專利名稱：以rna干擾特異性抑制基因表達的dna構(gòu)建體的制作方法
以RNA干擾特異性抑制基因表達的DNA構(gòu)建體
描述
本發(fā)明涉及制備載體的方法以及這些載體，在所述載體轉(zhuǎn)染進入真核 細胞之后，其適合于通過RNA干擾以靶向方式抑制一或幾種蛋白質(zhì)的形成。
近來， 一種抑制基因表達的可能性是基于合成雙鏈RNA分子。使用這 種雙鏈RNA (dsRNA)與任何其他方法相比，各個基因可被非常有效地和 更快速地以靶向方式關(guān)閉，而無需破壞鄰近基因的蛋白質(zhì)形成。其基本原 理被命名為RNA干擾，縮寫為RNAi。產(chǎn)生該現(xiàn)象的dsRNA序列被命名為 siRNA (小干擾RNA)。
SiRNA不能防止基因被讀出但是可以打開細胞機制，該機制防止從基 因讀出的mRNA分子產(chǎn)生并因此阻止相應(yīng)蛋白質(zhì)的形成(轉(zhuǎn)錄后基因沉 默)。
由19至23個RNA堿基長的短siRNA分子觸發(fā)mRNA的這種耙向降 解，該siRNA與轉(zhuǎn)錄為被抑制的蛋白質(zhì)的耙mRNA同源。siRNA分子組合 特異性內(nèi)切核糖核酸酶形成一個細胞的RNA蛋白復(fù)合體，稱為"RISC" (RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)。當這些復(fù)合體形成，RNA雙鏈解離，導(dǎo)致每 個均含有單鏈siRNA分子的所謂的活化的RISC。含有與耙mRNA互補的 反義鏈的活化RISC與靶mRNA結(jié)合，RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體的內(nèi)切核糖核酸 酶確保序列特異性降解mRNA。
采用實驗方法在細胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA或者從外部將其轉(zhuǎn)入。通過體外或 體內(nèi)給予合成制備的siRNA分子來完成這些實驗。
但是，該方法具有技術(shù)限制。合成的siRNA在培養(yǎng)基和細胞內(nèi)通常不 穩(wěn)定，原則上，使用合成的siRNA的抑制作用可能只是暫時的，許多細胞 (例如神經(jīng)細胞)可被非常無效率地轉(zhuǎn)染。因此基于合成siRNA轉(zhuǎn)染的研 究限制在時間上(從1到5天)和細胞類型上。此外，高生產(chǎn)成本和長時間生產(chǎn)也是不利因素。
其他方法是在細胞內(nèi)通過載體產(chǎn)生siRNA。它們是病毒載體或基于質(zhì) 粒的載體，其一旦進入到細胞內(nèi)就可表達形成siRNA序列。與轉(zhuǎn)染合成 siRNA比較，其優(yōu)勢在于更穩(wěn)定和更可調(diào)控相應(yīng)siRNA序列的轉(zhuǎn)錄。
但是，基于質(zhì)粒的載體不僅表現(xiàn)出低轉(zhuǎn)染效率，而且具有一個精細的 生產(chǎn)過程。因此需要選擇穩(wěn)定的克隆。通常這個過程冗長并需要花費數(shù)周 甚至數(shù)月，并且頻繁出現(xiàn)克隆實驗固有的大量潛在的困難。用于檢測產(chǎn)物 的測序程序也是費力和昂貴的。
此外，基于質(zhì)粒的載體含有選擇所必需的抗生素抗性基因。因此，這 個載體不適合應(yīng)用于活的生物體。與無處不在的細菌可能的重組導(dǎo)致在有 機體內(nèi)出現(xiàn)對抗生素具有抗性的細菌的風(fēng)險增加。抗生素抗性的傳播是一 嚴重問題，這一途徑是不可靠的。
因為病毒載體能夠有效和靶向轉(zhuǎn)染，與合成siRNA分子和基于質(zhì)粒的 載體比較，它們具有一定的優(yōu)勢。
但是，對于治療應(yīng)用僅能有條件的使用這樣的病毒載體。在此，病毒 序列與天然存在病毒的重組表現(xiàn)出一個固有的安全風(fēng)險，因此必須小心不 要創(chuàng)造一個新的致病性雜種病毒。另外，它們的制備也是精細和昂貴的。
甚至使用表達系統(tǒng)抑制僅僅一個基因產(chǎn)物的表達也與大量復(fù)雜情況相 關(guān)，在細胞或組織內(nèi)同時關(guān)閉幾個基因產(chǎn)物的表達是更加復(fù)雜而因此更難 實現(xiàn)這幾乎是公認的。
當使用幾個獨立的構(gòu)建體時，通過RNA干擾多重抑制基因表達的一個 主要問題是細胞僅將被一個構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的可能性低。這個低可能性隨使用 的構(gòu)建體數(shù)而呈指數(shù)的降低。但是，對于遺傳治療的某些方法，需要一個 可控的和同時的基因表達抑制。
存在的大量方法能在細胞內(nèi)共轉(zhuǎn)錄幾個RNA分子。最簡單的方法是共 轉(zhuǎn)染2個獨立的表達構(gòu)建體(以下也稱為載體)。另一個方法由轉(zhuǎn)染攜帶2 個獨立表達盒的載體組成。這樣的構(gòu)建體也可被用于合成siRNA分子。
