專利名稱：：使用硫酸鹽通透酶表達(dá)增強(qiáng)的微生物制備甲硫氨酸及其前體高絲氨酸或琥珀酰高絲氨酸...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過(guò)在包含碳源和硫源的適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物來(lái)生產(chǎn)曱硫氨酸或其衍生物的方法。要求保護(hù)的微生物以下述方式修飾半胱氨酸和/或Cl單位的產(chǎn)生被增強(qiáng)和/或Cl單位向高半胱氨酸上的轉(zhuǎn)移潛力被提高或優(yōu)化。還要求保護(hù)從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離甲硫氨酸或其衍生物。
背景技術(shù)：
：含硫的化合物例如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺普曱硫氨酸對(duì)于細(xì)胞代謝是關(guān)鍵性的，并被工業(yè)生產(chǎn)以用作食品或飼料添加劑和藥物。尤其是甲硫氨酸(一種不能由動(dòng)物合成的必需氨基酸)在許多身體功能中起重要作用。除了其在蛋白質(zhì)生物合成中的作用以外，曱硫氨酸還涉及轉(zhuǎn)曱基作用以及硒與鋅的生物利用率。甲硫氨酸也被直接用于治療病癥如變態(tài)反應(yīng)和風(fēng)濕熱。盡管如此，所生產(chǎn)的大部分甲硫氨酸被添加進(jìn)動(dòng)物飼料中。BSE和禽流感導(dǎo)致動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)的使用減少，因此對(duì)純甲硫氨酸的需求提高。從化學(xué)上講，D,L-甲硫氨酸普遍由丙烯醛、甲基硫醇和氰化物產(chǎn)生。然而例如在雞飼料添加劑中，外消旋混合物不如純L-曱硫氨酸功效好(Saunderson,C丄.，(1985)BritishJournalofNutrition54，621-633)。純L-甲硫氨酸可由外消旋甲硫氨酸產(chǎn)生，例如通過(guò)用?；柑幚鞱-乙酰基-D，L-甲硫氨酸來(lái)產(chǎn)生，這顯著提高了生產(chǎn)成本。與環(huán)境因素相關(guān)而對(duì)純L-甲硫氨酸逐漸增加的需求使得曱硫氨酸的微生物生產(chǎn)很有吸引力。微生物已經(jīng)發(fā)展出高度復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，所述機(jī)制精細(xì)地調(diào)節(jié)細(xì)胞組分的生物合成，從而允許最大的生長(zhǎng)速度。因此，只有需要量的代謝物(例如氨基酸)被合成，并且通常不能在野生型菌林的培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到。細(xì)菌主要通過(guò)酶的反饋抑制和基因轉(zhuǎn)錄的阻抑或激活來(lái)控制氨基酸生物合成。這些調(diào)節(jié)途徑的效應(yīng)物在多數(shù)情況下是相關(guān)途徑的最終產(chǎn)物。因此，用于在微生物中過(guò)量生產(chǎn)氨基酸的策略需要解除這些控制機(jī)制的調(diào)節(jié)。L-甲硫氨酸合成的途徑在許多微生物中是公知的。甲硫氨酸來(lái)自氨基酸天冬氨酸，但是其合成需要匯聚兩個(gè)其它途徑一一半胱氨酸生物合成和Cl代謝(N-甲基四氫葉酸)。天冬氨酸通過(guò)一系列三個(gè)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為高絲氨酸。高絲氨酸可隨后進(jìn)入蘇氨酸/異亮氨酸或甲硫氨酸生物合成途徑。在大腸桿菌中，進(jìn)入甲硫氨酸途徑需要將高絲氨酸?；社牾８呓z氨酸。該活化步驟允許隨后與半胱氨酸縮合，產(chǎn)生含石危醚的胱硫醚，胱硫醚水解得到高半胱氨酸。通過(guò)812依賴性或812非依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行最后產(chǎn)生曱硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移。大腸桿菌中的甲硫氨酸生物合成受到MetJ和MetR蛋白分別阻抑和激活曱硫氨酸生物合成基因的調(diào)節(jié)(綜述于Neidhardt,F.C.(主編)，R.CurtissIII，J.L.Ingraham，E.C.C.Lin,K.B.Low,B.Magasanik,W.S.Reznikoff,M.Riley,M.Schaechter，以及H.E.Umbarger(編輯)，1996,EscherichiacoliandSalmonella:CellularandMolecularBiology.AmericanSocietyforMicrobiology;Weissbach等，1991Mol.Microbiol.,5,1593-1597)。已知MetJ與其輔阻抑物S-腺普甲硫氨酸調(diào)節(jié)基因we,A、附CB、附WC、附CE和w"F。編碼涉及甲石危氨酸產(chǎn)生的酶的其它基因(例如gfyA、附WE、附e沮和w^F)由MetR激活，而附CA被MetR阻抑。相應(yīng)的酶均參與Cl單位的產(chǎn)生及其從絲氨酸到甲硫氨酸的轉(zhuǎn)移。GlyA編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化絲氨酸轉(zhuǎn)化成甘氨酸以及輔酶四氫葉酸(THF)上Cl單位的并發(fā)轉(zhuǎn)移。亞甲基-THF形式的Cl單位需要還原成甲基-THF，然后才能轉(zhuǎn)移到高半胱氨酸上，得到甲硫氨酸。該反應(yīng)由MetF蛋白催化。甲基的轉(zhuǎn)移由MetH通過(guò)維生素B12催化或直接由MetE催化。已知MetH酶的催化速率比MetE酶高一百倍。在沒(méi)有B12、因此也沒(méi)有活性MetH時(shí)，MetE可構(gòu)成細(xì)胞總蛋白的多達(dá)5%。活性MetH的存在很可能通過(guò)減少高半胱氨酸的量來(lái)降低MetE活性，高半胱氨酸通常通過(guò)MetR激活附WE的轉(zhuǎn)錄。因此，由于不表達(dá)大量的MetE，經(jīng)由MetH的曱石危氨酸產(chǎn)生為細(xì)胞節(jié)約了重要的資源。高半胱氨酸的累積對(duì)于大腸桿菌是有毒的(Tuite等，2005J.Bacterid,187,13,4362-4371.),同時(shí)對(duì)經(jīng)由MetR的柳CA表達(dá)具有負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)。因此，酶MetH和/或MetE的強(qiáng)表達(dá)顯然是高效產(chǎn)生曱硫氨酸所需要的。在大腸桿菌中，還原的硫整合進(jìn)半胱氨酸中，然后轉(zhuǎn)移至甲硫氨酸前體O-琥珀酰高絲氨酸上，該過(guò)程稱作轉(zhuǎn)硫化作用(transulfuration)(綜述于Neidhardt,F.C.(主編),R.CurtissIII,J.L.Ingraham,E.C.C.LinK.B.Low,B.Magasanik,W.S.Reznikoff,M.Riley,M.Schaechter以及H.E.Umbarger(編輯).1996.EscherichiacoliandSalmonella:CellularandMolecularBiology.AmericanSocietyforMicrobiology)。半脫氛酸由O-乙酰絲氨酸和H2S通過(guò)硫化氫解作用來(lái)產(chǎn)生。該過(guò)程受到產(chǎn)物半胱氨酸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，半胱氨酸作用于由CysE編碼的絲氨酸轉(zhuǎn)乙?；浮Ｓ蒓-乙酰絲氨酸自發(fā)產(chǎn)生的N-乙酰絲氨酸與轉(zhuǎn)錄因子CysB—起激活編碼下述酶的基因，所述酶涉及轉(zhuǎn)運(yùn)疏化合物、將其還原成H2S和將其整合進(jìn)入有機(jī)硫化合物半胱氨酸，半胱氨酸像甲硫氨酸一樣是必需氨基酸。不存在半胱氨酸時(shí)，MetB催化將曱硫氨酸前體O-琥珀酰高絲氨酸轉(zhuǎn)化成氨、a-酮丁酸(ketobutyrate)和琥珀酸，該反應(yīng)稱作，消除(Aitken&Kirsch，2005,ArchBiochemBiophys433,166-75)。a國(guó)酮丁酸可隨后轉(zhuǎn)化成異亮氨酸。該副反應(yīng)對(duì)曱硫氨酸的工業(yè)生產(chǎn)而言是不想要的，因?yàn)閮煞N氨基酸難以分離。