專利名稱：氨基酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氨基酸的制備方法。
背景技術(shù)：
作為氨基酸的制備方法，眾所周知的有采用屬于棒狀桿菌屬
(Corynebacterium)、 短桿菌屬(Brevibacterium)、 埃希氏菌 (Escherichia)屬、微桿菌屬(Microbacterium)、 沙雷氏菌屬 (Serratia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的 微生物等的發(fā)酵生產(chǎn)法(非專利文獻1)。
在上述發(fā)酵生產(chǎn)法中，開發(fā)了用于提高其生產(chǎn)效率的各種技術(shù)， 作為其中的一種，已知有通過調(diào)整培養(yǎng)基的溫度和pH、或者向培養(yǎng)液 中添加表面活性劑，使L-氨基酸在培養(yǎng)液中析出晶體，再使培養(yǎng)液中 的L-氨基酸的濃度維持在一定量以下，通過L-氨基酸的高濃度積累而 避免抑制生產(chǎn)性的方法(專利文獻1)。
而且，作為使溶解度較低的L-谷氨酸(L-Glu)在培養(yǎng)基中結(jié)晶的
方法，已知有使用將pH調(diào)整成析出L-Glu的條件的培養(yǎng)基的方法(專
利文獻2)，在培養(yǎng)液中的L-苯丙氨酸(L-Phe)的濃度在飽和溶解度以
上的條件下，在所述培養(yǎng)液中添加L-Phe的a晶體，或者通過將該培
養(yǎng)液的pH變更為7. 8-8. 3的范圍，使培養(yǎng)液中的L-Phe的a晶體析出
的方法(專利文獻3)。
但是，由于上述方法中培養(yǎng)液中包含細微的氨基酸的結(jié)晶，在基 于結(jié)晶與菌體的粒徑的差異而直接分離兩者的方法中氨基酸的產(chǎn)率
低，因此為了提高氨基酸的產(chǎn)率， 一旦溶解培養(yǎng)液中積累的氨基酸的 結(jié)晶，即進行向培養(yǎng)液中添加水等，加熱培養(yǎng)液等操作后，使用離心 式或過濾分離機等分離菌體和培養(yǎng)液后，必須進行濃縮結(jié)晶。
作為直接分離氨基酸的結(jié)晶的和菌體方法，已知有采用液體分流
器的方法(專利文獻4)，只不過氨基酸的結(jié)晶回收率在80°/ 以下。
如上所述，在氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法中， 一邊使氨基酸在培養(yǎng)基 中析出晶體， 一邊進行培養(yǎng)的方法較為優(yōu)異，但是也正在尋求效率更 高的方法
非專利文獻l:氨基酸發(fā)酵，學(xué)會出版中心，1986年 專利文獻l:特開昭62-288號公報 專利文獻2:特開2002-238593號公報 專利文獻3:特許第3239905號公報 專利文獻4:特許第2958789號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題
本發(fā)明的目的在于提供簡便且生產(chǎn)效率高的氨基酸的制備方法。
用于解決問題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以下(1)-(7)。
(1) 氨基酸的制備方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加平均粒徑 為1-120)am的氨基酸的結(jié)晶使得該氨基酸的結(jié)晶濃度為0. 5g/1以上 后，在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)這種氨基酸的能力的微生物，使之在 該培養(yǎng)基中生成并累積該氨基酸的結(jié)晶，從培養(yǎng)物中收集該氨基酸的 結(jié)晶。
(2) 氨基酸的制備方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加氨基酸的 結(jié)晶使培養(yǎng)基中的氨基酸的結(jié)晶的總表面積達到0. 02ra2/1以上后，在 該培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)這種氨基酸的能力的微生物，使之在該培養(yǎng) 基中生成并累積該氨基酸的結(jié)晶，從培養(yǎng)物中收集該氨基酸的結(jié)晶。
(3) 上述(1)或(2)的方法，添加的氨基酸的結(jié)晶為具有0. 06mVcm3 以上的比表面積的氨基酸結(jié)晶。
(4) 上述(l)-(3)中任一項的方法，生成并累積的氨基酸的結(jié)晶的 平均粒子徑在15 ium以上。
(5) 上述(l)-(4)中任一項的方法，其特征在于，由培養(yǎng)物中收 集氨基酸的方法基于它們的粒徑的差異分離生產(chǎn)氨基酸的微生物和累 積的氨基酸結(jié)晶。(6) 上述(l)-(4)中任一項的方法，其特征在于，由培養(yǎng)物中收 集氨基酸的方法基于它們的比重的差異分離生產(chǎn)氨基酸的微生物和累 積的氨基酸結(jié)晶。(7) 上述(l)-(6)中任一項的方法，其特征在于，氨基酸為L-谷 氨酰胺、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸 或L-色氨酸。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，可以提供簡便且生產(chǎn)效率高的氨基酸的制備方法。


