專利名稱：主要包括一種對(duì)映異構(gòu)體的1,1,1-三氟異丙醇的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及其中特定的對(duì)映異構(gòu)體占主要地位的l,U-三氟異丙醇的 制備方法，其通過(guò)1,1,1-三氟丙酮的對(duì)映選擇性的酶還原來(lái)制備。
背景技術(shù)：
已知僅有少數(shù)方法用于合成主要包括作為目標(biāo)藥物構(gòu)造單元的特定的 對(duì)映異構(gòu)體的l,U-三氟異丙醇(可選名1，1,1-三氟-2-羥基丙垸)。因此，例
如，根據(jù)Yonezawa等人(T. Yonezawa， Y. Sakamoto, K. Nogawa， T. Yamazaki， T. Kitazume, C7zew. Ze". 1996, 855-856)所述，通過(guò)在制備之后，分離形成的外 消旋體，可以選擇對(duì)映異構(gòu)體。然而，該類外消旋體拆分受限為預(yù)先制備 的總產(chǎn)物的最大產(chǎn)率的50%。
無(wú)可置疑的是，原則上最有效的合成路線是相應(yīng)酮"l，l，l-三氟丙酮"直 接不對(duì)稱地轉(zhuǎn)化成相應(yīng)醇，在這種情況下直接得到所需的對(duì)映異構(gòu)體。原 則上可以使用手性還原劑或者使用手性催化劑與還原劑。由于效率原因并 且由于顯著改善的原子經(jīng)濟(jì)性，后一種方法是更優(yōu)選的。然而，至今僅公 開(kāi)了關(guān)于通過(guò)1,1,1-三氟丙酮的對(duì)映選擇性的還原來(lái)制備主要包括一種對(duì) 映異構(gòu)體(下面也稱作"對(duì)映異構(gòu)體-富集的")的1,1,1-三氟異丙醇的兩項(xiàng)研 究，并將在下面進(jìn)行說(shuō)明。鑒于酮類的不對(duì)稱還原發(fā)展出的大量方法，這 是極為令人驚訝的。
因此，Brown等人使用用于l，l,l-三氟丙酮的立體選擇性還原的手性還 原劑得到了對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量89% ee的相應(yīng)醇(P.V. Ramachandran， A.V. Teodorovic, H.C. Brown, 7^ra/^Aow 1993,邦，1725-1738)。在這種情況下， 除了對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量低于90。/。ee之外，從工業(yè)觀點(diǎn)來(lái)看，其缺點(diǎn)在于使用 要求化學(xué)計(jì)量的量的手性還原劑"(-)-B-氯二異松茨烷基硼垸"。此外，要求 化學(xué)計(jì)量的量的樟腦衍生物作為手性助劑以制備這種有機(jī)硼化合物。
對(duì)映異構(gòu)體富集的l，l，l-三氟異丙醇的一種可選合成基于使用醇脫氫酶的l,U-三氟丙酮的直接酶還原。醇脫氫酶屬于酶類別EC 1，并催化羰基 化合物的(可逆)反應(yīng)以形成醇官能團(tuán)。在這種情況下，Prdog規(guī)則適用于選 擇性，根據(jù)Prelog規(guī)則取決于與羰基鄰近的基團(tuán)的各自尺寸發(fā)生優(yōu)先轉(zhuǎn)化 為相應(yīng)(i )或(5) X寸映異構(gòu)體(K. Faber，傷Wrara/orma"ora (>gam'c C/7emz.W/j， 4th edition, Springer, Berlin, 2000, Chapter 2.1.1, pp. 166-167)。因 此，具有與羰基鄰近的相似尺寸基團(tuán)的酮類的還原成為問(wèn)題，例如，在l，l,l-三氟丙酮的情況下也如此。因此，至今尚未公開(kāi)對(duì)于l，l,l-三氟異丙醇的使 用酶的高選擇性還原。因此，Bucciarelli等人報(bào)告的使用面包酵母菌還原 U,l-三氟丙酮形成OS)-U,l-三氟異丙醇導(dǎo)致對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量?jī)H有80.3% ee [M. Bucciarelli, A. Forni， I. Moretti, G. Torre， 5^"Aw^ 1983， 897-899]，因此顯 著低于工業(yè)應(yīng)用所需的對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量，8卩>90% ee，特別是>95% ee，極 優(yōu)選>99%^。例如，藥物應(yīng)用的要求在于，每種情況下光學(xué)活性產(chǎn)物的對(duì) 映異構(gòu)體過(guò)量為>99% ee (關(guān)于"ee"的定義和進(jìn)一步說(shuō)明，參見(jiàn)例如K. Faber,
Orgaw/c CTzew/s^y, 4th edition, Springer, Berlin, 2000， Chapter2丄l， pp. 28-52)。與此相比，多個(gè)例子是已知的，例如醇脫氫酶-催 化的酮類還原，這種酮具有與羰基鄰近的空間上明顯不同的取代基，并且 對(duì)映選擇性為>90% ee,特別是〉95。/。ee，極優(yōu)選>99% ee [參見(jiàn)尤其是K. Nakamura， T. Matsuda in: Cato/拜》z'w (9廠gam'c 5y涵e^ (編者K.
