專利名稱：生產(chǎn)靈菌紅素的海洋細菌菌株及其生產(chǎn)靈菌紅素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從海洋細菌篩選出來的可生產(chǎn)靈菌紅素的海洋細菌菌株及用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素的方法。
背景技術(shù)：
靈菌紅素(Prodigiosin)，結(jié)構(gòu)獨特，具有吡咯吡咯亞甲基骨架，以前主要來自臨床病原微生物沙雷氏菌(Sarratia marcesens)。靈菌紅素類化合物是具有吡咯吡咯亞甲基結(jié)構(gòu)特征的化合物的總稱，在整個分子中可以是2個，3個或者4個吡咯環(huán)，吡咯環(huán)可以接有烷基長鏈或者其它官能團。靈菌紅素有多種顯著的藥理活性1)抗腫瘤活性；2)抗微生物活性；3)抗瘧疾；4)促進細胞凋亡；5)有強的免疫抑制活性，其免疫作用機理與它獨特的吡咯吡咯亞甲基骨架結(jié)構(gòu)有關(guān)。由于靈菌紅素的細胞毒性，在目前它作為免疫抑制藥物的指數(shù)仍然受到限制，但以靈菌紅素類化合物作為基本架構(gòu)，尋找免疫抑制活性強、毒副作用低的衍生物，有較好的前景，備受國際關(guān)注。由于目前靈菌紅素通常是以沙雷氏菌為生產(chǎn)菌株，通過發(fā)酵制備并提純其代謝產(chǎn)物而獲得，由于其制備過程的原因，難以大量生產(chǎn)，對進一步研究產(chǎn)生影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從海洋細菌篩選出來的可生產(chǎn)靈菌紅素的海洋細菌菌株及用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素的方法，以便開辟一種靈菌紅素制取新途徑，使之具有菌株無毒，環(huán)境友好，遺傳穩(wěn)定，繁殖快，可大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，易形成產(chǎn)業(yè)化等特點。
本發(fā)明提供的可生產(chǎn)靈菌紅素的海洋細菌菌株是從大亞灣海水中篩選得到的新菌株，該菌株為海水中土生土長異養(yǎng)細菌，經(jīng)16 rRNA分析，屬于假單胞菌(Pseudomonas sp.)，其分類命名為Pseudomonas sp.105001，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNOM 205164。
該菌株產(chǎn)紅色代謝產(chǎn)物，生長快，代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高，無急性毒性。
該菌株的生理生化特性是細胞產(chǎn)紫紅色素，桿狀，革蘭氏陰性，無鞭毛運動，無芽孢，GUL葡萄糖(O/F)-，XYL木糖發(fā)酵(O/F)+W，RHA鼠李糖(O/F)-，MAL麥芽糖(O/F)-，RAF棉子糖(O/F)-，LAC乳糖(O/F)-，SOR山梨醇(O/F)-，ADO側(cè)金盞花醇(O/F)-，蛋白胨水(靛基質(zhì))+，DUL衛(wèi)矛醇(O/F)-，MAN甘露醇(O/F)-，INO肌醇(O/F)-，SAC蔗糖-，ARA阿拉伯糖+，ESC七葉樹苷利用-，OX氧化酶-，CAT接觸酶-，AMY淀粉酶-，NO3還原+，產(chǎn)H2S-，IND+，VP-，ADH精氨酸雙水解酶-，LDC賴氨酸脫羧酶-，URE尿素分解-，水楊苷發(fā)酵-，
％鹽度生長試驗0％-，3％+，6％+，8％+，10％+。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)靈菌紅素的方法，是用Pseudomonas sp.105001 CCTCC M 