯(lián)表是有用的，但是它們一般不足以解釋疾病復(fù)雜性。家族、途徑和基因相互作用可提供特異性。高分辨率變異作圖可揭示復(fù)雜遺傳相互作用的答案。在自身不能完全解釋與感興趣疾病、病癥、或疾患的關(guān)聯(lián)的一種已知遺傳風(fēng)險因子可能呈現(xiàn)卓越候選遺傳基因座用于更詳細(xì)的調(diào)查的情況中，這是特別適用的。此外，藥物遺傳學(xué)在可用于藥物開發(fā)的同時，還能延伸生物學(xué)關(guān)聯(lián)性。分析來自大量個體的序列數(shù)據(jù)以發(fā)現(xiàn)群體中個體間基因序列變異會導(dǎo)致群體中所有變體的更大部分的檢測。要通過本發(fā)明的方法來分析的初始序列信息衍生自多個受試者的基因組DNA。生物體可以是其多種序列可得的任何生物體，但是優(yōu)選來自人類。在鑒定新變異時，篩選基于人種、種族、性別和/或地理起源的不同群體組常常是有用的，因?yàn)樘囟ㄗ儺惖念l率在此類組間可能不同。最優(yōu)選地，對于認(rèn)為是多基因的疾病或病癥(遺傳復(fù)雜疾病/病癥)，由受試者群體呈現(xiàn)的表型來自型譜的極端。含有DNA的生物學(xué)樣品可以是血液、精液、頰拭樣等。自此類樣品分離DNA是本領(lǐng)域公知的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分析來自具有給定疾病、病癥或疾患(遺傳的或其它的)的至少一種已知風(fēng)險因子的多個受試者的核苷酸序列數(shù)據(jù)。分析核苷酸序列以生成單元型數(shù)據(jù)，并然后將單元型或遺傳變體繪圖到系統(tǒng)發(fā)生樹上以展現(xiàn)所代表的序列的進(jìn)化。通過將此樹與關(guān)于多個受試者的表型數(shù)據(jù)比較，有可能為攜帶在系統(tǒng)發(fā)生樹上觀察到的單元型的受試者個體做出預(yù)后或診斷。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)領(lǐng)域及遺傳單元型信息用于預(yù)測個體對疾病的易感性和/或他們對一種或多種特定藥物的響應(yīng)的用途，從而可以開發(fā)適應(yīng)群體組的遺傳差異的藥物和/或?qū)⑵涫┯糜诰哂羞m宜遺傳譜的個體。核苷酸序列信息衍生自基因組DNA。使用的基因組序列數(shù)據(jù)可以得自臨床或非人動物或得自培養(yǎng)的細(xì)胞或分離的組織研究。生物體可以是其多種序列可得的任何生物體， 但是優(yōu)選來自人類。在鑒定新變異時，篩選基于人種、種族、性別和/或地理起源的不同群體組常常是有用的，因?yàn)樘囟ㄗ儺惖念l率在此類組間可能不同。最優(yōu)選地，對于認(rèn)為是多基因的疾病或病癥(遺傳復(fù)雜疾病/病癥)，由受試者群體呈現(xiàn)的表型是極端對立項(xiàng)。含有DNA的生物學(xué)樣品可以是血液、精液、頰拭樣等。自此類樣品分離DNA是本領(lǐng)域公知的。用于確定特定感興趣遺傳基因座處的DNA序列的方法也是本領(lǐng)域已知的。自動化測序現(xiàn)在是廣泛可得的，而且只需要分離的DNA樣品和至少一種特異性設(shè)計成識別感興趣遺傳基因座內(nèi)或附近高度保守序列的引物。依照一些實(shí)施方案，自包括對特定病癥完善表征的患者的人群組，仔細(xì)測序出感興趣的限定遺傳區(qū)或基因座(例如由一套正向和反向PCR引物限定的)。確定共有序列，并且將給定基因座的所有觀察到的序列變體匯編成表。具有最大數(shù)目觀察到的變體的基因座代表來自共同祖先的進(jìn)化分歧。因此，這些基因座是順式連接于只具有一個或很少觀察到的變體的基因座的。至少在調(diào)查的初始階段期間，優(yōu)選配對成受試者組的群體共享代表相似祖先的共同一般表型。否則，經(jīng)由構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹來分析這些數(shù)據(jù)會需要極大數(shù)目的受試者。3.多重序列比對確定群體中基因或基因區(qū)中特定變異或多處變異的存在可以以多種方式來實(shí)施， 它們都涉及通過靶向感興趣區(qū)域內(nèi)已知高度保守的序列來定位特定遺傳基因座。根據(jù)高度保守的基因座，經(jīng)由本領(lǐng)域公知的多種技術(shù)之一易于獲得毗鄰序列。分析來自多個受試者的平行DNA序列中的第一步是多重序列比對(“MSA”)。MSA 通常用于展示來自在基因或基于區(qū)內(nèi)具有多態(tài)性差異的同源樣品的序列比對以顯示保守區(qū)域和變異序列?？梢允褂酶鞣N已知技術(shù)之一或更多和公眾可得軟件來構(gòu)建在感興趣基因座處獲得的序列信息的MSA，而且它們是公眾自許多來源(包括因特網(wǎng))可得的。本領(lǐng)域已知的用于分析多重序列比對的方法包括例如美國專利6，128，587，Sjolander ；美國專利 6，291，182，Schork et al.；及美國專利 6，401，043，Manton et al.中記載的那些。4.系統(tǒng)發(fā)生樹和分析各種用于構(gòu)建“系統(tǒng)發(fā)生樹”的方法是本領(lǐng)域已知的(見例如Sanderson，2008)。 Sim等人使用“單元型區(qū)段”分析來研究toll樣受體(TLR)變體與前列腺癌之間的關(guān)聯(lián) (2005)，而Bardel等人Q005)使用進(jìn)化枝分析辦法來調(diào)查CARD15基因變體與克羅恩氏病之間的關(guān)聯(lián)。然而，均未利用先前與疾病關(guān)聯(lián)起來的遺傳基因座來調(diào)查連鎖。依照一些實(shí)施方案的系統(tǒng)發(fā)生樹可以用拓?fù)鋪順?gòu)建，其中在所研究人類受試者個體中觀察到的單元型序列變體形成樹上的節(jié)點(diǎn)(代表在數(shù)據(jù)中觀察到的每一種序列)。節(jié)點(diǎn)可連接其它節(jié)點(diǎn)，而且在樹的分支位點(diǎn)、共同根或根節(jié)點(diǎn)處找到共同祖先。系統(tǒng)發(fā)生樹反映所分析數(shù)據(jù)的遺傳基因座間的進(jìn)化相關(guān)性(見Sanderson，2008 ；Tzeng,2005 ；SeItman, 2003)。圖4顯示為圖3所示遺傳基因座的B區(qū)構(gòu)建的詳細(xì)系統(tǒng)發(fā)生樹。系統(tǒng)發(fā)生樹評估的起點(diǎn)一般是MSA(見上文)。可使用多種軟件基于序列數(shù)據(jù)來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。見例如美國專利7, 127，466和美國專利6，532，467, Brocklebank, et al.。 基本前提在于展現(xiàn)許多變體的遺傳基因座由順式連接的這些變體呈現(xiàn)。多態(tài)性在樹中創(chuàng)建分支點(diǎn)(節(jié)點(diǎn))，其限定相關(guān)序列或單元型的組。利用系統(tǒng)發(fā)生樹來獲得信息，即迭代檢查受疾患影響的受試者與未受影響對照受試者之比；計算開始于在最大數(shù)目受試者中觀察到的節(jié)點(diǎn)并向樹的外圍移動至在較少受試者中觀察到的節(jié)點(diǎn)。目的是定位受感興趣疾患影響的受試者與未受影響對照受試者之比有實(shí)質(zhì)性變化的分支點(diǎn)、分支、或節(jié)點(diǎn)。此類分支點(diǎn)代表較高風(fēng)險受試者相對于較低風(fēng)險受試者的進(jìn)化分歧，反之亦然。對生成的系統(tǒng)發(fā)生樹的統(tǒng)計分析可以依照本領(lǐng)域已知方法來實(shí)施。一種本領(lǐng)域公認(rèn)的方法是計算自展置信水平(見Efron et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93， 13429-13434(1996))ο5.患者評估一旦為特定遺傳基因座生成系統(tǒng)發(fā)生樹，就可以評估受試者個體，即將他們的DNA 序列與構(gòu)成系統(tǒng)發(fā)生樹的序列比較。存在與代表具有更高感興趣疾患發(fā)病率的受試者(即受疾病或病癥影響的受試者與未受影響的對照受試者之比更高)的樹區(qū)域?qū)?yīng)的單元型或序列變體會意味著該受試者個體也具有升高的風(fēng)險。相反，實(shí)質(zhì)更低的比對應(yīng)于感興趣疾患形成的風(fēng)險較低。也可以依照一些實(shí)施方案基于感興趣疾患對感興趣的活性劑治療或治療方法的響應(yīng)性來分析系統(tǒng)發(fā)生樹。6. APOE 和 T0MM40ApoE表型和基因型是本領(lǐng)域公知的。為ApoE建立的命名系統(tǒng)以及其表型和基因型記載于例如Zannis et al.，1982，通過本文中的述及而收錄。T0MM40(線粒體外膜通道亞基，40kDa)表型和基因型也是已知的。T0MM40作為見于線粒體膜中的轉(zhuǎn)位酶的通道形成亞基的發(fā)揮其功能，其對于將蛋白質(zhì)輸入線粒體是必需的。來自阿爾茨海默氏病患者研究的基因組尺度關(guān)聯(lián)掃描數(shù)據(jù)毫無疑義地鑒定出含有載脂蛋白E(ApoE)基因的連鎖不平衡區(qū)域。自1993年的最初出版物(見例如Corder et al.)起，ApoE 4變體作為經(jīng)過證實(shí)的易感性基因已經(jīng)得到廣泛復(fù)制。然而，基因組尺度關(guān)聯(lián)掃描數(shù)據(jù)導(dǎo)致在細(xì)胞生物學(xué)研究中觀察到引人注目的“巧合”，涉及ApoE和T0MM40共定位至線粒體外膜。在1998年對ApoE周圍的連鎖不平衡建模的研究期間首次遭遇這種其它基因，T0MM40。多態(tài)性定位于ApoE鄰近的連鎖不平衡小區(qū)域內(nèi)。ApoE共定位至線粒體外膜，提示同等型特異性相互作用導(dǎo)致ApoE誘導(dǎo)的線粒體凋亡作為阿爾茨海默氏病表達(dá)中早期步驟的潛在作用。生物學(xué)數(shù)據(jù)已經(jīng)證明神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中活動線粒體的比例以及它們移動的速度及它們穿過的距離是影響線粒體凋亡升高的因素。系統(tǒng)發(fā)生數(shù)據(jù)提示T0MM40對阿爾茨海默氏病形成的獨(dú)立遺傳效應(yīng)。