Drauz, H. Waldmann)， Volume III, Wiley-VCH, 2nd edition, 2002, pp. 991-1047]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供主要包括一種對(duì)映異構(gòu)體的l,l，l-三氟異丙醇的 制備方法，所述方法可以制備高對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量〉卯。/。ee、特別是〉95。/。ee、 極優(yōu)選>99% ee的這些化合物。
根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法實(shí)現(xiàn)上述目的。優(yōu)選的實(shí)施方案由從屬權(quán) 利要求代表。所述方法利用了 l,U-三氟丙酮的對(duì)映選擇性的還原。
令人驚訝的是，使用本發(fā)明方法獲得對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量高達(dá)〉99。/。ee，在 至今的現(xiàn)有技術(shù)中是意料之外的。根據(jù)至今公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ee值明顯 <90% ee，并且基于Prdog規(guī)則-作為與羰基鄰近的CH3和CF3兩種基團(tuán)的相似性的結(jié)果-原則上將預(yù)期至較低的選擇性。然而，相比而言，本發(fā)明方
法獲得了優(yōu)異的對(duì)映選擇性〉90。/。ee，特別是〉95。/。ee，特別優(yōu)選>99% ee。 本發(fā)明方法中可以使用的醇脫氫酶原則上是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的該 類的所有酶，只要它們能夠催化本發(fā)明方法中使用的轉(zhuǎn)化/反應(yīng)。這通過(guò)常 規(guī)實(shí)驗(yàn)可以找到。
優(yōu)選使用的醇脫氫酶是即使與羰基鄰近的基團(tuán)具有相似的空間尺寸也 能催化立體選擇性的轉(zhuǎn)化的醇脫氫酶。
特別優(yōu)選使用選自以下生物體的至少一種醇脫氫酶紅串紅球菌 (/ /zo<io<:oct^ ^y^zrapoto) (S-ADH)，石蠟節(jié)桿菌(^4rf/zra6acfer _para^ wews) (S-ADH)或高加索酸奶乳桿菌(丄actoZ^c/〃附fe/ r) (R-ADH)(允eo^rapofc 的ADH: a) EP 1499716; b) K. Abokitse, W. Hummel， Cloning, sequence analysis, and heterologous expression of the gene encoding a (S)-specific alcohol dehydrogenase from i /zo^fococcws e，/zra/ o//51 DSM 43297， Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003， 62， 380-386 ; c) PCT/EP2005/06215). (A 戸4"冊(cè)的ADH: WO 2005103239)(丄a加6腦'〃w fe,的ADH: a) EP 456107; b) C.W. Bradshaw, W. Hummel， C,H. Wong, Lc oZ>ad//w Alcohol Dehydrogenase: A UsefUl Catalyst for Synthesis, J. Org. Chem. 1992， 57, 1532-1536; c) PCT/EP2005/06215)。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及其中至少一種醇脫氫酶源于選 自以下的生物體的本發(fā)明方法高加索酸奶乳桿菌(丄flcto6ac///^ fey 。、膠 紅類酉孝母菌(i /zoc^otora/a g/w&"&)、廣布肉桿菌(C"A7 o6acfm'畫、 野生鏈球菌(5^eptococcws;ferw"、浮游芽生桿菌OS/astoZ)flc/er "atoto〃'"力、鎖 接[5酉孝母菌(5^oW血6o/t^ sa/mom'co/or) 、 /Vc/n'a /^/c;pMa、尸z'c/zz.a / a加ni、 馬克思克魯維酵母(K/M_yveraw_yc&s mawa'a"w力、卡氏畢赤酵母(P/c/z/a carso"")、酉良酒酵母(&cc/zaramjcay cweWw'ae)禾口紅串紅球菌(朋ocfococcw51
優(yōu)選使用細(xì)菌醇脫氫酶。
