專利名稱：用于腫瘤細胞增強轉導的纖維修飾的腺病毒載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及腺病毒載體，其包括嵌合纖維蛋白并且與非嵌合腺病毒載體相比，呈現(xiàn)腫瘤細胞尤其是原發(fā)腫瘤細胞的增強的轉導。
背景技術：
基因治療用作向細胞提供外源核苷酸序列的手段，并且是一些最新穎和最有潛力的抗病工具的基礎。該方法不僅在治療癌癥而且在治療許多其它疾病包括膽囊纖維性病變、貧血、血友病、糖尿病、亨廷頓氏病、艾滋病、異常高血清膽固醇、某些免疫缺陷、和許多形式的癌中具有極大的前景?；蛑委熗ǔＲ蕾囘\載工具，如向細胞提供外源序列的病毒載體。重組腺病毒載體已顯示一些抗這些疾病的治療效能。為了回顧，參見Kim等(1996)Mol.Med.Today 12519-527和Smith等(1996)Gene Therapy 3496-502。
有兩種主要類型的腺病毒載體無能力復制型(復制缺陷的)和有能力復制型(replication-competent)。復制缺陷型載體通常缺乏一個或多個復制必要的基因。這些無能力復制型病毒在補充其缺少的必要基因的細胞中繁殖。無能力復制型腺病毒載體已被廣泛運用到體外和體內(nèi)轉導細胞并且表達各種轉基因。有能力復制型腺病毒載體通常不缺少任何復制必要的腺病毒基因并且可在某些細胞中選擇性復制。
免疫系統(tǒng)在多種癌的發(fā)病機理中扮演關鍵角色。當癌發(fā)生時，人們普遍相信免疫系統(tǒng)沒能充分應答或者沒能適當應答，允許癌細胞生長。目前，包括化療、手術、放射治療和細胞治療的癌標準醫(yī)學治療，相對于功效和毒性均具有明確的界限。迄今為止，這些方法取決于癌的類型、病人的基本健康狀況、診斷時的病期等獲得不同程度的成功。結合對癌的免疫應答的具體處理的改進對策與標準醫(yī)學治療的結合可提供增強功效和減少毒性的方法。
對用自體癌細胞作為疫苗來加強抗腫瘤免疫已研究了一段時間(Oettgen等，“The History of Cancer Immunotherapy”，在BiologicTherapy of Cancer，Devita等(編著)J.Lippincot Co.，87-199頁，1991；Armstrong TD和Jaffee EM，Surg Oncol Clin N Am.11(3)681-96頁，2002和Bodey B等，Anticancer Res 20(4)2665-76頁，2000)。
已經(jīng)顯示許多細胞因子在對腫瘤的免疫應答的調節(jié)中起作用。例如，美國專利US5,098,702描述了使用協(xié)同有效量的TNF、IL-2和IFN-β的組合物以抵抗存在的腫瘤。美國專利US5,078,996、US5,637,483和US5,904,920描述了利用GM-CSF治療腫瘤。然而，直接服用細胞因子治療癌癥未必實用，因為它們經(jīng)常是系統(tǒng)毒性的。(參見，例如，Asher等，J.Immunol.1463227-3234頁，1991和Havell等，J.Exp.Med.1671067-1085頁，1988)。
此方法的擴展涉及在疫苗位點局部表達細胞因子的基因修飾的腫瘤細胞的使用。通過在腫瘤模型中使用各種免疫調節(jié)細胞因子已經(jīng)證明有活性，這些免疫調節(jié)細胞因子包括如Golumbeck PT等，Science 25413-716頁，1991；Gansbacher B等，J.Exp.Med.1721217-1224頁，1990；Fearon ER等，Cell 60397-403頁，1990；Gansbacher B等，Cancer Res.507820-25頁，1990；Teng M等，PNAS 883535-3539頁，1991；Columbo MP等，J.Exp.Med.1741291-1298頁，1991；Aoki等，ProcNatl Acad Sci USA.89(9)3850-4頁，1992；Porgador A等，Nat Immun.13(2-3)113-30頁，1994；Dranoff G等，PNAS 903539-3543頁，1993；Lee CT等，Human Gene Therapy 8187-193頁，1997；Nagai E等，Cancer Immunol.Immonther.472-80，1998和Chang A等，HumanGene Therapy 11839-850頁，2000中分別描述的IL-4、IL-2、TNF-α、G-CSF IL-7、IL-6和GM-CSF。