ApoE特異性結(jié)合人類神經(jīng)元培養(yǎng)物中的線粒體(Chang，2005)，而且對數(shù)以百計的阿爾茨海默氏病患者和匹配對照中這個連鎖不平衡區(qū)域的測序，與T0MM40遺傳變體進(jìn)化的作圖組合，為ApoE-T0MM40相互作用限定了一個特別感興趣的區(qū)域，如圖3所示。這些進(jìn)化數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持ApoE與T0MM40之間的遺傳關(guān)聯(lián)，而且提示線粒體功能障礙可能導(dǎo)致多年里緩慢發(fā)生的神經(jīng)元死亡。阿爾茨海默氏病的發(fā)作年齡分布(見例如美國專利 6，027，896，Roses etal.)可能反映兩種生物化學(xué)相互作用蛋白質(zhì)導(dǎo)致疾病臨床表達(dá)的緊密連鎖變體的繼承。如本文中詳述的，T0MM40變體的多種單元型與ApoE等位基因之間的相互作用促成阿爾茨海默氏病發(fā)病機(jī)制；特別地，與ApoE的E 3等位基因連鎖的T0MM40單元型促成疾病發(fā)病機(jī)制。數(shù)種T0MM40基因變體僅與ApoE 3順式連鎖地進(jìn)化。(類似地，特定T0MM40 變體可能與ApoE 4或ApoE 2順式連鎖地進(jìn)化。)如此，T0MM40變體添加的任何遺傳效應(yīng)與ApoE 4獨(dú)立地分離，但是兩種變異蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以在功能上反式相互作用，以生成給定的可見的表型或性狀。如此，T0MM40變體添加的任何遺傳效應(yīng)與ApoE 4獨(dú)立地分離。鄰近相互作用基因的這種“巧合”可解釋在所有阿爾茨海默氏病基因組尺度關(guān)聯(lián)掃描研究中找到的特別顯著的統(tǒng)計關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)。有趣的是注意到最初的商品化基因組尺度關(guān)聯(lián)掃描平臺不含有任何ApoE多態(tài)性，但是用T0MM40和ApoCl SNP標(biāo)示-但是該區(qū)域事實(shí)上始終稱作 "ApoE 區(qū)”。還可以在藥物遺傳學(xué)背景內(nèi)審視組合了疾病遺傳與發(fā)病機(jī)制的推定分子機(jī)制的這些數(shù)據(jù)。由于繼承ApoE 4等位基因的強(qiáng)遺傳效應(yīng)，ApoE 4被稱作復(fù)雜易感性基因已經(jīng)超過十年。發(fā)作年齡分布作為ApoE基因型的函數(shù)的一致再現(xiàn)證實(shí)了 ApoE 3繼承的作用不完全是良性的，而是在較低疾病發(fā)作率觀察到的較低風(fēng)險因子。有T0MM40遺傳變體只定位在連鎖不平衡區(qū)域中含有ApoE 3的DNA鏈上(Roses et al.，未發(fā)表的數(shù)據(jù))，且因此沒有處于基因組尺度關(guān)聯(lián)組中的SNP所要求的Hardy-Weinberg平衡。T0MM40序列中只與ApoE 3順式連鎖的進(jìn)化變化起提高與ApoE 3有關(guān)的阿爾茨海默氏病風(fēng)險的作用，而與ApoE 3順式連鎖的其它T0MM40變體降低與ApoE 3有關(guān)的風(fēng)險。一種獨(dú)立遺傳測試會是確定那些與較少阿爾茨海默氏病有關(guān)的T0MM40多態(tài)性是否在含有ApoE 3的基因型[ApoE 3/3或ApoE 4/3]的發(fā)作年齡分布圖中在較大的年齡隔離。檢測受試者中ApoE 2、3或4和/或T0MM40單元型或編碼它們的DNA(在一些實(shí)施方案中，包括每一項(xiàng)的等位基因數(shù)目)的存在或缺失可以通過任何合適手段直接或間接進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道多種技術(shù)。一般都涉及自受試者收集含有DNA或蛋白質(zhì)的生物學(xué)材料的樣品，并然后檢測受試者是否具有感興趣單元型的步驟。例如，關(guān)于ApoE的檢測步驟可如下進(jìn)行，即自受試者(例如自腦脊液或含有ApoE的任何其它流體或組織)收集ApoE 樣品，并然后確定ApoE樣品中ApoE 2、3、或4同等型的存在或缺失(例如通過等電聚焦或免疫測定法)。確定編碼ApoE和/或T0MM40同等型的DNA的存在或缺失可以通過用經(jīng)合適可檢測基團(tuán)標(biāo)記的寡核苷酸探針對感興趣基因組DNA區(qū)域直接測序來進(jìn)行，和/或通過擴(kuò)增反應(yīng)的手段來進(jìn)行，諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(然后可以用經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸探針或多種其它技術(shù)來檢測該擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物)。另外，檢測步驟可以包括檢測受試者對于編碼ApoE和/或T0MM40單元型的基因是雜合還是純合的步驟。知道可用來進(jìn)行本發(fā)明的多種不同寡核苷酸探針測定形式。見例如美國專利No. 4，302，204，Wahl et al.；美國專利 No. 4，358，535，F(xiàn)alkow et al.；美國專利 No. 4，563，419，Ranki et al.；及美國專利 No. 4，994，373，Stavrianopoulos et al.(申請人明確意圖通過述及將本文中引用的所有美國專利參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容收入本文)。在一些實(shí)施方案中，檢測可以包括多重DNA擴(kuò)增(例如等位基因特異性熒光PCR)。 在一些實(shí)施方案中，檢測可以包括與微陣列(芯片、珠等)雜交。在一些實(shí)施方案中，檢測可以包括對含有試圖檢測的單元型的基因的適宜部分測序。在一些實(shí)施方案中，改變對一種或多種內(nèi)切核酸酶限制酶消化的易感性的單元型可用于檢測。例如，可使用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，其指在將各種限制酶施于DNA時的消化樣式。在一些實(shí)施方案中，一種或多種單元型的存在可通過等位基因特異性擴(kuò)增來確定。在一些實(shí)施方案中，單元型的存在可通過引物延伸來確定。在一些實(shí)施方案中，單元型的存在可通過寡核苷酸連接來確定。在一些實(shí)施方案中，單元型的存在可通過與可檢測標(biāo)記的探針的雜交來確定。見例如美國專利申請公開號 2008/0153088，Sun etal. ；Kobler et al.，Identification of an IlT allele in the polypyrimidine tract ofintron 8of the CFTR gene, Genetics in Medicine 8(2) :125-8(2006) ；Costa et al., Multiplex Allele-Specific Fluorescent PCR for Haplotyping the IVS8 (TG)m (T)nLocus in the CFTR Gene, Clin. Chem. ,54 1564-1567 (2008) ； Johnson et al. , AComparative Study of Five Technologically Diverse CFTR Testing Platforms, J. Mol. Diagnostics,9 (3) (2007) ；Pratt et al., Development of Genomic ReferenceMaterials for Cystic Fibrosis Genetic Testing, J. Mol. Diagnostics, 11 :186-193(2009)。可以通過任何合適手段對自生物學(xué)樣品分離的DNA進(jìn)行選定核酸序列或靶核酸序列的擴(kuò)增。一般見D. Kwoh and Τ. Kwoh, 19900合適擴(kuò)增技術(shù)的例子包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換擴(kuò)增(一般見Walker et al. , 1992a ；Walker et al., 1992b)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增(見Kwoh et al.，1989)、自主序列復(fù)制(“3SR”)(見Guatelli et al. ,1990),Q β復(fù)制酶系統(tǒng)(見Lizardi et al.，1988)、基于核酸序列的擴(kuò)增(“NASBA”) (見 Lewis, 1992)、修復(fù)鏈反應(yīng)(impair chain reaction, “RCR” )(見 Lewis,見上)、及飛反 DNA 擴(kuò)增(boomerang DNA amplification, “BDA”)(see Lewis, supra)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是當(dāng)前優(yōu)選的。
