專利名稱：：大豆肽混合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供一種即使在酸溶液中也不形成渣滓的大豆肽混合物。更特別地是，本發(fā)明提供一種即使在酸溶液中冷藏和j^藏時也不形成渣滓的大豆肽混合物。
背景技術(shù)：
：迄今為止，大豆蛋白分離物通常通過下述方法制備，這些方法是大豆蛋白工業(yè)化生產(chǎn)的主流方法。向脫脂大豆中加入水制成水性淤漿，用例如離心的方法分離去除其中的"豆渣(豆腐渣)"，向生成的水溶性部分(脫脂豆乳)中加入酸調(diào)整其pH值到大豆蛋白的等電點(diǎn)使大豆蛋白沉淀，分離和去除上清液(大豆乳清)，從而獲得酸性淤漿。加堿中和此酸性淤漿，通過噴霧干燥等方法進(jìn)行干燥得到所述"分離的大豆蛋白(separatedsoybeanisolate)"(以下稱為方法A)。另一方面，有一種方法，其用水提取大豆蛋白濃縮物以去除"豆渣"而得到大豆蛋白溶液，將該大豆蛋白溶液噴霧干燥后制得大豆蛋白分離物(以下稱為方法B)。大豆蛋白濃縮物，有一種是用醇溶液從脫脂大豆中分離去除乳清成分或其類似物所獲得的醇濃縮物，還有一種是將脫脂大豆在酸溶液中直接制成淤漿，然后去除上清液，即上清液中的乳清而獲得酸性淤漿，然后進(jìn)行干燥等所得到的酸濃縮物。就醇濃縮物而言，可以通過向濃縮物中加水來去除"豆渣"，然后進(jìn)行噴霧干燥等，從而獲得大豆蛋白分離物。就酸濃縮物而言，可以通過中和其淤漿來去除"豆渣"而獲得大豆蛋白分離物溶液，然后將其進(jìn)行噴霧干燥等而制得大豆蛋白分離物。由后面的方法(方法B)制備的大豆蛋白與由前面的方法(方法A)制備的大豆蛋白相比具有更好的口感，并且將此大豆蛋白水解得到的大豆蛋白水解物也具有良好的口感。然而，根據(jù)本發(fā)明人的研究，當(dāng)用于酸性食品和飲料例如酸性飲料時，由方法B制備的大豆蛋白水解物具有以下問題其與方法A制成的大豆蛋白水解物相比更容易形成渣滓。換句話說，對于用蛋白酶處理大豆蛋白分離物溶液得到的大豆蛋白水解物，使用由方法A制成的大豆蛋白獲得的水解物即便在酸性條件下冷藏時也難以形成渣滓(白濁)，而使用由方法B制成的大豆蛋白獲得的水解物則具有在酸性條件下冷藏時容易形成渣滓的問題。因為大豆蛋白的等電點(diǎn)在pH4.5附近，因此可以通過將水解物用于某些弱酸性飲料而不是酸性飲料來避免形成渣滓。例如，作為已知的方法，專利文獻(xiàn)1公開了將飲料的pH調(diào)整到大約6的高范圍的方法。然而，這樣的pH太高以致于不能制備pH3-4.5的酸性飲料。迄今為止，為了制備即使在酸性溶液中也不形成渣滓(白濁)的大豆蛋白水解物，已進(jìn)行了很多發(fā)明，所述水解物例如用于酸性飲料。專利文獻(xiàn)2公開了可溶性大豆蛋白的制備方法，所述大豆蛋白在酸性到堿性范圍內(nèi)可溶解，其中用胞內(nèi)/胞外蛋白酶處理由方法A獲得的大豆蛋白，然后離心分離等。然而，其具有不受歡迎的氣味和不好的味道例如澀味，并且其味道和風(fēng)味是不希望有的。本申請人在專利文獻(xiàn)3中公開了能在低于pH4.6的酸性食品中使用的、在pH3.0-4.5可溶的大豆蛋白。該發(fā)明的特征是在去除或滅活含大豆蛋白的溶液中的聚陰離子物質(zhì)，和/或向其中加入聚陽離子物質(zhì)后，在酸性條件下以高于IOO'C的溫度對溶液進(jìn)行加熱處理。此外，該文獻(xiàn)還公開了除去植酸和用植酸酶處理的如上述去除或滅活聚陰離子物質(zhì)的處理。此外，該文獻(xiàn)還公開了用蛋白酶水解處理蛋白質(zhì)。然而，盡管所生成的大豆蛋白在酸性范圍內(nèi)顯示出極好的溶解性和貯藏穩(wěn)定性，但它是具有功能型特征例如乳化能力和凝膠形成能力的大豆蛋白，而不是像本發(fā)明一樣的具有低分子量的大豆肽混合物。而且，其中沒有教導(dǎo)如本發(fā)明中的兩步酶分解處理。專利文獻(xiàn)4公開了一種在低于等電點(diǎn)的酸性范圍內(nèi)提高蛋白質(zhì)溶解性的方法，該方法制備pH約為2.0-4.2和固體成分含量為10-15重量％的大豆蛋白分離物的淤漿，并且在大約120-160。C的溫度下以連續(xù)方式對淤漿進(jìn)行加熱處理。然而，這是大豆蛋白，而不是如本發(fā)明所述的具有低分子量的水解大豆肽混合物。而且，當(dāng)被用于酸性飲料時其在貯藏時形成渣滓。專利文獻(xiàn)5公開了分離可溶性蛋白片段的方法，所述蛋白片段在pH4.6或更低時可溶，其中結(jié)合使用植酸酶處理和調(diào)整pH分離。然而，該方法的產(chǎn)率以大豆蛋白分離物原料計只有14%，并且不適于實際使用。而且，它沒有教導(dǎo)如本發(fā)明的兩步酶解處理。本申請人在專利文獻(xiàn)6中公開了即使在酸性范圍內(nèi)也不形成渣滓的大豆蛋白水解物的制備方法，其中將由方法A獲得的大豆蛋白進(jìn)行蛋白酶處理。