使用表達的GM-CSF同源或者異源細胞疫苗(GVAX)的臨床試驗已經(jīng)開始用于前列腺癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、腎癌、和多發(fā)性骨髓瘤的治療(Dummer R.，Curr Opin Investig Drugs 2(6)844-8頁，2001；Simons J等，Cancer Res.15；59(20)5160-8頁，1999；Soiffer R等，PNAS 9513141-13146，1998；Simons J等，Cancer Res.15；571537-1546頁，1997；Jaffee E等，J.Clin Oncol.19145-156頁，2001；和Salgia R等，J.Clin Oncol.21624-630頁，2003)。
盡管已應用腺病毒載體轉導腫瘤細胞，但是原發(fā)腫瘤細胞的轉導通常效率低。因此，需要提高腫瘤細胞尤其是原發(fā)腫瘤細胞的轉導效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過用具有嵌合纖維蛋白的腺病毒轉導腫瘤細胞以在腫瘤細胞中表達異源核苷酸的組合物和方法，其中，該嵌合纖維蛋白包括亞型B腺病毒或血清型37腺病毒頭的至少一部分和亞型C腺病毒或牛腺病毒纖維軸的至少一部分。在一個實施方式中，腫瘤細胞體外、體內(nèi)或離體轉導。在優(yōu)選實施方式中，腫瘤細胞為原發(fā)腫瘤細胞。
在本發(fā)明的實踐中，腺病毒可以是有能力復制型(也就是腫瘤消溶)或無能力復制型并且可以編碼轉基因或可以不編碼轉基因。
相應地，一方面提供選擇性細胞溶解的方法，即，殺死細胞群中的贅生性細胞，該方法包括在病毒載體和/或顆粒在贅生性細胞中選擇性地復制并且殺死贅生性細胞的條件下，將本發(fā)明的有效量的有能力復制型病毒載體和/或病毒顆粒與細胞群接觸。細胞群可以是在體外、直接體內(nèi)或間接體內(nèi)的裝置中。
一方面，本發(fā)明提供在腫瘤細胞中表達轉基因例如細胞因子(如GM-CSF)的方法。在優(yōu)選方面中，腫瘤細胞為原發(fā)腫瘤細胞。此外，提供生產(chǎn)腫瘤疫苗的方法。還提供將本發(fā)明的腫瘤疫苗輸送到哺乳動物的方法。
本發(fā)明進一步提供腺病毒顆粒，其中，靶配體包含于病毒顆粒的衣殼蛋白中。在進一步實施例中，衣殼蛋白是纖維蛋白并且配體位于纖維蛋白的C-末端或HI環(huán)。


圖1提供野生型的代表和示例的嵌合纖維構造?？蓪⑺斜恍揎椀睦w維混入腺病毒載體(例如具有E1區(qū)刪去的Ad5基載體)。在RSV啟動子的控制下，基于Av1nBg的載體表達β-半乳糖苷酶。在CMV前早期啟動子的支配下，基于Ad5-CMV5-GFP的載體表達綠色熒光蛋白。每個載體的軸和結區(qū)源如圖所示。
圖2是圖解FaDu人類頭和頸腫瘤異種移植腫瘤模型中的OV1991的抗腫瘤效果的圖。
圖3是圖解A375-luc人類黑素瘤異種移植腫瘤模型中的纖維嵌合腫瘤消解載體的抗腫瘤效果的圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供通過用具有嵌合纖維蛋白的腺病毒轉導腫瘤細胞在腫瘤細胞中表達異源核酸(例如，轉基因)的腺病毒的組合物和方法，其中，該嵌合纖維蛋白包括亞型B腺病毒或血清型37腺病毒頭的至少一部分和亞型C腺病毒或牛腺病毒纖維軸的至少一部分。在一個實施方式中，嵌合纖維蛋白包括Ad5或Ad2軸的至少一部分和Ad35頭的至少一部分。通常腫瘤細胞為原發(fā)腫瘤細胞。
不希望受理論或機理的束縛，本發(fā)明以包括與那些具有Ad2、Ad5或Ad35天然纖維的嵌合纖維相比能更有效地轉導某些癌細胞的具有Ad5或Ad2軸(或尾部)區(qū)和Ad35頭(結)區(qū)的嵌合纖維的腺病毒載體的觀察為根據(jù)。特別有趣的是，與單一血清型的非嵌合腺病毒相比，具有第一血清型的纖維軸和第二血清型的纖維頭的嵌合腺病毒(例如具有Ad5或Ad2軸(尾部)和亞群B腺病毒或血清型37腺病毒頭的腺病毒)具有更有效轉導原發(fā)腫瘤細胞的能力。被本發(fā)明的嵌合腺病毒載體更有效轉導的腫瘤細胞型的非限制性的實施例包括肺腫瘤細胞、前列腺腫瘤細胞、頭和頸腫瘤細胞、膀胱腫瘤細胞和腎腫瘤細胞?？赏ㄟ^標記基因(例如，β-半乳糖苷酶或GFP)的表達測定腫瘤細胞的轉導，然而，任何轉基因均可包含在本發(fā)明的腺病毒內(nèi)并被本發(fā)明的腺病毒表達。
Ad5是亞型C腺病毒而Ad35是亞型B病毒。與腺病毒血清型3(Sirena等，J Virol.2004年5月；78(9)4454-62頁)、11、14、16、21、3537和50一樣，Ad35纖維的頭區(qū)結合CD46。Ad37屬于腺病毒亞型D。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式具有亞型C腺病毒如Ad2或Ad5的纖維軸和與CD46結合的腺病毒的纖維頭。