諸如前述的DNA擴(kuò)增技術(shù)可涉及使用一種探針、一對探針、或兩對探針，這些探針特異性結(jié)合編碼ApoE 4的DNA，但是在相同雜交條件下不結(jié)合編碼ApoE 2或ApoE 3的 DNA，而且充當(dāng)用于在擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增ApoE 4DNA或其部分的引物。同樣地，可以使用一種探針、一對探針、或兩對探針，這些探針特異性結(jié)合編碼ApoE 2的DNA，但是在相同雜交條件下不結(jié)合編碼ApoE3或ApoE 4的DNA，而且充當(dāng)用于在擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增ApoE 2DNA或其部分的引物；而且可以使用一種探針、一對探針、或兩對探針，這些探針特異性結(jié)合編碼 ApoE 3的DNA，但是在相同雜交條件下不結(jié)合編碼ApoE 2或ApoE 4的DNA，而且充當(dāng)用于在擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增ApoE 3DNA或其部分的引物。類似地，可以使用一種探針、一對探針、或兩對探針，這些探針特異性結(jié)合編碼感興趣的T0MM40單元型的DNA，但是在相同雜交條件下不結(jié)合其它T0MM40單元型，而且充當(dāng)用于在擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增T0MM40DNA或其部分的引物。一般地，用于檢測編碼ApoE和/或T0MM40單元型的DNA的寡核苷酸探針是結(jié)合編碼感興趣的單元型的DNA，但是在相同雜交條件下不結(jié)合編碼其它單元型的DNA的寡核苷酸探針。用合適的可檢測基團(tuán)標(biāo)記寡核苷酸探針，諸如下文關(guān)于抗體列出的那些?？梢砸勒找阎夹g(shù)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。見例如美國專利No. 4，683，195 ； 4，683，202 ；4, 800，159 ；和4，965，188。一般地，PCR涉及首先在雜交條件下用針對要檢測的特定序列的每一條鏈的一種寡核苷酸引物處理核酸樣品(例如在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶存在下)，從而合成每種引物的延伸產(chǎn)物，其與每一條核酸鏈互補(bǔ)，其中引物與其要雜交的特定序列的每一條鏈足夠互補(bǔ)，使得當(dāng)與其互補(bǔ)物分開時，自每種引物合成的延伸產(chǎn)物能充當(dāng)模板來合成其它引物的延伸產(chǎn)物，并然后在變性條件下處理樣品以將引物延伸產(chǎn)物與其模板分開，如果要檢測的序列存在的話。循環(huán)重復(fù)這些步驟，直至獲得期望程度的擴(kuò)增。擴(kuò)增序列的檢測可以如下進(jìn)行，向反應(yīng)產(chǎn)物添加能夠與反應(yīng)產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針(例如本發(fā)明的寡核苷酸探針)，該探針攜帶可檢測標(biāo)記物，并然后依照已知技術(shù)或通過直接在凝膠上顯現(xiàn)來檢測標(biāo)記物。當(dāng)PCR條件容許擴(kuò)增所有ApoE等位基因類型時，可以通過與等位基因特異性探針的雜交、通過限制性內(nèi)切核酸酶消化、通過變性梯度凝膠上的電泳、或其它技術(shù)來區(qū)分各類型。用于確定ApoE基因型的一種PCR方案記載于Wfenham et al. (1991)，通過本文中的述及而收錄。其中記載了有效擴(kuò)增及鑒定ApoE同等型的引物的例子?？梢圆捎脤poE多態(tài)性區(qū)域具(無論Ap0E4、E3或E 特異性的引物。在Wfenham中，例如，采用擴(kuò)增跨越ApoE 多態(tài)性位點(diǎn)(密碼子112和158，其含有核苷酸3745和3883)的227bp DNA區(qū)域的PCR引物。然后使擴(kuò)增的片段接受限制性內(nèi)切核酸酶CfoI作用，其自六種可能的ApoE基因型提供不同限制性片段，可以在電泳凝膠上識別。別的方法還可見Hixon et al. (1990) ；Houlston et al. (1989) ；Wenham et al. (1991)；及Konrulaet al. (1990)，這些均通過本文中的述及而收錄。在阿爾茨海默氏病之外，有數(shù)種其它遺傳上復(fù)雜的疾病和病癥，對于它們，本發(fā)明的方法提供勝過現(xiàn)有分析的優(yōu)點(diǎn)。例如，來自多項(xiàng)2型糖尿病遺傳研究的數(shù)據(jù)支持為通過基因組尺度關(guān)聯(lián)研究來限定基因座提供統(tǒng)計顯著性會需要很多臨床病例/對照系列的觀
點(diǎn)ο7.活性劑、組合物和治療
如上所述，也可基于感興趣疾患對依照一些實(shí)施方案的感興趣活性劑治療或治療方法的響應(yīng)性來分析使用本文中詳述的方法創(chuàng)建的系統(tǒng)發(fā)生樹，而且為受試者或患者做出的治療決策可以基于所鑒定的特定遺傳變體?；钚詣??；钚詣┌ㄒ阎糜谥委煾信d趣疾患的那些，而且包括抗阿爾茨海默氏病活性劑，包括但不限于乙酰膽堿酯酶抑制劑、NMDA受體拮抗劑、和過氧化物酶體增殖子活化的受體(PPAR)激動劑或調(diào)控劑，包括但不限于噻唑烷二酮或glitazar類中的那些藥物。 活性劑還可以是生物藥學(xué)產(chǎn)品，例如抗體(例如單克隆抗體、多克隆抗體、抗體衍生物或經(jīng)修飾抗體諸如DomainAntibodiesTM、Bapineuzumab、等)、融合蛋白或治療性RNA分子?；钚詣┻€可以是任何這些產(chǎn)品的組合。乙酰膽堿酯酶抑制劑的例子包括但不限于多奈哌齊(donepezil)(可作為 ARICEPT購買)、加蘭他敏(galantamine)(可作為RAZADYNE購買)、和利凡斯的明 (rivastigmine)(可作為EXELON購買)及其藥學(xué)可接受鹽。別的例子包括但不限于美國專利 No. 6，303,633 ；5, 965, 569 ；5，595,883 ；5，574，046 ；和 5，171，750 中記載的那些(通過本文中的述及完整收錄本文中引用的所有美國專利參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容)。NMDA受體拮抗劑的例子包括但不限于美金剛(memantine)(可作為AKATIN0L、 AXURA, EBIXIA/ABIXIA、MEMOX和NAMENDA購買)及其藥學(xué)可接受鹽。別的例子包括但不限于美國專利 No. 6，956，055 ；6，828，462 ；6，642，267 ；6，432，985 ；和 5，990126 中記載的那些。噻唑烷二酮的例子包括但不限于羅格列酮(rosiglitazone)(可作為AVANDIA購買)及其藥學(xué)可接受鹽。別的例子包括但不限于5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-苯并噻唑基) 氨基)乙氧基]芐基)_2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-苯并噻唑基)氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4_噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-苯并P惡唑基)氨基)乙氧基]芐基)-2，4_噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-苯并P惡唑基)氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-嘧啶基)氨基)乙氧基]芐基)_2， 4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-嘧啶基)氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4_噻唑烷二酮；5-(442-(N-甲基-N-[2-(4，5-二甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]芐基)_2，
4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4，5-二甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-噻唑基)氨基)乙氧基]芐基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-噻唑基)氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-[4-(N-甲基-N-(4-苯基噻唑基))氨基)乙氧基)芐基]_2，4-噻唑烷二酮；
5-(4-[2-(N-甲基-N-(4-苯基噻唑基))氨基)乙氧基]苯亞甲基)_2，4-噻唑烷二酮； 5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-苯基-5-甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]芐基)_2，4_噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-苯基-5-甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2， 4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-甲基-5-苯基噻唑基)]氨基)乙氧基]芐基)-2，4_噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-甲基-5-苯基噻唑基)]氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]芐基)_2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-甲基噻唑基)]氨基)乙氧基] 苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-[4-(N-甲基-N-[2-(5-苯基P惡唑基)]氨基)乙氧基) 芐基]-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(5-苯基P惡唑基)]氨基)乙氧基]苯
27亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4，5-二甲基P惡唑基)]氨基)乙氧基]芐基)_2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4，5-二甲基P惡唑基)]氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-[4-(2-嘧啶基氨基)乙氧基)芐基]-2，4-噻唑烷二酮；5-[4-(2-嘧啶基氨基)乙氧基)苯亞甲基]-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-乙?；?N-(2-嘧啶基)氨基)乙氧基]芐基)_2，4-噻唑烷二酮；5-(4-(N-(2-苯并噻唑基)-N-芐基氨基)乙氧基)苯亞甲基)-2，4_噻唑烷二酮；5-(442-(N-(2-苯并噻唑基)-N-芐基氨基)乙氧基)芐基)_2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[3-(N-甲基-N-(2-苯并P惡唑基)氨基)丙氧基]芐基)_2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[3-(N-甲基-N-(2-苯并P惡唑基)氨基)丙氧基]苯亞甲基)-2，4_噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-吡啶基)氨基)乙氧基]芐基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-吡啶基)氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-W-(N-甲基-N-(2-苯并P惡唑基)氨基)丁氧基]苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-W-(N-甲基-N-(2-苯并P惡唑基)氨基)丁氧基]芐基)_2，
4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-(2-苯并P惡唑基)氨基)乙氧基]苯亞甲基)2，4-噻唑烷二酮；
5-(4-[2-(N-(2-苯并P惡唑基)氨基)乙氧基]芐基)_2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-異丙基-N-(2-苯并P惡唑基)氨基)乙氧基]芐基)_2，4-噻唑烷二酮，及其藥學(xué)可接受鹽。見例如美國專利No. 5，002953o如上所述，可以以其藥學(xué)可接受鹽的形式來制備本文中公開的活性劑。藥學(xué)可接受鹽指保持親本化合物的期望生物學(xué)活性且不產(chǎn)生不想要的毒理學(xué)效果的鹽。此類鹽的例子有(a)與無機(jī)酸形成的酸加成鹽，無機(jī)酸例如氫氯酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等；和與有機(jī)酸形成的鹽，有機(jī)酸諸如例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、 檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、棕櫚酸、海藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸、等等；(b)自元素陰離子形成的鹽，元素諸如氯、溴、 和碘；及(c)自堿衍生的鹽，諸如銨鹽、堿金屬鹽諸如鈉和鉀鹽、堿土金屬鹽諸如鈣和鎂鹽、 及與有機(jī)堿的鹽，有機(jī)堿諸如二環(huán)己胺和N-甲基-D-葡萄糖胺?？梢宰鳛榍八巵硎┯没钚詣Ｈ绫疚闹惺褂玫?，“前藥”指本發(fā)明化合物的如下前藥，其在合理醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)，適合于接觸人類和較人低等的動物的組織使用而沒有不當(dāng)?shù)亩拘?、刺激、過敏反應(yīng)等等，與合理的風(fēng)險/利益比相稱，且有效實(shí)現(xiàn)它們的預(yù)定用途，以及在可能的情況中本發(fā)明化合物的兩性形式。術(shù)語“前藥”指如下的化合物，其在體內(nèi)，例如通過血液中的水解迅速轉(zhuǎn)化以生成上式的親本化合物。詳盡的討論見 T. Higuchi and V. Stella, Prodrugs as Novel delivery Systems, Vol.14, the A.C.S.SymposiumSeries 及 Edward B. Roche, ed. , Bioreversible Carriers in Drug Design, AmericanPharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987,Μ ^^φ 的述及收錄二者。還可見美國專利No. 6，680，299。例子包括如下的前藥，其在體內(nèi)被受試者代謝成具有本文中描述的活性化合物的活性的活性藥物，其中所述前藥是醇或羧酸基團(tuán)的酯，如果化合物中存在此類基團(tuán)的話；醇基團(tuán)的縮醛或縮酮，如果化合物中存在此類基團(tuán)的話；胺基團(tuán)的N-Marmich堿或亞胺，如果化合物中存在此類基團(tuán)的話；或羧基的khiff 堿、肟、乙縮醛、烯醇酯、U惡唑烷或噻唑燒，如果化合物中存在此類基團(tuán)的話，諸如美國專利 No. 6，680，324和美國專利No. 6，680，322中記載的。組合物。為了施用，可以依照已知技術(shù)在藥學(xué)載體中配制上文所述活性劑。見例如 Remington，The Science And Practice of Pharmacy (9th EcL 1995)。在依照本發(fā)明的藥物配制劑的制造中，通常將活性化合物(包括其藥學(xué)可接受鹽)與可接受載體等混合。 當(dāng)然，載體必須是就與配制劑中的任何其它組分相容而言可接受的，而且不能是對患者有害的。載體可以是固體或液體或二者兼有，而且優(yōu)選與化合物一起配制成單位劑量配制劑， 例如片劑，其可以含有0.01或0.5%至95%或99% (以重量計)的活性化合物?？梢栽诒景l(fā)明的配制劑中摻入一種或多種活性化合物，配制劑可以通過藥學(xué)的任何公知技術(shù)來制備，包括將各成分(任選包括一種或多種助劑)混合。本發(fā)明的配制劑包括那些適合于口服、直腸、表面、口腔(例如舌下)、陰道、胃腸外(例如皮下、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、或靜脈內(nèi))、表面(即皮膚和粘膜表面，包括氣道表面)和經(jīng)皮施用，盡管任何給定情況中最合適的路徑會取決于所治療疾患的性質(zhì)和嚴(yán)重性及所使用特定活性化合物的性質(zhì)。適合于口服施用的配制劑可以呈現(xiàn)為分立的單元，諸如膠囊劑、扁囊劑、錠劑、或片劑，每個含有預(yù)定量的活性化合物；為粉劑或顆粒劑；為水或非水液體中的溶液或懸浮液；或?yàn)樗突蛴桶閯?。此類配制劑可以通過藥劑學(xué)的任何合適方法來制備，其包括使得活性化合物與合適載體(其可以含有一種或多種上文所述助劑)相關(guān)聯(lián)的步驟。一般地，如下制備本發(fā)明的配制劑，即將活性化合物與液體或粉碎的(finely divided)固體載體或二者兼有均勻且密切混合，并然后在必要時對所得混合物定型。例如，可以通過對含有活性化合物及任選的一種或多種助劑的粉末或顆粒壓制或鑄模來制備片劑?？梢酝ㄟ^在合適的機(jī)器中對自由流動形式的化合物(諸如粉末或顆粒，任選與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑和/或表面活性/分散劑混合)壓制來制備壓制片劑。可以通過在合適的機(jī)器中對用惰性液體粘合劑潤濕的粉化化合物鑄模來制備模制片劑適合于口腔(舌下)施用的配制劑包括在有香味的基材(通常是蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪樹膠)中包含活性化合物的錠劑；和在惰性基材諸如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠中包含化合物的軟錠劑。適合于胃腸外施用的本發(fā)明配制劑包括活性化合物的無菌的水和非水注射溶液， 該制劑優(yōu)選與預(yù)定接受者的血液等張。這些制劑可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得配制劑與預(yù)定接受者的血液等張的溶質(zhì)。水和非水無菌懸浮液可以包括懸浮劑和增稠劑。 配制劑可以在單劑或多劑容器中呈現(xiàn)，例如密封的安瓿和管形瓶，而且可以在冷凍-干燥 (凍干)條件中保存，只需要在臨使用前添加無菌液體載體，例如鹽水或注射用水。可以自先前描述種類的無菌粉劑、顆粒劑和片劑制備臨場配制的注射溶液和懸浮液。例如，在本發(fā)明的一個方面，在密封容器中以單位劑量形式提供了包含活性劑或其鹽的可注射的、穩(wěn)定的、無菌的組合物。以凍干物的形式提供化合物或鹽，其能夠用合適的藥學(xué)可接受載體重建以形成適合于注射入受試者的液體組合物。單位劑量形式通常包含約IOmg至約IOg化合物或鹽。當(dāng)化合物或鹽基本上不溶于水時，可以以足夠數(shù)量采用足夠量的生理學(xué)可接受的乳化劑以在水載體中乳化化合物或鹽。一種此類有用乳化劑是磷脂酰膽堿。適合于表面應(yīng)用于皮膚的配制劑優(yōu)選采取軟膏劑、乳膏劑、洗劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油的形式?？墒褂玫妮d體包括石油凝膠、羊毛脂、聚乙二醇、醇、經(jīng)皮強(qiáng)化劑及其兩種或更多種的組合。適合于經(jīng)皮施用的配制劑可以呈現(xiàn)為分立的貼劑，適應(yīng)保持與接受者的表皮密切接觸較長一段時間。適合于經(jīng)皮施用的配制劑也可以通過離子電滲來投遞(見例如 Pharmaceutical Research 3(6) :318 (1986))，而且通常采取活性化合物的任選緩沖的水溶液的形式。合適配制劑包含檸檬酸鹽或bis\tris緩沖液(pH 6)或乙醇/水且含有0. 1 至0. 2M活性組分。在活性劑之外，藥物組合物可以含有其它添加劑，諸如調(diào)節(jié)pH的添加劑。具體而言，有用的PH調(diào)節(jié)劑包括酸(諸如氫氯酸)、堿或緩沖劑(諸如乳酸鈉、乙酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉或葡糖酸鈉)。另外，組合物可以含有微生物防腐劑。有用的微生物防腐劑包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯和苯甲醇。在將配制劑放置在為多劑使用設(shè)計的管形瓶中時，通常采用微生物防腐劑。當(dāng)然，如指出的，可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)將本發(fā)明的藥物組合物凍干。