原則上在本發(fā)明方法中可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的形式(見(jiàn)下)使用 醇脫氫酶。然而，由于作為氧化還原酶的醇脫氫酶是輔因子依賴性酶，所 用酶所需的輔因子必須以足量存在于反應(yīng)混合物中，以成功地進(jìn)行還原，從而能夠確保酮類的完全轉(zhuǎn)化。由于這些輔因子是相對(duì)高成本的分子，因 此出于經(jīng)濟(jì)原因，使用最小量的輔因子是關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。能夠使用低于化學(xué)計(jì) 量所需量的輔因子的一種可能性是通過(guò)存在于混合物中的第二生物催化劑 使其再生。操作這種體系，使得(例如，有機(jī))化合物的酶轉(zhuǎn)化隨輔因子的"消 耗"進(jìn)行，并且這種輔因子通過(guò)第二酶體系原位再生。因此，其結(jié)果是降低 了高成本輔因子的使用量。
因此，借助于偶聯(lián)酶體系的反應(yīng)代表了有利的過(guò)程。
例如在DE-A 10233046或DE-A 10233107中提及了這種偶聯(lián)體系。 使所用的輔因子再生的酶首先取決于使用的輔因子，其次還取決于將 被氧化或被還原的輔底物。使NAD(P)H再生的一些酶記載在Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Ed.: K. Drauz, H. Waldmann， 1995， Vol. I， VCH，頁(yè)721中。出于商業(yè)利益并也可以大規(guī)模得到，且目前用于合成氨 基酸，從這些原因來(lái)看，有利的是使用所謂的甲酸脫氫酶(FDH)(也參見(jiàn) DE-A 10233046)和所謂的葡萄糖脫氫酶。因此，它們也優(yōu)選用于本發(fā)明方 法中來(lái)再生輔因子。FDH特別優(yōu)選地源于生物體博伊丁假絲酵母(07^/油 6oW/mY)。還可以使用其進(jìn)一步發(fā)展的突變體，例如記載在DE-A 19753350 中的那些。還可以并優(yōu)選使用源于枯草桿菌(5"c///^ w^/fc)的葡萄糖脫氫 酶。然而，例如通過(guò)使用異丙醇的底物-偶聯(lián)再生也是可以的(使用異丙醇的 輔因子再生方法的例子a) W. Stampfer, B. Kosjek, C. Moitzi, W. Kroutil， K. Faber,C7zem. 2002， J", 1056-1059; b) M. Wolberg, W. Hummel， C. Wandrey, M. Mmier，爿wg緩Oz置2000， 7", 4476-4478)。
在本發(fā)明方法中，立體特異性轉(zhuǎn)化/反應(yīng)可以在適于這種反應(yīng)的任何介 質(zhì)中進(jìn)行。例如可以在純的水溶液或在用有機(jī)溶劑補(bǔ)充的含水介質(zhì)中進(jìn)行 催化。在這一方面可以是單相或多相體系。本發(fā)明方法的所選反應(yīng)介質(zhì)沒(méi) 有限制，只要所選酶能夠催化其中所需的立體選擇性反應(yīng)，并且產(chǎn)率為所 需程度。
使用高初始底物濃度進(jìn)行所述方法(從高的單位體積產(chǎn)率的觀點(diǎn)來(lái)看) 是有利的。這些濃度通常>50 g/1,優(yōu)選〉100g/1，極優(yōu)選M50g/1。此外，通 過(guò)在催化轉(zhuǎn)化中連續(xù)供應(yīng)新的底物溶液，可以任選地保持底物濃度，特別 是當(dāng)使用下述全細(xì)胞催化劑時(shí)。原則上可以在任何適合的溫度下進(jìn)行所述方法。在這一方面本領(lǐng)域技 術(shù)人員的目的是優(yōu)選以最大純度和最小時(shí)間獲得所需產(chǎn)物的最大產(chǎn)率。此 外，所用酶在所用溫度下應(yīng)足夠穩(wěn)定，反應(yīng)具有最大的對(duì)映選擇性。使用
源于喜溫生物體的酶，完全可以例如達(dá)到IO(TC的溫度。主要目的是所用酶 催化最適宜時(shí)的溫度。水性體系中肯定可測(cè)的下限是-15'C。本發(fā)明方法的 優(yōu)選溫度范圍為10°C~60°C，特別優(yōu)選20'C 4(rC，并主要根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)確 定。
反應(yīng)中的pH同樣主要根據(jù)所用酶和輔因子的穩(wěn)定性確定，并可以通過(guò) 測(cè)定轉(zhuǎn)化速率來(lái)確定，而且針對(duì)本發(fā)明方法相應(yīng)地設(shè)置。用于酶的優(yōu)選范 圍通常為pH5 H，但是，如果所用酶的一種在較低值或較高值下具有最大 催化，那么在例外情況下pH也可以更高或更高。本發(fā)明方法中進(jìn)行反應(yīng)的 pH范圍優(yōu)選為5.5~10.0，特別是6.0~9.0。