除非另有陳述，本發(fā)明的實踐使用常規(guī)的化學、分子生物學、微生物學、重組DNA、遺傳學、免疫學、細胞生物學、細胞培養(yǎng)和轉基因生物學技術，這些均落在現(xiàn)有技術內(nèi)。參見，例如，Maniatis等，1982，Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York)；Sambrook等，1989，Molecular Cloning，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，第三版(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring，New York)；Ausubel等，1992，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，包括定期更新內(nèi)容)；Glover，1985，DNA Cloning(IRL Press，Oxford)；Anand，1992，Techniques for the Analysis of Complex Genomes，Academic Press，NewYork；Guthrie和Fink，1991，Guide to east Genetics and MolecularBiology，Academic Press，New York；Harlow和Lane，1988，Antibodies，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Jakoby和Pastan，1979；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins編著，1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins編著，1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRLPress，1986)；B.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos編著，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In CellAnd Molecular Biology(Mayer和Walker，編著，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，編著，1986)；Riott，Essential Immunology，第六版，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1988；Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
定義除非另有指示，本文使用的所有術語與本領域技術人員所知的意義相同，并且本發(fā)明的實踐會使用本領域技術人員所知的常規(guī)微生物學技術和重組DNA技術。
在本文中，利用包括所有的專利、專利申請、公開物(包括已公開的專利申請)，和本文中與該說明書有關的數(shù)據(jù)庫登錄號的公開物和其它內(nèi)容，闡明本發(fā)明的背景并且尤其，提供與實踐有關的其它細節(jié)的案例。包括所有的專利、專利申請、公開物(包括已公開的專利申請)，和本文中與該說明書有關的數(shù)據(jù)庫登錄號的公開物和其它內(nèi)容，全部引入本文供參考。
在本發(fā)明的描述中，使用以下術語且定義如下。
縮寫“pfu”代表噬菌斑形成單元。
術語“病毒”、“病毒顆?！?、“載體顆?！?、“病毒載體顆?！?、和“毒粒”可互換使用并且可廣泛地理解為當例如將本發(fā)明的病毒載體轉導入合適細胞或細胞系用于產(chǎn)生感染性顆粒時形成的感染性病毒顆粒?？梢岳帽景l(fā)明的病毒顆粒體外或體內(nèi)轉移DNA進入細胞。對于本發(fā)明的目的，這些術語涉及腺病毒，包括當本發(fā)明的腺病毒載體被包封在腺病毒衣殼內(nèi)時形成的重組腺病毒。
