專利名稱：一種檢測少兒綜合疾病遺傳易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學和醫(yī)學領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種檢測少兒綜合疾病遺傳易感性的試 劑盒，通過對疾病遺傳風險相關(guān)的基因進行檢測分析來評估少兒綜合疾病遺傳易感性。
背景技術(shù)：
基因檢測分析技術(shù)已迅速成為預(yù)測人類疾病健康的重要工具?；蚣夹g(shù)能將人類的健康狀態(tài)和生理病 癥、遺傳突變的因素、疾病的傾向和狀態(tài)等關(guān)聯(lián)起來。DNA序列由于堿基插入、缺失、錯配引發(fā)的遺傳因 子突變，以及個體DNA表達式的上下調(diào)節(jié)等都是和健康狀態(tài)及疾病的機理有關(guān)的生物信息。例如，"老年性癡呆"是一種出現(xiàn)于老年期的持續(xù)性智能損害。遺傳基因是老年性癡呆的重要風險因 素，其中AP0E基因e4亞型與老年性癡呆患病風險密切相關(guān)。如果攜帶2個拷貝AP0E e4等位基因(e4/ e4)， 便屬于高風險人群。在沒有采取預(yù)防措施的情況下，65歲以下患老年性癡呆的可能性是60%到75%。而相 比之下，在AP0E基因e4等位基因檢測結(jié)果呈陰性的人群中，老年性癡呆的發(fā)病危險不足10%。被測試者 可以根據(jù)基因檢測結(jié)果，采取積極預(yù)防措施，使發(fā)病年齡至少可以推遲10年。又如，研究顯示P0N1基因的Glnl92Arg多態(tài)性與冠心病嚴重性、冠狀動脈粥樣硬化進展程度、血脂 水平和降血脂藥物治療效果都有相關(guān)。通過檢測中國北方地區(qū)49例老年冠心病患者和38例健康老年對照 者的P0N1的Gln/ Argl92基因多態(tài)性，研究發(fā)現(xiàn)冠心病組與健康組比較各基因型分布差異具有顯著性意 義。B等位基因在冠心病組比例為0.56，在健康組為0.37，冠心病組的B等位基因比例明顯高于健康組。 B等位基因是中國北方地區(qū)冠心病發(fā)病的危險因素。說明P0N1基因Gln/Argl92遺傳多態(tài)性與中國北方地 區(qū)冠心病發(fā)病明顯相關(guān)。通過檢測P0N1基因的Gln/ Argl92遺傳多態(tài)性能夠得到被檢測者的冠心病易感 性，可以根據(jù)檢測結(jié)果盡早采取預(yù)防措施，減小發(fā)病的可能性。再如，p53突變和DNA甲基化在一定程度上預(yù)示了直腸癌的病理存在，進行基因檢測可以在被測者身 體尚未顯現(xiàn)任何癥狀的情況下發(fā)現(xiàn)早期直腸癌，及早采取措施進行治療，延長生命。ALDH2基因的rs671 多態(tài)性改變(G/A)缺陷導(dǎo)致機體對乙醛的代謝能力下降，引起飲酒的不適感，臉紅綜合癥等，容易導(dǎo)致 酒精中毒。通過基因檢測分析可以預(yù)知個人是否會發(fā)生酒精中毒情況，可以進行提前預(yù)防。相對于已經(jīng)發(fā) 生酒精中毒再進行補救，基因檢測可以更好地保障生命健康。同樣對于一些藥物的使用，基因檢測可以得 知個體對藥物藥效與毒副作用的敏感性，基因檢測的結(jié)果可以作為醫(yī)師用藥的參考。發(fā)明內(nèi)容基于基因檢測分析技術(shù)可用來評估個體疾病遺傳易感性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測少兒綜合疾病 遺傳易感性的試劑盒。本發(fā)明所述的試劑盒主要用于檢測與藥物性耳聾、支氣管哮喘、兒童肥胖、代謝性疾病等，及改善抗 氧化能力、解毒能力、炎癥反應(yīng)、維生素利用、葉酸代謝能力、骨骼發(fā)育相關(guān)的基因，為被測少兒提供一 份相關(guān)基因分型檢測報告和個體化的健康發(fā)育指導(dǎo)報告，幫助少兒在發(fā)育過程中預(yù)防哮喘、藥物致聾、肥 胖和營養(yǎng)失衡等問題的發(fā)生。該試劑盒包括檢測N0S3、 CTLA4、 ENOS、 ERCC1、 ERCC2、 MTHFR、 MTRR、 MTR、 MS4A2、 XRCC1、 ALDH2、 TNFA、 CCL5、 PARP1、 OPG、 VDR、 P0N1、 AGT、 CCND1、 UCP2、 ADH2、 ADBR2、 APOB、 CYP11B2、 CYP1A1、 CYP2E1、 CETP、 NQ01基因上28個SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對；熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、反應(yīng)緩沖液、去離子水等)。 本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對N0S3、 CTLA4、 EN0S、 ERCC1、 ERCC2、 MTHFR、 MTRR、 MTR、 MS4A2、 XRCC1、 ALDH2、 TNFA、 CCL5、 PARP1、 OPG、 VDR、 P0N1、 AGT、 CCND1、 UCP2、 ADH2、 ADBR2、 APOB、 CYP11B2、 CYP1A1、 CYP2E1、 CETP、 NQOl基因上28個SNP位點而設(shè)計，能特異性擴增出包含這28個SNPs 位點的DNA片段的引物對。設(shè)計這類引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。特異性引物對可用常規(guī)的 合成技術(shù)進行合成。本試劑盒中所述的特異性熒光探針對是指針對N0S3、 CTLA4、 EN0S、 ERCC1、 ERCC2、 MTHFR、 MTRR、 MTR、 MS4A2、 XRCC1、 ALDH2、 TNFA、 CCL5、 PARP1、 0PG、 VDR、 P0N1、 AGT、 CCND1、 UCP2、 ADH2、 ADBR2、 APOB、 CYP11B2、 CYP1A1、 CYP2E1、 CETP、 NQ01基因上28個SNP位點而設(shè)計，能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性檢 測出這28個SNPs位點基因型的Taqman探針對。