劑量。其使用在本發(fā)明的范圍中的任何特定活性劑的治療有效劑量會隨化合物的不同及患者的不同而有所變化，而且會取決于患者的狀況及投遞的路徑。對于口服施用，可使用1、2或3mg至30、40或50mg的總?cè)談┝?，作為每日單劑給予或分成分成每日兩或三齊IJ。治療。本文中描述的或使用本文中教導(dǎo)的方法發(fā)現(xiàn)的遺傳變體可用于確定受疾患 (例如與ApoE和/或T0MM40有關(guān)的疾患)影響的患者的治療過程，通過例如基于一種或多種遺傳變體的存在或缺失來確定施用哪種活性劑和/或治療過程。遺傳變體的存在或缺失可指示活性劑和/或治療過程對患者的功效，預(yù)測疾患發(fā)作年齡，指示優(yōu)選的劑量方案， 等。可以為患者生成遺傳譜，而且參考該譜來確定該患者是否在有可能對特定活性劑有響應(yīng)的患者組中。關(guān)于使用的用法說明可以與活性劑一起包裝或以其它方式與活性劑關(guān)聯(lián)，指明基于遺傳變體的存在或缺失關(guān)于治療、治療時機(jī)、劑量方案等的推薦。8.確定疾病風(fēng)險預(yù)測或預(yù)后的方法為了依照本發(fā)明的一些實(shí)施方案確定無癥狀個體的疾病風(fēng)險預(yù)測或預(yù)后(根據(jù)疾病的通常過程或病例的特性預(yù)料痛苦或疾病過程的前景)，可以加工診斷數(shù)據(jù)包括患者的診斷或醫(yī)學(xué)史和遺傳數(shù)據(jù)諸如患者的基因型(例如ApoE和/或T0MM40基因型)以提供治療選項(xiàng)和后果預(yù)測。加工可以包括獲得“患者譜”，諸如患者的醫(yī)學(xué)史的集合，包括年齡和性別、感興趣基因座的基因型定型(例如使用適當(dāng)設(shè)計的引物及使用RT-PCR或PCR擴(kuò)增步驟)和/或表型定型(例如使用抗體介導(dǎo)的方法或酶測試)、及將此原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成預(yù)后的統(tǒng)計分析或其它分析。預(yù)后可以包括預(yù)測患者疾病發(fā)作年齡、對藥物療法的響應(yīng)、治療的時機(jī)、治療功效等。在一些實(shí)施方案中，預(yù)后可以包括使用計算機(jī)軟件程序來分析患者數(shù)據(jù)并針對關(guān)系數(shù)據(jù)庫運(yùn)行統(tǒng)計交叉核對以將患者數(shù)據(jù)或譜轉(zhuǎn)換成預(yù)后?！盎颊咦V”包括關(guān)于正在實(shí)施預(yù)測和/或預(yù)后分析的患者的數(shù)據(jù)和/或材料。數(shù)據(jù)可以包括關(guān)于患者的診斷、年齡、性別和/或基因型的信息?；颊咦V還可以包括來自患者的材料，諸如血液、血清蛋白質(zhì)樣品、腦脊液或純化的RNA或DNA。9.臨床試驗(yàn)中的基因型分層在進(jìn)行臨床試驗(yàn)時可以使用本文中教導(dǎo)的或用本文中的方法確定的基因型的檢測，其方式就像使用其它基因型信息來進(jìn)行臨床試驗(yàn)，諸如例如美國專利No. 6，573，049、 6，368，797 和 6，291，175 中記載的。在一些實(shí)施方案中，此類方法有利地將患者群體分層或容許患者群體細(xì)化(例如通過將群體分成一個或多個亞組)，使得能更加準(zhǔn)確地檢測特定治療方案的優(yōu)點(diǎn)，特別是對于具有特定基因型的特定患者亞群。在一些實(shí)施方案中，此類方法包括給多個受試者施用測試活性劑或療法(通常給分開的但相似表征的多個受試者施用對照或安慰劑療法)并在多個受試者中如上所述檢測基因型(例如ApoE和/或T0MM40)的存在或缺失?？梢栽谑┯脺y試療法的步驟之前、之后或同時檢測基因型。然后可以根據(jù)任何合適參數(shù)或潛在治療結(jié)果或后果(包括但不限于所述療法的功效、療法的副作用的缺失等)來確定一種或多種檢測到的等位基因?qū)y試療法的影響。對于診斷有疾病或有疾病形成風(fēng)險的受試者，可以建立臨床試驗(yàn)來測試測試化合物治療任何數(shù)目已經(jīng)確定與特定基因型有關(guān)的疾病的功效。如果在臨床試驗(yàn)完成后對受試者進(jìn)行基因型定型，那么該分析仍可致力于確定對疾病的治療與要評估功效的等位基因之間的相關(guān)性?；蛘?，如果有癥狀的或無癥狀的受試者尚未診斷出疾病但已經(jīng)確定有疾病形成風(fēng)險，那么可以進(jìn)行與上文所述臨床試驗(yàn)相似的臨床試驗(yàn)。在設(shè)計治療組時也可以考慮根本的生物學(xué)機(jī)制。例如，ApoE 4(1-272)片段比 ApoE 3(1-272)更多地結(jié)合線粒體，降低線粒體細(xì)胞動力學(xué)及降低突觸發(fā)生。羅格列酮，一種用于治療阿爾茨海默氏病的藥物候選，提高有絲分裂及提高突觸發(fā)生-對抗ApoE片段結(jié)合的效果-影響ApoE 3的程度比ApoE 4高。因此，可以基于根本的作用機(jī)制來選擇藥物或治療候選(例如羅格列酮)，因?yàn)樗婕坝糜诜謱拥倪z傳標(biāo)志物(例如ApoE 2、E 3、E 4 和/或T0MM40變體)。為試驗(yàn)選擇的藥物的功效評估可以包括監(jiān)測受試者一段時間并分析疾病發(fā)作的延遲和發(fā)作時疾病的強(qiáng)度，以及測量與疾病有關(guān)的癥狀的發(fā)作。在臨床試驗(yàn)中消除或延遲疾病發(fā)作或減輕疾病癥狀的的藥物可能是在診斷有疾病或有疾病形成風(fēng)險的患者中使用的有益藥物。在此類試驗(yàn)中可以使用的測試化合物包括上文所述藥劑，包括先前批準(zhǔn)用于臨床使用的藥劑和尚未批準(zhǔn)使用或未批準(zhǔn)用于治療特定疾病的的新化合物。如此，在一些實(shí)施方案中，臨床試驗(yàn)可以包括優(yōu)化藥物施用，包括劑量、施用的時機(jī)、毒性或副作用、施用的路徑和治療的功效。10.可用于檢測感興趣基因座處的基因型變體的試劑盒本文中提供了用于確定受試者是否處于疾病形成風(fēng)險升高、在較早的發(fā)作年齡形成疾病和/或?yàn)樘囟ㄖ委煹暮蜻x者的試劑盒，其中所述疾病與ApoE和/或T0MM40有關(guān)(例如晚期發(fā)作阿爾茨海默氏病)。試劑盒包括至少一種對于檢測本文所述ApoE和/或T0MM40 變體的存在或缺失具特異性的試劑，而且可以包括有助于確定受試者是否疾病形成風(fēng)險升高的用法說明。試劑盒可以任選包括用于檢測ApoE基因(例如ApoE 2,ApoE 3和/或ApoE 4)的核酸或關(guān)于用于檢測ApoE基因型的等電聚焦方法的用法說明；和/或用于檢測本文所述T0MM40變體的核酸。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可以任選包括一種或多種結(jié)合ApoE 2,ApoE 3,ApoE 4或T0MM40同等型的抗體?？梢砸匀魏魏线m方式來包裝測試試劑盒，通常所有要素與一張關(guān)于進(jìn)行測試的印刷用法說明一起置于一個容器中。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可以任選含有緩沖液、酶和試劑，用于通過引物指導(dǎo)的擴(kuò)增來擴(kuò)增基因組核酸。試劑盒還可以包括一種或多種用于檢測擴(kuò)增核酸中特定單元型的存在或缺失的裝置。此類裝置可以包括一種或多種與單元型核酸雜交的探針，其可以附著至生物芯片或微陣列裝置，諸如美國專利No. 6，355，429中記載的生物芯片或微陣列裝置
31之任一。生物芯片或微陣列裝置任選具有至少一種能與單元型序列雜交的捕捉探針，附著于表面。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物芯片或微陣列含有多種探針，且最優(yōu)選含有針對單元型序列的至少一種探針，若單元型序列存在的話，它會通過一套側(cè)翼引物來擴(kuò)增。例如，如果五對側(cè)翼引物用于擴(kuò)增，那么該裝置會含有針對每一種擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一種單元型探針， 即至少五種探針。試劑盒還優(yōu)選包括關(guān)于使用試劑盒成分的用法說明。在下面的非限制性實(shí)施例中更為詳細(xì)地解釋本發(fā)明。實(shí)施例1 系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建所有已知基因組尺度掃描研究在載脂蛋白Cl[ApoCl]基因座周圍展現(xiàn)極其顯著的 P 值(Mahley et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:5644—51(2006) ；Coon et al.， J. Clin. Psychiatry 68 :613-8(2007) ；Li et al.，Arch. Neurol. 65 :45-53 (2007))。同樣重要的是每個系列鑒定出ApoE連鎖不平衡區(qū)域以外的一個“偏愛”臨界顯著的候選基因， 但是每一項(xiàng)研究中的這些偏愛候選基因是不同的。T0MM40靠近ApoCl，而且與ApoE連鎖不平衡。認(rèn)為ApoE 3或ApoE4與不同T0MM40同等型之間的相互作用與較早年齡范圍內(nèi)阿爾茨海默氏病形成風(fēng)險升高或降低有關(guān)。Apo 4/4、3/4、3/3、2/4、和2/3基因型的發(fā)作年齡曲線顯示于圖2，指示疾病較早形成的一系列風(fēng)險，這取決于ApoE譜。然而，ApoE本身似無法解釋這些發(fā)作年齡曲線中的所有數(shù)據(jù)。已經(jīng)提出了用于與不同ApoE等位基因有關(guān)的阿爾茨海默氏病風(fēng)險的多態(tài)性制譜的各種方法(見例如Cox等人的美國申請No. 20060228728 ；Li和Grupe的美國申請 No. 20080051318)。本文中展現(xiàn)了用于解決ApoE 4之謎的一種系統(tǒng)發(fā)生辦法。生物學(xué)樣品、DNA分離、感興趣基因座擴(kuò)增。總共340名受試者包括A組中的135 個阿爾茨海默氏病病例和99個年齡匹配對照以及B組中的57個病例和49個對照。所有受試者攜帶先前與較高風(fēng)險的較早疾病發(fā)作關(guān)聯(lián)起來的ApoE基因型(即3/3、3/4、或4/4)。 自所有受試者收集含有DNA的生物學(xué)樣品。