因此，低，消除活性是甲硫氨酸工業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要方面。2005年2月7日提交的臨時(shí)專利申請(qǐng)US60/650,124描述了如何通過(guò)優(yōu)化酶MetB來(lái)降低y-消除。優(yōu)化半胱氨酸生物合成流也能夠降低y-消除，從而降低副產(chǎn)品異亮氨酸的產(chǎn)生，這構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及在發(fā)酵過(guò)程中使用微生物生產(chǎn)曱硫氨酸、其前體或其衍生產(chǎn)物的方法，所述微生物具有提高的半胱氨酸產(chǎn)生，并在確定的碳源和硫源上生長(zhǎng)。甲硫氨酸前體定義為屬于甲硫氨酸特異性代謝途徑一部分的代謝物，或者可來(lái)自于這些代謝物。甲硫氨酸特異性途徑開(kāi)始于高絲氨酸琥珀?；D(zhuǎn)移酶(MetA)將高絲氨酸轉(zhuǎn)化為琥珀酰高絲氨酸。來(lái)自曱硫氨酸的產(chǎn)物來(lái)源于甲硫氨酸轉(zhuǎn)化和/或降解途徑。為了提高半胱氨酸生產(chǎn)，發(fā)明人已經(jīng)增強(qiáng)了涉及半胱氨酸生產(chǎn)的基因的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"增強(qiáng)的"在本文中描述相應(yīng)DNA所編碼酶活性的胞內(nèi)活性的提高，例如通過(guò)增加基因的拷貝數(shù)、使用強(qiáng)啟動(dòng)子或使用具有提高活性的等位基因以及在可能情況下這些手段的組合來(lái)實(shí)現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)"提高的表達(dá)"或"增強(qiáng)的表達(dá)"在本文中均有使用并具有相似的含義。為了提高基因的表達(dá)，其可被染色體編碼或染色體外編碼。染色體編碼時(shí)，基因組上可以有一個(gè)或若干個(gè)可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組方法引入的拷貝。染色體外編碼時(shí)，基因可以被不同類型的質(zhì)粒負(fù)載，所述質(zhì)粒在復(fù)制起點(diǎn)方面不同，從而在細(xì)胞中的拷貝數(shù)不同。它們可以以l-5個(gè)拷貝存在，約20個(gè)或高達(dá)500個(gè)拷貝存在，對(duì)應(yīng)于具有嚴(yán)緊型復(fù)制的低拷貝數(shù)質(zhì)粒(pSC101,RK2)、低拷貝數(shù)質(zhì)粒(pACYC，pRSF1010)或高拷貝數(shù)質(zhì)粒(pSKbluescript11)。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基因可以使用具有不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)，所述啟動(dòng)子需要或不需要通過(guò)誘導(dǎo)物分子來(lái)誘導(dǎo)。這些啟動(dòng)子可以是同源的或異源的。實(shí)例為啟動(dòng)子Ptrc、Ptac、Plac、X啟動(dòng)子cl或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它啟動(dòng)子。靶基因的表達(dá)可以被使相應(yīng)信使RNA(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15,58國(guó)64)或蛋白質(zhì)(例如GSTtags,AmershamBiosciences)穩(wěn)定或去穩(wěn)定的元件加強(qiáng)或降低.本發(fā)明還涉及微生物，所述微生物含有本發(fā)明待增強(qiáng)基因的一個(gè)或若干個(gè)等位基因。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，增強(qiáng)了半胱氨酸產(chǎn)生所涉及基因的表達(dá)。半胱氨酸產(chǎn)生所涉及基因包括編碼硫源輸入、硫源轉(zhuǎn)化為硫化氬以及硫化氫同化作用或硫源進(jìn)入半胱氨酸或其衍生物所需蛋白質(zhì)的基因。在大腸桿菌中，這些蛋白質(zhì)由以下基因(后面是登錄號(hào)和相應(yīng)多肽的功能)編碼在本發(fā)明的描述中，使用大腸桿菌中相應(yīng)基因的命名來(lái)標(biāo)識(shí)基因和蛋白質(zhì)。然而，除非另有說(shuō)明，這些名稱的使用具有本發(fā)明更普遍的含義，并涵蓋其它生物(更特別地是微生物)中所有的相應(yīng)基因和蛋白質(zhì)。PFAM(比對(duì)和隱Markov模型的蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)；合。每個(gè)PFAM使得有可能顯示多重比對(duì)、察看蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、評(píng)價(jià)在生物間的分布、進(jìn)入其它數(shù)據(jù)庫(kù)，以及顯示已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。COG(clustersoforthologousgroupsofproteins,蛋白質(zhì)直系同源組聚類；http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)通過(guò)比較來(lái)自66個(gè)完全測(cè)序的基因組(其代表了30條主要的種系發(fā)生線)的蛋白質(zhì)序列而獲得。每個(gè)COG通過(guò)至少三條線來(lái)定義，這樣可以鑒定出以前的保守結(jié)鑒定同源序列及其同源性百分比的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，功能硫酸鹽通透酶好u酸鹽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的組件膜結(jié)合的辟u酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cysK上游的ORFATP硫酸化酶好b酸腺香酰轉(zhuǎn)移酶腺苷酰硫酸激酶腺苷酰-危酸還原酶亞石克酸鹽還原酶，a亞基亞硫酸鹽還原酶，P亞基絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶半胱氨酸合酶0-乙酰基絲氨酸硫化氫解酶石克酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)周質(zhì)硫酸鹽結(jié)合蛋白，Z，NcysZsbp構(gòu)域。尤其是可在網(wǎng)站http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上使用的BLAST程序，其以該網(wǎng)站上標(biāo)明的默認(rèn)參數(shù)使用。然后可以使用例如程序CLUSTALW(http:〃www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http:〃prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi國(guó)bin/multalin.pl)，使用那些網(wǎng)站上標(biāo)明的默認(rèn)參數(shù)來(lái)利用(例如比對(duì))獲得的序列。使用GenBank上針對(duì)已知基因給出的參考，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定在其它生物、細(xì)菌菌林、酵母、真菌、哺乳動(dòng)物、植物等中的等價(jià)基因。該常規(guī)工作有利地使用可如下確定的共有序列來(lái)完成與來(lái)自其它微生物的基因進(jìn)行序列比對(duì)，以及設(shè)計(jì)筒并探針以克隆另一生物中的相應(yīng)序列。這些分子生物學(xué)常規(guī)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并描述于例如Sambrook等(1989MolecularCloning:aLaboratoryManual.2nded.ColdSpringHarborLab.，ColdSpringHarbor,NewYork.)中。作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，修飾本發(fā)明方法中使用的微生物以提高本發(fā)明還涉及含有編碼本發(fā)明絲氨酸轉(zhuǎn)乙?