盡管本文所述方法也可以用在適合的反應(yīng)介質(zhì)中分離的酶進(jìn)行，但在 特別優(yōu)選的實(shí)施方案中使用全細(xì)胞催化劑進(jìn)行本發(fā)明方法，其中全細(xì)胞催 化劑是包括反應(yīng)用的(至少一個(gè))全細(xì)胞的體系，所述細(xì)胞優(yōu)選能夠同時(shí)表達(dá) 所需的醇脫氫酶和再生輔因子的酶(對(duì)于使用全細(xì)胞催化劑進(jìn)行對(duì)映選擇性 的還原的方法設(shè)計(jì)，參見(jiàn)例如，尤其是PCT/EP2005/06215)。因此，所述 細(xì)胞優(yōu)選表達(dá)至少一種具有醇脫氫酶活性的酶(多肽)和至少一種具有使所 用輔因子再生的活性的酶。所用的這些酶和/或細(xì)胞優(yōu)選源于前述提及的生 物體。
對(duì)于使用異丙醇的輔因子再生，還可以使用優(yōu)選表達(dá)至少一種具有醇 脫氫酶活性的酶(多肽)和具有使所用輔因子再生的活性的任選一種酶的細(xì) 胞。
原則上可以舉出的適合的微生物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于此目的 的所有生物體，例如，酵母菌，如T/a"se"w/a jw&worp/w、戶!'c/n'a s卩、
原核生物，'如co/z'、萬(wàn)a"7/iw ^Z^/fe，或真核細(xì) 胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等?？梢圆⑶覂?yōu)選的是使用用于此目的的 五.co/Z菌株。極特別優(yōu)選的是五.co//XL1 Blue、 NM522、 JM101、 JM109、 JM105、 RR1、 DH5a、 TOP l(T或HB101 。這些菌株是公知的，并且可購(gòu)得。
優(yōu)選使用如DE-A 10155928中記載的生物體作為主體生物體。這種生物體的優(yōu)點(diǎn)在于，同時(shí)表達(dá)適于本發(fā)明方法的兩種多肽體系，從而對(duì)于本 發(fā)明方法僅需要使用一種重組(經(jīng)基因修飾的)生物體。
為調(diào)節(jié)與所需催化活性相關(guān)的多肽(酶)的表達(dá)，相應(yīng)的編碼核酸序列可 以以不同的復(fù)制數(shù)存在于不同質(zhì)粒上，和/或不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子可以用于核 酸序列的不同強(qiáng)度的表達(dá)。使用這種經(jīng)調(diào)節(jié)的酶體系，其優(yōu)點(diǎn)在于不會(huì)積 聚中間體化合物，并且相關(guān)反應(yīng)可以在最佳總速率下進(jìn)行。然而，這是本
領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(Gellissen， G.; Piontek, M.; Dahlems, U.; Jenzelewski， V.; Gavagan， J.W.; DiCosimo, R.; Anton， D丄.；Janowicz, Z.A. (1996)， Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46， 46-54; Farwick， M.; London, M.; Dohmen, J.; Dahlems, U.; Gellissen， G.; Strasser, A.W.; DE-A 19920712)。用作"全細(xì)胞催化 劑"并在合適時(shí)經(jīng)基因修飾的微生物的制備原則上可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的方法進(jìn)行(Sambrook， J.; Fritsch， E.R and Maniatis, T. (1989)， Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Balbas， P. and Bolivar， F. (1990), Design and construction of expression plasmid vecitors in E. coli, Methods Enzymol. 185， 14-37; Rodriguez, R丄.and Denhardt， D.T. (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205-225, Butterworth, Stoneham)。關(guān) 于一般過(guò)程(PCR、克隆、表達(dá)等)所用的技術(shù)，可以參見(jiàn)以下文獻(xiàn)及其中引 用的文獻(xiàn)Universal Genome Walker Kit User Manual, Clontech, 3/2000和 其中引用的文獻(xiàn)；Triglia T.; Peterson, M.G. and Kemp， D丄(1988)， A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences, Nucleic Acids Res. 16, 8186; Sambrook, J.; Fritsch, E.F. and Maniatis， T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Rodriguez, R.L. and Denhardt, D.T. (eds) (1988)， Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworth, Stoneham。