圖l:圖1是表示添加的氨基酸的結(jié)晶的平均粒徑，比表面積和 總表面積與培養(yǎng)基中所積累的氨基酸的結(jié)晶的形狀和回收率之間的關(guān) 系的圖。而且，圖中的照片，縱方向的邊是1000 Mm。
具體實施方式
1.本發(fā)明的制備方法中可使用的微生物本發(fā)明的制備方法中可使用的微生物如果是具有生產(chǎn)氨基酸的 能力的微生物，沒有特別的限制，該微生物可以是從自然分離的微生 物，而且也可以是氨基酸的生產(chǎn)性被人為改善了的微生物。所謂氨基酸的生產(chǎn)性被人為改善了的微生物，可以例舉有通過單 獨或組合使用以下方法獲得的微生物(a) 緩和或解除至少一種控制氨基酸的生物合成的機制的方法，(b) 表達強化至少一種參與氨基酸的生物合成的酶的方法，(c) 使至少一種參與氨基酸的生物合成的酶基因的拷貝數(shù)增加的方法，(d) 弱化或阻斷由氨基酸的生物合成途徑向該氨基酸之外的代謝 產(chǎn)物的分支的代謝途徑至少一個的方法，和(e) 選擇對氨基酸的類似物的耐受性比野生型抹高的細胞林的方法等。上述(a)的具體的方法，記載于 Agric. Biol. Chem， 43,105-111(1979) 、 J.Bacteriol ， 110， 761-763 ( 1972 )和 Appl.Microbiol.Biotechnol. ， 39， 318-323 (1993)等中，上述(b)的 具體方法記載于 Agric. Biol. Chem. ， 43， 105-111 (1979)和 J.Bacteriol. ，110， 761-763 (1972)等中，上述(c)的具體方法記載 于Appl.Microbiol，Biotechnol. ， 39， 318-323 (1993)和Agric. Biol. Chem. ， 39， 371-377 (1987)等中，上述(d)的具體方法記載于 Appl. Environ. Micrbiol. ,38，181-190 (1979)和 Agric. Biol. Chem.， 42， 1773-1778 (1978)等中，上述(e)的具體方法記載于 Agric. Biol. Chem. ， 36， 1675-1684 (1972)、 Agric. Biol. Chem. ， 41，109 -116 (1977) 、 Agric. Biol. Chem. ， 37， 2013-2 02 3 (197 3)和Agric. Biol. Chem. ， 51， 2089-2094 (1987)等中。而且，對于由上述(a)-(e)中任一項或它們的組合的方法制備具 有生成、積累氨基酸的能力的微生物的制備方法，在Biotechnology 2nd ed. ， Vol. 6， Products of Primary Metabolism(VCH Verlagsgesellschaf t mbH， Weinheim， 1996) section 14a， 14b和Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, 1—35 (2003)，氨基酸發(fā)酵，學(xué)會出 版中心，相田浩等人(1986)中記載了許多例子，而且除上述之外，具 體的具有生成、積累具體的氨基酸的能力的微生物的制備方法已有特 開2003-164297， Agric.Biol.Chem. ， 39， 15 3-160 (1975) ，Agric. Biol. Chem. ， 39， 1149-1153 (1975)， 特開昭 58-13599, J.Gen.Appl. Microbiol. , 4， 272-283 (1958), 特開昭 63—94985， Agric. Biol. Chem. ， 37， 201 3-2023 (1973) ， W097/15673、特開昭56-18596、特開昭 56-144092和特表2003-511086等多篇報道，通過參照上述文獻等， 可以制備具有生產(chǎn)氨基酸的能力的微生物。
作為上述具有生產(chǎn)氨基酸的能力的微生物，如果是可以適用上述(a)-(e)的方法的微生物或具有上述遺傳特征的微生物，就可以是任意 一種微生物，優(yōu)選可以列舉原核生物，更優(yōu)選細菌。作為原核生物，埃希氏菌(Escherichia)屬，沙雷氏菌屬 (Serratia)，芽孢桿菌屬，短桿菌屬(Brevibacterium)，棒狀桿菌屬 (Corynebacterium)， 微桿菌屬(Microbacterium), 假單胞菌屬 (Pseudomonas) ， 土壤桿菌屬(Agrobacter ium), 月旨環(huán)酸桿菌屬 (Al icyclobaci 1 lus)，魚腥藍細菌屬(Anabena)，藍細菌屬(Anacyst is) 屬、節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬、固氮桿菌屬(Azotobacter)，著色菌 屬(Chromatium)， 歐文氏菌屬(Erwinia), 甲基桿菌屬 (Methylobacterium)， 席藍細菌屬(Phormidium)， 紅細菌屬 (Rhodobacter), 紅曱單月包菌屬(Rhodopseudomonas), 紅螺菌屬 (Rhodospirillum)， 柵藻屬 (Scenedesmus), 鏈霉菌屬 (Streptomyces)， 聚球藍細菌屬(Synechoccus)和發(fā)酵單胞菌屬 (Zymomonas)等的微生物。