本文中提及的“腺病毒載體”或“腺病毒的載體”(可互換使用)為可包入腺病毒毒粒的多核苷酸構造。在一些實施方式中，本發(fā)明的腺病毒載體包括治療基因序列，如，細胞因子基因序列。本發(fā)明的示例性的腺病毒載體包括，但不局限于，DNA、包封于腺病毒殼內(nèi)的DNA、包裝于另一病毒或病毒狀形式內(nèi)(如單純皰疹和AAV)的腺病毒DNA、包封于脂質體的腺病毒DNA、與聚賴氨酸復合的腺病毒DNA、與合成聚陽離子分子復合的、與運鐵蛋白共軛的、或與化合物如PEG復合以免疫地“掩蓋”抗原性和/或增加半壽期的、或與非病毒蛋白共軛的腺病毒DNA。因此，本文中使用的術語“腺病毒載體”或“腺病毒的載體”包括腺病毒或腺病毒顆粒。
本文中使用的與本發(fā)明的腺病毒載體有關的術語“有能力復制型的”，是指本發(fā)明的腺病毒載體和顆粒優(yōu)選在某些而不是更少程度或全部其他類型的細胞或組織中復制。在本發(fā)明的一個實施方式中，腺病毒載體和/或顆粒選擇性地在腫瘤細胞和/或異常增殖組織如實體瘤和其它贅生物中復制。這些包括在美國專利US5,677,178、US5,698,443、US5,871,726、US5,801,029、US5,998,205、和US6,432,700以及PCT公開WO95/19434、WO 98/39465、WO 98/39467、WO 98/39466、WO 99/06576、WO 98/39464和WO 00/15820中公開的病毒。這樣的病毒可稱為“溶瘤病毒”或“溶瘤載體”且可認為是“溶細胞的”或“至細胞病變的”以及認為是影響靶細胞的“選擇性細胞溶解”。
如本文中所使用，術語“病毒載體”根據(jù)其技術領域公認的意思使用。它指包括病毒來源的至少一個成分并且可包裝于病毒載體顆粒的核酸載體結構。利用該病毒載體和/或顆粒用于將DNA、RNA或其它核酸體外或體內(nèi)轉移進細胞。包括腺病毒載體的許多病毒載體形式在現(xiàn)有技術中是已知的。
當術語“來源于”用于上下文中的腺病毒載體時，是指與腺病毒載體基因組同源的腺病毒血清型。大多數(shù)情況下，大多數(shù)腺病毒基因組來自于一種血清型并且在這種情況中據(jù)說該腺病毒載體來源于該種血清型。當腺病毒載體基因組僅具有來自第二血清型的一種腺病毒編碼序列時，據(jù)說這種腺病毒載體僅來源于第一腺病毒血清型。
術語“嵌合纖維蛋白”指包括非天然氨基酸順序，除了或代替一部分天然的纖維氨基酸順序的腺病毒纖維蛋白。非天然氨基酸順序可來自不同血清型的腺病毒纖維蛋白。非天然氨基酸順序可以是任何合適的長度(例如3到約200氨基酸)。示范性的“嵌合纖維蛋白”具有來源于一種腺病毒血清型的軸和來源于不同腺病毒血清型的頭。
術語“載體”、“多核苷酸載體”“多核苷酸載體結構”、“核酸載體結構”、和“載體結構”在本文中可互換使用，是指用于基因轉移的任何核酸結構，如同本領域技術人員所理解的那樣。
術語“復制必要的基因”指核苷酸序列，其轉錄是病毒載體所需要的，以在靶細胞中復制。例如，在本發(fā)明的腺病毒載體中，復制必要的基因可選自E1a、E1b、E2a、E2b和E4基因。
如本文中使用的，“包裝細胞”是能包裝腺病毒基因組或修飾基因組以產(chǎn)生病毒顆粒的細胞。它可以提供丟失的基因產(chǎn)物或其等價物。因此，包裝細胞可以向腺病毒中除去的基因提供補充功能并且能將腺病毒基因組包裝入腺病毒顆粒。這些顆粒的產(chǎn)生需要復制基因組以及生產(chǎn)組裝感染性病毒必要的蛋白質。顆粒還需要病毒顆粒的成熟所必要的某些蛋白質。這種蛋白質可以通過載體或通過包裝細胞提供。
術語“HeLa-S3”是指American Type Culture Collection(ATCC，Manassas，VA)提供的人類宮頸腫瘤源細胞系，并且命名為ATCC號CCL-2.2。HeLa-S3是親代HeLa系(ATCC CCL-2)的克隆衍生物。HeLa-S3是在1955年由T.T.Puck等(J.Exp.Med.103273-284頁(1956))克隆的。
在本文中，“自加工切割位點”或“自加工切割序列”是指DNA或氨基酸順序，其中在翻譯或被翻譯時，發(fā)生包含自加工切割位點的多肽的快速分子內(nèi)(順式)切割，從而引起離散的成熟蛋白或多肽產(chǎn)物的表達。這種“自加工切割位點”，還可稱為后翻譯或共翻譯加工切割位點，例如，2A位點、序列或結構域。2A位點、序列或結構域通過修飾核糖體的活性以促進酯鍵的水解，由此以容許離散下游翻譯產(chǎn)物發(fā)生的方式從翻譯復合物釋放多肽顯示翻譯效果(Donnelly，2001)。換句話說，2A位點、序列或結構域通過順時切開它自己的C-末端以產(chǎn)生初級切割產(chǎn)物(Furler；Palmenberg，Ann.Rev.Microbiol.44603-623頁(1990))顯示“自動蛋白酶解”或“切割”。