；傅囊粋€(gè)或多個(gè)等位基因的微生物。這些菌林通過(guò)下述事實(shí)來(lái)表征它們所具有的半胱氨酸代謝通過(guò)提供用于"胱硫醚合成(由MetB催化的反應(yīng))的底物濃度提高而允許朝向曱硫氨酸的通量提高。在低半胱氨酸濃度下，MetB酶從琥珀酰高絲氨酸生產(chǎn)氨、琥珀酸和a-酮丁酸，這是稱作，消除的反應(yīng)。提高的半胱氨酸濃度減少了所產(chǎn)生的a-酮丁酸的量，因此提高了朝向甲硫氨酸的流量。絲氨酸轉(zhuǎn)乙?；富钚缘脑鰪?qiáng)表達(dá)可以在使用絲氨酸和乙酰CoA的酶測(cè)試中驗(yàn)證。通過(guò)添加含絲氨酸轉(zhuǎn)乙?；富钚缘牡鞍踪|(zhì)提取物來(lái)開(kāi)始反應(yīng)，并在蛋白質(zhì)沉淀和用硅烷化試劑衍生后通過(guò)GC-MS監(jiān)測(cè)O-乙酰絲氨酸的形成。本發(fā)明還涉及編碼O-乙酰絲氨酸硫化氫解酶的cysM基因的增強(qiáng)表達(dá)，這允許提高硫代硫酸鹽進(jìn)入硫代半胱氨酸的整合，這加強(qiáng)了半胱氨酸的產(chǎn)生。本發(fā)明因此要求保護(hù)一種方法，其中通過(guò)優(yōu)化半胱氨酸的生產(chǎn)來(lái)降低，消除，并從而降低異亮氨酸的產(chǎn)生。本發(fā)明的異源啟動(dòng)子應(yīng)理解為修飾的野生型啟動(dòng)子或者來(lái)自另一生物的任何啟動(dòng)子或者完全合成的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，異源啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子，例如Ptrc、Ptac、Xcl或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它啟動(dòng)子。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，要求保護(hù)一種方法，其中將微生物用于生產(chǎn)甲硫氨酸或其衍生物，其中提高或優(yōu)化表達(dá)涉及C1單位產(chǎn)生和/或其向高半胱氨酸上轉(zhuǎn)移的潛力的基因。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)將目的基因的表達(dá)水平以獲得最高甲硫氨酸產(chǎn)生的方式進(jìn)行適應(yīng)性改造來(lái)實(shí)現(xiàn)優(yōu)化。在多數(shù)情況下，這通過(guò)使用例如異源啟動(dòng)子創(chuàng)建相關(guān)基因的表達(dá)文庫(kù)并篩選最佳生產(chǎn)者來(lái)完成。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)C1單位描述單個(gè)碳原子，所述碳原子作為甲基、亞甲基、次甲基或曱酰基與運(yùn)載體分子四氫葉酸結(jié)合。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)移潛力，，描述了微生物將Cl單位轉(zhuǎn)移至高半胱氨酸上的能力。該潛力通過(guò)已經(jīng)被發(fā)明人增強(qiáng)和/或優(yōu)化的MetF和/或MetH的活性來(lái)測(cè)定。涉及Cl單位產(chǎn)生的基因列于以下<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>涉及將Cl單位轉(zhuǎn)移至高半胱氨酸上的基因列于以下:/nefF17903775,10-亞甲基四氫葉酸還原酶/&H179(M50B12-依賴性高半胱氨酸-N5-曱基四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶ot"E2367304四氪蝶酰三谷氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在本發(fā)明特別優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，修飾用于生產(chǎn)甲硫氨酸的微生物以提高挑CF或附WH或二者的表達(dá)，或從異源啟動(dòng)子表達(dá)wCF。增強(qiáng)的維生素B12依賴性甲硫氨酸合酶(MetH)活性可以在酶測(cè)試中在維生素B12和SAM存在下使用甲基-THF和高半胱氨酸來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)添加含亞曱基四氫葉酸還原酶活性的蛋白質(zhì)提取物來(lái)開(kāi)始反應(yīng)，并在蛋白質(zhì)沉淀和用珪烷化試劑衍生后通過(guò)GC-MS監(jiān)測(cè)曱硫氨酸的形成。可以通過(guò)提高甲硫氨酸生物合成中所涉及其它基因的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步提高甲硫氨酸產(chǎn)生，這也是本發(fā)明的一個(gè)目的。這些基因列于以下膨fAl790443高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶附e氾1790375胱At醚-y—合酶/neiC1789383胱硫醚-^-裂合酶meff17903775,10-亞曱基四氬葉酸還原酶附e汲17卯262metE、metH和metF的正調(diào)節(jié)基因另外，可以降低降解甲硫氨酸或偏離甲硫氨酸生產(chǎn)途徑的途徑中基因的表達(dá)，或者可以缺失所述基因。印eD1786311S-腺香曱硫氨酸脫羧酶印eC1789337鳥(niǎo)氨酸脫羧酶加A1788043精氨酸琥珀酰基轉(zhuǎn)移酶鄉(xiāng)A1788823二氫p比咬二羧酸合酶可以通過(guò)表達(dá)以下基因來(lái)加強(qiáng)回補(bǔ)反應(yīng)。邵c1790393磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶p/wI787"4磷酸烯醇式丙酮酸合酶可以通過(guò)過(guò)表達(dá)以下基因來(lái)加強(qiáng)消耗乙酸的反應(yīng)。flcs1790505乙酰CoA合成酶L-甲硫氨酸、其前體或其衍生化合物的產(chǎn)生可通過(guò)過(guò)表達(dá)一個(gè)或多個(gè)下列基因來(lái)實(shí)現(xiàn)額外的提高例如來(lái)自菜豆才艮瘤菌(i/^M/ww"http://)的丙酮酸羧化酶(pyc，U51439)或其同系物之一，由基因f/^A(高絲氨酸脫氫酶/天冬氨酸激酶，1786183)(優(yōu)選具有降低的反饋敏感性)、w^L(高絲氨酸脫氫酶/天冬氨酸激酶，g1790376)或/pC(天冬氨酸激酶，1790455)和flW(天冬氨酸半醛脫氫酶)編碼的高絲氨酸合成酶。L-甲硫氨酸、其前體或其衍生化合物的產(chǎn)生通過(guò)缺失阻抑蛋白MetJ的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步提高，該阻抑蛋白如JP2000157267-A/3(也參見(jiàn)GenBank17卯373)所述負(fù)責(zé)下調(diào)甲石克氨酸調(diào)節(jié)子。通過(guò)使用高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶等位基因來(lái)進(jìn)一步提高曱硫氨酸生產(chǎn)，所述等位基因?qū)ζ湟种苿㏒AM和甲硫氨酸的反饋敏感性降低，如專利申請(qǐng)WO2005/111202(并入本文中)中所述?？梢酝ㄟ^(guò)弱化以下基因之一的活性或缺失以下基因之一來(lái)提高L-甲硫氨酸、其前體或其衍生化合物的產(chǎn)生。弱化在本文中描述通過(guò)下列手段降低酶的胞內(nèi)活性，例如降低其表達(dá)、降低酶的穩(wěn)定性、提高其降解和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它解決方案?