但是，這2種可能性具有風(fēng)險，即轉(zhuǎn)錄物在數(shù)量、加工、半衰期和翻 譯效率顯著不同以及在蛋白質(zhì)表達量也顯著不同，結(jié)果是其應(yīng)用的特征是無效性和低重復(fù)性。因此，這種表達系統(tǒng)的使用也會導(dǎo)致不同程度的siRNA 轉(zhuǎn)錄，將最終產(chǎn)生相關(guān)基因的不平衡抑制。
使用IRES (內(nèi)部核糖體進入位點)元件構(gòu)建雙順反子和多順反子RNA 分子代表另一種共表達幾個基因的可能性。它們允許通過序列元件由核糖 體起始翻譯，而與mRNA帽子結(jié)構(gòu)無關(guān)。IRES元件最早在小RNA病毒的 mRNA中被發(fā)現(xiàn)(Pelletier and Sonenberg， 1988， Nature 334: 320-325， Jang et al., 1988, Journal Virology 62: 2636-2643)。
構(gòu)建雙順反子載體時，最常使用脊髓灰質(zhì)炎病毒和EMCV (腦心肌炎 病毒)的IRES元件(Dirks etal.， 1993, Gene 128:247-249)。不幸的是，它 們的效率很大程度依賴于使用的細胞系而變化較大(Bomian et al.， 1997， Nucleic Acids Res. 25: 925-932)。
大多數(shù)可使用的雙順反子表達盒由排列在IRES元件3'側(cè)的可選擇標 記物或報道基因和插入所需基因的MCS (多克隆位點)組成(Dirks et al.， 1993, Gene 128: 247-249)。使用IRES元件的三順反子和多順反子表達系統(tǒng) 也是已知的(Zitvogel et al" 1994, Hum Gene Ther 5: 1493-1506, Fussenegger et al" 1998a， Nature Biotechnol. 16: 468-472, Mielke et al" 2000， Gene 254. 1-8)。
但是，對于治療應(yīng)用僅能有條件的使用病毒IRES元件。在此，病毒序 列與天然存在病毒的重組表現(xiàn)出一個固有的安全風(fēng)險，因此必須小心不要 創(chuàng)造一個新的致病性雜種病毒。
通過連接無IRES元件的轉(zhuǎn)錄單元也可構(gòu)建多順反子載體。 一方面，通 過不同MCS插入質(zhì)粒載體可以克隆所需基因，另一方面，通過DNA接頭 連接從質(zhì)粒分離的表達盒形成線性多順反子載體(Tsang et al.， 1997， Bio Techniques 22: 68)。
但是，線性順式連接基因表達率的研究顯示對這種方式排列的表達盒 轉(zhuǎn)錄存在較強的負面影響(Esperet et al.， 2000, J Biol Chem 275: 25831-25839)。
表達多基因的質(zhì)粒載體在克隆的轉(zhuǎn)錄單位數(shù)量上不同于常規(guī)質(zhì)粒載 體。在本文中，相同或不同來源的啟動子或poly(A)序列可被用于轉(zhuǎn)錄單位。使用不同啟動子時出現(xiàn)的不利因素是由于啟動子的強度不同而因此各
個基因的表達率改變，而使用相同啟動子可導(dǎo)致DNA二級結(jié)構(gòu)的形成，其 結(jié)果是可能導(dǎo)致啟動子功能喪失。
所有提及的多基因表達載體共同的是它們是基于質(zhì)?；虿《据d體。除 了所有目前多編碼載體所描述的缺陷以外，另外它們表現(xiàn)出這類載體的不 利因素。病毒載體的不利因素(包括減毒疫苗株的不穩(wěn)定性)和質(zhì)粒DNA 載體的缺陷(例如伴隨使用過程中抗生素抗性基因的傳播(在EP0941 318 Bl中詳細描述))充分己知。
因此，需要siRNA表達系統(tǒng)也能夠同時抑制幾個基因的基因表達?；?許解決這個問題的最大難題是連接序列以產(chǎn)生siRNA分子的接頭，其確保 在每種情況中充分的轉(zhuǎn)錄以抑制這些序列的基因表達。
從文獻已知一個使用DNA連接元件連接DNA片段的方法。Seeman 描述了用于研究天然分枝連接(Verzweigimgen)的DNA序列，稱為霍利 迪連結(jié)體，假定為B-DNA在扭曲應(yīng)力下的特異性拓撲形式(Seeman: 1982, J Theor Biol 99: 237-247; Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct, 1998. 27: 225-248)。目前，這些結(jié)構(gòu)的應(yīng)用局限于研究DNA結(jié)構(gòu)形式的短寡核苷酸 片段。
從DE 100 48 417 Al已知一個多功能連接，其描述兩個反應(yīng)性功能基 團通過接頭的接合(Konjugation)。作為可以這種方式偶聯(lián)的生物學(xué)物質(zhì)也 提及了核酸，但是實施例只顯示了本發(fā)明關(guān)于肽接合的應(yīng)用。WO 01/87348 A2描述轉(zhuǎn)運幾個基因進入細胞進行有效表達的另一個方法。共價鍵連接核 酸形成稱為樹狀聚體的超分子結(jié)構(gòu)。