然后依照常規(guī)方法分離基因組DNA，用于對染色體19上的遺傳基因座測序。圖3顯示染色體19上使用來自多份報告的基因組尺度掃描數(shù)據(jù)的研究所靶向的遺傳區(qū)域。該區(qū)域涵蓋在GenBank參照序列AF0501M內(nèi)。使用軟件來為變異基因座生成多重序列比對(例如 ClustalW2，European Bioinformaticshstitute)。隨后，使用用于形成系統(tǒng)發(fā)生樹的軟件來分析多重序列比對(例如MEGA version 2. 1，Center for Evolutionary Functional Genomics, TREEV0LVE, Department of Zoology, University of Oxford，或基于簡約性的構(gòu)建軟件，諸如PAUP，Sinauer Associates)?？梢杂美邕z傳數(shù)據(jù)分析(GDA 用于分析分立遺傳數(shù)據(jù)的軟件，北卡羅來納州州立大學(xué)的生物信息研究中心)來實(shí)施統(tǒng)計分析。B區(qū)分析的結(jié)果展現(xiàn)于圖4的系統(tǒng)發(fā)生樹中。圖4中的每個數(shù)據(jù)代表一個觀察到的序列變體。這些變體可以是核苷酸替代、插入、刪除或微衛(wèi)星，而且可以導(dǎo)致或不導(dǎo)致基因表達(dá)或蛋白質(zhì)功能的可檢測差異。每個節(jié)點(diǎn)代表在超過一條染色體上發(fā)生的一種變體(或一些變體)。鄰近節(jié)點(diǎn)限定順式的，且因此更有可能作為受試者的染色體上感興趣區(qū)域中的一個單元繼承的序列的邊界。在最大數(shù)目的后續(xù)節(jié)點(diǎn)之前的節(jié)點(diǎn)代表隨時間發(fā)生遺傳分歧的進(jìn)化祖先變體。存在對應(yīng)于代表具有實(shí)質(zhì)性更高阿爾茨海默氏病發(fā)病率的受試者(即受疾病影響的受試者與未受影響的對照受試者的比更高)的樹區(qū)域單元型或序列變體會意味著該受試者個體也處于升高的風(fēng)險。相反，實(shí)質(zhì)性更低的比對應(yīng)于阿爾茨海默氏病形成風(fēng)險降低。在線粒體蛋白質(zhì)輸入的調(diào)節(jié)中，T0MM40與ApoE直接相互作用，而且當(dāng)前的一種假說是特定T0MM40變體的表達(dá)加劇與ApoE 3等位基因的劑量依賴性存在有關(guān)的相對中等的阿爾茨海默氏病風(fēng)險。使用本發(fā)明的方法在B區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)此類T0MM40變體。對人類受試者測試新藥物具有極大的風(fēng)險(見Kenter and Cohen, Lancet, 368 1387-91 (2006))0使用系統(tǒng)發(fā)生樹來預(yù)料個體對感興趣藥物或治療的響應(yīng)有可能顯著降低該風(fēng)險。預(yù)備研究指示羅格列酮(Avandia)在阿爾茨海默氏病的治療中可能具有遺傳譜特異性功效(見Risner et al. ,ThePharmacogenomics Journal 6,246-254(2006) ；Brodbeck et al.，Proc. Nat. Acad. Sci. 105，1343-6 (2008)) II 期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)指示沒有 ApoE 4 等位基因的阿爾茨海默氏病患者比攜帶1個或2個ApoE 4等位基因的患者更好地響應(yīng)羅格列酮(未顯示的數(shù)據(jù))。這支持用本文中教導(dǎo)的方法鑒定出的變體可用于基于基因型來預(yù)料個體對治療的響應(yīng)的假說。實(shí)施例2 感興趣T0MM40變體的鑒定使用CLUSTAL X程序(version 2. 0. 10, Larkin et al.，Clustal W and ClustalX version 2. 0. Bioinformatics, 23 :2947-2948 (2007))比對 174 條序列(87 名受試者每人 2 條)。使用歐洲生物信息研究所(EBI)網(wǎng)站上執(zhí)行的近鄰連接算法((Saitou and Nei,The neighbor-joining method :a new method for reconstructingphylogenetic trees. Mol. Evol.Biol.，4 :406-425(1987)),使用多重序列比對來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。所得系統(tǒng)發(fā)生樹具有在第一分歧處有兩個大組(A、B)的結(jié)構(gòu)。將這些組的ApoE 基因型頻率制表并顯示于圖5。顯然B組含有主要為ε 3/ε 3和ε 3/ε 4ΑροΕ基因型的受試者單元型，而且?guī)缀鯖]有ε 4/ ε 4的受試者單元型。A組含有幾乎所有是ε 4/ ε 4基因型的受試者單元型。使用通過SNP發(fā)現(xiàn)平臺(Polymorphic)生成的多態(tài)性表來鑒定將數(shù)據(jù)隔離成兩個組的特定T0MM40基因變體。使用似然比檢驗(yàn)來鑒定ρ值小于0. 005的重要變體。變體表匯總于表1。在該表中，在次要等位基因是核苷酸刪除時使用術(shù)語“刪除”， 而在次要等位基因是核苷酸添加時使用術(shù)語“插入”。在有超過兩種可能形式且次要等位基因不明顯時使用術(shù)語“刪除/插入多態(tài)性”。例如，對于poly-T多態(tài)性，觀察到多種長度多態(tài)性。該表的第二欄提供關(guān)于與將序列分成兩個組的變體有關(guān)的特定等位基因的身份的信息。例如，T > A指示T等位基因?qū)⑿蛄蟹蛛x入系統(tǒng)發(fā)生樹上的“A”組。在列出兩種等位基因時，例如G > B ;A > A，每一種等位基因獨(dú)特地將序列數(shù)據(jù)分離入兩個組，而在列出一種等位基因時，它與數(shù)據(jù)的優(yōu)勢分離有關(guān)，而剩余等位基因沒有獨(dú)特地將數(shù)據(jù)分離成同質(zhì)組， 而是兩個組的混合。表1 與系統(tǒng)發(fā)生樹上通過ApoE基因型來分區(qū)的組有關(guān)的T0MM40變體
3權(quán)利要求
1.一種用于鑒定與感興趣疾患形成有關(guān)的遺傳變體的方法，包括(a)根據(jù)含有DNA的生物學(xué)樣品測定由多名人類受試者個體在感興趣遺傳基因座處攜帶的核苷酸序列，其中所述受試者包括(i)受感興趣疾患影響的受試者和(ii)未受感興趣疾患影響的受試者二者；(b)實(shí)施多重序列比對分析以自在所述多名受試者中觀察到的核苷酸序列鑒定所述遺傳基因座處的遺傳變體；(c)將所述遺傳變體繪圖以構(gòu)建所述受試者的系統(tǒng)發(fā)生樹，所述樹包含鑒定同一順反子上所述受試者間變體變化的分支；(d)檢查所述樹中作為分支呈現(xiàn)的遺傳變體并確定受影響的與未受影響的受試者之比以鑒定那些導(dǎo)致受影響與未受影響受試者之比變化的變化；和然后(e)鑒定受影響與未受影響受試者之比與所述樹上一種或多種鄰近變體相差至少5% 的遺傳變體以由此鑒定與所述感興趣疾患形成有關(guān)的遺傳變體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所有受試者攜帶所述感興趣疾患的相同已知多態(tài)性。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述已知多態(tài)性是載脂蛋白E等位基因。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述感興趣遺傳基因座與所述已知多態(tài)性連鎖不平衡。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述感興趣遺傳基因座與所述已知多態(tài)性在同一染色體上且相距小于10、20、30、40或50千堿基。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述遺傳基因座是T0MM40。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述感興趣疾患與升高或降低的線粒體功能障礙有關(guān)。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述感興趣疾患是神經(jīng)變性疾病、代謝疾病、心血管疾病、精神病癥或癌癥。
9.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述感興趣疾患是冠狀動脈疾病。
10.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述感興趣疾患是II型糖尿病。
11.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述感興趣疾患是帕金森氏病。
12.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述感興趣疾患是阿爾茨海默氏病。
13.一種用于確定感興趣疾患形成風(fēng)險升高的方法，包括(a)根據(jù)含有DNA的生物學(xué)樣品確定由受試者個體攜帶的通過權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法鑒定的遺傳變體；和然后(b)當(dāng)所述遺傳變體存在時確定所述受試者形成所述感興趣疾患形成的風(fēng)險升高。
14.一種用于確定受試者中阿爾茨海默氏病形成風(fēng)險升高的方法，包括(a)自取自所述受試者的含有DNA的生物學(xué)樣品檢測與阿爾茨海默氏病風(fēng)險升高或降低有關(guān)的T0MM40基因遺傳變體的存在或缺失，其中所述變體是T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的刪除/插入多態(tài)性；和(b)當(dāng)所述遺傳變體存在或缺失時確定所述受試者形成阿爾茨海默氏病風(fēng)險的升高或降低。
15.權(quán)利要求14的方法，進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