該方法的特征在于加熱處理，而且水解物即使在酸性范圍內(nèi)也不形成渣滓。然而，產(chǎn)品具有令人不愉快的氣味和差的味道例如澀味，因此這些味道和風(fēng)味是不希望有的。此外，本申請人在專利文獻(xiàn)7中公開了大豆蛋白的處理方法，其中將大豆蛋白經(jīng)蛋白酶處理，然后經(jīng)植酸酶處理。然而，其原料是方法A獲得的大豆蛋白，并且處理的目的是減少或去除大豆蛋白中含有的植酸。因此，該方法沒有教導(dǎo)兩步酶解。作為使用由方法B獲得的大豆蛋白的例子，專利文獻(xiàn)8公開了在pH3-5具有優(yōu)良溶解性的蛋白質(zhì)的制備方法，其中用微生物來源的酸性植酸酶在pH2-6處理經(jīng)酸洗的脫脂大豆，然后分離可溶性部分。此外，該文獻(xiàn)還公開了在對酸性淤漿進(jìn)行植酸酶處理的同時或之后進(jìn)行蛋白酶處理。在該發(fā)明中，植酸酶處理的目的是提高蛋白質(zhì)在酸性條件下的提取率，而蛋白酶的處理目的是進(jìn)一步改善味道。因此該發(fā)明的目的和過程與本發(fā)明的不同。此外，它沒有教導(dǎo)兩步蛋白酶處理。而且，當(dāng)在酸性條件下用蛋白酶高強(qiáng)度水解時，產(chǎn)生澀味和特殊的味道。這是不希望有的。專利文獻(xiàn)l:JP2002-10764A專利文獻(xiàn)2:JP2005-80668A專利文獻(xiàn)3:WO2002/067690專利文獻(xiàn)4:JP53-19669A專利文獻(xiàn)5:JP55-29654A專利文獻(xiàn)6:JP2001-238693A專利文獻(xiàn)7:WO2004/17751專利文獻(xiàn)8:JP51-125300A
發(fā)明內(nèi)容如前所述，盡管由方法B制備的大豆蛋白水解獲得的大豆肽混合物與由方法A制備的大豆蛋白混合物獲得的產(chǎn)品相比具有更好的味道和風(fēng)味，然而仍存在如下缺陷在酸性溶液中易于形成渣滓，尤其是在冷藏條件下。因此，本發(fā)明的目的是提供一種大豆蛋白水解物，尤其是具有相對低分子量的大豆肽混合物，所述大豆蛋白水解物以由方法B制成的大豆蛋白為原料，其即使在酸性條件下冷藏時也不形成渣滓。解決技術(shù)問題的技術(shù)方案大豆蛋白在堿:至中:條件下用內(nèi)切;白酶水解，生成的水解物在酸性條件下用具有外切酶活性(exo-activity)的蛋白酶處理，然后進(jìn)一步用植酸酶處理，則生成的大豆蛋白水解物即使在酸溶液中也不形成渣滓。而且，本發(fā)明人研究了在酸性條件下使用的酶，發(fā)現(xiàn)根霉菌屬(/^/W/7W)來源的蛋白水解酶表現(xiàn)出顯著的效果，曲霉菌屬(ylyp^^7/W5")來源的蛋白水解酶也表現(xiàn)出一定程度的效果。從而，完成了本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明提供了由方法B獲得的大豆蛋白通過兩步酶水解及植酸酶處理所獲得的大豆肽混合物，其具有良好的味道并且即使在冷藏狀態(tài)下的酸溶液中也不形成渣滓。尤其是，本發(fā)明提供了大豆肽混合物的制備方法，其包括如下步驟(a)用水提取濃縮大豆蛋白獲得提取物；(b)用蛋白酶在堿性到中性條件下處理提取物；(c)用蛋白酶在酸性條件下進(jìn)一步處理生成的產(chǎn)物；(d)用植酸分解酶處理生成的產(chǎn)物；和(e)從產(chǎn)物中分離和去除不溶性物質(zhì)。優(yōu)選地，(b)步驟中使用的酶包括內(nèi)切型。根據(jù)蛋白質(zhì)成分的15%三氯乙酸溶解率，優(yōu)選地(b)步驟中的水解度是20-98%的大豆蛋白分解率。優(yōu)選地，(c)步驟中使用的酶包括外切型。優(yōu)選地(c)步驟中使用的酶是曲霉菌屬或根霉菌屬來源的酶。優(yōu)選地，(d)步驟在(c)步驟后或同時進(jìn)行。大豆蛋白混合物的平均分子量優(yōu)選200-5000。發(fā)明效果本發(fā)明使制備這樣一種大豆肽混合物成為可能，其與根據(jù)常規(guī)方法A用蛋白酶處理大豆蛋白得到的產(chǎn)品相比不僅具有良好的味道，而且即使在酸性溶液中冷藏也不形成渣滓。因此，本發(fā)明可以提供能用于酸性食品和飲料中的具有良好味道的大豆肽混合物，所述食品和飲料例如酸性飲料和酸性果凍。具體實施方式本發(fā)明是一種大豆肽混合物的制備方法，其包括如下步驟(a)用水提取濃縮大豆蛋白獲得提取物；(b)用蛋白酶在堿性到中性條件下處理提取物；(c)用蛋白酶在酸性條件下進(jìn)一步處理生成的產(chǎn)物；(d)用植酸分解酶處理生成的產(chǎn)物；和(e)從產(chǎn)物中分離和去除不溶性物質(zhì)。換句話說，本發(fā)明的特征在于使用(a)和步驟(b)-(e)的必要構(gòu)成特征。如
背景技術(shù)：