；?ew&""A:條目活性1788633乙酸激酶1788635磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶1786304丙酮酸脫氳酶E11786305丙酮酸脫氳酶E2/;^1786307丙酮酸脫氬酶E31786948琥珀酰CoA合成酶，p亞基犯cD1786949琥珀酰CoA合成酶，a亞基1789807磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶W"1788160丙酮酸激酶IIp,1787965丙酮酸激酶I1787096丙酮酸氧化酶"vB1790104乙酰鞋酸合酶I,大亞基z7vN1790103乙酰羥酸合酶I,小亞基z7vG1790202乙酰羥酸合酶n，大亞基1790203z雄1790204乙酰羥酸合酶n，小亞基!7vl1786265乙酰羥酸合酶in，大亞基z7vH1786266乙酰羥酸合酶in，小亞基aroF1788953DAHP合成酶aroG1786969DAHP合成酶1787996DAHP合成酶f純1786184高絲氨酸激酶ArC1786185蘇氨酸合酶1788116絲氨酸脫氨酶1789161絲氨酸脫氨酶可通過(guò)使用改變的metB等位基因來(lái)進(jìn)一步提高甲硫氨酸產(chǎn)生，所述等位基因優(yōu)選地或排他地使用H2S并因此從O-琥珀酰高絲氨酸生產(chǎn)高半胱氨酸，如專利申請(qǐng)WO2004/076659(其內(nèi)容通過(guò)參考并入本文)中所述。用于發(fā)酵生產(chǎn)L-甲硫氨酸、其前體或其衍生化合物的硫源可以是以下任何一種或其組合硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化氫、二硫代硫酸鹽、連二亞石克酸鹽、亞-危酸鹽。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，硫源是硫酸鹽和/或硫代硫酸鹽。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)L-曱硫氨酸、其前體或其衍生化合物的方法，所述方法包括發(fā)酵如上所述的產(chǎn)甲石危氨酸的微生物，濃縮甲硫氨酸、其前體或衍生物，以及分離發(fā)酵液中的目的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)"和"發(fā)酵，，可無(wú)差別地使用，表示微生物在含有簡(jiǎn)單碳源的適當(dāng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。根據(jù)本發(fā)明，筒單碳源是本領(lǐng)域技術(shù)人員用于獲得微生物(尤其是細(xì)菌)正常生長(zhǎng)的碳源。特別地，它可以是可同化的糖，例如葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖或糖蜜，或這些糖的副產(chǎn)物。特別優(yōu)選的簡(jiǎn)單碳源是葡萄糖。另一優(yōu)選的筒單碳源是蔗糖。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定用于本發(fā)明微生物的培養(yǎng)條件。特別地，在20"C和55t:之間、優(yōu)選25X:和40"C之間的溫度下發(fā)酵細(xì)菌，更特別地，對(duì)谷氨酸棒桿菌(Cg/i/toiif/ci/附)而言約30匸，對(duì)大腸桿菌而言約發(fā)酵通常在含有具有適應(yīng)所使用細(xì)菌的已知確定組成的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行，所述培養(yǎng)基含有至少一種簡(jiǎn)單碳源，以及必要時(shí)產(chǎn)生該代謝物所需的共底物(co-substrate)。特別地，大腸桿菌的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基可以與M9培養(yǎng)基(Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.ScLUSA32:120-128)和M63培養(yǎng)基(Miller,1992;AShortCourseinBacterialGenetics:ALaboratoryManualandHandbookforEscherichiacoliandRelatedBacteria,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork)或例如由Schaefer等(1999,Anal.Biochem.270:88-96)所定義的培養(yǎng)基具有相同或相似的組成。類似地，用于谷氨酸^^桿菌的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基可以與BMCG培養(yǎng)基(Liebl等，1989，Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205-210)或例如Riedel等(2001,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3:573-583)所述的培養(yǎng)基具有相同或相似的組成?？梢匝a(bǔ)充培養(yǎng)基以補(bǔ)償由突變引入的營(yíng)養(yǎng)缺陷(auxotrophy)。發(fā)酵L-甲硫氨酸、其前體或其衍生化合物后，將其回收和純化(必要時(shí))。用于回收和純化培養(yǎng)基中產(chǎn)生的化合物(例如甲硫氨酸)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員的。任選地，在純化發(fā)酵產(chǎn)物期間可保留從0°/。到100%的生物量。本發(fā)明還涉及經(jīng)優(yōu)化用于發(fā)酵生產(chǎn)曱硫氨酸的微生物。術(shù)語(yǔ)"優(yōu)化的微生物，，描述了這樣的微生物其中整合了上述修飾，從而生產(chǎn)目的代謝產(chǎn)物時(shí)具有最佳的工業(yè)性能以及有可能副產(chǎn)物的生產(chǎn)最低。在一個(gè)優(yōu)選的應(yīng)用中，所述生物為大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌或釀酒酵在最優(yōu)選的應(yīng)用中，所述生物為大腸桿菌。發(fā)明詳述2004年5月12日提交的PCTN。PCT/IB04/001901中描述了一種大腸桿菌菌株，其中由metJ基因編碼的甲硫氨酸阻抑物被氯霉素盒代替(A附WJ::Cm)，并具有挑"A等位基因，所述附WA等位基因?qū)诇p歲酸和SAM(附WA"1)具有的反饋敏感性降低。向該菌林中引入以下遺傳修飾。MG1655wCA*llA附&J::CmP^r畫柳"F::Km的構(gòu)建為了克隆位于異源P加啟動(dòng)子控制下的基因，使用Datsenko&Wanner(2000)描述的同源重組策略。該策略允許在目的基因附近插入氯霉素或卡那霉素抗性盒。為此，^使用以下的寡核苷酸PtrcmetFR(SEQIDNO1)GCCAGGCTCTGATTCAGGGCATCCCGCTGGCTGGCGTGAAAAAAGCTCATafltotoccfcc加ttccacac敏atocgagcc欲啤a加aflf扭cflflcagcfcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其具有-與基因metF(網(wǎng)站http:〃genolist,pasteur.fr/Colibri/上的參照序列)的序列(4130259-4160195)同源的區(qū)域(大寫)-與具有RBS(黑體)和-35與-10盒(黑體)的啟動(dòng)子Ptrc序列同源的區(qū)域(斜體)-用于擴(kuò)增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner,B丄"2000，PNAS,97:6640-6645中的參照序列)的區(qū)域(大寫)Ptrc-metFF(SEQIDNO2)ccttcatetttacatctggacgtctaaacggatagatgtgcacaacacaacatataactacaagcgattgatgaggtaaggtfcaca"gg"caccttc鄉(xiāng)敏gcc麵gcCATATGAATATCCTCCTTAG其具有-與基因metF(網(wǎng)站11:〃8611011814)3816111*.&/(:010)11/上的參照序列)區(qū)域的序列(4130114-4130195)同源的區(qū)域(小寫)-與噬菌體T7末端序列(GenbankV01146)同源的區(qū)域(斜體，小寫)-用于擴(kuò)增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner,B丄"2000,PNAS，97:6640-6645中的參照序列)的區(qū)域(大寫)使用寡核苷酸Ptrc-metFF和Ptrc-metFR從質(zhì)粒pKD4中擴(kuò)增卡那霉素抗性盒。然后通過(guò)電穿孔將獲得的PCR產(chǎn)物引入菌^MG1655m"A*llA附"J(pKD46)中，其中表達(dá)的Red重組酶允許進(jìn)行同源重組。