專利名稱：一種檢測少兒藥物性耳聾遺傳風(fēng)險的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測少兒藥物性耳聾遺傳風(fēng)險的試劑 盒，通過同時檢測MTRNR1基因上的四個位點(diǎn)多態(tài)性基因型來評估少兒藥物性耳聾遺傳風(fēng)險。
背景技術(shù)：
目前我國每年新生聾兒2萬-3萬，其中50%是由遺傳因素造成的。藥物不良反應(yīng)導(dǎo)致耳聾是新生兒 先天性耳聾及成人后天性耳聾的主要原閔。藥物性耳聾被破壞的不是外耳和中耳的聲音傳導(dǎo)系統(tǒng)，即非傳導(dǎo)性耳聾，而是感知聲音最重要又最脆 弱的部位耳蝸毛細(xì)胞遭到藥毒損害。毛細(xì)胞是聽覺神經(jīng)的末梢感受器，正常情況下毛細(xì)胞把聲能轉(zhuǎn)化成生 物電沖動傳給聽覺神經(jīng)輸入大腦中樞，人才能聽到外界的各種聲音。耳毒性藥物專門傷害毛細(xì)胞，讓人感 受不到外界的聲音。這種耳聾屬于"感音神經(jīng)性耳聾"，是不可逆的。大劑量的氨基糖苷類抗生素具有一定的耳毒性,能導(dǎo)致前庭功能受損，從而使得聽力減退，甚至耳聾。 然而在氨基糖苷類抗生素引發(fā)的耳聾患者中，有些患者對毒性特別敏感，小劑量甚至單次劑量的藥物就可 能導(dǎo)致耳聾，存在個體差異。 一般來講，這類藥物在正常劑量下使用是比較安全的，但是有些病人對該類 藥物具有家族遺傳易感性和個體差異，在使用中即使很小劑量、短療程、正常途徑，也可能出現(xiàn)早期或嚴(yán) 重的耳毒性反應(yīng)。藥物性耳聾可以發(fā)生在各年齡，但少兒更易發(fā)生。因此，在使用氨基糖苷類抗生素之前對用藥對象進(jìn)行藥物敏感性篩選，提高合理用藥，減少濫用聽力損害藥物是降低我國g前少兒聽力殘疾的 有效途徑。對母系遺傳性耳聾大家系研究表明，線粒體脫氧核糖核酸12SrRNA基因A1555G基因突變與家族性致聾 有關(guān)，進(jìn)一步的常染色體全基因組掃描研究發(fā)現(xiàn)，45個陽性位點(diǎn)可作為家族系連鎖分析的候選位點(diǎn)，表明除 線粒體突變外,核基因組中多個基因位點(diǎn)可能與耳聾有關(guān)，所以母系遺傳性耳聾是多基因決定的,線粒體突 變、陽性核基因及不同的環(huán)境因素的影響將導(dǎo)致不同的表型。人量家系研究表明線粒體DNA的MTRNR1基 因上的A1555G, U1494A, T1095C, 961T缺失位點(diǎn)與藥物性耳聾有密切關(guān)系。發(fā)明內(nèi)容根據(jù)國家生物基因檢測技術(shù)應(yīng)用評估認(rèn)證中心頒布的《中國人口健康服務(wù)基因位點(diǎn)認(rèn)證規(guī)程》，對與 少兒藥物性耳聾易感相關(guān)基因位點(diǎn)的支持文獻(xiàn)、分子生物學(xué)機(jī)理研究、中國人群適用性等進(jìn)行綜合分析評 估后，MTRNR1基因上的A1555G、 U1494A、 T1095C這三個SNP位點(diǎn)和DEL 961T CINS位點(diǎn)通過國家生物基 因檢測技術(shù)應(yīng)用評估認(rèn)證中心認(rèn)定，可用于檢測評估少兒藥物性耳聾易感遺傳風(fēng)險?；贛TRNR1基因上A1555G、 U1494A、 T1095C這三個SNP位點(diǎn)和DEL 961T CINS位點(diǎn)多態(tài)性可用來評 估個體少兒藥物性耳聾易感遺傳風(fēng)險的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測少兒藥物性耳聾易感遺傳風(fēng)險的試劑 盒。 '該試劑盒包括檢測MTRNR1基因上A1555G、 U1494A、 T1095C這三個SNP位點(diǎn)和DEL 961T CINS位點(diǎn)多態(tài)性基因型的 特異性引物對及DNA測序引物；PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、去離子水等)； PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、Exo I酶、去離于水等)；DNA測序反應(yīng)組件(包括BigDyemix， EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、去離子 水等)。本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對MTR服1基因上A1555G、 U1494A、 T1095C這三個SNP位點(diǎn)和 DEL 961T CINS位點(diǎn)，能特異性擴(kuò)增出包含這4個位點(diǎn)的DNA片段的引物對。設(shè)計這類引物對是本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 1和2所示序列的引物對。特異性引物 對可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這對引物。本試劑盒中所述的DNA測序引物是指針對MTRNR1基因上A1555G、 U1494A、 T1095C這三個SNP位點(diǎn)和 DEL 961T CINS位點(diǎn)而設(shè)計，能通過DNA測序技術(shù)特異性檢測出這4個位點(diǎn)基因型的DNA測序引物。