例如、可以列舉大腸桿菌、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)、 巨大芽孢桿菌(Baci 1 lus megaterium)、 淀粉 液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、 凝結(jié)芽孢桿菌 (Bacillus coagulans)、地衣芽孢桿菌(Baci 1 lus 1 icheniformis)、 短小芽孑包桿菌(Baci 1 lus pumilus)、 產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)、 未成熟短桿菌(Brevibacterium immariophilum)、 解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)、 黃色短桿菌 (Brevibacterium flavum)、 產(chǎn)乳酸短桿菌 (Brevibacterium lactofermentum)、 谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、 嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、嗜氨桿 菌(Microbacterium ammoniaphi lum)、 無花果沙雷氏菌(Serrat ia HcarU)、 居泉沙雷氏菌(Serrat ia fonticola)、 液化沙雷氏菌 (Serratia 1 iquefaciens)、 粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、 惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)、 放射形 土壤桿菌 (Agrobacterium radiobacter)、發(fā)根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)、 懸鉤子 土壤桿菌(Agrobacterium rubi)、 柱孑包魚腥藍細菌(Anabaena cylindrica)、桶形魚腥藍細菌(Anabaenadol iolum)、水華魚腥藍細 菌(Anabaena flos-aquae)、金黃節(jié)桿菌(Arthrobacter aurescens)、 檸檬節(jié)桿菌(Arthrobacter citreus)、球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globformis) ， Arthrobacter hydrocarbonglutamicus ， 邁索爾節(jié)桿 菌 (Arthrobacter mysorens)， 煙草節(jié)桿菌 (Arthrobacter nicotianae)， 石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacter paraffineus), 原玻璃螞 節(jié)桿菌(Arthrobacter protophormiae), 玫瑰色石蠟節(jié)桿菌 (Arthrobacter roseoparaffinus)， 疏碌節(jié)桿菌(Arthrobacter sulfureus)， 產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacter ureafaciens)， 巴氏著色 菌(Chromatium buderi), 微溫著色菌(Chromatium tepidum)， 酒色 著色菌 (Chromatium vinosum)， 沃氏著色菌 (Chromatium warmingii) , Chromatium fluviatile, 喧夏孢歐文氏菌(Erwinia uredo窗a),胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)，'菱蘿歐文 氏菌(Erwinia ananas)，草生歐文氏菌(Erwinia herbicola) , Erwinia punctata, Erwinia terreus, 羅得西亞曱基桿菌(Methylobacteri認 rhodesianum)， 扭脫甲基桿菌(Methy lobacter ium extorquens)， 席 藍細菌屬種(Phormidium sp. )ATCC 29409，莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus)， 類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)， 生芽紅假 單月包菌(Rhodopseudomonas blastica)， 海紅菌(Rhodopseudomonas marina),血色紅假單孢菌(Rhodopseudomonas palustris)， 深紅紅 螺菌(Rhodospirillum rubrum), 需鹽紅螺菌(Rhodospiri 1 lum salexigens)，鹽場紅螺菌(Rhodospiri 1 lum salinarium),產(chǎn)二素鏈 