中所述的醇濃縮物或酸濃縮物也可以用作(a)步驟中的濃縮大豆蛋白。濃縮大豆蛋白的例子包括用醇溶液從脫脂大豆中分離和去除乳清成分等而得到的醇濃縮物；和直接將脫脂大豆在酸性溶液中制成淤漿，去除上清液即乳清，然后干燥所生成的酸性淤漿而得到的酸濃縮物(酸濃縮大豆蛋白)。因此，濃縮大豆蛋白的水提取物可以用如下方式獲得將水加入醇濃縮物，然后從生成的淤漿中去除"豆渣"；或者將酸濃縮物中和，然后去除"豆渣"。例如，按照本申請人的公開專利WO2004/013170中描述的方法可獲得(a)步驟中濃縮大豆蛋白的水提取物。下面，說明用蛋白酶在堿性到中性條件下處理提取物的(b)步驟。本發(fā)明的特征在于在(b)步驟后結(jié)合(c)步驟和(d)步驟。盡管原因未知，但是當(dāng)(a)用作原料時，僅僅在堿性到中性條件下進(jìn)行蛋白酶處理的(b)步驟很難獲得在酸溶液中不形成渣滓的大豆蛋白水解物。在本發(fā)明的(b)步驟中，在堿性到中性條件下進(jìn)行蛋白酶處理是適當(dāng)?shù)?。盡管原因未知，但是假設(shè)在堿性到非常弱的堿性條件下用內(nèi)切蛋白酶水解，大豆蛋白的結(jié)構(gòu)會松散和變成不牢固的狀態(tài)，然后在酸條件下水解，會產(chǎn)生一定的效果。因此，在堿性到中性范圍內(nèi)具有活性pH的酶是適用的，在堿性到中性范圍內(nèi)具有最適pH的酶是優(yōu)選的。在酶解過程中，反應(yīng)混合物的pH降低到酸性邊緣。但是，在本發(fā)明中，只要酶解反應(yīng)開始時pH在堿性到中性范圍內(nèi)即可。優(yōu)選地，酶解反應(yīng)開始時pH是pH7-9，因為可以減少中和反應(yīng)生成的鹽。其它水解條件(溫度、E/S比例等)因使用的蛋白水解酶的不同類型而不同，所以可確定加入的酶量和反應(yīng)時間以獲得期望的分解率。本發(fā)明的(b)步驟中使用的酶因產(chǎn)生不適于飲料用途的特殊的味道和氨基酸的味道而出現(xiàn)不協(xié)調(diào)感，因此優(yōu)選所述酶含有內(nèi)切型即所述內(nèi)切蛋白酶以降低這些味道。通常地，蛋白酶處理后的酶解產(chǎn)物的干物質(zhì)中游離氨基酸含量在10%之內(nèi)是適當(dāng)?shù)模瑑?yōu)選在5%之內(nèi)。這些酶可以是任何動物、植物或微生物來源的酶。其具體例子包括絲氨酸蛋白酶(動物來源的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，微生物來源的枯草桿菌蛋白酶，等)，和巰基蛋白酶(植物來源的木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶，等)。更具體地，此處的例子包括地衣芽孢桿菌(Bfld〃M"/c/!emybnn^s)來源的"堿性蛋白酶"(由NovozymesJapanLtd.生產(chǎn))，枯草桿菌(必a"〃"s)來源的"蛋白酶S，，(由AmanoEnzymeInc.生產(chǎn))，"BioplaseSP-15FG"(由NagaseChemtexCorporation生產(chǎn))，"ProtinAY40"(由DaiwaKaseiCo"Ltd.生產(chǎn))，"ProtinAC10"(由DaiwaKaseiCo"Ltd.生產(chǎn)),"ProtinNY50"(由DaiwaKaseiCo.，Ltd.生產(chǎn))，以及類似的酶。這些酶在堿性到中性范圍內(nèi)具有活性pH,在非常弱堿性到堿性范圍內(nèi)具有最適pH,除了ProtinNY50在中性范圍內(nèi)具有最適pH。這些酶可以單獨(dú)使用或者2種以上組合使用。蛋白酶處理的大豆蛋白溶液的合適蛋白質(zhì)濃度是1-30重量％，優(yōu)選5-15重量％，更優(yōu)選8-12重量％。通過適當(dāng)?shù)剡x擇提取條件可將蛋白質(zhì)濃度調(diào)整在此范圍內(nèi)，所述條件例如提取pH、提取溫度、提取時間、提取量、提取次數(shù)等。即使?jié)舛冗^低，也不妨礙蛋白酶處理。但是生產(chǎn)率低，并且導(dǎo)致大豆蛋白水解物的制造成本上升。此外，當(dāng)大豆蛋白溶液的濃度過高時，需要大量的酶才能充分地反應(yīng)。根據(jù)蛋白質(zhì)成分的15%三氯乙酸溶解率計算，(b)步驟中蛋白酶處理引起的水解度即大豆蛋白分解率通常是20-98%，更適當(dāng)?shù)厥?0-90%。蛋白水解酶反應(yīng)需要的時間根據(jù)使用的蛋白水解酶的活性和用量而不同。然而，通常約為30分鐘-24小時，優(yōu)選約為l-4小時。酶解時間過長容易導(dǎo)致腐敗。下面，說明在酸性條件下的蛋白酶處理的(c)步驟。酸性條件下蛋白酶處理的目的是通過組合后面的(d)步驟來沉淀渣滓，而不需要在酸性條件下高度水解。本發(fā)明的(c)步驟的特征是在酸性條件下進(jìn)行蛋白酶處理。而且，是輕度水解以免形成渣滓，即使如上所述游離氨基酸升高，或者即使平均分子量降低，其水解度也優(yōu)選在上述范圍內(nèi)。