在http:〃www.ambion.com顯示制備siRNA載體的另一種可能性。這個 過程避免了上述提及的不利因素。但是，這個制備過程太耗時并且由于對 于相關(guān)序列通過PCR (聚合酶鏈反應(yīng))需采取許多必須的擴增步驟而容易 導(dǎo)致錯誤發(fā)生。該方法通過PCR過程擴增存在很高的產(chǎn)生非所需和不引人 注意的突變體的可能性。所以，在此檢測對照序列是必須的，該檢測導(dǎo)致 制備過程延長和成本增加。
考慮到現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)，本發(fā)明的任務(wù)是提供一個體外和體內(nèi)合成一或多種指定siRNA序列的方法，因此制備的表達構(gòu)建體和完成合成的試劑盒。 這個任務(wù)通過獨立要求的特征實現(xiàn)。
因此，本發(fā)明揭示了一種表達構(gòu)建體，其包含第一個末端DNA發(fā)夾環(huán)、 第二個末端發(fā)夾環(huán)和T形DNA結(jié)構(gòu)，其中所述第一個末端DNA發(fā)夾環(huán)中 單鏈脫氧核糖核苷酸向后折疊形成一個雙鏈區(qū)域以至后者呈現(xiàn)出一個粘性 突出末端，在相對末端，形成雙鏈的單鏈通過單鏈環(huán)相互連接，所述第二 個末端發(fā)夾環(huán)與第一個末端發(fā)夾環(huán)類似構(gòu)建，所述T形DNA結(jié)構(gòu)具有三 個通過霍利迪連結(jié)體連接的雙鏈DNA臂，其中至少一個臂含有待轉(zhuǎn)錄序 列，在與其他臂相對連接的末端，這個雙鏈DNA臂的單鏈通過單鏈DNA 環(huán)相互連接，并且其他兩個臂呈現(xiàn)粘性末端，其中一個臂呈現(xiàn)出適合的末 端序列和另一個臂呈現(xiàn)合適的啟動子序列。
所提及的成分是本發(fā)明構(gòu)建體的必需部分。本發(fā)明也包括具有這些成 分的表達構(gòu)建體，但是所述成分來自DNA結(jié)構(gòu)的其他組合。
此外，本發(fā)明揭示了一個以RNA干擾靶向抑制基因表達的表達構(gòu)建
體，該構(gòu)建體呈現(xiàn)第一末端DNA發(fā)夾環(huán)，其中單鏈脫氧核糖核苷酸向后折
疊形成雙鏈區(qū)域以便后者呈現(xiàn)出一個粘性突出末端，在相對末端形成雙鏈
的單鏈通過一個單鏈環(huán)相互連接，此外該構(gòu)建體還呈現(xiàn)第二末端發(fā)夾形環(huán)， 其與第一末端發(fā)夾環(huán)類似構(gòu)建且其雙鏈和單鏈區(qū)由待轉(zhuǎn)錄序列和適合的啟
動子序列和在DNA雙鏈中位于上述兩個末端發(fā)夾環(huán)之間的適合的反向互 補終止序列組成。
這樣一個表達構(gòu)建體僅僅顯示待合成siRNA —個雙鏈拷貝。使用這個 構(gòu)建體可以制備僅有一個拷貝存在的siRNA，因為待轉(zhuǎn)錄序列被RNA聚合 酶經(jīng)過單鏈環(huán)讀出并轉(zhuǎn)錄。這對于雙鏈質(zhì)粒是不可能的。
本發(fā)明的兩個表達構(gòu)建體設(shè)計為在每種情況下幾個T形或線性DNA 結(jié)構(gòu)均在末端通過霍利迪連結(jié)體以接頭連接。本文中，它設(shè)計為待轉(zhuǎn)錄序 列編碼相同或不同基因。
接頭是連接DNA表達盒的寡核苷酸。本發(fā)明的接頭由兩或多條鏈組 成，如下的接頭實施例所述，由與在相互連接的A、 B和C鏈上的三個表 達盒相連接的三個寡核苷酸形成A的5'末端具有與B的3'末端互補的序列并形成雙鏈，而A的3'末端與C的5'末端配對，最終B的5'末端和C 的3'末端配對。DNA雙鏈的這類連接也稱為霍利迪連結(jié)體(F.W. Stahl: Genetics. 1994 Oct;138(2): 241-6)，它的優(yōu)點在于僅天然成分用于連接表達 盒在本發(fā)明被用于醫(yī)學(xué)目的時由于毒理學(xué)的原因被證明是特別有利的。
選擇用于分支DNA連接的寡脫氧核苷酸序列以至在每種情況中在寡 核苷酸5'末端雜交(例如)可以產(chǎn)生一個4個堿基長的突出粘端。分支連 接體每一個臂的粘性末端序列可以不同，但是并不是必須的。T形或線性 DNA結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)與粘性末端互補的突出端。這可以靶向連接表達盒與分支連 接體的各個臂。
本發(fā)明的這種表達構(gòu)建體適合于靶向、多重抑制不同基因的基因表達。 由于構(gòu)建在每種情況中含有產(chǎn)生siRNA分子所需序列的T形結(jié)構(gòu)是相同 的，因此相同數(shù)量的不同siRNA分子被合成。抑制其蛋白質(zhì)表達的基因數(shù) 依賴于由接頭連接的T形結(jié)構(gòu)數(shù)。
在本發(fā)明表達構(gòu)建體的另一個實施方案中，特異性和獨特性選擇用于 和其他成分靶向連接的各個成分的粘性末端是有利的。這允許靶向構(gòu)建所 需的表達構(gòu)建體。
含有合成一或多種siRNA分子的序列的DNA表達構(gòu)建體可以靶向方 式轉(zhuǎn)染細胞。