術語“核酸”指以或單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸及其聚合物(“多核苷酸”)。除非特別限定，該術語涵蓋包括與參照核酸類似的結合性能以及與天然存在的核苷酸類似的方式代謝的天然核苷酸的已知類似物的核酸。除非另有陳述，特殊的核酸分子/多核苷酸還意味著其保守修飾的變型(例如兼并密碼子置換)和互補序列以及明確指出的序列。具體地，兼并密碼子置換可通過生成其一個或多個選擇的(或所有的)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基(Batzer等，Nucleic Acid Res.195081頁(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.2602605-2608頁(1985)；Rossolini等，MoI.Cell.Probes 891-98頁(1994))所替代的序列得到。核苷酸由其堿基通過以下標準縮寫表示腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G)。
當與另一核酸配置成功能關系時，核酸是“有效連接的”。例如，如果兩個核苷酸序列為有效連接，或啟動子或調節(jié)DNA序列影響編碼或結構DNA序列的表達水平的狀態(tài)，啟動子或調節(jié)DNA序列被稱為與編碼RNA和/或蛋白的DNA順序為“有效連接的”。有效連接的DNA序列通常(但不是必須)是連續(xù)的。
術語“編碼序列”和“編碼區(qū)”是指被轉錄成RNA如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有意義RNA或反義RNA的核苷酸序列。在一個實施方式中，RNA然后在細胞中被翻譯以產(chǎn)生蛋白質。
術語“ORF”是指開放閱讀框(Open Reading Frame)。
術語“基因”是指位于基因組內(nèi)的限定區(qū)并且除了如前所述的編碼序列，包括其它的，主要是調節(jié)，跟表達的控制有關的核苷酸序列，即，編碼部分的轉錄和翻譯。基因還可包括其它的5′和3′未翻譯序列和終止序列。根據(jù)基因的來源，提供進一步的組分可能是，例如，內(nèi)含子。
參考核酸分子如啟動子和基因編碼序列，本文中使用的術語“異源的”和“外源的”是指來源于對特殊病毒或寄主細胞是外源的核苷酸序列或，如果來源于相同來源，則該序列由其原型修飾而成。因此，病毒或細胞中的異源基因包括對特殊病毒或細胞為內(nèi)源的但已通過例如密碼子優(yōu)化，修飾過的基因。該術語還包括天然存在的核苷酸序列的非天然存在的多種拷貝。因此，該術語是指對病毒或細胞是外來的或異源的核酸片段，或對病毒或細胞是同源的但在宿主病毒或細胞基因組內(nèi)的位置通常未被發(fā)現(xiàn)。
參考核酸分子，本文中使用的術語“同源的”是指與宿主病毒或細胞有天然聯(lián)系的核苷酸序列。
術語“補充”和“互補”是指包含反向平行的核苷酸序列中的互補堿基殘基間在形成氫鍵時能互相配對的兩條核苷酸序列。
術語“天然的”是指存在于野生型病毒或細胞基因組中的基因或蛋白質。
術語“天然存在”或“野生型”是用來描述能在自然界中發(fā)現(xiàn)的與人工生產(chǎn)的不同的物體。例如，存在于有機體(包括病毒)中的能在自然界中從其來源分離出來并且沒有經(jīng)過人類在實驗室中有意修飾的蛋白質或核苷酸序列，為天然存在的。
本文中使用的術語“靶配體”是指優(yōu)選將腺病毒顆粒引入到所需細胞型和/或組織的化學部分。這種配體的種類包括，但不局限于，肽、多肽、單鏈抗體和多聚體蛋白質。特殊的配體包括TNF超家族的配體，這些配體包括腫瘤壞死因子(或TNF)如，例如，TNF-α和TNF-β，淋巴毒素(LT)，如LT-α和LT-β，與Fas抗原結合的Fas配體；CD40配體，該配體與B-淋巴細胞的CD40受體結合；CD30配體，該配體與Hodgkin氏淋巴瘤的贅生性細胞的CD30受體結合；CD27配體，NGF配體，和OX-40配體；運鐵蛋白，該蛋白與位于腫瘤細胞、激活的T-細胞和神經(jīng)組織細胞的運鐵蛋白受體結合；ApoB，其與肝細胞的LDL受體結合；α-2-巨球蛋白，該蛋白與肝細胞的LRP受體結合；α-I酸性糖蛋白，該蛋白與肝臟的脫唾液酸糖蛋白受體結合；含甘露糖肽，其與巨噬細胞的甘露糖受體結合；含唾液酸-Lewis-X抗原肽，其與激活的內(nèi)皮細胞的ELAM-I受體結合；CD34配體，其與造血干細胞的CD34受體結合；ICAM-I，其與胸腺依賴性細胞的LFA-I(CD11b/CD18)受體或巨噬細胞的Mac-I(CD11a/CD18)受體結合；M-CSF，其與脾和骨髓巨噬細胞的c-fms受體結合；環(huán)子孢子蛋白，其與肝細胞的肝惡性瘧原蟲受體結合；VLA-4，其與激活的內(nèi)皮細胞的VCAM-I受體結合；HIV