優(yōu)選使用例如在攪拌容器、級(jí)聯(lián)攪拌容器或膜反應(yīng)器中的反應(yīng)體系， 可以間歇操作和連續(xù)方式操作。然而，可以進(jìn)行本發(fā)明方法的任何類型的體系均是適合的。
在本發(fā)明中，膜反應(yīng)器是指其中催化劑封裝在反應(yīng)器中，同時(shí)低分子 量物質(zhì)可以被加到反應(yīng)器中或能夠離開(kāi)反應(yīng)器的任何反應(yīng)容器。此外，膜 可以直接集成在反應(yīng)室中或者加入至單獨(dú)在外的過(guò)濾模塊中，其中反應(yīng)溶 液通過(guò)過(guò)濾模塊連續(xù)或間歇地流動(dòng)，并且滲余物返回到反應(yīng)器中。適合的
實(shí)施方案尤其記載在W098/22415和Wandrey等人的Jahrbuch 1998， Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI, pp. 151 et s叫；Wandrey 等人的Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds, Vol. 2， VCH 1996, pp. 832 et seq.; Kragl等人，Angew. Chem. 1996, 6, 684 et seq中。 此外，除了間歇和半連續(xù)過(guò)程之外，可以在裝置中進(jìn)行的連續(xù)過(guò)程例 如可以錯(cuò)流過(guò)濾模式或終端過(guò)濾形式進(jìn)行。這兩種方法的變體原則上記載 于王見(jiàn)有技術(shù)中(Engineering Processes for Bioseparations， Ed.: L.R. Weatherley， Heinemann, 1994， 135-165; Wandrey等人，Tetrahedron Asymmetry 1999， 10, 923-928)。
對(duì)于應(yīng)用，用于本發(fā)明方法的相關(guān)多肽可以作為均勻純化的化合物的 自由形式或作為重組產(chǎn)生的酶使用。此外，這些多肽還可以用作完整"主體 生物體"(經(jīng)基因修飾的微生物)的構(gòu)成成分，或與在需要時(shí)被純化并在適宜 時(shí)被破壞的主體生物體細(xì)胞聯(lián)用。
同樣，可以使用固定形式的酶(SharmaB.P.; Bailey L.F. and Messing R.A. (1982)， Immobilisierte Biomaterialiern畫Techniken und Anwendungen， Angew. Chem. 94, 836-852)。優(yōu)選通過(guò)凍干進(jìn)行固定(Paradkar， V.M.; Dordick, J.S. (1994), Aqueous-Like Activity of oc-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116， 5009-5010; Mori, T.; Okahata， Y (1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971-1974; Otamiri， M.; Adlercreutz, R; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active form in toluene, Biocatalysis 6， 291-305)。牛寺另U優(yōu)選的是在表 面活性物質(zhì)存在下的凍干，例如，Aerosol OT、聚乙烯吡咯垸酮、聚乙二醇 (PEG)或Brij 52 (二甘醇單十六烷基醚)(Kamiya， N.; Okazaki， S.-Y.; Goto, M.(1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11,375-378)，但不限于此。特別優(yōu)選的 是在Euperg^上的固定，特別是Eupergit C⑧和Eupergit 250L (R6hm) (Eupergit.RTM. C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential. Katchalski-Katzir, E.; Kraemer, D. M. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2000)， 10(1-3)， 157-176)。同樣，優(yōu)選在與補(bǔ)充有His標(biāo)簽(六組氨酸)的多肽組合的Ni-NTA上的 固定(Purification of proteins using polyhistidine' affinity tags. Bornhorst， Joshua A.; Falke， Joseph J. Methods in Enzymology (2000)， 326, 245-254)。