16.權(quán)利要求14的方法，進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是ApoE3/E3或E3/E4受試者ο
17.權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括下述步驟(c)當(dāng)所述受試者被確定為形成阿爾茨海默氏病的風(fēng)險升高時以治療有效量給所述受試者施用抗阿爾茨海默氏病活性劑。
18.權(quán)利要求17的方法，其中當(dāng)與所述遺傳變體不存在或不缺失的受試者相比通過所述遺傳變體的存在或缺失所述受試者被確定為風(fēng)險升高時在較小的年齡在所述受試者中進(jìn)行所述施用步驟。
19.權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的方法，其中所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑，NMDA受體拮抗劑，過氧化物酶體增殖子活化的受體激動劑或調(diào)控劑，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子，及其組合。
20.權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的方法，其中所述活性劑是羅格列酮或其藥學(xué)可接受 ο
21.權(quán)利要求14-20任一項(xiàng)的方法，其中所述T0MM40遺傳變體是NCBIBuild36. 3基因組位置50，094, 889處的poly-T插入變體。
22.一種通過以治療有效量給受試者施用抗阿爾茨海默氏病活性劑來治療受試者阿爾茨海默氏病的方法；改良包括當(dāng)與不攜帶與阿爾茨海默氏病風(fēng)險升高有關(guān)的T0MM40基因遺傳變體的相應(yīng)受試者相比所述受試者攜帶所述遺傳變體時在較小的年齡給所述受試者施用所述活性劑，其中所述T0MM40遺傳變體是T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的刪除/插入多態(tài)性 (DIP)。
23.權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/E3、E2/E4、 E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
24.權(quán)利要求23的方法，進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是ApoE3/E3或E3/E4受試者ο
25.權(quán)利要求22-M任一項(xiàng)的方法，其中所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑， NMDA受體拮抗劑，過氧化物酶體增殖子活化的受體激動劑或調(diào)控劑，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子，及其組合。
26.權(quán)利要求22-M任一項(xiàng)的方法，其中所述活性劑是羅格列酮或其藥學(xué)可接受鹽。
27.權(quán)利要求2216任一項(xiàng)的方法，其中所述T0MM40基因遺傳變體是選自下組的變體 rsl0524523, rsl0602329 和 DIP3。
28.權(quán)利要求2216任一項(xiàng)的方法，其中所述DIP是插入多態(tài)性。
29.權(quán)利要求2246任一項(xiàng)的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態(tài)性。
30.權(quán)利要求22- 任一項(xiàng)的方法，其中所述T0MM40基因遺傳變體是rsl0524523。
31.權(quán)利要求2246任一項(xiàng)的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態(tài)性，具有為至少27個連續(xù)堿基對的poly-T。
32.權(quán)利要求2246任一項(xiàng)的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態(tài)性，具有為 rsl0524523處的至少27個連續(xù)堿基對的poly-T。
33.一種為有所需要的患者治療感興趣疾患的方法，其中所述感興趣疾患與ApoE和/ 或T0MM40有關(guān)，所述方法包括(a)確定由受試者個體攜帶的通過權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法鑒定的遺傳變體的存在或缺失以生成所述患者的遺傳圖譜；和然后，若所述圖譜指示所述患者會對活性劑有響應(yīng)，則(b)以治療有效量給所述受試者施用所述活性劑以治療所述感興趣疾患。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑，NMDA受體拮抗劑，過氧化物酶體增殖子活化的受體激動劑或調(diào)控劑，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子， 及其組合。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述活性劑是羅格列酮或其藥學(xué)可接受鹽。
36.權(quán)利要求33-35任一項(xiàng)的方法，其中所述T0MM40遺傳變體是選自下組的 NCBI Build 36. 3 遺傳位置處的 T0MM40 變體50，092，565，50，092，587，50，093，506， 50，093，609，50，094，317，50，094，558，50，094，716，50，094，733，50，094，889，50，095，252， 50，095，506,50, 095, 698,50, 095, 764,50, 096, 271,50, 096, 531,50, 096, 647,50, 096, 697， 50，096，812，50，096，902，50，097，361，50，098，378，50，098，513 和 50，099，628。
37.權(quán)利要求33-36任一項(xiàng)的方法，其中所述T0MM40基因遺傳變體是刪除/插入多態(tài)性(DIP)。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述DIP是插入多態(tài)性。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態(tài)性。
40.權(quán)利要求37-39任一項(xiàng)的方法，其中所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。
41.權(quán)利要求37-39任一項(xiàng)的方法，其中所述DIP是rsl0524523。
42.一種在受試者中治療阿爾茨海默氏病的方法，包括(a)自取自所述受試者的含有DNA的生物學(xué)樣品檢測與對活性劑的響應(yīng)性有關(guān)的 T0MM40基因遺傳變體的存在或缺失；并若所述遺傳變體存在，則(b)以治療有效量給所述受試者施用所述活性劑以治療所述阿爾茨海默氏病。
43.權(quán)利要求42的方法，進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/E3、E2/E4、 E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
44.權(quán)利要求42的方法，進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是ApoE3/E3或E3/E4受試者ο
45.權(quán)利要求42-44任一項(xiàng)的方法，其中所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑， NMDA受體拮抗劑，過氧化物酶體增殖子活化的受體激動劑或調(diào)控劑，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子，及其組合。
46.權(quán)利要求42-44任一項(xiàng)的方法，其中所述活性劑是羅格列酮或其藥學(xué)可接受鹽。
47.權(quán)利要求42-46任一項(xiàng)的方法，其中所述T0MM40基因遺傳變體位于選自下組的 NCBI Build 36. 3 的遺傳位置處:50，092，565，50，092，587，50，093，506，50，093，609， 50，094，317，50，094，558，50，094，716，50，094，733，50，094，889，50，095，252，50，095，506， 50，095，698，50，095，764，50，096，271，50，096，531，50，096，647，50，096，697，50，096，812， 50，096，902，50，097，361，50，098，378，50，098，513 和 50，099，628。
48.權(quán)利要求42-47任一項(xiàng)的方法，其中所述T0MM40基因遺傳變體是刪除/插入多態(tài)性(DIP)。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述DIP是rsl05M523、rsl06023^或DIP3。
50.權(quán)利要求48或權(quán)利要求49的方法，其中所述DIP是插入多態(tài)性。
51.權(quán)利要求48或權(quán)利要求49的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態(tài)性。
52.權(quán)利要求48或權(quán)利要求49的方法，其中所述DIP是rsl0524523。
53.抗阿爾茨海默氏病活性劑用于制備藥物的用途，所述藥物用于進(jìn)行權(quán)利要求 17-52任一項(xiàng)的方法。
54.抗阿爾茨海默氏病活性劑用于進(jìn)行權(quán)利要求17-52任一項(xiàng)的方法的用途。