gpl20和類II MHC抗原，其與T-輔助細胞的CD4受體結合；脫脂蛋白E(ApoE)分子的LDL受體結合區(qū)；克隆刺激因子或CSF，其與CSF受體結合；類胰島素生長因子，如IGF-I和IGF-II，它們分別與IGF-I和IGF-II受體結合；白細胞介素1-14，它們分別與白細胞介素1-14受體結合；免疫球蛋白的Fv抗原-結合結構域；明膠酶(MMP)抑制劑；鈴蟾肽，胃泌素釋放肽；物質P；促生長素抑制素；促黃體素釋放激素(LHRH)；血管活性肽(VIP)；胃泌素；促黑素細胞激素(MSH)；環(huán)RGD肽和任何其它配體或細胞表面蛋白結合(或靶)分子。在本發(fā)明的一個實施方式中，將肽靶配體插入腺病毒載體的衣殼蛋白中，通常為腺病毒載體的纖維蛋白。
參照核酸分子，本文中使用的術語“重組子”是指利用重組DNA技術將核酸分子結合在一起形成子代核酸分子的核酸分子組合。參照病毒、細胞和有機體，本文中使用的術語“重組子”、“轉化的”和“轉基因”是指已經(jīng)引入異源核酸分子的宿主病毒、細胞或有機體。核酸分子能被穩(wěn)定地整合進宿主的基因組或核酸分子還可以作為染色體外分子存在。這種染色體外分子能自我復制。應該理解，重組病毒、細胞和生物體不僅包含轉化過程的最終產(chǎn)物而且包含其重組子代?！胺寝D化的”、“非轉基因”或“非重組子”宿主是指不含異源核酸分子的野生型病毒、細胞或有機體。
“調控元件”是涉及控制核酸表達的核苷酸序列。調控元件包括啟動子，增強子和終止信號。它們通常還包含核苷酸序列的合適翻譯所需的核苷酸序列。
術語“啟動子”是指通常位于編碼區(qū)上游的未翻譯的DNA序列，其包含RNA聚合酶II結合部位并且啟動DNA的轉錄。啟動子區(qū)還可包括充當基因表達調節(jié)器的其它元件。術語“最小啟動子”是指啟動子元件，尤其指非活化的或缺少上游活化元件的啟動子活性極大減低的TATA元件。
術語“增強子”在本發(fā)明內(nèi)的意思可以是任何遺傳成分，例如，核苷酸序列，它能增強與啟動子具有有效連接的編碼序列的轉錄，使在一定程度上大于當與該編碼序列具有有效連接時受啟動子本身影響的轉錄活化，也就是它從啟動子增強轉錄。
術語“表達”是指細胞中的內(nèi)源基因、轉基因或編碼區(qū)的轉錄和/或翻譯。就反義結構而論，表達可以僅指反義DNA的轉錄。
本文中使用的術語“正調節(jié)的”是指與其它細胞相比，在靶細胞中能發(fā)現(xiàn)特異基因的大量RNA。例如，與非腫瘤細胞相比，如果腫瘤細胞產(chǎn)生更多端粒末端轉移酶RNA，則該腫瘤細胞具有端粒末端轉移酶的正調節(jié)表達。當靶細胞(例如腫瘤細胞)中的特異RNA的量至少是別的細胞(非腫瘤細胞)的3倍多時，表達被認為是正調節(jié)的。在另一實施方式中，特異RNA的量至少為5倍多。在另一實施方式中，特異RNA的量至少為10倍多。本領域技術人員知道如何測定特異RNA序列(例如Northern分析)的RNA水平。
本文中使用的術語“腫瘤選擇性啟動子活性”是指腫瘤細胞中本發(fā)明的啟動子片段的啟動子活性高于非腫瘤細胞型。
如本文中使用，“內(nèi)部核糖體進入位點”或“IRES”是指啟動直接的內(nèi)部核糖體進入起始密碼子的元件，如順反子(蛋白質編碼區(qū))的ATG，由此導致基因的不依賴帽(cap-independent)的翻譯。(Jackson R J，Howell M T，Kaminski A(1990)Trends Biochem Sci 15(12)477-83頁和Jackson R J及Kaminski，A.(1995)RNA 1(10)985-1000頁)。本發(fā)明包括任何IRES元件的使用，其能啟動直接的內(nèi)部核糖體進入順反子的起始密碼子。本文中使用的“在IRES的翻譯控制下”是指翻譯與IRES有關并且以不依賴帽的方式進行。在現(xiàn)有技術中已知的“IRES”的實例包括，但不局限于可從小核糖核酸病毒中獲得的IRES(Jackson等，1990，Trends Biochem Sci15(12)477-483頁)；和可從病毒或細胞mRNA來源獲得的IRES，例如實例，免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)，血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)(Huez等(1998)Mol.Cell.Biol.18(11)6178-6190頁)，成纖維細胞生長因子2，和類胰島素生長因子、翻譯起始因子eIF4G、酵母轉錄因子TFIID和HAP4。