霉菌(Streptomyces ambofaciens),金霉素鏈霉菌(Streptomyces aureofaciens),金色鏈霉菌(Streptomyces aureus), 殺真菌素鏈霉 菌(Streptomyces fungicidicus)， 灰產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)，灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus), 淺青紫 鏈霉菌(Streptomyces lividans), 橄欖灰鏈霉菌(Streptomyces olivogriseus)， 枝鏈霉菌(Streptomyces rameus)， 田無鏈霉菌 (Streptomyces tanashiensis)，酒紅鏈霉菌(Streptomyces vinaceus) 和運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)等，作為優(yōu)選原核生物，可以 列舉屬于埃希氏桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒桿 菌屬、假單胞菌屬或鏈霉菌屬等的細菌、例如，屬于上述埃希氏桿菌 屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒桿菌屬、假單胞菌屬或 鏈霉菌屬等的種，作為更優(yōu)選的細菌，可以列舉大腸桿菌、谷氨酸棒 桿菌、產(chǎn)氨棒桿菌、產(chǎn)乳酸棒桿菌、黃色棒桿菌、棒桿菌.工7 4力 '〉只、黃色短桿菌、產(chǎn)乳酸短桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、 粘質(zhì)沙雷氏菌、惡臭假單胞菌、Pseudomonas aerugi謂a、鏈霉菌-七卩力，一或淺青紫鏈霉菌，特別優(yōu)選大腸桿菌，谷氨酸棒桿菌，產(chǎn) 氨棒桿菌，更具體的可以例舉有具有生產(chǎn)L-谷氨酰胺能力的FERM P4806, ATCC14751和ATCC14752等，具有生產(chǎn)L-纈氨酸能力的 ATCC1 3005和ATCC19561等，具有生產(chǎn)L-亮氨酸能力的FERMBP-4704 和ATCC21 302等，具有生產(chǎn)L-異亮氨酸能力的FERM BP-3757和 ATCC14310等，具有生產(chǎn)L-苯丙氨酸能力的ATCC1 3281和ATCC21669 等，具有生產(chǎn)L-酪氨酸能力的ATCC21652等，和具有生產(chǎn)L-色氨酸能 力的DSM10118、 DSM10121、 DSM10123和FERM BP-1777等。而且，上述由FERM編號表示的菌抹可以從獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技 術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本)獲得，由ATCC編號表示的菌林 可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(美國)獲得，由DSM編號表示的菌林 可 以 從 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(德國)獲得。2.本發(fā)明的氨基酸的制備方法作為本發(fā)明的氨基酸的制備方法，可以例舉有(1)特征在于在 培養(yǎng)基中添加平均粒徑為1-120um的氨基酸的結(jié)晶使得該氨基酸的 結(jié)晶濃度為0. 5g/l以上后，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)上迷1的該氨基 酸的能力的微生物，使該培養(yǎng)基中生成并累積該氨基酸的結(jié)晶，從培 養(yǎng)物中收集該氨基酸的結(jié)晶的氨基酸的制備方法；和(2)特征在于在培養(yǎng)基中添加氨基酸結(jié)晶使培養(yǎng)基中的氨基酸結(jié)晶的總表面積達到0. 02m7l以上后，在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)上述1的該氨基酸的能 力的微生物，使該培養(yǎng)基中生成并累積該氨基酸的結(jié)晶，從培養(yǎng)物中 收集該氨基酸的結(jié)晶的氨基酸的制備方法。在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物的方法除了添加氨基酸的結(jié)晶之 外，可以按照微生物的培養(yǎng)中可以使用的常規(guī)的方法進行。也就是說，如果是含有該微生物能夠同化的碳源、氮源、無機鹽 類等，能夠有效進行該微生物的培養(yǎng)的培養(yǎng)基，優(yōu)選液體培養(yǎng)基，可 以使用天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基的任意一種。作為碳源，可以是該微生物能夠同化的碳源，可以使用葡萄糖、 果糖、蔗糖、含有這些物質(zhì)的糖蜜、淀粉或淀粉水解產(chǎn)物等碳水化合 物；醋酸、丙酸等有機酸；乙醇、正丙醇等醇類等。作為氮源，可以使用氨、氯化銨、疏酸銨、醋酸銨、磷酸銨等無 機酸或有機酸的銨鹽、其它含氮化合物、以及蛋白胨、肉提取物、酵 母提取物、玉米漿、酪蛋白水解產(chǎn)物、豆餅和豆餅水解產(chǎn)物、各種發(fā) 酵菌體和其消化物等。