作為CLEC的用途同樣是可想到的(St. Clair, N.; Wang, Y,F.; Margolin, A丄.(2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380-383)。這些措施也適用于產(chǎn)生在水和有機(jī)溶劑的混合物、或在完全的有機(jī)介 質(zhì)中表現(xiàn)出催化活性的多肽，由于這些多肽被有機(jī)溶劑破壞穩(wěn)定性。通過(guò)本發(fā)明方法制備對(duì)映異構(gòu)體富集的l，l，l-三氟異丙醇，包括優(yōu)選地 首先在優(yōu)選含水溶劑中溶解相應(yīng)于所需最終產(chǎn)物(l，l，l-三氟丙酮)的酮類， 任選地向該溶液中加入生物催化劑所需的所有添加劑并使其穩(wěn)定，在合適 時(shí)調(diào)節(jié)pH，將生物催化劑加到溶液中，從而進(jìn)行酮類還原，形成所需的(i )-或CS)-對(duì)映異構(gòu)體富集的l,U-三氟異丙醇。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，l，l，l-三氟丙酮直接溶解在適于生物催化劑 的細(xì)胞介質(zhì)中(表達(dá)所需酶)，加入生物催化劑和任選的酶所需的輔因子，并 在生物催化劑穩(wěn)定并且酶對(duì)于所催化的各反應(yīng)顯示高活性的溫度下進(jìn)行獲 得所需對(duì)映異構(gòu)體的催化轉(zhuǎn)化。然而，可選擇地，各成分的加入順序也可以根據(jù)需要變化。因此，更優(yōu)選的實(shí)施方案包括在加入l,U-三氟丙酮之前加入生物催化劑。"對(duì)映異構(gòu)體富集的"或"富集對(duì)映異構(gòu)體的"或"主要包括一種對(duì)映異構(gòu)體"是指在混合物的相關(guān)光學(xué)對(duì)映體中存在>50%的一種對(duì)映異構(gòu)體。l,U-三氟丙酮、OS)-U，l-三氟異丙醇和(及)-l，l,l-三氟異丙醇的結(jié)構(gòu)如下所示l,l，l-三氟丙酮0 叉 F3C CH3OS)-u，i-三氟異丙醇OH(i )-l,l,l-三氟異丙醇 QH3C CH33C CH3本文所引用的出版物被視為包含于本公開(kāi)內(nèi)容中。 實(shí)施例實(shí)施例1:將由I,l,l-三氟丙酮(IO mM底物濃度)、輔因子(IO mM輔因子濃度； NADPH或NADH，取決于所用酶的優(yōu)選輔因子)和特定醇脫氫酶的酶溶液 (通過(guò)珠磨200 mg濕的生物質(zhì)(E co//， DSM 14459)從標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞破壞制備， 包括在0.8 ml緩沖溶液中以過(guò)表達(dá)形式的醇脫氫酶)構(gòu)成的反應(yīng)溶液(2 ml) 在30'C的反應(yīng)溫度下攪拌24小時(shí)。24小時(shí)后，檢査反應(yīng)混合物是否形成 所需產(chǎn)物(5>或(/0-1，1，1-三氟異丙醇。結(jié)果示于下表。表l: 1,1,1-三氟丙酮的對(duì)映選擇性還原實(shí)驗(yàn)號(hào)酶3)反應(yīng)時(shí)間[hj轉(zhuǎn)化[%]ee [%]。)1RE-ADH2494>99(。2AP-ADH244>99 OS)3LK-ADH248090 (A)a) RE-ADH =源于紅串紅球菌的醇脫氫酶，參見(jiàn)尤其是PC17EP2005/06215; AP-ADH =源于石蠟節(jié)桿菌的醇脫氫酶，參見(jiàn)尤其是WO 2005103239: LK-ADH=源 于高加索酸奶乳桿菌的醇脫氫酶，參見(jiàn)尤其是PCT/EP2005/06215; b)在每種情況下， 括號(hào)中表示優(yōu)先形成的對(duì)映異構(gòu)體。實(shí)施例2:在lOOmM的底物濃度下，通過(guò)全細(xì)胞方法將l，l，l-三氟丙酮制備性生物催化還原以形成OS)-l,l,l-三氟異丙醇(對(duì)于全細(xì)胞催化劑和方法原理，也 參見(jiàn)PCT/EP/2005/06215):在Titrino反應(yīng)容器中制備反應(yīng)混合物(總體積 50 ml)，包括磷酸鹽緩沖液(調(diào)節(jié)至pH 6.5)、 ￡.co// DSM14459型的GS)-對(duì)映 選擇性全細(xì)胞催化劑(包括尺eo^ra/ o/z^的(5)-醇脫氫酶和^c"^ ra6"fe 的葡萄糖脫氫酶，按專利申請(qǐng)PCT/EP2005/06215制備；量1.5 g，相當(dāng)于細(xì)胞濃度 30g濕的生物質(zhì)/1)、 D-葡萄糖(量1.486 g，相當(dāng)于按所用酮類的 摩爾量計(jì)為1.5當(dāng)量)和三氟丙酮(量560.3 mg， 5 mmol，相當(dāng)于底物濃度 100 mM)。然后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌反應(yīng)時(shí)間24小時(shí)，通過(guò)加入 氫氧化鈉溶液(lMNaOH)，使pH保持在 6.5。然后，離心除去生物質(zhì)，對(duì) 得到的濾液進(jìn)行"F-NMR譜分析，測(cè)定轉(zhuǎn)化率。在這種情況下轉(zhuǎn)化率>95%。