設(shè)計 這類引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 3所示序列的DNA 測序引物。DNA測序引物可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的DNA測序 引物不限于這條引物，所有可用于DNA測序技術(shù)檢測本發(fā)明中所述的4個位點(diǎn)多態(tài)性的DNA測序引物均在 本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括1. PCR反應(yīng)套裝10X PCR反應(yīng)緩沖液2.5nl，25mM dNTP混合液0.2^1，25mM MgCl2溶液1.5^1,5units/Vl Taq DNA聚合酶0. 125(U，20nM特異性引物對每條引物各0.25nl，去離子水19. 175nl。2. PCR產(chǎn)物純化套裝 lunits/nl SAP酶O. 75nl, lOunits/pl Exol酶0.375^1， 去離子水3. 875pl。3. 測序反應(yīng)套裝 25% BigDye mix3.2(iM DNA測序引物lul, 125mM EDTA溶液1^1， 100%乙醇溶液15nl， 70%乙醇溶液30M1, HIDI溶液8jxl， 去離子水2nl。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明?！狥列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2: PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用檢測試劑盒中的PCR反應(yīng)套裝，其中，含有下列引物對 有義引物l: 5' - GCGTTTGGTCCTAGCCTTTC -3' (SEQ ID NO: 1) 反義引物l: 5' - GCATCTTTCCCTTGCGGTAC -3' (SEQ ID NO: 2) 反應(yīng)的體系為總體積25nl，包含濃度為12.5ng/nl的DNA模板l|il、10X PCR反應(yīng)緩沖液2.5nl，25mM dNTP混合液0.2nl, 25mMMgC12溶液1.5^il， 5units/nl T叫DNA聚合酶0.125^1， 20jiM特異性引物對每 條引物各0.25fi1,去離子水19.175fil。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為94'C、 12分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)的94'C 、 30秒，60 'C、 30秒，72'C、 30秒，然后進(jìn)行72。C、 IO分鐘。步驟3: PCR產(chǎn)物純化使用檢測試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化套裝，反應(yīng)體系為總體積25(il，包含PCR產(chǎn)物2(^1， lunits/pl SAP 酶O. 75nl， 10units/nl Exol酶0.375^1,去離子水3.875nl。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37'C、 15分鐘，72°C、 20分鐘。步驟4: DNA測序反應(yīng)使用檢測試劑盒中的測序反應(yīng)套裝，其中，含有下列DNA測序引物 DNA測序引物:5' — GCGTTTGGTCCTAGCCTTT -3' (SEQ ID NO: 3) 反應(yīng)的體系為總體積5nl，包含PCR純化產(chǎn)物lnl， 25%BigDye mix 1^1， 3.2pMDNA測序引物1^1， 去離子水2pl。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件為98'C 、2分鐘，進(jìn)行25個循環(huán)的％'C 、30秒，55°C 、 30秒，60'C、 4分鐘。反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液lpl和100%乙醇溶液15jxl， f室溫下沉淀15分鐘；在4'C以3650 轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30nl,以3650轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15分鐘， 輕輕倒去上清液；室溫放置20分鐘后加入HIDI溶液8nl，放入測序儀中。步驟5:基因型分析熟悉DNA測序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測位點(diǎn)的基因型。實施例2.進(jìn)行少兒藥物性耳聾易感遺傳風(fēng)i檢測的服務(wù) 步驟l: DNA提取由醫(yī)院檢驗科醫(yī)師指導(dǎo)被檢少兒使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上 皮細(xì)胞的DNA抽提。