作為無機鹽，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸 鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅和碳酸鈣等。上述(1)的制備方法中添加的氨基酸的結(jié)晶的平均粒徑為1-120 ym，如果是使結(jié)晶在培養(yǎng)基的濃度為0. 5g/1以上的氨基酸的結(jié)晶， 對所添加的氨基酸的結(jié)晶的平均粒徑，量，氨基酸的種類和結(jié)晶形的 種類等的不作限制，但是作為添加的氨基酸的結(jié)晶的平均粒徑，可以 列舉l-120jum，優(yōu)選2-110 jam,更優(yōu)選5-70iam，更優(yōu)選7-50iam， 特別優(yōu)選10-35 jam,最優(yōu)選11-13ym。作為氨基酸的結(jié)晶量，可以列舉添加后的培養(yǎng)基中的氨基酸的結(jié) 晶濃度達到0. 5g/1以上，優(yōu)選達到2-30g/l，更優(yōu)選達到3-"g/1， 更優(yōu)選達到4-22g/l，特別優(yōu)選5-20g/l，最優(yōu)選達到5.5-16. 5g/l 的量。而且，作為上述添加的氨基酸的結(jié)晶的平均粒徑與添加量的組 合，如果可以是使平均粒徑為1-U0jjm且結(jié)晶在培養(yǎng)基中的濃度為 0.5g/l以上的組合，則沒有特別的限制，可以列舉使平均粒徑為1-120 jam且結(jié)晶濃度為0. 5g/l，優(yōu)選平均粒徑為2-llOjam且結(jié)晶濃度為 2-30g/1，更優(yōu)選平均粒徑為5-70nm且結(jié)晶濃度為3-25g/l,更優(yōu)選 平均粒徑為7-50 jam且結(jié)晶濃度為4-22g/l，特別優(yōu)選平均粒徑為 10-35 nm且結(jié)晶濃度為5-20g/l，最優(yōu)選平均粒徑為11-13ym且結(jié)晶 濃度為5. 5-16.5g/1的組合。在培養(yǎng)基中添加氨基酸的結(jié)晶的時期可以在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有 生產(chǎn)氨基酸的能力的微生物前，或者在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)氨基酸 的能力的微生物后的培養(yǎng)期間中的任意時期，優(yōu)選在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具 有生產(chǎn)氨基酸的能力的微生物后，從培養(yǎng)基中的氨基酸濃度達到飽和 溶解度前后開始，到在培養(yǎng)基中析出氨基酸的結(jié)晶前；更優(yōu)選在培養(yǎng) 基中的氨基酸濃度達到飽和溶解度后，到在培養(yǎng)基中析出氨基酸的結(jié) 晶前；更優(yōu)選培養(yǎng)基中的氨基酸濃度為過飽和的時候，在培養(yǎng)基中析 出氨基酸的結(jié)晶前。不過，上述所謂培養(yǎng)基中析出氨基酸的結(jié)晶前， 優(yōu)選是完全沒有觀察到氨基酸的結(jié)晶的時期，在結(jié)晶回收率方面等， 如果在能實現(xiàn)本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)，也可以觀察到微量的氨基酸的 結(jié)晶的析出。培養(yǎng)基中的氨基酸的濃度為過飽和時添加氨基酸的結(jié)晶時的氨 基酸的結(jié)晶量，作為相對于添加時的培養(yǎng)基量的量，可以列舉O. sg/i 以上，優(yōu)選達到2-30g/1，更優(yōu)選達到3-25g/l，更優(yōu)選達到4-22g/l， 特別優(yōu)選5-20g/l,最優(yōu)選達到5. 5-16. 5g/l。培養(yǎng)基中的氨基酸的濃度為過飽和時添加氨基酸的結(jié)晶時，作為 添加的氨基酸的結(jié)晶的平均粒徑和量的組合，可以列舉平均粒徑為 1-120 iam的結(jié)晶且添加0. 5g/l以上的相對于添加時的培養(yǎng)基量的量， 優(yōu)選平均粒徑為2-110um且添加2-30g/l的相對于添加時的培養(yǎng)基量 的量，更優(yōu)選平均粒徑為5-70jum且添加3-25g/l的相對于添加時的 培養(yǎng)基量的量，更優(yōu)選平均粒徑為7-50lam且添加4-22g/l的相對于 添加時的培養(yǎng)基量的量，特別優(yōu)選平均粒徑為10-35nm且添加 5-20g/l的相對于添加時的培養(yǎng)基量的量，最優(yōu)選平均粒徑為11-13 U m且添加5. 5-16， 5g/l的相對于添加時的培養(yǎng)基量的量的組合。而且，上述(2)的制備方法中添加的氨基酸的結(jié)晶如果是培養(yǎng)基 中的氨基酸的結(jié)晶的總表面積達到0. 02m2/l以上的氨基酸結(jié)晶，則對 所添加的氨基酸的結(jié)晶的平均粒徑、量、氨基酸的種類和結(jié)晶形的種 類等不作限制，但是作為添加的氨基酸的結(jié)晶，可以列舉添加后的培 養(yǎng)基中的氨基酸的結(jié)晶的總表面積達到0.02m2/l以上，優(yōu)選 0. 08-70m2/1，更優(yōu)選0. 