轉(zhuǎn)染是使用生物學(xué)、化學(xué)或物理學(xué)方法將核酸序列導(dǎo)入細胞，其結(jié)果 是在轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)這些序列編碼的催化性RNA轉(zhuǎn)錄本的持續(xù)或瞬時表達。
更進一步地，本發(fā)明表達構(gòu)建體呈現(xiàn)一或幾種共價連接肽、蛋白質(zhì)、 糖類、抗體或者類固醇。
本發(fā)明也涉及表達構(gòu)建體的制備方法，該構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進入真核細胞后 通過RNA干擾以耙向方式抑制所需蛋白質(zhì)的形成。
用于線性表達構(gòu)建體的一個方法包括開始于方法步驟a)混合DNA雙 鏈、b)發(fā)夾形寡脫氧核苷酸和c)啟動子，所述DNA雙鏈含有基因序列 或其反向互補序列的19至23堿基長的單一拷貝和RNA聚合酶的終止信號 并且在一端末端由8到12堿基長的序列閉合，選擇其以便相對堿基從不相 互互補并且側(cè)翼DNA單鏈共同連接形成DNA雙鏈，其在另一末端呈現(xiàn)一短突出DNA單鏈，所述發(fā)夾形寡脫氧核苷酸在末端呈現(xiàn)一單鏈DNA的短 突出末端，所述啟動子具有單鏈DNA的短突出端，其中所述啟動子的單鏈 5'末端可與發(fā)夾形寡脫氧核苷酸或10到1000堿基長的雙鏈配對，并且所 述啟動子的單鏈3'末端與a)中所述DNA雙鏈的單鏈5'末端互補，在方法 步驟d)中進行隨后的DNA片段連接，在最后的方法步驟e)中進行合成 載體的最終純化。
可隨意設(shè)計本發(fā)明方法以合成線性表達構(gòu)建體以至在方法步驟c)中加 入發(fā)夾形寡脫氧核苷酸之前先加入具有單鏈DNA的短突出末端的10到 1000 (=n)堿基長的非編碼序列的DNA雙鏈，其中單鏈3'末端可與啟動 子的單鏈5'末端配對，單鏈5'末端與發(fā)夾形寡脫氧核苷酸的單鏈3'末端互 補。
對于合成轉(zhuǎn)染進入真核細胞后通過RNA干擾以耙向方式抑制指定蛋 白質(zhì)形成的T形表達構(gòu)建體， 一種方法包括開始于方法步驟a)混合T形 DNA雙鏈和寡脫氧核苷酸，所述T形DNA雙鏈含有5'到3'方向的基因序 列的19到23堿基長的單一拷貝和RNA聚合酶終止信號并且在一端末端由 8到12個堿基長的序列閉合，選擇其以便相對堿基從不相互互補和側(cè)翼雙 鏈區(qū)域因此由2個DNA單鏈相互連接，且在另一末端呈現(xiàn)出2個短突出 DNA單鏈，所述寡脫氧核苷酸的序列與所述2個短突出DNA單鏈互補并 形成單鏈DNA的2個短突出末端，在方法步驟b)中與在末端呈現(xiàn)單鏈 DNA的短突出末端的發(fā)夾形寡脫氧核苷酸混合，方法步驟c)中與另一個 發(fā)夾形寡脫氧核苷酸混合，所述另一個發(fā)夾形寡脫氧核苷酸在末端呈現(xiàn)與 a)中的T形DNA雙鏈互補的單鏈DNA的短突出末端，方法步驟d)中與 具有單鏈DNA的短突出末端的啟動子混合，其中所述啟動子的單鏈5'末端 可與b)的發(fā)夾形寡脫氧核苷酸配對，啟動子的單鏈3'末端與T形DNA雙 鏈的單鏈5，末端互補，在方法步驟e)中進行隨后的DNA片段連接，其中 無需10到1000堿基長的DNA雙鏈也可合成構(gòu)建體，在最后方法步驟f) 中進行合成載體的最終純化。
依據(jù)本發(fā)明，這個制備方法包括在方法步驟c)后加入具有單鏈DNA 的短突出末端的10到1000堿基(=n)長的非編碼序列的DNA雙鏈，其中單鏈3'末端可與啟動子的單鏈5'末端配對，并加入互補于步驟b)的發(fā)夾 形寡脫氧核苷酸的單鏈3'末端的單鏈5'末端和/或加入具有單鏈DNA的短 突出末端的10到1000堿基(=n)長的非編碼序列的DNA雙鏈，其中單鏈 5'末端可與T形DNA雙鏈的單鏈3'末端配對并且單鏈3'末端與方法步驟c) 的發(fā)夾形寡脫氧核苷酸的單鏈5'末端互補。
在優(yōu)選的實施方案中，包括一種方法，其中啟動子是細菌擴增質(zhì)粒 (bakteriell amplifizierbaren Plasmides)的一部分，在、混合成分之前使用可 識別質(zhì)粒上啟動子側(cè)翼的切割位點的限制性核酸內(nèi)切酶將其切割，該切割 位點在合成的分子上是不存在的。
原則上，所述啟動子可以是在靶細胞即基因表達被抑制的細胞內(nèi)可操 作的任何啟動子。如果用本發(fā)明的表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染人類細胞或組織，這些 啟動子優(yōu)選是人來源的。但是，它們也可以是例如病毒、細菌或寄生蟲來 源的或耙物種以外的其他物種來源。所述啟動子特別是也不限于人U6啟動 子、人H1啟動子、鼠U6啟動子、CMV啟動子和7SK啟動子。
此外，依據(jù)本發(fā)明，如果啟動子被用作細菌擴增質(zhì)粒的一部分，在將 啟動子從質(zhì)粒切除的限制性核酸內(nèi)切酶存在時進行連接步驟。
在一個實施方案中，在最終的純化步驟之前，使用特異于3'DNA末端 或5'DNA末端的核酸外切酶進行反應(yīng)混合物的消化。