在各種病毒如心病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒、HCV、弗羅德鼠類白血病病毒(FrMLV)和莫洛尼鼠類白血病病毒(MoMLV)中也同樣報導有IRES。如本文中所使用，“IRES”包括IRES序列的功能變化，只要該變化能啟動直接的內(nèi)部核糖體進入順反子的起始密碼子。在優(yōu)選實施方式中，IRES為哺乳動物。在其它的實施方式中，IRES為病毒或原生動物。在本文公開的說明性實施方式中，從腦心肌炎病毒(ECMV)(可從Novogen購買，Duke等(1992)J.Virol 66(3)1602-1609)中可獲得IRES。在本文公開的另一個說明性實施方式中，IRES來自VEGF。在美國專利US6,692,736中描述了IRES序列的實例。
在兩個或多個核苷酸或蛋白質序列前后的術語“相同的”或“同一性”百分率，是指利用一種本文中描述的序列比較算法例如Smith-Waterman算法或通過外觀檢查測定，當對照并排列成最大一致時，兩個或多個序列或子序列是相同的或氨基酸殘基或核苷酸的指定百分數(shù)是相同的。
“正常細胞狀態(tài)”或“正常生理狀態(tài)”是處于正常生理條件下并且以調節(jié)方式不分裂或分裂的細胞的狀態(tài)，即，細胞處于正常生理狀態(tài)?！爱惓＜毎麪顟B(tài)”定義為與相同類型的細胞有關，該細胞處于不分裂/調節(jié)分裂狀態(tài)并且處于正常生理條件下。由此可見具有“異常細胞狀態(tài)”的細胞顯示未調節(jié)的細胞分裂。
如本文中使用的術語“癌”、“癌細胞”、“贅生性細胞”、“瘤形成”、“腫瘤”和“腫瘤細胞”(可互換使用)是指顯示相對自主增長的細胞，它們表現(xiàn)出由顯著細胞增殖控表征的異常生長表型或異常細胞狀態(tài)。腫瘤細胞可以是增生性的細胞、呈現(xiàn)體外或體內(nèi)生長的缺少接觸抑制的細胞、不能體內(nèi)移動的細胞、或者能夠體內(nèi)移動的細胞。贅生性細胞可以是惡性的或良性的。由此可見癌細胞被認為是具有異常細胞狀態(tài)。
術語“原發(fā)腫瘤細胞”的使用與現(xiàn)有技術中意思一致。原發(fā)腫瘤細胞是從哺乳動物的腫瘤分離出來的并且未廣泛體外培養(yǎng)的癌細胞。
如本文中所使用的與特殊核苷酸序列有關的術語“基本組成”或“基本構成”是指特殊的核苷酸序列在或者5′或3′末端或者兩端可以具有額外的殘基，其中額外殘基實質上不影響所列舉序列的基本和新穎特征。
在本文中術語“細胞因子”或語法上的等價物是指免疫系統(tǒng)細胞激素的通常等級，包括淋巴細胞因子，單細胞因子及其他。定義包括，不局限于，局部起作用并且不在血液中循環(huán)的激素，以及，當根據(jù)本發(fā)明使用時，會產(chǎn)生個體的免疫應答的改變。
在本文中術語“來自腫瘤細胞的抗原”或其語法上的等價物，是指來自能引起免疫應答的腫瘤細胞的任何蛋白質、碳水化合物或其它組分。該定義是指包括，但不局限于，使用整個腫瘤細胞及其所有關聯(lián)抗原作為抗原，以及從細胞體中分離出的任何組分，如質膜、胞質蛋白、跨膜蛋白、從細胞表面或膜純化的蛋白質、或與細胞表面有關的獨特的碳水化合物部分。該定義還包括從需要細胞的特殊處理的細胞表面以便使用的那些抗原。
如在本文中使用的術語“基因修飾腫瘤細胞”是指包含細胞群的組合，該組合已被基因修飾以表達轉基因，而且作為部分癌治療方法給予病人?；蛐揎椖[瘤細胞疫苗包括對進行治療的病人而言是“自體的”或“異源的”的腫瘤細胞或與取自病人的腫瘤細胞混合的“旁觀者細胞”。在本文中，表達GM-CSF的基因修飾腫瘤細胞疫苗可以是指“GVAX”。
本文中術語“系統(tǒng)免疫應答”或語法上的等價物是指免疫應答，該應答沒有定位但是總體上影響個體，因此容許對相同刺激產(chǎn)生特異的隨后應答。
在本文中術語“形成腫瘤的逆轉”或語法上的等價物是指原始腫瘤的抑制、退化或部分或全部消失。該定義是指包括在原始腫瘤的大小、潛力或生長速度上的任何減少。
術語“阻滯腫瘤的生長”是指減慢腫瘤生長速度，抑制腫瘤大小或腫瘤細胞數(shù)目增加，或者減少腫瘤細胞數(shù)目、腫瘤大小或腫瘤數(shù)目。
術語“轉導”是指通過物理手段將外源核酸引入細胞中。例如，轉導包括使用本發(fā)明的病毒顆粒將外源的核酸引入細胞中。對于用于操作哺乳動物細胞的各種技術，參見Keown等，Methods of Enzymology 185527-537頁(1990)。