2-23ra2/1,更優(yōu)選0. 4-15m2/1，特別優(yōu)選 0. 7-9. 3mV"最優(yōu)選2. 0-7. Om2/1的氨基酸的結(jié)晶。作為上述(2)的制備方法中添加的具體的氨基酸的結(jié)晶，可以列 舉使平均粒徑為1-120 um且結(jié)晶濃度為0. 5g/1以上，優(yōu)選平均粒徑 為2-110jam且結(jié)晶濃度為2-30g/l，更優(yōu)選平均粒徑為5-70Mm且結(jié) 晶濃度為3-25g/l，更優(yōu)選平均粒徑為7-50um且結(jié)晶濃度為4-22g/1， 特別優(yōu)選平均粒徑為10-35 iam且結(jié)晶濃度為5-20g/1，最優(yōu)選平均粒 徑為11-13um且結(jié)晶濃度為5. 5-16. 5g/1的氨基酸的結(jié)晶。在培養(yǎng)基中添加氨基酸的結(jié)晶時期與上述(l)的制備方法相同。作為培養(yǎng)基中的氨基酸的濃度為過飽和時，添加氨基酸的結(jié)晶時 的氨基酸的結(jié)晶，可以列舉根據(jù)添加時的培養(yǎng)基量計算的時候的總表 面積為0. 02mVl以上，優(yōu)選0. 08-70m2/1，更優(yōu)選0. 2-23m2/1 ，更優(yōu) 選0. 4-15m2/1，特別優(yōu)選0. 7-9. 3m2/1，最優(yōu)選2. 0-7. 0m2/1的氨基酸 的結(jié)晶。作為具體的氨基酸的結(jié)晶，可以列舉使平均粒徑為l-UO)am且 相對于添加時的培養(yǎng)基量的量為0. 5g/1以上的結(jié)晶，優(yōu)選平均粒徑為 2-llGMm且相對于添加時的培養(yǎng)基量的量為2-30g/l的結(jié)晶，更優(yōu)選 平均粒徑為5-70"m且相對于添加時的培養(yǎng)基量的量為3-25g/1的結(jié) 晶，更優(yōu)選平均粒徑為7-50pm且相對于添加時的培養(yǎng)基量的量為 4-22g/1的結(jié)晶，特別優(yōu)選平均粒徑為10-35 jam且相對于添加時的培 養(yǎng)基量的量為5-20g/l的結(jié)晶，最優(yōu)選平均粒徑為11-13 Min且相對于 添加時的培養(yǎng)基量的量為5. 5-16. 5g/l的結(jié)晶。
在上述內(nèi)容中，作為測定培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基量的方法，可以是公 知的任意一種方法，可以列舉，例如通過離心分離培養(yǎng)物，分離培養(yǎng) 基與菌體等不溶物質(zhì)，測定沉淀的不溶物質(zhì)的體積，從培養(yǎng)物量中減 去其體積的方法等。進而，在上述(1)和(2)的制備方法中，添加的氨基酸的結(jié)晶，可 以列舉平均比表面積為0. 06m7cm3以上的氨基酸的結(jié)晶，優(yōu)選 0. 07-7. 2mVcm3,更優(yōu)選0. 07-1. 43m2/cm3，更優(yōu)選0, 1-1. 0mVcm3,特 別優(yōu)選0. 14-0. 72mVcm3的氨基酸的結(jié)晶。作為在上述(1)和(2)的制備方法中添加的氨基酸，如果是微生物 可生產(chǎn)的氨基酸，可以是任意一種氨基酸，優(yōu)選可以列舉選自于L-谷 氨酰胺、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸 和L-色氨酸的氨基酸，更優(yōu)選選自于L-谷氨酰胺、L-纈氨酸和L-色 氨酸的氨基酸，更優(yōu)選L-谷氨酰胺。不過，可以從本發(fā)明的制備方法 中添加的氨基酸的結(jié)晶中除去L-苯丙氨酸的oc晶體。本發(fā)明中可以使用的用于培養(yǎng)基添加的氨基酸的結(jié)晶可以照原 樣使用市售品或用公知的方法例如發(fā)酵生產(chǎn)法和純化法獲得的氨基酸 的結(jié)晶等，或者可以通過用市售的粉碎機，例如M4型自由粉碎機(奈 良機械制作所制)、Atomizer-TAP-20型(東京Atomizer制造社制)、 Air Classifying Mi 11 (H0S0KAWA MICRON POWDER SYSTEMS 乂>司制) 等，將市售的氨基酸的結(jié)晶或由上述的公知方法獲得的氨基酸的結(jié)晶 制備成具有目的平均粒徑的氨基酸的結(jié)晶來獲得。例如，通過使用M4型自由粉碎機，在篩cj) 1. Omm,轉(zhuǎn)數(shù)4500rpm， 處理速度約400kG/h的條件下粉碎由公知的發(fā)酵生產(chǎn)法和純化法獲得 的平均粒徑為約llOum的氨基酸的結(jié)晶，可以獲得平均粒徑在約45 ILim的氨基酸的結(jié)晶，再通過在篩(J) 0. 3mm,轉(zhuǎn)數(shù)6000rpm,處理速度 約200kG/h的條件下粉碎該氨基酸的結(jié)晶，可以獲得平均粒徑為約11 jam的氨基酸的結(jié)晶。氨基酸的結(jié)晶的比表面積，可以使用市售的測定儀進行測定，例 如Seishin企業(yè)抹式會社制SK LASER MICRON SIZER LMS-24 (LASER 衍射'散射式粒度分布測定裝置)測定，不過優(yōu)選在測定氨基酸的結(jié)晶 的比表面積時，假定該結(jié)晶為球狀且是相似系進行計算。可以根據(jù)氨基酸的結(jié)晶的比表面積和添加的量計算氨基酸的結(jié) 晶的總表面積。