依據(jù)本發(fā)明的方法，在混合開始時加入的DNA雙鏈可產(chǎn)生自部分自身 互補的寡脫氧核苷酸或2個互補寡脫氧核苷酸的退火。反應(yīng)混合物自身也 可發(fā)生退火，所以在依據(jù)本發(fā)明的方法開始時，僅加入單鏈互補寡脫氧核 苷酸。
在一個優(yōu)選的實施方案中，選擇寡脫氧核苷酸序列以至生成的發(fā)夾在 其雙鏈區(qū)域存在限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列。
使用本發(fā)明方法合成的載體的最終純化優(yōu)選采用色譜或凝膠電泳方法 進行。
如果啟動子在本發(fā)明的制備方法中用作細菌擴增質(zhì)粒的一部分，將啟 動子從質(zhì)粒切割的限制性核酸內(nèi)切酶是II類限制性核酸內(nèi)切酶組中之一， 優(yōu)選是選自Bbsl、 Bbvl、 BbvII、 Bpil; Bpll、 Bsal、 BsmAI、 BsmBI、 BsmFI、BspMI、 Eaml1041、 Earl、 Eco311、 Esp31、 Fokl、 Hgal、 SfaNI或它們的同 切點酶的酶。
本發(fā)明還涉及實施本發(fā)明方法的試劑盒，其含有至少一個啟動子、發(fā) 夾形寡脫氧核苷酸和酶。所述酶是連接酶，限制性核酸內(nèi)切酶，限制性核 酸外切酶，激酶和聚合酶或選擇的酶混合物形式的組合。另外，根據(jù)實施 方案，所述試劑盒也可含有進行酶反應(yīng)的手段和純化制備的載體的手段。 所述啟動子也可包含在試劑盒中作為質(zhì)粒的一部分，使用適合的限制性核 酸內(nèi)切酶可將其從質(zhì)粒切割。
此外，設(shè)計一個可以合成多個RNAi表達構(gòu)建體的試劑盒，其含有所 述T形結(jié)構(gòu)。除了已經(jīng)提及的成分之外，所述試劑盒還含有一個T形結(jié)構(gòu)， 在其具有待轉(zhuǎn)錄序列的雙鏈臂中可插入所需序列。
如果使用具有霍利迪連結(jié)體的接頭，本發(fā)明用以通過RNA干擾耙向抑 制基因表達的表達構(gòu)建體適合于抑制超過一個基因的表達。由于本發(fā)明構(gòu) 建體的特殊結(jié)構(gòu)，形成siRNA的待轉(zhuǎn)錄序列被RNA聚合酶以相同程度讀 出。
轉(zhuǎn)染本發(fā)明的多抑制構(gòu)建體后，被抑制基因的數(shù)量依賴于呈現(xiàn)出接頭 的雙鏈臂的數(shù)目。
根據(jù)本發(fā)明，共轉(zhuǎn)染兩個獨立的載體或者DE 100 48 417 Al中描述的 用于化學(xué)連接編碼的基因序列和必須控制元件(啟動子，poly(A)信號)的 方法均不是最接近現(xiàn)有技術(shù)。在使用脂質(zhì)體的共轉(zhuǎn)染中，不同的載體也同 樣產(chǎn)生相互之間的空間上接近并轉(zhuǎn)運進入細胞，但是本方法的根本原理是 不同的。此外，不幸地，描述的表達構(gòu)建體的化學(xué)接合產(chǎn)生更大分子量的 結(jié)構(gòu)，已知其更難于轉(zhuǎn)運進入細胞。同樣的問題也出現(xiàn)在WO 01/87348 A2 描述的構(gòu)建含有核酸的樹枝聚體的方法中。此外，描述的構(gòu)建樹狀聚體的 方法是多步且復(fù)雜的制備過程。
本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明表達構(gòu)建體之一的藥物，優(yōu)選疫苗。這類藥 物可被局部和全身地應(yīng)用于人類和動物，并適于治療感染例如皰疹病毒感 染、乳頭瘤病毒感染和慢病毒感染，治療新陳代謝紊亂例如Parkinson's病 和囊性纖維化，治療心血管疾病，治療癌癥例如癌、黑色素瘤和肉瘤，治療其他疾病例如年齡相關(guān)性黃斑變性，和炎癥、外傷或手術(shù)過程后的治療， 例如可影響脊髓、腦和其他器官。
在其他從屬權(quán)利要求中描述了更多有利特征；使用實施方案的實施例 和如下圖片更詳細描述本發(fā)明，它們顯示如下
Fig. 1 線性siRNA載體的成分
Fig. 2 T形siRNA載體的成分
Fig. 3 T形雙siRNA載體的成分
Fig. 4 T形三siRNA載體的成分
Fig. 5 詳細表示T形構(gòu)建體的靶序列環(huán)
Fig. 6/7本發(fā)明T形siRNA表達載體(T-siRNA-CDC2)與含有相同靶 序列的合成RNA (CDC2-RNA)相比較的實驗結(jié)果
Fig. 1:顯示線性siRNA載體的成分
A:在本法中使用的siRNA序列與靶mRNA同源。所述序列由一條有 義或反義區(qū)(靶區(qū))、8到12堿基長的序列環(huán)和反向互補終止序列組成。 siRNA序列由必須借助酶混合物被退火、連接和合適時磷酸化的各個ODN 片段組成，它也可以完整的ODN片段存在。
此外，所述成分通過連接酶與ODN片段連接。這些成分是具有相應(yīng)互 補突出端的啟動子序列和發(fā)夾形寡二核苷酸，該發(fā)夾形寡二核苷酸在每種 情況中4個堿基的自身互補和獨特突出端導(dǎo)致共價閉合線性載體的產(chǎn)生， 其由啟動子、靶序列和終止序列組成并具有閉合的發(fā)夾形末端。
在啟動子和末端寡核苷酸之間，可以使用具有單鏈DNA的短突出末端 的10到1000堿基(=n)長的非編碼序列的DNA雙鏈。