(c)步驟的優(yōu)選條件如下。酸性范圍的pH適當(dāng)?shù)厥莗H3-6.2，優(yōu)選pH4-5.5。在堿性條件下很難獲得目標(biāo)大豆肽混合物。溫度范圍為30-70°C,優(yōu)選為45-65。C。而反應(yīng)時間根據(jù)所用酶的活性和用量而不同，通?？梢允谴蠹s2分鐘至4小時，優(yōu)選為大約5分鐘到1小時。當(dāng)反應(yīng)時間過長時，產(chǎn)生特殊的味道、苦味等。因此，由(c)步驟中水解引起的游離氨基酸的增量以干固體成分(drysolidcontent)計保持在4重量％以下，優(yōu)選保持在2重量％以下，更優(yōu)選保持在1重量％以下。而且，(c)步驟中水解引起的平均分子量的降低保持在50%以內(nèi)，優(yōu)選在30%以內(nèi)。例如，假設(shè)(b)步驟后經(jīng)分離不溶性物質(zhì)得到的大豆肽混合物的平均分子量是5000，如果(c)步驟中的少許水解引起的降低量在50%之內(nèi)，則平均分子量是2500-5000，而如果在30%之內(nèi)，則平均分子量是3500-5000。(c)步驟中使用的酶優(yōu)選根霉菌屬或曲霉菌屬來源的酶為宜。根霉菌屬來源的酶的例子包括來源于米根霉(及/n'w/7w的"PeptidaseR，，(由AmanoEnzymeInc.生產(chǎn))、來源于雪白根霉(及/i/zo/uww/veiw)的"Newlase3FG，，(由AmanoEnzymeInc.生產(chǎn))等。曲霉菌屬來源的酶的例子包括來源于米曲霉(y^/^fg///^o/jzfle)的"蛋白酶M"、"蛋白酶A，，(由AmanoEnzymeInc，生產(chǎn))以及"S腿izymeAP，,、"SumizymeFP，，、"S腿izymeLP"、"S咖izymeLPL"(由ShinNihonChemicalsCo.，Ltd.生產(chǎn))等。優(yōu)選地，這些酶含有外切型。因為通常使用粗制的酶，它們含有外切和內(nèi)切蛋白酶。因此，通過將其在酸性條件下進(jìn)行反應(yīng)，從而在酸溶液中冷藏時可以抑制渣滓的形成。也就是說，當(dāng)使用由方法A獲得的大豆蛋白時，僅通過(b)步驟，或者通過結(jié)合(b)步驟和后述的(d)步驟，可以獲得在酸溶液中難于形成渣滓的大豆蛋白水解物。在這種情況下，(d)步驟不是必須的，但以結(jié)合使用為佳。然而，當(dāng)水解由方法B獲得的大豆蛋白時，必須結(jié)合進(jìn)行(b)步驟、(c)步驟、和(d)步驟。下面，說明植酸分解酶處理的(d)步驟。由上述步驟獲得的大豆蛋白的酶解產(chǎn)物的pH值通常被調(diào)整為pH3-6.2,優(yōu)選調(diào)整為pH4-5.5。通常濃度與(b)步驟中的水解時的濃度相同，為1-30重量％,優(yōu)選為5-15重量％，更優(yōu)選為8-12重量％。當(dāng)在下面描述的不溶性物質(zhì)分離后進(jìn)行處理時，可以減少植酸分解酶的添加量，因為底物的量變小了。在酸性條件下，可以任選先進(jìn)行(d)步驟或(c)步驟，也可以同時進(jìn)行，優(yōu)選(d)步驟在(c)步驟之后或同時進(jìn)行。首先，說明本發(fā)明中使用的植酸分解酶。用于本發(fā)明的植酸分解酶，它的來源不局限于具體的一種酶，有植物例如小麥和馬鈴薯來源的酶；動物器官例如腸管來源的酶；微生物例如細(xì)菌、酵母、真菌和放線菌來源的酶，以及基因重組酶，并且可以使用例如具有植酸分解活性的植酸酶和磷酸酶。在這些分解植酸的植酸酶和磷酸酶中，植酸酶是更優(yōu)選的。植酸酶，可以使用來源于能生產(chǎn)各種植酸酶的菌林，例如曲霉菌屬、根霉菌屬、酵母菌屬(5"flcc/m/w^c")、毛霉菌屬(Mwcor)和地絲菌屬(GWc/m附)。優(yōu)選地，曲霉菌屬來源的酶是合適的。更優(yōu)選地，其選自來源于以下曲霉菌屬(As/7ew///"s)的植酸酶，例如無花果曲霉(^45/7e/^7/tw/c肌m)、黑曲霉(^s戸g"/ws)、和土曲霉(^印"^7/fW^TeMS)。為了將大豆中的植酸分解為肌醇，必須切斷酯類基團(tuán)，植酸酶即是進(jìn)行該切斷操作的酶。而且，酸性磷酸酶，可以使用真菌來源的酸性磷酸酶。特別^ko其可以選自來源于以下曲霉菌屬的酸性植酸酶無花果曲霉(J5:/7Wg"/MSyc肌附)，黑曲霉(/45/erg"/w51w/ger)和土曲霉(^45/e,gi〃iw^rrew51)。因為酶處理的植酸分解反應(yīng)可以在非常溫和的條件下進(jìn)^f，因而對蛋白質(zhì)的影響4艮小。例如，本發(fā)明的酶反應(yīng)可以在30-70°〇進(jìn)4亍0.1-30小時。優(yōu)選地，與上述(c)步驟一樣，其通常可以在30-70。C下處理約0.1-4小時，優(yōu)選約10分鐘-l小時。