55.一種在患者中確定阿爾茨海默氏病預(yù)后或形成風(fēng)險的方法，包括獲得患者圖譜，其中所述獲得患者圖譜包括在所述患者的生物學(xué)樣品中檢測至少一種ApoE 2, ApoE 3或ApoE 4等位基因的存在或缺失，和檢測位于T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態(tài)性 (DIP)的存在或缺失，和然后將所述患者圖譜轉(zhuǎn)換成所述預(yù)后，其中所述ApoE 2、ApoE 3或ApoE 4等位基因的存在及所述至少一種T0MM40DIP多態(tài)性的存在將所述患者鑒定為處于阿爾茨海默氏病形成風(fēng)險的患者。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述DIP是rsl05M523、rsl06023^或DIP3。
57.權(quán)利要求55的方法，其中所述DIP是插入多態(tài)性。
58.權(quán)利要求55的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態(tài)性。
59.權(quán)利要求55的方法，其中所述DIP是rsl0524523。
60.權(quán)利要求55-59任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/ Ξ3、E2/E4、E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
61.一種用于將受試者分層入用于治療阿爾茨海默氏病的療法的臨床試驗(yàn)的亞組的方法，所述方法包括在所述患者的生物學(xué)樣品中檢測至少一種ApoE 2, ApoE 3或ApoE 4等位基因的存在或缺失，檢測位于T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態(tài)性 (DIP)的存在或缺失，并基于所述至少一種ApoE 2、ApoE 3或ApoE 4等位基因和/或T0MM40DIP等位基因存在或缺失將所述受試者分層入所述療法的所述臨床試驗(yàn)的所述亞組。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述DIP是插入多態(tài)性。
63.權(quán)利要求61的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態(tài)性。
64.權(quán)利要求61的方法，其中所述DIP是rsl05M523、rsl06023^或DIP3。
65.權(quán)利要求61的方法，其中所述DIP是rsl0524523。
66.權(quán)利要求61-65任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/ Ξ3、E2/E4、E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
67.一種用于在阿爾茨海默氏病的治療的臨床試驗(yàn)中鑒定患者的方法，包括(a)鑒定診斷有阿爾茨海默氏病的患者；并(b)為所述診斷有阿爾茨海默氏病的患者確定預(yù)后，包括獲得患者圖譜，其中所述獲得患者圖譜包括(i)在所述患者的生物學(xué)樣品中檢測至少一種ApoE3, ApoE 4和/或ApoE 2等位基因的存在或缺失，(ii)檢測位于T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態(tài)性(DIP)的存在或缺失，并(iii)將所述患者圖譜轉(zhuǎn)換成所述預(yù)后，所述預(yù)后包括對患者是否是阿爾茨海默氏病的所述治療的所述臨床試驗(yàn)的候選者的預(yù)測。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述DIP是插入多態(tài)性。
69.權(quán)利要求67的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態(tài)性。
70.權(quán)利要求67的方法，其中所述DIP是rsl05M523、rsl06023^或DIP3。
71.權(quán)利要求67的方法，其中所述DIP是rsl0524523。
72.權(quán)利要求67-71任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/ Ξ3、E2/E4、E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
73.一種用于確定受試者是否形成晚期發(fā)作阿爾茨海默氏病的風(fēng)險升高的試劑盒，包括(A)至少一種特異性檢測ApoE3,ApoE 4和/或ApoE 2的試劑，其中所述試劑選自下組選擇性結(jié)合ApoE同等型的抗體，和選擇性結(jié)合編碼ApoE等位基因的DNA的寡核苷酸探針；(B)至少一種特異性檢測位于T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的至少一種T0MM40 刪除/插入多態(tài)性(DIP)的存在或缺失的試劑；和(C)通過下述步驟確定受試者是否形成晚期發(fā)作阿爾茨海默氏病的風(fēng)險升高的用法說明，(i)用所述至少一種試劑在所述受試者中檢測ApoE3、ApoE4和/或ApoE 2同等型的存在或缺失；(ii)檢測位于T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態(tài)性(DIP)的存在或缺失；并(iii)通過觀察用所述至少一種試劑是否檢測到ApoE3, ApoE 4、和/或ApoE 2及所述T0MM40DIP的存在來觀察所述受試者是否形成晚期發(fā)作阿爾茨海默氏病的風(fēng)險升高，其中ApoE 3、ApoE4和/或ApoE 2同等型及所述T0MM40DIP的存在指示所述受試者形成晚期發(fā)作阿爾茨海默氏病的風(fēng)險升高。
74.權(quán)利要求73的試劑盒，其中所述至少一種試劑和所述用法說明包裝在一個容器中。
75.權(quán)利要求73或權(quán)利要求74的試劑盒，其中所述DIP是插入多態(tài)性。
76.權(quán)利要求73或權(quán)利要求74的試劑盒，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態(tài)性。
77.權(quán)利要求73或權(quán)利要求74的試劑盒，其中所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或 DIP3。
78.權(quán)利要求73或權(quán)利要求74的試劑盒，其中所述DIP是rsl0524523。
79.權(quán)利要求73-78任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述確定步驟進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是 Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
80.一種用于確定受試者是否會對用活性劑治療感興趣疾患有響應(yīng)的試劑盒，其中所述感興趣疾患與ApoE和/或T0MM40有關(guān)，所述試劑盒包括(A)至少一種特異性檢測ApoE3,ApoE 4和/或ApoE 2的試劑，其中所述試劑選自下組選擇性結(jié)合ApoE同等型的抗體，和選擇性結(jié)合編碼ApoE等位基因的DNA的寡核苷酸探針；(B)至少一種特異性檢測位于T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的至少一種T0MM40 刪除/插入多態(tài)性(DIP)的存在或缺失的試劑；和(C)通過下述步驟確定受試者是否會對用所述感興趣活性劑治療所述感興趣疾患有響應(yīng)的用法說明，(i)用所述至少一種試劑在所述受試者中檢測ApoE3、ApoE4和/或ApoE 2同等型的存在或缺失；(ii)檢測位于T0MM40基因內(nèi)含子6或內(nèi)含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態(tài)性(DIP)的存在或缺失；并(iii)通過觀察用所述至少一種試劑是否檢測到ApoE3,ApoE 4和/或ApoE 2同等型及所述T0MM40DIP的存在來確定受試者是否會對治療有響應(yīng)，其中ApoE 3、ApoE 4和/或 ApoE 2及所述T0MM40DIP的存在指示所述受試者會對用所述活性劑的所述治療有響應(yīng)。
81.權(quán)利要求80的試劑盒，其中所述至少一種試劑和所述用法說明包裝在一個容器中。
82.權(quán)利要求80或權(quán)利要求81的試劑盒，其中所述DIP是插入多態(tài)性。
83.權(quán)利要求80或權(quán)利要求81的試劑盒，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態(tài)性。
84.權(quán)利要求80或權(quán)利要求81的試劑盒，其中所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或 DIP3。
85.權(quán)利要求80或權(quán)利要求81的試劑盒，其中所述DIP是rsl0524523。
86.權(quán)利要求80-85任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述確定步驟進(jìn)一步包括檢測所述受試者是否是 Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
全文摘要
本文中提供的是一種用于鑒定與感興趣疾患(例如阿爾茨海默氏病)形成有關(guān)的遺傳變體的方法及如此鑒定的遺傳變體。還提供了在檢測到本文中所描述的遺傳變體后，用活性劑(例如用特定活性劑和/或在較早的年齡)治療的方法。在一些實(shí)施方案中，所述遺傳變體是TOMM40基因的刪除/插入多態(tài)性(DIP)。還提供了用于確定受試者是否處于晚期發(fā)作阿爾茨海默氏病形成風(fēng)險升高的試劑盒。進(jìn)一步提供了用于確定受試者是否會對用活性劑治療感興趣疾患有響應(yīng)的試劑盒。
文檔編號G01N33/48GK102177436SQ200980140279
公開日2011年9月7日 申請日期2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月12日
發(fā)明者艾倫·D·羅塞斯 申請人:金帆德爾制藥股份有限公司