B:用于轉(zhuǎn)染的終產(chǎn)物
Fig. 2:顯示T形siRNA載體的成分
A:方法中使用的SiRNA序列與靶mRNA同源。序列由有義或反義區(qū) (靶區(qū))、8到12堿基長的序列環(huán)和終止序列組成。siRNA序列由必須借 助酶混合物被退火、連接和合適時磷酸化的各個ODN片段組成；它也可以 完整的ODN片段存在。B/C:此外，所述成分通過連接酶與ODN片段連接。這些成分是具有 相應(yīng)互補突出端的啟動子序列和發(fā)夾形寡二核苷酸，所述發(fā)夾形寡二核苷 酸在每種情況中的4個堿基的自身互補和獨特的突出端導(dǎo)致共價閉合載體 的產(chǎn)生，其由啟動子、有義環(huán)或反義環(huán)和終止序列組成并且具有閉合發(fā)夾 形末端。
在啟動子和末端寡核苷酸之間，以及在終止序列和末端寡核苷酸之間， 可以使用具有單鏈DNA的短突出末端的10到1000堿基(=11)長的非編碼 序列的DNA雙鏈。
D:用于轉(zhuǎn)染的終產(chǎn)物
Fig. 3:顯示T形多siRNA載體(雙構(gòu)建體)的成分
A/B/C/D:方法中使用的SiRNA序列與靶mRNA同源。這兩個序列由有 義或反義區(qū)(靶A，靶B)、 8到12堿基長的序列環(huán)和終止序列組成。siRNA 序列由必須借助酶混合物被退火、連接和合適時磷酸化的各個ODN片段組 成；它們也可以完整的ODN片段存在。此外，所述成分通過連接酶與ODN 片段連接。這些成分是具有相應(yīng)互補突出端的啟動子序列，DNA雙鏈接頭 和發(fā)夾形寡二核苷酸，在每種情況中所述發(fā)夾形寡二核苷酸的4個堿基的 自身互補和獨特的突出端導(dǎo)致共價閉合載體的產(chǎn)生，其由啟動子、有義環(huán) 或反義環(huán)和終止序列組成并且具有閉合發(fā)夾形末端。
在啟動子和末端寡核苷酸之間，在終止序列和末端寡核苷酸之間，以 及在接頭和啟動子之間的每種情況中，可以使用具有單鏈DNA的短突出末 端的10到1000堿基(=n)長的非編碼序列的DNA雙鏈。
E:用于轉(zhuǎn)染的終產(chǎn)物
Fig. 4: 顯示T形多siRNA載體(三構(gòu)建體)的成分 A/B/C/D/E:方法中使用的SiRNA序列與耙mRNA同源。這三個序列由 有義或反義區(qū)(靶A,靶B)、8到12堿基長的序列環(huán)和終止序列組成。siRNA 序列由必須借助酶混合物被退火、連接和合適時磷酸化的各個ODN片段組 成；它們也可以完整的ODN片段存在。此夕卜，所述成分通過連接酶與ODN 片段連接。這些成分是具有相應(yīng)互補突出端的啟動子序列，DNA雙鏈接頭 和發(fā)夾形寡二核苷酸，在每種情況中所述發(fā)夾形寡二核苷酸的4個堿基的自身互補和獨特的突出端導(dǎo)致共價閉合載體的產(chǎn)生，其由啟動子、有義環(huán) 或反義環(huán)和終止序列組成并且具有閉合發(fā)夾形末端。
在啟動子和末端寡核苷酸之間，在終止序列和末端寡核苷酸之間，在
接頭和啟動子之間的每種情況中，可以使用具有單鏈DNA的短突出末端的 10到1000堿基(=n)長的非編碼序列的DNA雙鏈。 F:用于轉(zhuǎn)染的終產(chǎn)物
Fig. 5:顯示T形構(gòu)建體耙序列環(huán)的詳細描述
Fig. 6: 顯示本發(fā)明T形siRNA表達載體(T-siRNA-CDC2)與含有相 同靶序列的合成RNA(CDC2-RNA)相比較的實驗結(jié)果
HeLa細胞轉(zhuǎn)染后采用定量實時PCR檢測CDC2 mRNA。使用以下材 料本發(fā)明方法制備的含有CDC2靶序列的T形siRNA載體；相同CDC2 靶序列的合成RNA;和未處理細胞。數(shù)值為多個測定值計算的平均值。正 如預(yù)料，未處理細胞未觀察到CDC2mRNA的抑制。作為對照，使用T形 siRNA載體和合成RNA處理的細胞證明顯著少量的CDC2 mRNA。與陽性 對照(未處理細胞)比較，這減少直至96.7%。
Fig. 7:顯示本發(fā)明T形siRNA表達載體(T-siRNA-CDC2)與含有相同靶 序列的合成RNA (CDC2-RNA)相比較的實驗結(jié)果。
HeLa細胞轉(zhuǎn)染后經(jīng)Western印跡檢測CDC2蛋白質(zhì)。使用以下材料 本發(fā)明方法制備的含有CDC2靶序列的T形siRNA載體；同樣CDC2耙序 列的合成RNA;和未處理細胞。使用P-微管蛋白作為內(nèi)標。正如預(yù)料，未 處理細胞(泳道4)未觀察到CDC2 mRNA的抑制。作為對照，使用T形 siRNA構(gòu)建體(泳道2)和合成RNA (泳道3)處理的細胞證明顯著少量 的CDC2蛋白質(zhì)。
依據(jù)本發(fā)明方法用"siRNA表達載體試劑盒"制備的T形siRNA構(gòu)建體 對基因表達的抑制與合成RNA轉(zhuǎn)染的作用是可比較的。在兩個轉(zhuǎn)染實驗 中，基因表達的抑制作用在94和96%之間。
實施例1:抑制CDC2表達的T形siRNA載體的制備 編碼CDC2的siRNA載體如下獲得兩個CDC2的ODN片段在9(TC加熱3分鐘并逐漸冷卻退火。按此方 法獲得編碼CDC2的序列