一般而言，因為常規(guī)可獲得的植酸酶通常含有蛋白酶，當(dāng)反應(yīng)長時間進(jìn)行時，由于蛋白酶的活性有時會產(chǎn)生特殊的味道。此外，植酸的分解反應(yīng)可以如上所述在pH3-6.2進(jìn)行，優(yōu)選在pH4-5.5進(jìn)行?？梢允褂萌魏涡螒B(tài)的酶，例如粉末狀或液體狀。以大豆蛋白中的粗蛋白重量計算，加入酶的量為0.01-10重量％，優(yōu)選為0.05-2重量%，更優(yōu)選為約0.1-1重量％。優(yōu)選加入的植酸酶的酶效為0.1-100U/g粗蛋白，優(yōu)選為0.5-20U/g粗蛋白，更優(yōu)選為l-10U/g粗蛋白。酶活性可以如下定量將反應(yīng)混合液在37。C下反應(yīng)30分鐘，向其中加入1.0ml的10y。TCA終止反應(yīng)，其中所述反應(yīng)混合液包括0.5ml的0.2MTris-HCl緩沖液(pH6.5)(其中含有4mM植酸鈉)、0.4ml蒸餾水和0.1ml酶溶液。用Fiske-Subbarow法測量反應(yīng)后的反應(yīng)混合液中的無機(jī)磷酸的含量。在上述條件下能在1分鐘內(nèi)釋放出lnmol的無機(jī)磷酸所用的酶的量定為1單位(U)。在本發(fā)明中，包括用蛋白水解酶分解蛋白質(zhì)的步驟((b)步驟和(c)步驟)和用植酸分解酶分解植酸的步驟((d)步驟)是很重要的?？紤]這些步驟的順序，優(yōu)選先進(jìn)行(b)步驟。優(yōu)選在進(jìn)行(d)步驟之前將反應(yīng)混合液調(diào)節(jié)至酸性。優(yōu)選地，在(c)步驟后或與(c)步驟同時進(jìn)4亍(d)步驟，因為這樣可以將大豆肽混合物的干固體成分中的植酸(六磷酸中肌醇，mesoinositolhexaphosphate)含量降低到0.7重量％以下，優(yōu)選0.2重量％以下，更優(yōu)選檢測極限以下(檢測極限5mg/100g)，所述含量由鉬蘭酸(vanadomolybdicacid)吸光光度法測得。接下來，說明分離和去除不溶性物質(zhì)的(e)步驟。不溶性物質(zhì)包括在大豆蛋白的蛋白酶處理中未分解的殘渣，其易于在大豆蛋白的等電點(diǎn)附近聚集。當(dāng)目標(biāo)大豆肽混合物的溶液中存在這種不溶性物質(zhì)時，需要將其分離和去除。不需要在(b)-(d)步驟的每個步驟后分離不溶性物質(zhì)，但是需要在(b)步驟后的任意步驟分離。換句話說，當(dāng)在(b)步驟后分離和去除不溶性物質(zhì)時，只要在(c)步驟后或(d)步驟后不溶性物質(zhì)不沉淀就不需要分離。當(dāng)在(b)步驟后沒有去除不溶性物質(zhì)的情況下就進(jìn)行(c)步驟或(d)步驟的處理時，可以在(c)步驟或(d)步驟后去除不溶性物質(zhì)。作為分離和去除不溶性物質(zhì)的設(shè)備，可以使用過濾設(shè)備如壓濾機(jī)和膜分離，也可使用離心分離器、旋液分離器等設(shè)備。不溶性物質(zhì)的分離適合在酸性pH(pH3-6.2)的條件下進(jìn)行。酶反應(yīng)后的pH根據(jù)反應(yīng)條件而不同。雖然如此，(b)步驟后，pH通常在pH5-8的范圍內(nèi)。因此，為了分離不溶性物質(zhì)，優(yōu)選將pH值調(diào)整為pH3-6.2，更優(yōu)選調(diào)整為pH4-5.5。因為包括未分解的殘渣的不溶性物質(zhì)容易在大豆蛋白的等電點(diǎn)附近聚集，因此在此pH范圍內(nèi)，上述不溶性物質(zhì)的聚集能力提高，進(jìn)而提高了分離時的分離能力。此操作也叫做酸沉淀。由于沉淀的蛋白質(zhì)可以通過分離步驟去除，因此酸沉淀是沒有問題的。當(dāng)在(c)步驟或(d)步驟后進(jìn)行分離時，由于pH已經(jīng)被調(diào)整到酸性，因此分離可以在不調(diào)整pH的情況下進(jìn)行。此外，即使在分解反應(yīng)混合物中添加鈣或鎂的氯化物；鹽例如硫酸鹽；堿土金屬化合物例如氫氧化物；蛋白聚集劑例如聚丙烯酸鈉、褐藻酸、殼多糖或殼聚糖，仍然可以提高上述不溶性物質(zhì)的聚集能力并提高分解能力。此外，為了提高上述不溶性物質(zhì)的聚集能力和分離能力，可以實施加熱處理步驟。加熱可以比通常使酶失活或滅菌進(jìn)行的加熱處理溫和。加熱可以在如下條件下進(jìn)行加熱時間是10(s"-,xT)分鐘或更短(其中T是加熱溫度(。C))。當(dāng)加熱時間超過此時間時，分解的大豆蛋白水解物出現(xiàn)著色的問題，從品質(zhì)的觀點(diǎn)看是不優(yōu)選的。根據(jù)具體的應(yīng)用，如上述那樣獲得的大豆肽混合物的溶液可以直接使用或者濃縮后使用?？蛇x擇地，也可以經(jīng)過滅菌和干燥步驟。