選擇卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體，并使用下文定義的Ptrc-metFvF和Ptrc-metFvR通過(guò)PCR分析來(lái)驗(yàn)證抗性盒的插入。Ptrc-metFvF(SEQIDNO3):GCCCGGTACTCATGTTTTCGGGTTTATGG(與來(lái)自4129866到4129894的序列同源)Ptrc-metFvR(SEQIDNO4):CCGTTATTCCAGTAGTCGCGTGCAATGG(與來(lái)自4130524到4130497的序列同源)。得到的菌林稱為MG1655im^A*11A附"jP^r-w^F:Km。質(zhì)粒pME101-thrA*l-cysE的構(gòu)建pME101-thrA*l為了加強(qiáng)高絲氨酸的產(chǎn)生，使用啟動(dòng)子P&c從質(zhì)粒pCL1920(Lerner&Inouye,19卯，NAR18，15p4631)中表達(dá)編碼thrA*，其編碼對(duì)蘇氨酸的反饋抗性降低的天冬氨酸激酶/高絲氨酸。為了構(gòu)建質(zhì)粒pME101-thrA*l，使用以下的寡核苷酸M因組DNA中PCR擴(kuò)增鄉(xiāng)HlthrA(SEQIDNO5):ttaTCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggcS廳lthrA(SEQIDNO6):ttaCCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc用限制性酶5s/;HI和切割PCR擴(kuò)增片段，并克隆進(jìn)載體pTRC99A(Stratagene)的7V"I/S附"I位點(diǎn)中。為了從低拷貝載體中表達(dá)，如下構(gòu)^"粒pME101。使用寡核苷酸PME101F和PME101R來(lái)PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pCL1920,并將來(lái)自載體pTRC99A的帶有基因和P化c啟動(dòng)子的5對(duì)Z17I-JV附wI片段插入所擴(kuò)增的栽體中。用jpfll和限制性處理所得載體和帶有幼rA基因的載體，并將含有幼rA的片段克隆進(jìn)載體pME101中。為了將ThrA從反饋抑制中釋放，使用寡核苷酸ThrAFF318S和ThrARF318S通過(guò)定點(diǎn)誘變(Stratagene)引入突變F318S，得到載體pME101-thrA*l。PME101F(SEQIDNO7):CcgacagtaagacgggtaagcctgPME101R(SEQIDNO8):AgcttagtaaagccctcgctagThrAFF318S(Smal)(SEQIDNO9):CcaatctgaataacatggcaatgtccagcgtttctggQ^ggggThrARF318S(Smal)(SEQIDNO10):CccgggccagaaacgctggacattgccatgttattcagattggpME101-thrA*l-cysE為了構(gòu)建pME101-thrA*l-cysE,使用寡核苷酸OmeB001和OmeB002通過(guò)PCR擴(kuò)增cysE基因，用限制性酶戶v"II切割PCR產(chǎn)物并克隆進(jìn)載體pME101-tiirA*l的Smal位點(diǎn)中，得到載體pME101-ttirA*l-cysE。OmeB001—cysER-PvuII(SEQIDNO11)GGAGGGAC4CCrGATACGAAAGAAGTCCGCGAACTGGCGCOmeB002—cysEF國(guó)PvuII(SEQIDNO12)Atacgcagc她gacattagatcccatccccatactcaaatgtatgg戶v"II位點(diǎn)加有下劃線。黑體序列對(duì)應(yīng)于cysE(Colibri)(3780423-3780397)MG1655/w^A*llAmetJ::CmP"c-wetH::Km的構(gòu)建為了加強(qiáng)甲硫氨酸的產(chǎn)生，使用P加啟動(dòng)子it^達(dá)附e沮基因。使用以下寡核苷酸進(jìn)行構(gòu)建DiclR-metHF(SEQIDNO13)gcaccagaatacgttcatttaactgcgcacgcagttgttccactttgctgctcatGTCrGrCCTCC4GTJG4rGC14CCCC4C4C47T47^CG4GCCGG^rG^77^7TGrC44C4GCrCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其具有畫與基因附"H(網(wǎng)站http:〃genolist.pasteur.fr/Colibri/上的參照序列)的序列(4221461-4221408)同源的區(qū)域(小寫)-與具有RBS(黑體)和-35與-10盒(黑體)的啟動(dòng)子Ptrc序列同源的區(qū)域(斜體，大寫)畫用于擴(kuò)增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B丄"2000,PNAS,97:6640-6645中的參照序列)的區(qū)域(大寫)iclR-metHF(SEQIDNO14)CGrGTCGG(24GC^4G7X:ATATGAATATCCTCCTTAG其具有國(guó)與基因wWR(網(wǎng)站http:〃genolistpasteur.fr/Colibri/上的參照序列)區(qū)域的序列(4221327-4221406)同源的區(qū)域(斜體，大寫)畫用于擴(kuò)增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner,B丄"2000,PNAS，97:6640-6645中的參照序列)的區(qū)域(大寫)。使用寡核苷酸DiclR-metHF和iclR-metHF從質(zhì)粒pKD4擴(kuò)增卡那霉素抗性盒。然后通過(guò)電穿孔將獲得的PCR產(chǎn)物引入菌林MG1655/w"A*llAw"J(pKD46)中，其中表達(dá)允許同源重組的Red重組酶。選擇卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體并使用下文定義的寡核苷酸iclF和iclR通過(guò)PCR分析驗(yàn)證抗性盒的插入。iclF(SEQIDNO15):CCTTTGAGGTCGCATGGCCAGTCGGC(與從4221558到4221533的序列同源)。iclR(SEQIDNO16):GCTTTTTAATAGAGGCGTCGCCAGCTCCTTGCC(與從4219917到4219949的序列同源)。得到的菌林稱為MG1655i"A*llA附CJP"c-w"F:Km。MG1655iCA*llAwi"J::CmP^r畫iwCF:KmPfro附WH的構(gòu)建為了構(gòu)建菌林MG1655metA*llAwd:CmP^r國(guó)w^F:KmPfrc-w&H，將氯霉素和卡那霉素抗性盒從菌林MG1655w"A*llAwi^J::CmP^r-iw"H:Km中去除。將帶有FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20通過(guò)電穿孔引入該重組菌林中，所述FLP重組酶作用于氯霉素抗性盒的FRT位點(diǎn)。在42"C的一系列培養(yǎng)后，通過(guò)PCR分析證實(shí)兩個(gè)盒的缺失。保留的菌林命名為MG1655/M^A*11A附CJP加-附e沮。為了將啟動(dòng)子構(gòu)建體P^r::w"F:Km轉(zhuǎn)移進(jìn)菌林MG1655i^A*llA附"JP加-we沮中，使用噬菌體P1轉(zhuǎn)導(dǎo)法。所遵循的方案在2個(gè)步驟中實(shí)現(xiàn)制備菌林MG1655MG1655iWA*llA挑"JP^r-附^F::Km的噬菌體裂解液并l^轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)菌林MG1655iii&AniA附WJP"c-m"H中。制備嗟菌體裂解液P1:畫用100pi菌林MG1655m^A*11A附"JP^r國(guó)附"F:Km的過(guò)夜培養(yǎng)物接種10mlLB+Km50ng/ml+葡萄糖0.2%+CaCl25mM國(guó)在37C下?lián)u動(dòng)孵育30分鐘。-添加100nl用菌林MG1655制備的噬菌體裂解液Pl(約1.109個(gè)嗟菌體/ml)。-在37"C搖動(dòng)3小時(shí)直到所有的細(xì)胞被裂解。-添加200nl氯仿并振蕩。-在4500g離心10分鐘以去除細(xì)胞淬片。-轉(zhuǎn)移上清液至無(wú)菌管中并添加200nl氯仿。