Seq. ID 1: TGGGGTCAGCTCGTTACTCTCTC 19個堿基來自有義鏈，而隨后的4個堿基(下劃線)來自環(huán)序列的開始。
隨后PN激酶的磷酸化作用。使用3.9嗎CDC2獲得10昭終產(chǎn)物。隨 后加入5.2嗎H1啟動子(seq. ID 2)和5'磷酸化發(fā)夾形寡脫氧核苷酸(s叫. ID3和4):
Seq. ID 2: ATATTTGCAT GTCGCTATGT GTTCTGGGAA ATCACCATAA ACGTGAAATG TCTTTGGATT TGGGAATCTT ATAAGTTCTGT ATGAGAGCAC AGATAGGG S叫.ID 3: 5'-PH畫GGG AAA GCT TAG TTT TCT AAG CTT-3' (1.3pg)及 Seq. ID 4: 5'-PH-GTT GGA ATT CAG TTT TCT GAA TTC-3' (1.3)tig)， T4 DNA連接酶幫助各個片段連接。T7 DNA聚合酶處理生成的核酸混合 物。終產(chǎn)物表達siRNALuc的載體通過柱層析純化并備用于轉(zhuǎn)染。
權(quán)利要求
1、通過RNA干擾靶向抑制基因表達的DNA表達構(gòu)建體，其由以下 成分組成a) 第一末端DNA發(fā)夾環(huán)，其中脫氧核糖核苷酸的一條單鏈向后折疊形成雙鏈區(qū)以至后者在一個末端具有粘性突出端而在相對末端具有單鏈 環(huán)；b) 與第一末端發(fā)夾環(huán)相似地構(gòu)建第二末端發(fā)夾環(huán)；c) 具有通過霍利迪連結(jié)體相互連接的三個雙鏈DNA臂的至少一個T 形DNA結(jié)構(gòu)，其中I、 一條臂含有待轉(zhuǎn)錄序列并且這個DNA雙鏈臂的單鏈在與其他臂連 接相對的末端通過單鏈DNA環(huán)相互連接；ii.其他2個臂呈現(xiàn)粘性末端，其中一條臂呈現(xiàn)適合的終止序列而另一 臂呈現(xiàn)適合的啟動子序列。
2、 通過RNA干擾靶向抑制基因表達的DNA表達構(gòu)建體，其由以下 成分組成a) 第一末端DNA發(fā)夾環(huán)，其中脫氧核糖核苷酸的一條單鏈向后折疊 形成雙鏈區(qū)以至后者呈現(xiàn)具有粘性突出端的一個末端以及在相對末端形成 雙鏈的單鏈通過單鏈環(huán)互相連接；b) 與第一末端發(fā)夾環(huán)相似地構(gòu)建第二末端發(fā)夾環(huán)且其雙鏈和單鏈區(qū) 由待轉(zhuǎn)錄序列組成；c) 適合的啟動子序列和適合的反向互補終止序列，其位于a)和b)中描 述的兩個末端發(fā)夾環(huán)之間的DNA雙鏈中。
3、 權(quán)利要求1的DNA表達構(gòu)建體，其中幾個T形DNA結(jié)構(gòu)均在一 個末端由接頭通過霍利迪連結(jié)體連接。
4、 權(quán)利要求2的DNA表達構(gòu)建體，其中幾個線性DNA結(jié)構(gòu)均在一個末端由接頭通過霍利迪連結(jié)體連接。
5、 前述權(quán)利要求任一項的DNA表達構(gòu)建體，其中特異性和獨特性地 選擇用于與其他成分靶向連接的各個成分的粘性末端。
6、 權(quán)利要求1-4任一項的靶向抑制一或幾個基因表達的DNA表達構(gòu) 建體，其中待轉(zhuǎn)錄的序列編碼相同或不同基因。
7、 權(quán)利要求1-4任一項的靶向抑制一或幾個基因表達的DNA表達構(gòu) 建體，其中對核酸外切酶降解的保護通過共價彼此連接線性雙鏈的兩條鏈 的3到8個脫氧核苷酸的短單鏈區(qū)完成。
8、 權(quán)利要求1-4任一項的靶向抑制一或幾個基因表達的DNA表達構(gòu) 建體，其中所述DNA表達構(gòu)建體在短單鏈區(qū)內(nèi)與一或幾個肽、蛋白質(zhì)、糖 類、抗體或類固醇共價連接。
9、 一種合成載體的方法，所述載體在轉(zhuǎn)染進入真核細胞后通過RNA 干擾以靶向方式抑制指定蛋白質(zhì)的形成，所述方法特征在于以下步驟a) 混合DNA雙鏈，所述DNA雙鏈含有19到23堿基長的、單一拷貝 的基因序列或其反向互補序列和RNA聚合酶終止信號，并且在一個末端通 過8到12堿基長的序列環(huán)閉合，選擇所述DNA雙鏈以至相對堿基從不相 互互補并且側(cè)翼DNA單鏈相互連接形成DNA雙鏈，在其另一末端呈現(xiàn)一 個短突出DNA單鏈，以及b) 在末端呈現(xiàn)單鏈DNA的短突出末端的發(fā)夾形寡脫氧核苷酸，和c) 具有單鏈DNA的短突出末端的啟動子，其中所述啟動子的單鏈5' 末端可與發(fā)夾形寡脫氧核苷酸或者10到1000堿基長的雙鏈配對，并且所 述啟動子的單鏈3'末端與a)中描述的DNA雙鏈的單鏈5'末端互補，和d) 隨后連接DNA片段，e) 以及最后純化合成的載體。
10、 權(quán)利要求9的合成方法，其中在方法步驟b)之后加入具有單鏈 DNA的短突出末端的10到1000堿基(=n)長的非編碼序列的DNA雙鏈， 其中單鏈3'末端可與啟動子單鏈5'末端配對，單鏈5'末端與發(fā)夾形寡脫氧 核苷酸單鏈3'末端互補。