205164為生產(chǎn)菌株，經(jīng)母種制備，發(fā)酵培養(yǎng)，提取紅色代謝產(chǎn)物和純化代謝產(chǎn)物的過程，具體制備步驟是(1)用2216E液體培養(yǎng)基生產(chǎn)發(fā)酵母種，所述的2216E液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨5g，酵母膏1g，檸檬酸鐵0.1g，陳海水1000ml，pH7.6，所述的陳海水是指將海區(qū)帶回的自然海水陳放三個月以上的海水；(2)用制備的生產(chǎn)發(fā)酵母種在發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)條件是，通氣培養(yǎng)，生長溫度25-30℃，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方及制備如下有機成分A魚粉10g水解，取上清液；無機成分B粗鹽32g，KCl 0.644g，NaHCO30.192g，KBr 0.096g，H3BO30.026g，SrCl20.024g，NaF 0.003g，將A、B成分溶于去離子水至總量1000mL，PH 7.6；(3)將發(fā)酵液離心，收集沉淀物，洗滌后，用乙醇溶解沉淀物，然后提取其中的紅色代謝產(chǎn)物；(4)將乙醇提取物經(jīng)硅膠柱層析，用乙酸乙酯、石油醚淋洗所得的組分，再經(jīng)SephdexLH-20柱以及制備板層析純化即得紅色代謝物——本發(fā)明產(chǎn)品靈菌紅素類化合物。
對上述方法所制得的產(chǎn)品(樣品)的組分和結(jié)構(gòu)的測定結(jié)果樣品根據(jù)一維、二維核磁1HNMR，13CNMR，1H-1HCOSY，HMBC，HMQC，EIMS，UV推出化合物組分和結(jié)構(gòu)如下結(jié)構(gòu) 靈菌紅素R1＝R2＝H；二甲基靈菌紅素R1＝R2＝Me分子式為C20H25N3O產(chǎn)物數(shù)據(jù)紅色無定型固體UV λmax(McOH)534(ε4.4×106)，496(ε3.3×106)；IRvmax(KBr)cm-12950，1630，1600，1250，950EIMS(m/z％)323(M+，75)，308(M-CH3，15)，266(100)，251(12)；1HNMR(CDCl3，TMSδppm)7.17(1H，b，H-2)，6.29(1H，dt，J＝4.0，2.0Hz，H-3)，6.85(1H，b，H-4)，6.02(1H，s，H-7)，6.89(1H，s，H-10)，6.62(1H，s，H-12)，3.94(3H，s，21-OCH3)，2.47(3H，s，15-CH3)，2.33(2H，t，J＝12.0Hz，Ch2-16)，1.28(6H，b，Ch2-17-19)，0.88(3H，t，J＝7.0Hz，20-CH3).13CNMR(CDCl3，δppm)125.96(d，C-2)，110.72(d，C-3)，116.01(d，C-4)，121.23(s，C-5)，146.69(s，C-6)，91.62(d，C-7)，164.75(s，C-8)，119.68(s，C-9)，115.02(d，C-10)，124.14(s，C-11)，127.50(d，C-12)，127.42(s，C-13)，146.02(s，C-14)，11.45(q，C-15)，24.31(t，C-16)，28.79(t，C-17)，30.91(t，C-18)，21.49(t，C-19)，13.03(q，C-20)，57.70(q，C-21)，1H-1HCOSY(CDCl3)H-2/H-3，H-3/H-4，H2-16/H2-17，H2-19/H3-20；HMBC(CDCl3)H-2/C-3，C-4，C-5；H-3/C-2，C-5；H-4/C-2，C-5；H-7/C-5，C-6，C-8，C-9；H10/C8，C-12；H-12/C-11，C-13，C-14；15-CH3/C-14，C-12；16-CH2/C-13，C-14；21-CH3/C-8；B-NH/C-7，C-8，C-9.HREIMS m/z 323.1968(M+，calcd for C20H25N3O，323.1971)。
經(jīng)過有關(guān)分子量和結(jié)構(gòu)分析，可證明由海洋細菌Pseudomonas sp.105001 CCTCC M205164發(fā)酵提取的紅色代謝物為靈菌紅素類化合物。