-將裂解液儲(chǔ)存于4x:。轉(zhuǎn)導(dǎo)-將5ml菌林MG1655metA*11A柳CJPtrc-w"H在LB培養(yǎng)基中的過(guò)夜培養(yǎng)物在1500g離心10分鐘?！獙⒓?xì)胞沉淀懸浮于2.5ml10mMMgS04、5mMCaCl2中-對(duì)照管lOOnl細(xì)胞100nl菌林MG1655iWA*llA附^JPftr-附WF:Km的噬菌體PI一測(cè)試管100nl細(xì)胞+100nl菌林MG1655t"A*llA附CJP^r-w&F:Km的噬菌體PI-在30C不搖動(dòng)孵育30分鐘?！蛎抗苤刑砑?00jil1M梓檬酸鈉并振蕩?！砑?mlLB。-在37匸搖動(dòng)孵育1小時(shí)。-將管在7000rpm離心3分鐘后涂布在平板LB+Km50照/ml上。-在37"C孵育過(guò)夜。菌抹的驗(yàn)證選捧卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體并使用上述寡核苷酸Ptrc-附WFvF和Ptrc-附CFvR通過(guò)PCR分析驗(yàn)證啟動(dòng)子構(gòu)建體Pftr-w"F:Km的存在。保留的菌林命名為MG1655w^A*llA附WJ::CmP&c-附e沮P加-柳&F:Km。MG1655iCA*llAwi"J::CmPrtr-Q^M::Km的構(gòu)建為了克隆位于異源P^r啟動(dòng)子控制下的基因，使用Datsenko&Wanner(2000)描述的同源重組策略。該策略允許在相關(guān)基因附近插入氯霉素或卡那霉素抗性盒。為此^f吏用以下的寡核苷酸Ptrc-cysMFgcctgatgcgacgcttgcgcgtcttateaggtctacaggttacaaaccttgccata她似c故c加ccacaca加tocgagccgg啤a"aa鄉(xiāng)caacflg"cCATATGAATATCC;TCCTTAG(SEQIDNO17)其具有-與基因cpM(網(wǎng)站http:〃genolist,pasteur.fr/Colibri/上的參照序列)的序列(2537627-2537681)同源的區(qū)域(小寫)-與具有RBS(黑體)和-35與-10盒(黑體)的啟動(dòng)子PM序列同源的區(qū)域(斜體，小寫)畫用于擴(kuò)增卡那霉素抗性盒(Datsenko,K.A.&Wanner,B丄"2000，PNAS,97:6640-6645中的參照序列)的區(qū)域(大寫)Ptrc隱cysMRggttgagtgaatgttaaacgcccggaggcgcttcccgcgatecgggctttt7^rC4C4CrGGCrC4CC7TCCGGTGGGCC7TrcrGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQIDNO18)其具有-與基因gsM(網(wǎng)站http:〃genolist.pasteur.fr/Colibri/上的參照序列)區(qū)域的序列(2537734-2537684)同源的區(qū)域(小寫)-與噬菌體T7末端序列(GenbankV01M6)同源的區(qū)域(斜體，大寫)畫用于擴(kuò)增卡那霉素抗性盒(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000，PNAS,97:6640-6645中的參照序列)的區(qū)域(大寫)。使用寡核苷酸Ptrc-cysMF和Ptrc-cysMR從質(zhì)粒pKD4中擴(kuò)增卡那霉素抗性盒。然后通過(guò)電穿孔將獲得的PCR產(chǎn)物引入菌林MG1655w^A*llA附WJ(pKD46)中，其中表達(dá)允許同源重組的Red重組酶。選擇卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體并^f吏用下文定義的寡核苷酸Ptrc-cysMvF和Ptrc-cysMvR通過(guò)PCR分析驗(yàn)證抗性盒的插入。Ptrc-cysMvF:ggtgacaagaatcagttccgc(與來(lái)自2537262到2537282的序列同源)。(SEQIDN019)Ptrc-cysMvR:GCGTTTATTCGTTGGTCTGC(與來(lái)自2537833到2537814的序列同源)。(SEQIDNO20)得到的菌林稱為MG1655w^A*llAm"JJP&c-c^sM::Km。MG1655i"A*llAiijWJP"c-wiCFP^r誦ni"HP^c-cj;sM:Km的構(gòu)建為了構(gòu)建菌林MG1655metA*llA附^JP"c-附"FP"c-附CHP&c-c"M:Km，如上所述使用質(zhì)粒pCP20將氯霉素和卡那霉素抗性盒從菌抹MG1655wCA*llA附WJ::CmP^c-附^F:KmP^r-/m"H中去除。得到的菌株命名為MG1655me,A*llA/w"JP&c-附WFP"c-附CH。為了將啟動(dòng)子構(gòu)建體P&c-o;sM:Km轉(zhuǎn)移進(jìn)菌林MG1655w^A*llA附WJP"c-附"FP^c-附"H中，使用噬菌體Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)法。所遵循的方案在2個(gè)步驟中完成制備菌林MG1655MG1655w^A*llAm^JP^r-c"M::Km的謹(jǐn)菌體裂解液，以及隨后轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)菌林MG1655i"A*llA附&JP^c-附WFP&owiCH中。獲得的菌株命名為MG1655i^A*llA附"JP"c-附"FP加國(guó)附"HP加-c"M::Km。用等位基因w"A*ll和A附WJ將增強(qiáng)cpE和附WH表達(dá)與優(yōu)化w&F和為了構(gòu)建菌林MG1655/iiCA*llA附"J::Cm(pME101-ArA*l)、MG1655i^A*llAwid:CmP^r-i"H:Km(pME101-^/*A*l-cj;sE)、MG1655mCA^llA附^J::CmPfrc誦m^HPfrc-w^F:Km(pME101-ArA^l國(guó)o;sE)和MG1655iw^A*llAwiWJP"oiifWFP"o/m^HP^r-c"M:Km(pME101-ArA*l-cj;sE),將質(zhì)粒(pME101-^^A*l)或(pME101*A*l-c"E)通過(guò)轉(zhuǎn)化引入菌林MG1655附"A"1A柳"J::Cm、MG1655/uWA*llA附WJ::CmP&c-附"H:Km、MG1655附&A^11Ain^J::CmP^r-附CHP^r-iWF:Km和MG1655/mc^A*11Aiw^JP"c-附CFP"c-附CHP^r-cjsM:Km中。評(píng)價(jià)甲硫氨酸生產(chǎn)菌林，所述菌林具有異源啟動(dòng)子控制下增強(qiáng)的c"E、/mWH和/或c_ysM和/或附WF|達(dá)首先在小錐形瓶中評(píng)價(jià)生產(chǎn)菌林。在含有2.5g/1葡萄糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物，并用于接種基本培養(yǎng)基PC1中的過(guò)夜培養(yǎng)物。該培養(yǎng)物用于在培養(yǎng)基PC1中接種50ml培養(yǎng)物至OD600為0.2,所述培養(yǎng)基PC1中補(bǔ)充有0.01g丄"的維生素B12。如果指明的話，將硫酸銨替換為5.6g/1的硫代硫酸銨。適當(dāng)時(shí)，以100mg/1的濃度添加大觀霉素。在4.5到5的OD600下，在OPA/Fmoc衍生化后通過(guò)HPLC定量細(xì)胞外氨基酸，并在硅烷化后使用GC-MS分析其它相關(guān)代謝物。表1.基本培養(yǎng)基pc1的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>如表2中所示，甲石危氨酸的量隨著過(guò)表達(dá)c"E、與柳CH或者cpE、w^H與附WF表達(dá)改變而增加。增強(qiáng)cysM的i達(dá)可進(jìn)一步提高曱硫氨酸產(chǎn)生。某些菌林在硫代硫酸鹽存在下生產(chǎn)更大量的甲硫氨酸。當(dāng)c"E、cpM和w^H過(guò)表達(dá)、附&F表達(dá)位于P&c啟動(dòng)子的控制下且存在硫代硫酸鹽時(shí)，獲得最高的甲硫氨酸生產(chǎn)。c^E和附WH表達(dá)時(shí)異亮氨酸生產(chǎn)被強(qiáng)烈降低，指示"消除活性的降低。在過(guò)表達(dá)cysE和metH并從異源啟動(dòng)子表達(dá)附"F的k林中，cysM的過(guò)表達(dá)降低y-消除。表2.