滅菌和干燥步驟中使用的設(shè)備是不受特別限制的，只要是普通的滅菌設(shè)備即可，例如，蒸汽注入型的連續(xù)直熱式滅菌設(shè)備是優(yōu)選使用的。具體地，滅菌可以在下述條件下進(jìn)行溫度為100-160。C,優(yōu)選105-145°C;滅菌時間是l秒-3分鐘。此外，干燥方法不受特別限制，只要是常規(guī)已知的干燥方法即可，例如，可優(yōu)選使用冷凍干燥、噴霧干燥、真空干燥等。而且，在滅菌和干燥之前，可以加入各種配合成分，其例子包括乳化劑、穩(wěn)定劑、營養(yǎng)劑和甜味劑。當(dāng)計劃應(yīng)用于酸性食品和飲料例如酸性飲料和酸性果凍時，大豆肽混合物的平均分子量為200-5000，優(yōu)選200-3000為宜。此外，在大豆肽混合物的干固體成分中，植酸(六磷酸中肌醇)的量為0.7重量％以下，優(yōu)選為0.2重量％以下，更優(yōu)選檢測不到植酸，所述量由鉬蘭酸吸光光度法測得(檢測極限5mg/100g)。如上所述，在使用(a)的大豆蛋白的情況下，結(jié)合(b)步驟、(c)步驟和(d)步驟，并且最后在(e)步驟中去除不溶性物質(zhì)，可以獲得在酸溶液中不形成渣滓的大豆蛋白水解物。接下來說明本發(fā)明中使用的分析方法。TCA、溶解率將蛋白質(zhì)以1.0重量％的濃度分散在水中并且充分?jǐn)嚢柚瞥扇芤?，用凱氏定氮法、Lowry法或其它類似方法測定溶液中15%三氯乙酸(TCA)溶解的蛋白質(zhì)相對于總蛋白質(zhì)的比率。平均分子量通過使用高效液相色譜的凝膠過濾法所獲得的色譜的分子量分布來計算大豆肽混合物的平均分子量。具體地，按如下方法進(jìn)行。(1)將大豆肽混合物溶解在洗脫劑(45%乙腈、0.05%三氟乙酸溶液)中，濃度為0.1重量％，并且用孔徑為0.2jim的膜過濾器過濾，以制備測試溶液。(2)用下述凝膠過濾法獲得測試溶液的色譜柱TSK凝膠G3000PWXL(ToshoCorporation)和TSK凝膠G2500PWXL(ToshoCorporation)，兩柱串聯(lián)；洗脫劑的流速0.3ml/min;柱溫40°C;檢測方法在220rnn的波長下檢測吸光度。(3)以橫軸為持續(xù)時間、縱軸為220nm處的吸光值，繪制樣品的分子量分布曲線來計算平均分子量。使用JASCOCorporation生產(chǎn)的JASCO-BORWIN色譜數(shù)據(jù)處理程序，進(jìn)行色譜的數(shù)據(jù)處理。游離氨基酸的量大豆肽混合物中游離氨基酸的量以如下方式定量大豆肽混合物以0.4重量％的濃度分散在3%磺基水楊酸中，沉淀和去除肽成分，用HitachiCo.，Ltd.生產(chǎn)的L-8500型高性能氨基酸分析儀檢測可溶性成分。以下實施例中的游離氨基酸的量表示為干固體成分中的含量。實施例以下，用實施例具體說明本發(fā)明的實施方式。然而，本發(fā)明不局限于這些實施例的技術(shù)范圍內(nèi)。除了另外指出的之外，實施例中的全部百分比為重量百分比。實施例1向6重量份45。C溫水中，緩慢加入1重量份NS190的低度變性脫脂大豆片。在用鹽酸調(diào)整到pH4.2的同時輕輕攪拌混合物IO分鐘后洗滌，然后用離心分離器(1500G，IO分鐘)分離和去除溶出的乳清成分，獲得2重量份濃縮大豆蛋白。向2重量份的這種濃縮大豆蛋白中，加入6重量份的45。C溫水。輕微攪拌10分鐘后洗滌，溶出的乳清成分用離心分離器(1500G,IO分鐘)分離和去除，獲得6重量份乳清和2重量份濃縮大豆蛋白，該濃縮大豆蛋白的含水量為63%、每份固體成分的粗蛋白含量為72%。向該2重量份的濃縮大豆蛋白中，加入4重量份水，將混合物調(diào)整到pH7.0，攪拌30分鐘，離心獲得提取殘留物和4重量份提取物(固體成分8.0%)。提取在60'C進(jìn)行，用1500G、IO分鐘的離心分離條件進(jìn)行固-液分離，用20。/。氫氧化鈉溶液調(diào)整提取物的pH值。如此獲得的大豆蛋白提取物用蒸汽注入型連續(xù)直熱式滅菌器在14(TC滅菌10秒鐘，然后噴霧干燥制得水分含量為5%的大豆蛋白分離物粉末。每份干固體成分中的粗蛋白含量為90%。將如此獲得的大豆蛋白分離物粉末在58。C下溶解制成pH8.5的8%溶液，然后，加入1.5%E/S比例的"ProtinAY40"(由DaiwaKaseiCo.，Ltd.生產(chǎn))作為蛋白水解酶，然后在58。C水解3小時(15。/。TCA溶解率70%)。"ProtinAY40"是內(nèi)切型堿性蛋白酶。酶促反應(yīng)后向大豆蛋白水解物溶液中加入檸檬酸調(diào)整到pH4.5,然后對混合物進(jìn)行加熱處理(85。C超過10分鐘)，然后離心(1500G,20分鐘)分離和去除含有未分解殘渣的不溶性物質(zhì)。獲得的離心上清液中水解物的15。/。TCA溶解率是99。/。，平均分子量是1200，游離氨基酸的量大約是0.6%。向獲得的離心上清液中，加入0.5。