權(quán)利要求
1. 主要包括一種對(duì)映異構(gòu)體的1，1，1-三氟異丙醇的制備方法，其通過(guò)使用醇脫氫酶使1，1，1-三氟丙酮對(duì)映選擇性地還原而制備，其特征在于，形成對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量＞90％ee的1，1，1-三氟異丙醇的所需對(duì)映異構(gòu)體。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，形成對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量>95% ee，特別是>99% ee的1,1,1-三氟異丙醇的所需的對(duì)映異構(gòu)體。
3、 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法中使用 的醇脫氫酶源于選自以下的生物體高加索酸奶乳桿菌(kc勵(lì)^/^ 膠紅類酵母菌(i /706foro7w/o: g/w /"&)、廣布肉桿菌(Car"o6(7cfe7"'Mm ^Vergera)、 野生f連球菌CSV,'eptococc^/e,-w力、浮游芽生桿菌CS/aWo6""e/' watotorzi")、鎖 我P酉孝母菌CS; on.(i/oZ o/1^ sa/mom.co/o/')、尸/c/n'a /2a_p/op/7//a、 /Vc/z/a ; a^07'&、 馬克思克魯維酵母(^/M_yve/'ow_yc& warx/朋^)、卡氏畢赤酵母(尸^/ / ca,^om7)、酉良酒酉孝母(Sacc/7arow7c&y ce廠ev^/ae)禾口紅串紅球菌(i /20fifococcM1
4、 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用細(xì)菌醇脫氫酶。
5、 如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，使用源于紅串紅球菌(A/20doCOCCl e/7^Zrap0fc)的細(xì)菌醇脫氫酶。
6、 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，使用偶聯(lián)酶體系使所述酮發(fā)生轉(zhuǎn)化。
7、 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述偶聯(lián)酶體系包括醇脫氫酶和使 所述醇脫氫酶的輔因子再生的酶。
8、 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，用于使所述酮轉(zhuǎn)化的初始底物濃度〉50g/1，優(yōu)選M00g/1，特別優(yōu)選〉150g/1。
9、 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化在-15~100 °C、優(yōu)選10 6(TC、特別優(yōu)選20 4(TC的溫度下進(jìn)行。
10、 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化在5~11 、 優(yōu)選5.5-10、特別優(yōu)選6~9的pH下進(jìn)行。
11、 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在所述方法中 使用至少一種微生物，所述微生物能夠同時(shí)表達(dá)醇脫氫酶和使輔因子再生 的酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及主要包括一種對(duì)映異構(gòu)體的1，1，1-三氟異丙醇的制備方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種通過(guò)1，1，1-三氟丙酮的對(duì)映選擇性的酶還原來(lái)制備其中特定的對(duì)映異構(gòu)體占主要地位的1，1，1-三氟異丙醇的方法。
文檔編號(hào)C12P7/02GK101305098SQ200680041700
公開(kāi)日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2006年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月11日
發(fā)明者H·格勒格爾, K·多德雷爾, O·邁 申請(qǐng)人:贏創(chuàng)德固賽有限責(zé)任公司