本發(fā)明提供了一種由海洋細菌Pseudomonas sp.105001 CCTCC M 205164生產(chǎn)靈菌紅素的安全和大量的生產(chǎn)手段，在此基礎(chǔ)上，可對其衍生物進行深入的藥理藥效進行研究，找新的免疫抑制活性強，毒副作用低的靈菌紅素，雖然由于靈菌紅素的毒副作用目前在臨床上未能廣泛應用，但可通過制備衍生物深入進行藥理、藥效的研究，發(fā)現(xiàn)新的、高效的、低毒的免疫抑制物，或是作用互補、沒有毒性疊加的聯(lián)合抑制劑，開發(fā)成為具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型器官移植免疫用藥。靈菌紅素類化合物具有與目前臨床使用的免疫抑制劑有不同的作用機理，在用藥方式上將更具靈活性，應用范圍也更加廣泛。本發(fā)明應用海洋微生物進行靈菌紅素生產(chǎn)，開辟海洋微生物資源研究和開發(fā)新途徑。該菌株遺傳穩(wěn)定，繁殖快，可進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，資源保障，環(huán)境友好，對靈菌紅素類化合物的進一步研究和開發(fā)，具有廣闊的前景和意義。
具體實施例方式
以下對利用Pseudomonas sp.105001 CCTCC M 205164為生產(chǎn)菌株生產(chǎn)靈菌紅素的方法作進一步的詳細說明。
用Pseudomonas sp.105001 CCTCC M 205164為生產(chǎn)菌株生產(chǎn)靈菌紅素的具體步驟如下(1)母種制備用2216E液體培養(yǎng)基生產(chǎn)發(fā)酵母種，所述的2216E液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨5g，酵母膏1g，檸檬酸鐵0.1g，陳海水1000ml，pH7.6；(2)將母種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)發(fā)酵生產(chǎn)條件是，通氣培養(yǎng)，生長溫度25-30℃，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方及制備如下有機成分A在10g魚粉中加入水解酶0.1g，于60℃水解4小時，取上清液；無機成分B粗鹽32g，KCl 0.644g，NaHCO30.192g，KBr 0.096g，H3BO30.026g，SrCl20.024g，NaF 0.003g，將A、B成分溶于去離子水至總量1000mL，PH 7.6，發(fā)酵過程分四個階段，逐步擴大培養(yǎng)。首先將母種菌株經(jīng)過復壯后接種多支斜面(根據(jù)需要而定)(稱一級培養(yǎng)，18-24小時)，然后接種到裝在三角瓶中的液體培養(yǎng)基(250mL)進行搖床培養(yǎng)(稱二級培養(yǎng)，約18-24小時)，再將三角瓶發(fā)酵液作為母液加到裝有2L液體培養(yǎng)基中，進行通氣發(fā)酵培養(yǎng)(稱三級培養(yǎng)，一般24小時)，最后將三級培養(yǎng)發(fā)酵液作為母液加到裝有20L液體培養(yǎng)液大罐中通氣發(fā)酵培養(yǎng)(稱為生產(chǎn)性發(fā)酵培養(yǎng)，兩天左右)，將培養(yǎng)發(fā)酵液收集，進行產(chǎn)物提取。每級母液和液體培養(yǎng)基之間比例為1/10。
(3)提取紅色代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物提取分兩步第一步為發(fā)酵產(chǎn)物的收集，第二步為代謝物的提取。
第一步將發(fā)酵液離心(5000r/min)20min沉淀，棄去上清液；再用無菌水對沉淀物進行洗滌，離心，棄去上清液，反復多次，得菌體細胞及沉淀代謝物。
第二步提取根據(jù)紅色代謝物溶于乙醇、酯類，不溶液于水物性，用乙醇作為溶劑提取代謝物。其過程包括在收集產(chǎn)物中加入95％乙醇，使紅色代謝物溶于乙醇中；對乙醇溶液進行過濾，使菌體和基質(zhì)殘渣分離(多次加入乙醇進行溶解和過濾)，收集溶有代謝產(chǎn)物的乙醇溶液；對乙醇溶解液進行蒸餾，回收乙醇，對余下物質(zhì)進行干燥，獲紅色膏狀物。