/qE/S比例的植酸分解酶"S腿izymePHY"(由ShinNihonChemicalsCo"Ltd.生產(chǎn))和0.04%E/S比例的才艮霉菌屬來源的"肽酶R"(由AmanoEnzymeInc.生產(chǎn))，混合物在50。C反應(yīng)10分鐘。"肽酶R，，是中性肽酶，但是含有內(nèi)切型和外切型的酸性蛋白酶。酶反應(yīng)后的大豆蛋白水解物溶液用蒸汽注入型連續(xù)直熱式滅菌器在120'C滅菌7秒鐘，然后噴霧干燥，制、成水分含量為4%的大豆肽混合物粉末。獲得的大豆肽混合物，15。/。TCA溶解率是99。/。，平均分子量是1100，游離氨基酸的量大約是1%。而且，當(dāng)用鉬蘭酸吸光光度法檢測這種大豆肽混合物的干固體成分中的植酸(六磷酸中肌醇)含量時，沒有檢測到植酸(檢測極限5mg/100g)。實施例2除了在酸性條件下反應(yīng)的"肽酶R，，(由AmanoEnzymeInc.生產(chǎn))的加入量不同，其它按照實施例1中所述的相同步驟，制備大豆肽混合物粉末。而且，以不同添加量單獨(dú)使用以下各種酶來代替這種酶，如來源于根霉菌屬的"Newlase3FG，，(由AmanoEnzymeInc.生產(chǎn))，及來源于曲霉菌屬的"SumizymeAP"(由ShinNihonChemicalsCo"Ltd.生產(chǎn))、"SumizymeFP"(由ShinNihonChemicalsCo"Ltd.生產(chǎn))、"SumizymeLP"(由ShinNihonChemicalsCo"Ltd.生產(chǎn))、"SumizymeLPL，，(由ShinNihonChemicalsCo"Ltd.生產(chǎn))、"蛋白酶M，，(由AmanoEnzymeInc.生產(chǎn))和"蛋白酶A"(由AmanoEnzymeInc.生產(chǎn))，均按照相同的步驟制備大豆肽混合物粉末。上述這些酶都含有內(nèi)切和外切型酸性蛋白酶。渣滓的檢測用濁度計(OD:光密度)檢測上述實施例1、參考例1(后述)和比較例1-3(后述)所得各種大豆肽混合物的酸性溶液在冷藏下形成的渣滓。分別制備實施例1、2、參考例1(后述)和比較例1、2、3(后述)獲得的大豆肽混合物粉末的5%水溶液，用檸檬酸調(diào)整到pH3.8，然后冷卻到4°C，檢測其濁度(OD61Gnm)。實施例1、參考例1和比較例1、2、3的結(jié)果如表l所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在實施例1中，OD6H)鵬是0.013，抑制了渣滓的形成。下面，實施例2每種蛋白酶的添加量和其冷藏時的濁度的結(jié)果如表2中所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>從表2中可以看出，即使冷藏，在弱酸性條件下(pH4.5)反應(yīng)也不形成渣滓的酶是來源于根霉菌屬的"肽酶R"和"Newlase3FG"，來源于曲霉菌屬的"SumizymeFP"、"SumizymeLP"、"SumizymeLPL"、"蛋白酶M"和"蛋白酶A"。盡管加入0.3%"SumizymeAP"也不能完全防止渣滓形成，但是其可以降低所形成的漆滓量。當(dāng)制備由實施例1和下述參考例1獲得的大豆肽混合物的5%水溶液時，對比味道，發(fā)現(xiàn)實施例1制備的產(chǎn)品與參考例1相比降低了不受歡迎的氣味和壞的味道例如澀味，其味道優(yōu)良。參考例1由方法A制備的大豆蛋白的蛋白酶處理。向1重量份低度變性脫脂大豆片(NS1卯)中，加入12重量份40°C溫水，用氳氧化鈉溶液將混合物調(diào)整到pH7.0。用勻漿器(TokuahuKikakouCo.，Ltd.生產(chǎn))將此大豆分散液在5000rpm攪拌1小時，提取蛋白質(zhì)，然后用離心分離器(1500G,10分鐘)去除"豆渣"獲得脫脂豆乳。向此脫脂豆乳中，加入鹽酸調(diào)整到pH4.5，用離心分離器收集沉淀的蛋白凝乳。向此蛋白凝乳中加入水，攪拌混合物制成凝乳淤漿(DM9.0%)。當(dāng)pH調(diào)整到7.0后，用蒸汽注入型連續(xù)直熱式滅菌器將混合物在140。C滅菌IO秒鐘，獲得大豆蛋白提取物。將其噴霧干燥制成水分含量為5%的大豆蛋白分離物粉末，然后在58"制成pH8.5的8%溶液。向由此獲得的大豆蛋白溶液中，以1.5%E/S比例加入"ProtinAY40"(由DaiwaKaseiCo.，Ltd.生產(chǎn))作為蛋白水解酶，混合物在58°C水解3小時(15。/。TCA溶解率70%)。酶反應(yīng)后，向大豆蛋白水解溶液中加入檸檬酸調(diào)整到pH4.5，對混合物進(jìn)行加熱處理(85。C10分鐘)，然后離心(1500G，20分鐘)分離和去除含有未分解殘渣的不溶性物質(zhì)。用蒸汽注入型連續(xù)直熱式滅菌器將生成的大豆蛋白水解物溶液在120。C滅菌7秒鐘，然后噴霧干燥制成水分含量為4%的大豆肽混合物粉末。