在使用硫酸鹽(S)或硫代硫酸鹽(T)作為硫源的分批培養(yǎng)中，由上述菌林生產(chǎn)的以mmol/gDW計(jì)的曱硫氨酸和異亮氨酸，n.d.,未測(cè)定。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>3.測(cè)定CysE和MetH的酶活性改變?yōu)榱蓑?yàn)證CysE表達(dá)和MetH表達(dá)的改變，在粗提物中測(cè)定相應(yīng)酶的活性。為了體外測(cè)定酶活性，在如上所述的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌并在對(duì)數(shù)中期(midlogphase)收集。將細(xì)胞重懸于冷的磷酸鉀緩沖液中并在水上超聲處理(Branson超聲波儀，70W)。離心后，定量上清液中含有的蛋白質(zhì)(Bradford,1976)。為了測(cè)定絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性(CysE)，在100mM磷酸鉀pH7.5、4mM乙酰CoA、30mML-絲氨酸中將10nl提取物于25匸下測(cè)定10分鐘。用丙酮沉淀蛋白質(zhì)并在用硅烷化試劑衍生化后通過(guò)GC-MS檢測(cè)O-乙?；z氨酸。為了測(cè)定維生素B12依賴性甲硫氨酸合酶活性(MetH),在100mM砩酸鉀pH7.2、lmM高半胱氨酸、0.25mM甲基四氫葉酸、50維生素B12、20nMS-腺苷甲硫氨酸和25mMDTT中將100jil提取物于37C下測(cè)定10分鐘。用丙酮沉淀蛋白質(zhì)并在用硅烷化試劑衍生化后通過(guò)GC-MS檢測(cè)產(chǎn)生的甲硫氨酸。如表3所示，基因cysE和metH的過(guò)表達(dá)提高相應(yīng)的酶活性。因此，這些基因活性的提高導(dǎo)致曱硫氨酸產(chǎn)生的提高。表3.在硫代硫酸鹽存在下培養(yǎng)的甲硫氨酸生產(chǎn)菌林中以mUI/gDW計(jì)的絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶(CysE)和曱硫氨酸合酶(MetH)活性<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>驗(yàn)證發(fā)酵條件下的甲硫氨酸生產(chǎn)隨后使用分批補(bǔ)料方案，在300ml發(fā)酵罐(DASGIP)中在生產(chǎn)條件下測(cè)試生產(chǎn)大量目的代謝物的菌林。為此，使用在含2.5g/1葡萄糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時(shí)的培養(yǎng)物來(lái)接種基本培養(yǎng)基PC1(見(jiàn)上文)中的過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)物。用150ml基本培養(yǎng)基(B1)填充發(fā)酵罐并用1.5ml濃縮的預(yù)培養(yǎng)物(9g/1和12g/1之間)接種至近0.09g/1的生物量濃度。表4.基本培養(yǎng)基B1的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表5.Tl型基本培養(yǎng)基FB<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表6.S型基本培養(yǎng)基FB<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>保持培養(yǎng)溫度恒定在37X:，并使用NH4OH溶液將pH恒定調(diào)節(jié)至6.5和8之間的值，優(yōu)選6.7。分批期(batchphase)期間將攪動(dòng)速率維持在600rpm并在分批補(bǔ)料期結(jié)束時(shí)提高到多至1000rpm。通過(guò)使用氣體控制器將溶解氧濃度維持在20%和40%之間、優(yōu)選30%的飽和度。當(dāng)細(xì)胞量達(dá)到0.9g/1到1.2g/1的濃度時(shí)，以0.1ml/h和1.5ml/h之間(優(yōu)選0.43ml/h)的起始流速開(kāi)始分批補(bǔ)料，并S形(24小時(shí))提高至0.5ml/h和5.8ml/h之間(優(yōu)選1.7ml/h)的流速。確切的補(bǔ)料條件通過(guò)下式計(jì)算嫩=-+1+其中Q(t)是對(duì)于150ml批體積的補(bǔ)料流速(以mL/h計(jì))Pl為0.025至0.35，優(yōu)選0.100。P2為0.400至5.600，優(yōu)選1.600。P3為0.068至0.95，優(yōu)選0.270。P4為1.250至17.5,優(yōu)選5.000。在該情況下，使用含有濃度為300g/l至800g/1(優(yōu)選500g/L)葡萄糖的FB培養(yǎng)基。當(dāng)生物量的濃度達(dá)到20g/1至50g/1(優(yōu)選35g/L，40至80h)的值時(shí)停止發(fā)酵，并使用HPLC測(cè)定細(xì)胞外甲硫氨酸和異亮氨酸濃度。表7.在下述菌林的分批補(bǔ)料發(fā)酵中獲得的曱硫氨酸效價(jià)，所述菌林在異源啟動(dòng)子下過(guò)表達(dá)^E，以及附CH或附"F，或三者的組合。參照對(duì)應(yīng)于MGl655wCA*llA附WJ。菌林在硫代硫酸鹽(T)或硫酸鹽(S)存在下生長(zhǎng)。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>如表7所示，在異源啟動(dòng)子控制下增強(qiáng)cpE;和柳CH以及c"E、附WH和附&F的表達(dá)或者在硫代硫酸鹽存在下培養(yǎng)菌林可顯著地提高曱石克氨酸生產(chǎn)。異亮氨酸生產(chǎn)被cysE和/或metH的過(guò)表達(dá)顯著降低。隨后使用分批補(bǔ)料方案在2.5L發(fā)酵罐(PIERREGUERIN)中于生產(chǎn)條件下對(duì)在300ml發(fā)酵罐中生產(chǎn)最大量甲硫氨酸的菌林進(jìn)行測(cè)試。為此，使用在含2.5g/l葡萄糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)了8小時(shí)的培養(yǎng)物來(lái)接種基本培養(yǎng)基PC1中的過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)物。用600ml基本培養(yǎng)基(B2)填充發(fā)酵罐并用6ml濃縮的預(yù)培養(yǎng)物(9g/1至12g/1展種至0.9g/1的生物量o將培養(yǎng)物的溫度維持恒定在37*C，并使用NH4OH28%溶液將pH恒定調(diào)節(jié)至6.3至8、優(yōu)選6.8。在分批階段將最初的攪動(dòng)速率設(shè)定在200rpm并在補(bǔ)料分批期時(shí)提高至至多1200rpm。分批期將最初的氣流速度設(shè)定為40Nl/h并在分批補(bǔ)料期時(shí)提高到多至250Nl/h。通過(guò)提高攪動(dòng)速度和氣流速度將溶解氧濃度維持在20%至40%(優(yōu)選30%)飽和度。當(dāng)生物量濃度達(dá)到1.2g/1到1.5g/1時(shí)，以0.5ml/h至4ml/h(優(yōu)選1.0ml/h)的起始流速開(kāi)始分批補(bǔ)料，并指數(shù)式提高(15小時(shí))到3ml/h至35ml/h(優(yōu)選20.1ml/h)的流速。在該點(diǎn)，將流速維持恒定10到45個(gè)小時(shí)，優(yōu)選30h。對(duì)于補(bǔ)料而言，使用含有濃度300g/l至800g/1(優(yōu)選750g/1)葡萄糖的FB型T2(見(jiàn)表8)。當(dāng)生物量的濃度達(dá)到40g/l和UOg/l之間(優(yōu)選卯g/L)的值時(shí)停止發(fā)酵，并使用HPLC測(cè)定細(xì)胞外甲硫氨酸濃度。在這些條件下菌林MG1655附"A"1A附"JP&c-挑"HP"c-附&F(pMElOl-thrA*l-cysE)生產(chǎn)169mM甲硫氨酸。表8.基本培養(yǎng)基FBT2<table>complextableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表9.基本培養(yǎng)基B2的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>權(quán)利要求1.