培養(yǎng)在通常的振蕩培養(yǎng)或深部通氣攪拌培養(yǎng)等好氧條件下進行。培養(yǎng)溫度可以是15-40°C，培養(yǎng)時間通常為5小時-7天。在培養(yǎng)過程 中，將pH維持在3. 0~9.0。使用無機酸或有機酸、堿溶液、尿素、 碳酸鈣、氨等進行pH調(diào)節(jié)。而且，培養(yǎng)中可以根據(jù)需要，在培養(yǎng)基中添加氨爺青霉素和四環(huán) 素等抗生素。當(dāng)培養(yǎng)被采用誘導(dǎo)性啟動子作為啟動子的表達栽體轉(zhuǎn)化的微生 物時，根據(jù)需要，還可以向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物。例如，在培養(yǎng)被釆 用lac啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化的微生物時，可以向培養(yǎng)基中加入異丙 D-硫代半乳糖苷等；在培養(yǎng)經(jīng)采用trp啟動子的表達栽體轉(zhuǎn)化 的微生物時，可以向培養(yǎng)基中加入吲哚丙烯酸等。作為上述方法中培養(yǎng)基中所累積的氨基酸，如果是微生物可生產(chǎn) 的氨基酸，可以是任意一種氨基酸，優(yōu)選可以列舉選自于L-谷氨酰胺、 L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨 酸的氨基酸，更優(yōu)選選自于L-谷氨酰胺、L-纈氨酸和L-色氨酸的氨基 酸，更優(yōu)選L-谷氨酰胺。而且，作為上述方法中培養(yǎng)基中所累積的氨基酸的結(jié)晶，可以列 舉平均粒徑在15 jum以上，優(yōu)選20ym以上，更優(yōu)選^Mm以上，更 優(yōu)選40pm以上，特別優(yōu)選50|am以上，最優(yōu)選60 u m以上的結(jié)晶。在本發(fā)明的制備方法中，作為收集培養(yǎng)物中的氨基酸的結(jié)晶的方 法，如果是常規(guī)的氨基酸的純化方法，可以是任意一種方法，優(yōu)選可 以列舉通過利用培養(yǎng)結(jié)束后的菌體和結(jié)晶的粒徑以及比重差異，直接 分離純化培養(yǎng)終止后的培養(yǎng)物中的菌體和氨基酸的結(jié)晶來進行分離純 化氨基酸的結(jié)晶的方法。作為上述利用粒徑和比重差異分離純化氨基酸的結(jié)晶的方法，可
以列舉以往公知的方法-重力分級分離法，離心分級分離法，更優(yōu)選離 心分級分離法，該離心分級分離法中更優(yōu)選沉降式離心分離法。通過上述收集方法，可以以高回收率獲得充分純化的氨基酸的結(jié) 晶，但是根據(jù)需要，可以再通過使用活性碳或離子交換樹脂等的常規(guī) 的方法或通過有機溶劑的提取、結(jié)晶、薄層色i脊、高效液相色i脊法等 進行純化。以下，記載了實施例，但是本發(fā)明不受這些實施例的限制。 實施例1L-谷氨酰胺的結(jié)晶的制備(1)在裝入了生產(chǎn)培養(yǎng)基[250g/1葡萄糖，30g/L NH4C1、 1. Og/L K2HP04、 l.Og/L KH2P04、 0. 5g/L MgS04 7H20、 20mg/L FeS04、 2mg/L MnS04'4H20、 10jjg/L生物素、lmg/L石克胺素鹽酸鹽、pH6.8]的體積為 500L的發(fā)酵罐中， 一邊調(diào)節(jié)適宜的pH、培養(yǎng)溫度， 一邊進行培養(yǎng)(谷 氨酸纟奉桿菌ATCC14752。培養(yǎng)開始后，培養(yǎng)基中的L-谷氨酰胺的濃度 達到其飽和溶解度后，L-谷氨酰胺的結(jié)晶在培養(yǎng)基中析出前，在培養(yǎng) 基中添加平均粒徑40um的L-谷氨酰胺的結(jié)晶，使得結(jié)晶濃度達到 16. 5g/l。然后，繼續(xù)培養(yǎng)， 一邊使L-谷氨酰胺的結(jié)晶在培養(yǎng)基中成 長， 一邊進行培養(yǎng)。培養(yǎng)開始約96小時時終止培養(yǎng)，獲得了 noL含 有90g/L的L-谷氨酰胺的培養(yǎng)物。使用巴工業(yè)(抹)制沉降器(PTM006 型)，從該培養(yǎng)物中分離獲得6.2kg的L-谷氨酰胺。該結(jié)晶的平均粒 徑為62ym。此時，培養(yǎng)基中析出的結(jié)晶通過沉降器的回收率為98.9%。實施例2L-谷氨酰胺的結(jié)晶的制備(2)作為培養(yǎng)中添加的結(jié)晶，除了使用平均粒徑為圖l所示的粒徑的 L-谷氨酰胺的結(jié)晶之外，用與實施例1同樣的方法進行培養(yǎng)，獲得了 L-谷氨酰胺的結(jié)晶。而且，使用SeisMn企業(yè)林式會社制SK LASER MICRON SIZER LMS-24 (LASER衍射.散射式粒度分布測定裝置)測定L- 谷氨酰胺的結(jié)晶的比表面積。但是優(yōu)選在測定氨基酸的結(jié)晶的比表面 積時，假定該結(jié)晶為球狀且是相似系進行計算。添加的L-谷氨酰胺的結(jié)晶和通過發(fā)酵生產(chǎn)獲得的L-谷氨酰胺的 結(jié)晶的形狀、L-谷氨酰胺的結(jié)晶的回收率，千燥物含量等示于圖1。如圖l所示，可知在培養(yǎng)基中不添加結(jié)晶的情況下，由于培養(yǎng)基 中析出細微的結(jié)晶，通過離心分離的結(jié)晶回收率降低，而且添加的氨 基酸的粒徑小者，結(jié)晶回收率有上升的傾向。