如表l中所示，由方法A制成的這種大豆肽混合物的溶液的濁度(OD61()nm)低至0.043。即，僅僅使用(b)步驟(中性到堿性條件下的蛋白酶處理)和(e)步驟(分離和除去不溶性物質(zhì))就不形成渣滓。換句話說，這種大豆肽混合物，沒有經(jīng)過酸性條件下的蛋白酶處理和植酸分解酶處理，如表l中所示即使在酸性條件下也不形成渣滓。比較例1頁除了不加入在酸性條件下反應(yīng)的"肽酶R"(由AmanoEnzymeInc.生產(chǎn))之外，其它按照實施例1中的相同步驟，制備大豆肽混合物粉末。如表l中所示，不在酸性條件下進(jìn)行蛋白酶處理，濁度(OD^^)高達(dá)1.184，形成了渣滓。比較例2除了在植酸酶反應(yīng)(酸性條件)中不加入"肽酶R，，(由AmanoEnzymeInc.生產(chǎn))而在水解過程(pH6.3-8.5)中以0.05%的E/S比例加入"ProtinAY40"(由DaiwaKaseiCo"Ltd.生產(chǎn))之外，其它按照實施例l中的相同步驟，制備大豆肽混合物粉末。然而，ODh。目是1.356并且即使在弱堿性到中性條件下(pH6.3-8.5)的蛋白質(zhì)水解過程中加入"肽酶R，，(由AmanoEnzymeInc.生產(chǎn))也不能抑制渣滓的形成。比較例3除了不加入"SumizymePHY，，作為植酸酶(由ShinNihonChemicalsCo.,Ltd.生產(chǎn))之外，其它按照實施例1中的相同步驟制備大豆肽混合物粉末。如表l中所示，OD61()nmA1.349并且因為沒有加入植酸酶而形成了渣滓。工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明，可以制備大豆肽混合物，其比普通的大豆肽混合物具有更好的味道并且即使在酸溶液中(特別是pH3-4.5)也不形成渣滓。由此，即使將此大豆肽混合物用于酸性條件下的食品和飲料例如酸性飲料和酸性果凍，得到的產(chǎn)品也具有良好的口感并且不形成渣滓。因此，此大豆肽混合物可以用于廣泛的酸性食品和飲料，尤其是，酸性液態(tài)食品。本發(fā)明中使用的大豆蛋白原料是由
背景技術(shù)：
中描述的方法B制備的，而使用方法A制備的大豆蛋白可以獲得在酸性冷藏液體中不形成渣滓的大豆肽混合物是不言而喻的。然而，從味道的角度，使用由方法B制備的大豆蛋白提供了比使用由方法A獲得的大豆蛋白原料具有更好味道的大豆肽混合物。權(quán)利要求1.大豆肽混合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(a)用水提取濃縮大豆蛋白獲得提取物；(b)在堿性到中性條件下用蛋白酶處理提取物；(c)在酸性條件下用蛋白酶進(jìn)一步處理生成的產(chǎn)物；(d)用植酸分解酶處理生成的產(chǎn)物；和(e)從產(chǎn)物中分離和去除不溶性物質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，(b)步驟中使用的酶包括內(nèi)切型。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，(b)步驟中的水解度，以根據(jù)蛋白質(zhì)成分在15%三氯乙酸中的溶解率計算的大豆蛋白分解率計，為20-98%。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，(c)步驟中使用的酶包括外切型。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，(c)步驟中使用的酶是曲霉菌屬或根霉菌屬來源的酶。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，(d)步驟在(c)步驟之后或同時進(jìn)行。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，大豆肽混合物的平均分子量是200-5000。全文摘要本發(fā)明的目的是提供一種大豆蛋白水解物，特別是一種具有相對低分子量的大豆肽混合物，其中所述大豆蛋白水解物可由說明書中所述“方法B”制備的大豆蛋白水解而得到，其即使在酸性條件下冷藏也不形成渣滓。本發(fā)明公開了大豆肽混合物的制備方法，包括步驟(a)用水提取濃縮大豆蛋白獲得提取物；(b)在堿性到中性條件下用蛋白酶處理提取物；(c)在酸性條件下用蛋白酶進(jìn)一步處理生成的產(chǎn)物；(d)用植酸分解酶處理生成的產(chǎn)物；和(e)從產(chǎn)物中分離和去除不溶性物質(zhì)。文檔編號A23J3/00GK101336076SQ20068005200公開日2008年12月31日申請日期2006年12月6日優(yōu)先權(quán)日2005年12月6日發(fā)明者中森俊宏,劉新旗,片瀨滿申請人:不二制油株式會社