設(shè)計這類探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。特異 -性熒光探針對可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進行合成。所有可用于熒光定量PCR法檢測本發(fā)明中所述的28個 SNPs位點的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測試劑盒，每個SNP位點分別進行一次獨立的熒光定量PCR反應(yīng)，每個反應(yīng)的體系為總體積 lOjxl，包含濃度為20ng/nl的DNA模板2fil、 lpl 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0. Uil 25raM dNTP混合 液、0.6^1 25mM MgCl2溶液、(5units/nl) Taq DNA聚合酶、20|xM的引物每一條各0. 225^1、 10pM的熒光探針每一條各0. 25(^1,去離子水5. 325nl 。在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50'C、 2分鐘，95'C、 10分鐘，進行60個循環(huán)的 95。C、 30秒，60°C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCK儀上讀取樣品熒光量。步驟3: SNP基因型分析熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根 據(jù)不同序列探針的不同炎光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的基因型。實施例2.對少兒進行綜合疾病遺傳易感性檢測的服務(wù) 步驟l: DNA提取由醫(yī)院檢驗科醫(yī)師指導(dǎo)被檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮 細胞的DNA抽提。步驟2:基因分型檢測使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢測者基因組DM的N0S3、 CTLA4、 ENOS、 EKCC1、 EKCC2、 MTHFR、 MTRR、 MTR、 MS4A2、 XRCC1、 ALDH2、 TNFA、 CCL5、 PARP1、 OPG、 VDR、 P0N1、 AGT、 CCND1、 UCP2、 ADH2、 ADBR2、 APOB、 CYP11B2、 CYP1A1、 CYP2E1、 CETP、 NQ01基因上28個SNP位點分別進行熒光定量PCR檢測，確定這 些SNP位點的基因型。步驟3:綜合疾病遺傳易感性的分析通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具綜合疾病遺傳易感性的分析報告單，并由醫(yī)師向被檢者詳 細說明和解讀綜合疾病遺傳易感性分析報告單。
權(quán)利要求
1. 一種檢測少兒綜合疾病遺傳易感性的試劑盒，其特征在于包括同時檢測NOS3、CTLA4、ENOS、ERCC1、ERCC2、MTHFR、MTRR、MTR、MS4A2、XRCC1、ALDH2、TNFA、CCL5、PARP1、OPG、VDR、PON1、AGT、CCND1、UCP2、ADH2、ADBR2、APOB、CYP11B2、CYP1A1、CYP2E1、CETP、NQO1基因上28個SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對NOS3、 CTLA4、 EN0S、 ERCC1、 ERCC2、 MTHFR、 MTRR、 MTR、 MS4A2、 XRCC1、 ALDH2、 TNFA、 CCL5、 PARP1、 OPG、 VDR、 P0N1、 AGT、 CCND1、 UCP2、 ADH2、 ADBR2、 APOB、 CYP11B2、 CYP1A1、 CYP2E1、 CETP、 NQ01基因上28個SNP位點而設(shè)計， 能特異性擴增出包含這28個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性熒光探針對是指針對N0S3、CTLA4、EN0S、 EI CC1、 ERCC2、 MTHFR、 MTRR、 MTK、 MS4A2、 XRCC1、 ALDH2、 TNFA、 CCL5、 PARP1、 0PG、 VDR、 P0N1、 AGT、 CCND1、 UCP2、 ADH2、 ADBR2、 APOB、 CYP11B2、 CYP1A1、 CYP2E1、 CETP、 NQ01基因上28個SNP位點而設(shè)計， 能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性檢觀纟出這28個SNPs位點基因型的Taqman探針對。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測少兒綜合疾病遺傳易感性的試劑盒。該試劑盒包括同時檢測NOS3、CTLA4、ENOS、ERCC1、ERCC2、MTHFR、MTRR、MTR、MS4A2、XRCC1、ALDH2、TNFA、CCL5、PARP1、OPG、VDR、PON1、AGT、CCND1、UCP2、ADH2、ADBR2、APOB、CYP11B2、CYP1A1、CYP2E1、CETP、NQO1基因上28個SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對、用于熒光定量PCR檢測的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過同時檢測與少兒綜合疾病遺傳易感性密切相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點基因型來評估少兒綜合疾病遺傳易感性。
文檔編號C12Q1/68GK101275161SQ20071003859
公開日2008年10月1日 申請日期2007年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月29日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司