步驟2:基因分型檢測使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢測少兒基因組DNA的MTRNR1基因上A1555G、 U1494A、 T1095C這三 個SNP位點(diǎn)和DEL 961T CINS位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行DNA測序檢湖ij,確定這4個位點(diǎn)的多態(tài)性基因型。步驟3:少兒藥物性耳聾易感遺傳風(fēng)險的分析通過對被檢測者位點(diǎn)多態(tài)性基因型的分析，出具少兒藥物性耳聾易感遺傳風(fēng)險的分析報告單。報告中 詳細(xì)說明了被檢測少兒藥物性耳聾易感遺傳風(fēng)險的高低，并由醫(yī)師向被檢者詳細(xì)說明和解讀少兒藥物性耳 聾易感遺傳風(fēng)險分析報告單。序歹U表<110>上海主健生物工程有限公司<120> —種檢測少兒藥物性耳聾遺傳風(fēng)險的試劑盒〈160〉 3<210> 1 〈211〉 20 <212> DNA <213>人工序列<220><223>引物 <400〉 1GCGTTTGGTC CTAGCCTTTC 20<210> 2 〈211> 20 <212〉 DNA 〈213>人工序列<220><223>引物 <400> 2GCATCTTTCC CTTGCGGTAC 20<210> 3 <211> 19 <212〉 DNA <213>人工序列<220>〈223〉引物 <400> 3GCGTTTGGTC CTAGCCTTT 19
權(quán)利要求
1. 一種檢測少兒藥物性耳聾遺傳風(fēng)險的試劑盒，其特征在于包括檢測MTRNR1基因上的A1555G、U1494A、T1095C這三個SNP位點(diǎn)和DEL 961T CINS位點(diǎn)的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、Exo I酶、BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去離子水等。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對MTRNR1基因上的 A1555G、 U1494A、 T1095C這三個SNP位點(diǎn)和DEL 961T CINS位點(diǎn)，能特異性擴(kuò)增出包含這4個位點(diǎn)的DNA 片段的引物對。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的DNA測序引物是指針對MTRNR1基因上的A1555G、 U1494A、 T1095C這三個SNP位點(diǎn)和DEL 961T CINS位點(diǎn)而設(shè)計，能通過DNA測序技術(shù)特異性檢測出這4個 位點(diǎn)基因型的DNA測序引物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對選自具有SEQ ID NO: 1和2所 示序列的引物對。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的DNA測序引物選自具有SEQ ID NO: 3所示序 列的引物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括1) PCR反應(yīng)套裝10X PCR反應(yīng)緩沖液2. 5W， 25rnM dNTP混合液0. 2W， 25mM MgC12溶液1.5W， 5units/14 Taq DNA聚合酶0. 125化2(Ml特異性引物對每條引物各0.25W，去離子水19. 175W。2) PCR產(chǎn)物純化套裝:lunits/WSAP酶0. 75ri， lOunitsM Exol酶O. 去離子水3. 875Ml。3) 測序反應(yīng)套裝25% BigDye raix 1W, 3. 2湖DNA測序引物1W， 125mM EDTA溶液l叱醒乙 醇溶液70%乙醇溶液HIDI溶液8W,去離子水2"1。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C。.
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測少兒藥物性耳聾遺傳風(fēng)險的試劑盒。該試劑盒包括檢測MTRNR1基因上的四個位點(diǎn)多態(tài)性的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測序反應(yīng)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測與少兒藥物性耳聾遺傳風(fēng)險密切相關(guān)的MTRNR1基因上的四個位點(diǎn)多態(tài)性基因型來評估少兒藥物性耳聾遺傳風(fēng)險。
文檔編號C12Q1/68GK101240319SQ200710037169
公開日2008年8月13日 申請日期2007年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司