用于生產(chǎn)甲硫氨酸、其衍生物或前體的方法，所述方法通過(guò)在含有碳源和硫源的適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物并從培養(yǎng)基中回收甲硫氨酸來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所述微生物被修飾以增強(qiáng)半胱氨酸的生產(chǎn)。2.權(quán)利要求l的方法，其中涉及半胱氨酸生產(chǎn)的至少一個(gè)基因的表達(dá)被提高。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述涉及半胱氨酸生產(chǎn)的至少一個(gè)基因選自磁b酸鹽通透酶cysT硫酸鹽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的組件"■sW膜結(jié)合的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cysZcysK上游的ORF0NATP硫酸化酶，D硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶腺香酰辟u酸激酶腺苷酰硫酸還原酶，1亞轎u酸鹽還原酶，a亞基一亞石危酸鹽還原酶，p亞基絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶，K半胱氨酸合酶cysMo-乙?；蚧瘹褰饷竐ysZ好u酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)sbp周質(zhì)硫酸鹽結(jié)合蛋白4.權(quán)利要求2的方法，其中至少的表達(dá)被提高。5.權(quán)利要求2的方法，其中至少q;sM的表達(dá)被提高。6.權(quán)利要求l到5中任一項(xiàng)的方法，其中涉及C1單位的產(chǎn)生以及向高半胱氨酸上進(jìn)行轉(zhuǎn)移的潛力的至少一個(gè)基因的表達(dá)被提高和/或被異源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。7.權(quán)利要求6的方法，其中涉及C1單位的產(chǎn)生以及向高半胱氨酸上進(jìn)行轉(zhuǎn)移的潛力的至少一個(gè)基因選自編碼5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶的柳"F編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的g(vA編碼甘氨酸切割復(fù)合體的gcvTHP，//^/。8.權(quán)利要求7的方法，其中附WE、附CH和/或的表達(dá)被提高和/或至少所述基因之一由異源啟動(dòng)子表達(dá)。9.權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)優(yōu)化半胱氨酸生物合成流來(lái)維持低，消除活性，并因此減少副產(chǎn)物異亮氨酸的產(chǎn)生。10.權(quán)利要求l到9中任一項(xiàng)的方法，其中提高了涉及甲硫氨酸產(chǎn)生的另外基因的表達(dá)。11.權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)的方法，其中弱化了減少甲硫氨酸產(chǎn)生的基因的表達(dá)。12.權(quán)利要求l到11中任一項(xiàng)的方法，其中由w^J基因編碼的甲硫氨酸阻抑物被缺失或突變，和/或高絲氨酸琥珀?；D(zhuǎn)移酶(MetA)等位基因被整合進(jìn)菌林中，所述等位基因編碼對(duì)S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸的反饋敏感性降低的酶。13.權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)基中的硫源是;P克酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化氫、二硫代硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、亞硫酸鹽或所述不同來(lái)源的組合。14.權(quán)利要求13的方法，其中培養(yǎng)基中的硫源是硫酸鹽或硫代硫酸鹽或二者的混合物。15.權(quán)利要求1到14中任一項(xiàng)的方法，所述方法包括下述步驟分離任選地部分或全部(0-100%)保留在終產(chǎn)物中的所需氨基酸/發(fā)酵液組分和/或生物量。16.用于發(fā)酵生產(chǎn)甲硫氨酸或其衍生物的微生物，其中所述微生物被優(yōu)化以增強(qiáng)半胱氨酸的產(chǎn)生。17.權(quán)利要求16的微生物，其中涉及半胱氨酸產(chǎn)生的至少一個(gè)基因的表達(dá)被提高。18.權(quán)利要求17的微生物，其中涉及半胱氨酸產(chǎn)生的至少一個(gè)基因選自硫酸鹽通透酶，U，cysT石危酸鹽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的組件膜結(jié)合的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，ZcysK上游的ORFcysNATP碌u酸化酶，D石危酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，C腺香酰為t酸激酶，H腺普酰好b酸還原酶一亞好u酸鹽還原酶，a亞基亞^P克酸鹽還原酶，0亞基絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶g^K半胱氨酸合酶0-乙?；蚧瘹浣饷竎ysZAt酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)sbp周質(zhì)^Tu酸鹽結(jié)合蛋白19.權(quán)利要求17的微生物，其中至少cysE的表達(dá)被提高。20.權(quán)利要求17的微生物，其中至少cysM的表達(dá)被提高。21.權(quán)利要求16到20中任一項(xiàng)的微生物，其中涉及C1單位的產(chǎn)生和至高半胱氨酸上的轉(zhuǎn)移潛力的至少一個(gè)基因的表達(dá)被提高和/或受外源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。22.權(quán)利要求21的微生物，其中涉及C1單位的產(chǎn)生以及向高半胱氨酸上的轉(zhuǎn)移潛力的至少一個(gè)基因選自編碼5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶的附WF編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的g/jA編碼甘氨酸切割復(fù)合體的gcvTHP，23.權(quán)利要求21的微生物，其中metE、metH和/或附"F的表達(dá)被提高和/或至少所述基因之一由異源啟動(dòng)子表達(dá)。24.權(quán)利要求16到23中任一項(xiàng)的微生物，其中通過(guò)優(yōu)化半胱氨酸生物合成流來(lái)維持低Y-消除活性，并因此降低副產(chǎn)物異亮氨酸的產(chǎn)生。25.權(quán)利要求16到24中任一項(xiàng)的微生物，其中涉及甲硫氨酸產(chǎn)生的另外基因的表達(dá)被提高。26.權(quán)利要求16到25中任一項(xiàng)的微生物，其中減少曱硫氨酸產(chǎn)生的基因的表達(dá)被弱化。27.權(quán)利要求16到26中任一項(xiàng)的微生物，其中缺失或突變了由附WJ基因編碼的甲硫氨酸阻抑物，和/或整合了高絲氨酸琥珀?；D(zhuǎn)移酶(MetA)等位基因，所述等位基因編碼對(duì)S-腺苷基甲硫氨酸和/或甲硫氨酸的反饋敏感性降低的酶。全文摘要本發(fā)明涉及通過(guò)在包含碳源和硫源的適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物來(lái)生產(chǎn)甲硫氨酸或其衍生物的方法。要求保護(hù)的微生物以下述方式被修飾半胱氨酸和/或C1單位的生產(chǎn)被增強(qiáng)和/或C1單位向高半胱氨酸上的轉(zhuǎn)移的潛力被提高或優(yōu)化。還要求保護(hù)甲硫氨酸或其衍生物從發(fā)酵培養(yǎng)基中的分離。文檔編號(hào)C12P13/12GK101351558SQ200680050326公開(kāi)日2009年1月21日申請(qǐng)日期2006年1月4日優(yōu)先權(quán)日2006年1月4日發(fā)明者塞利娜·雷諾,法比安·盧克斯,米歇爾·沙托,菲利普·蘇卡勒,雷納·菲格申請(qǐng)人:代謝探索者公司