(4)純化代謝產(chǎn)物將上述乙醇提取物經(jīng)硅膠柱層析，用20％乙酸乙酯、石油醚淋洗所得的組分，再經(jīng)Sephdex LH-20柱(淋洗劑按V/V計氯仿∶甲醇＝1∶1)以及制備板層析(展開劑按V/V計石油醚∶乙酸乙酯＝8∶2)進行純化即得紅色代謝物——本發(fā)明產(chǎn)品靈菌紅素類化合物。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)靈菌紅素的海洋細菌菌株，從海洋細菌篩選而得，其特征在于該菌株經(jīng)16rRNA分析，屬于假單胞菌(Pseudomonas sp.)，其分類命名為Pseudomonas sp.105001 CCTCCM 205164，該菌株的生理生化特性是細胞產(chǎn)紫紅色素，桿狀，革蘭氏陰性，無鞭毛運動，無芽孢，GUL葡萄糖(O/F)-，XYL木糖發(fā)酵(O/F)+W，RHA鼠李糖(O/F)-，MAL麥芽糖(O/F)-，RAF棉子糖(O/F)-，LAC乳糖(O/F)-，SOR山梨醇(O/F)-，ADO側(cè)金盞花醇(O/F)-，蛋白胨水(靛基質(zhì))+，DUL衛(wèi)矛醇(O/F)-，MAN甘露醇(O/F)-，INO肌醇(O/F)-，SAC蔗糖-，ARA阿拉伯糖+，ESC七葉樹苷利用-，OX氧化酶-，CAT接觸酶-，AMY淀粉酶-，NO3還原+，產(chǎn)H2S-，IND+，VP-，ADH精氨酸雙水解酶-，LDC賴氨酸脫羧酶-，URE尿素分解-，水楊苷發(fā)酵-，％鹽度生長試驗0％-，3％+，6％+，8％+，10％+。
2.一種生產(chǎn)靈菌紅素的方法，其特征在于用Pseudomonas sp.105001 CCTCC M 205164為生產(chǎn)菌株，經(jīng)母種制備，發(fā)酵培養(yǎng)，提取紅色代謝產(chǎn)物和純化代謝產(chǎn)物的過程，具體制備步驟是(1)用2216E液體培養(yǎng)基生產(chǎn)發(fā)酵母種，所述的2216E液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨5g，酵母膏1g，檸檬酸鐵0.1g，陳海水1000ml，pH7.6；(2)用制備的生產(chǎn)發(fā)酵母種在發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)條件是，通氣培養(yǎng)，生長溫度25-30℃，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方及制備如下有機成分A魚粉10g水解，取上清液；無機成分B粗鹽32g，KCl 0.644g，NaHCO30.192g，KBr 0.096g，H3BO30.026g，SrCl20.024g，NaF 0.003g，將A、B成分溶于去離子水至總量1000mL，PH 7.6；(3)將發(fā)酵液離心，收集沉淀物，用乙醇溶解沉淀物，然后提取其中的紅色代謝產(chǎn)物；(4)將乙醇提取物經(jīng)硅膠柱層析，用乙酸乙酯、石油醚淋洗所得的組分，再經(jīng)SephdexLH-20柱以及制備板層析純化即得紅色代謝物——靈菌紅素類化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從海洋細菌篩選出來的可生產(chǎn)靈菌紅素的海洋細菌菌株及用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素的方法。該海洋細菌菌株為Pseudomonas sp.105001 CCTCC M 205164。用Pseudomonas sp.105001 CCTCC M 205164為生產(chǎn)菌株，經(jīng)母種制備，發(fā)酵培養(yǎng)，提取紅色代謝產(chǎn)物和純化代謝產(chǎn)物制備步驟，即可制得菌種的紅色代謝物——本發(fā)明產(chǎn)品靈菌紅素類化合物。本發(fā)明所提供的海洋細菌新菌株遺傳穩(wěn)定，繁殖快，可進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，應用該海洋微生物進行靈菌紅素生產(chǎn)，開辟了海洋微生物資源研究和開發(fā)的新途徑。
文檔編號C12P1/04GK1884483SQ20061003602
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月20日
發(fā)明者蔡創(chuàng)華, 周毅頻, 沈鶴琴, 張穗 申請人:中國科學院南海海洋研究所