而且，添加結(jié)晶時，培 養(yǎng)終止時獲得的培養(yǎng)基中的氨基酸的結(jié)晶的平均粒徑全部都為30 ym 以上。而且，還可知通過籃型離心分離機使以沉降器分離的結(jié)晶脫液， 通過干燥獲得的結(jié)晶的含量(干燥物含量)由于添加總表面積大的結(jié)晶 而提高。根據(jù)上述內(nèi)容，通過本發(fā)明的制備方法，不僅L-谷氨酰胺、在 各種氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，通過在培養(yǎng)基中添加氨基酸的結(jié)晶使培養(yǎng) 基中的氨基酸的過飽和度保持到 一定以下，并且使作為晶種的適當(dāng)數(shù) 量的氨基酸的結(jié)晶存在于培養(yǎng)基中，即通過調(diào)整在培養(yǎng)基中添加的氨 基酸的結(jié)晶的平均粒徑和量或者該結(jié)晶的總表面積，可以控制培養(yǎng)中 培養(yǎng)基中析出的氨基酸的結(jié)晶的粒徑，其結(jié)果表明與菌體容易分離， 并且可以獲得回收率高的氨基酸的結(jié)晶。工業(yè)實用性通過本發(fā)明可以簡便且有效地制備氨基酸。
權(quán)利要求
1、氨基酸的制備方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加平均粒徑為1-120μm的氨基酸的結(jié)晶使得該氨基酸的結(jié)晶濃度為0.5g/l以上后，在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)這種氨基酸的能力的微生物，使之在該培養(yǎng)基中生成并累積該氨基酸的結(jié)晶，從培養(yǎng)物中收集該氨基酸的結(jié)晶。
2、 氨基酸的制備方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加氨基酸的結(jié) 晶使培養(yǎng)基中的氨基酸的結(jié)晶的總表面積達到0. 02m7l后，在該培養(yǎng) 基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)這種氨基酸的能力的微生物，使之在該培養(yǎng)基中生成并累積該氨基酸的結(jié)晶，從培養(yǎng)物中收集該氨基酸的結(jié)晶。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2記載的方法，添加的氨基酸結(jié)晶為具有 0. 06mVcii^以上的比表面積的氨基酸結(jié)晶。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項記載的方法，生成并累積的氨基酸 的結(jié)晶的平均粒子徑在15 jam以上。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項記栽的方法，其特征在于，由培養(yǎng) 物中收集氨基酸的方法基于它們的粒徑的差異而分離生產(chǎn)氨基酸的微 生物和累積的氨基酸結(jié)晶。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l-4中任一項記載的方法，其特征在于，由培養(yǎng) 物中收集氨基酸的方法基于它們的比重差異而分離生產(chǎn)氨基酸的微生 物和累積的氨基酸結(jié)晶。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項記載的方法，其特征在于，氨基酸 為L-谷氨酰胺、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸或L-色氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了氨基酸的制備方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加平均粒徑為1-120μm的氨基酸的結(jié)晶使得該氨基酸的結(jié)晶濃度為0.5g/l以上后，在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)這種氨基酸的能力的微生物，使之在該培養(yǎng)基中生成并累積該氨基酸的結(jié)晶，從培養(yǎng)物中收集該氨基酸的結(jié)晶，本發(fā)明還提供了下述氨基酸的制備方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加氨基酸結(jié)晶使培養(yǎng)基中的氨基酸結(jié)晶的總表面積達到0.02m²/l后，在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)這種氨基酸的能力的微生物，使該培養(yǎng)基中生成并累積該氨基酸的結(jié)晶，從培養(yǎng)物中收集該氨基酸的結(jié)晶。
文檔編號C12P13/04GK101155927SQ20068001154
公開日2008年4月2日 申請日期2006年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月12日
發(fā)明者下瀨強, 大橋亮, 藤永克己 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社