11、 一種載體的合成方法，所述載體在轉(zhuǎn)染進入真核細胞后通過RNA 干擾以靶向方式抑制指定蛋白質(zhì)的形成，所述方法特征在于以下方法步驟a) 混合T形DNA雙鏈和寡脫氧核苷酸，所述T形DNA雙鏈含有19 到23堿基長的5'到3'方向的單拷貝基因序列和RNA聚合酶的終止信號， 并且其在一個末端通過8到12堿基長度的序列環(huán)閉合，選擇其以至相對堿 基從不相互互補并且側(cè)翼雙鏈區(qū)由2個DNA單鏈相互連接，在另一末端呈 現(xiàn)兩個短突出DNA單鏈，所述寡脫氧核苷酸的序列與2個短突出DNA單 鏈互補并形成單鏈DNA的兩個短突出末端，和b) 發(fā)夾形寡脫氧核苷酸，其在末端呈現(xiàn)單鏈DNA的短突出末端，和c) 另一個發(fā)夾形寡脫氧核苷酸，其在末端呈現(xiàn)與a)的T形DNA雙鏈 互補的單鏈DNA的短突出末端，和d) 具有單鏈DNA的短突出末端的啟動子，其中所述啟動子的單鏈5' 末端可與b)的發(fā)夾形寡脫氧核苷酸配對，并且所述啟動子的單鏈3'末端與 T形DNA雙鏈的單鏈5'末端互補，和e) 隨后連接DNA片斷，及f) 最終純化合成載體。
12、 權(quán)利要求11的合成方法，其中在方法步驟c)之后加入具有單鏈 DNA的短突出末端的10到1000堿基(=n)長的非編碼序列的DNA雙鏈， 其中單鏈3'末端可與啟動子單鏈5'末端配對并且單鏈5'末端互補于方法步 驟b)的發(fā)夾形寡脫氧核苷酸的單鏈3'末端和/或加入具有單鏈DNA的短 突出末端的10到1000堿基(=n)長的非編碼序列的DNA雙鏈，其中單鏈 5'末端可與T形DNA雙鏈的單鏈3'末端配對并且單鏈3，末端與方法步驟c)的發(fā)夾形寡脫氧核苷酸的單鏈5'末端互補。
13、 權(quán)利要求9-12任一項的合成方法，其中在方法開始之前，部分互 補的單鏈寡脫氧核苷酸雜交形成接頭分子，其中所述雜交是不完全的以至 具有相同或不同堿基序列的粘性末端的2個或多個雙鏈區(qū)通過霍利迪連結(jié) 體相互連接并隨后進行所示的方法步驟。
14、 權(quán)利要求9-13任一項的方法，其中所述啟動子是細菌擴增質(zhì)粒的 一部分，在混合各種成分之前質(zhì)粒被識別質(zhì)粒上啟動子側(cè)翼切割位點的限 制性核酸內(nèi)切酶切割，該切割位點不存在于被合成的表達構(gòu)建體中。
15、 權(quán)利要求14的方法，其中在從質(zhì)粒剪接啟動子的限制性核酸內(nèi)切 酶存在時進行各連接步驟。
16、 權(quán)利要求14或15的方法，其中在最終純化步驟之前，使用特異 于3'或5'DNA末端的核酸外切酶消化反應(yīng)混合物。
17、 權(quán)利要求14-16任一項的方法，其中限制性核酸內(nèi)切酶是II類限 制性核酸內(nèi)切酶之一，優(yōu)選是選自BbsI、 Bbvl、 BbvII、 Bpil; Bpll、 Bsal、 BsmAI、 BsmBI、 BsmFI、 BspMI、 Eam 11041、 Eari、 Eco311、 Esp31、 Fokl、 Hgal、 SfaNI或它們的同切點酶的酶。
18、 權(quán)利要求9-17任一項的方法，其中在混合成分時加入產(chǎn)生于部分 自身互補的寡脫氧核苷酸或至少2條寡脫氧核苷酸的部分退火的DNA雙 鏈。
19、 權(quán)利要求9-18任一項的方法，其中發(fā)夾形寡脫氧核苷酸在其雙鏈 區(qū)呈現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列。
20、 權(quán)利要求9-19任一項的方法，其中通過層析和/或使用凝膠電泳進 行純化。
21、 用于由權(quán)利要求9-20任一項的方法合成載體的試劑盒，所述載體 在其轉(zhuǎn)染進入真核細胞后適合于在這些細胞內(nèi)通過RNA干擾以靶向方式 抑制指定蛋白質(zhì)的形成，所述試劑盒含有至少一個啟動子、發(fā)夾形寡脫氧 核苷酸和酶。
22、 用于合成權(quán)利要求1-4任一項的表達構(gòu)建體的試劑盒，其至少含 有適合形成末端發(fā)夾環(huán)的寡核苷酸、適合形成接頭的寡脫氧核苷酸、其中 可插入待轉(zhuǎn)錄序列的T形DNA結(jié)構(gòu)和酶以及進行連接、剪接、DNA降解 和純化步驟的手段。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達構(gòu)建體及其合成方法，在它們轉(zhuǎn)染進入真核細胞后，在這些細胞內(nèi)適合以RNA干擾以靶向方式抑制指定蛋白質(zhì)的形成。在一個反應(yīng)容器中，制備這種載體的不包含PCR步驟的方法是3步法并且可在幾小時內(nèi)完成。此外，本發(fā)明涉及適合以RNA干擾靶向抑制基因表達的DNA表達構(gòu)建體，其中這些表達構(gòu)建體也適合于多基因表達抑制。
文檔編號C12N15/11GK101313067SQ200680043264
公開日2008年11月26日 申請日期2006年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日
發(fā)明者D·奧斯拉德, M·施羅夫 申請人:莫洛根股份公司