如在本文中使用的術語“治療”、“治療學使用”或“醫(yī)學使用”，將指以任何方式治療疾病狀態(tài)或癥狀、或阻止、阻礙、阻滯、或逆轉疾病或其它不希望癥狀的發(fā)展的任何和所有要求組合物的使用。
在本文中，術語“治療有效量”或語法上的等價物是指足夠通過刺激或抑制調節(jié)個體的系統(tǒng)免疫應答的制劑的量。在本發(fā)明的癌疫苗地情況下，它刺激對癌細胞的哺乳動物的免疫應答。對于不同個體、不同腫瘤類型和不同制劑的量可以不同?！爸委熡行Я俊庇杀绢I域技術人員使用常規(guī)操作導致“改善治療效果”來確定。
如在本文中所使用，與癌有關的術語“改善的治療結果”和“增強的治療效果”是指遲緩或減少癌細胞或實體瘤的生長，或減少癌細胞的總數(shù)或總腫瘤量。因此，“改善的治療結果”或“增強的治療學效果”是指根據(jù)任何臨床上可接受的標準，病人狀態(tài)的改善，包括預期壽命的增加或生命質量的改善。在本文中，術語“失活細胞”和“增殖缺陷細胞”或語法上的等價物是通過使它們增殖缺陷的處理引起治療細胞失活致。這一治療引起細胞不能進行多輪的有絲分裂，卻仍維持表達蛋白質如細胞因子和/或腫瘤抗原的能力。通過本領域技術人員所知的各種方法均可完成。
“輻射的細胞”是這種失活細胞的一個實例。這種輻射的細胞已受到足夠的輻射以使它們增殖缺陷。
術語“個體”、“主體”或其語法上的等價物是指任何一種個體哺乳動物。
靶細胞本發(fā)明提供一種在靶細胞如原發(fā)腫瘤細胞中表達異源核酸的方法。靶細胞用具有嵌合纖維蛋白的腺病毒載體體外、離體或體內(nèi)轉導，其中該嵌合纖維蛋白包括Ad5或Ad2軸的至少一部分和Ad35頭的至少一部分。
靶細胞可以是任何細胞或組織類型。在優(yōu)選方法中，靶細胞是腫瘤細胞，通常為原發(fā)靶細胞。在一個實施方式中，原發(fā)腫瘤細胞選自肺腫瘤細胞(例如非小細胞肺腫瘤細胞)、前列腺腫瘤細胞、頭和頸腫瘤細胞、膀胱腫瘤細胞、黑素瘤腫瘤細胞、淋巴瘤細胞和腎腫瘤細胞中的一種細胞。
在某些優(yōu)選實施方式中，該原發(fā)腫瘤細胞選自膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、卵巢癌、子宮頸癌、胰腺癌、直腸癌、前列腺癌、胃癌、表皮癌；淋巴或骨髓譜系的造血癌；間質來源的癌如纖維肉瘤或橫紋肌肉瘤；其它的腫瘤類型如黑素瘤、畸胎癌、神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)膠質瘤和腺癌中的一種癌細胞。
本發(fā)明的嵌合腺病毒載體提供的優(yōu)點是腫瘤細胞尤其是原發(fā)腫瘤細胞的增強轉導。增強轉導效率是指需要較少的腺病毒載體。這導致必須生產(chǎn)的腺病毒載體量的減少。同樣，由于腺病毒載體轉導效率更有效，可以使用比通常非嵌合腺病毒載體更少量的病毒獲得同樣的轉導效率。
本發(fā)明的腺病毒載體和方法具有幾個用途。例如，幾十年來已經(jīng)使用腺病毒載體在細胞內(nèi)引入和表達異源編碼序列。本發(fā)明提供了更有效地在原發(fā)腫瘤細胞中引入和表達異源編碼序列的腺病毒載體和方法。這提供了一種用于研究各種轉基因對原發(fā)腫瘤細胞影響的有效工具。還可用本發(fā)明的載體和方法在腫瘤細胞尤其是原發(fā)腫瘤細胞中測試不同的治療學轉基因。本發(fā)明的腺病毒載體和方法提供用于治療學應用的載體和方法，例如，治療哺乳動物中的癌。本發(fā)明的方法可用于體外、離體或體內(nèi)轉導腫瘤細胞。
本發(fā)明的腺病毒載體如在本文中所使用，用術語“腺病毒”和“腺病毒顆粒”稱可歸類為腺病毒的任何和全部病毒，包括感染人類或動物的任何腺病毒，包括全部群、亞型和血清型。因此，如在本文中所使用，“腺病毒”和“腺病毒顆粒”是指病毒本身或其衍生物并且覆蓋所有血清型和亞型以及天然存在型和重組子形式，除另外指出之外。這樣的腺病毒可以是野生型或可以是用現(xiàn)有技術中已知的或如在本文中公開的各種方式修飾。這種修飾包括為了產(chǎn)生感染性病毒而包裝在顆粒中的腺病毒基因組的修飾。這種修飾包括現(xiàn)有技術中已知的缺失，如E1a、E1b、E2a、E2b、E3或E4編碼區(qū)中的一個或多個的缺失。該術語還包括復制-特異性腺病毒；也就是，優(yōu)選在某些類型的細胞或組織但在較少程度或根本不在其它類型中復制的病毒。這樣的病毒有時認為是“溶細胞的”或“致細胞病變的”病毒(或載體)，并且，如果它們對贅生性細胞具有這種影響，認為是“腫瘤消解”病毒(或載體)。
本發(fā)明的腺病毒載體編碼嵌合纖維蛋白并且本發(fā)明的腺病毒顆粒含有嵌合纖維蛋白，其中所述的嵌合纖維蛋白包括Ad35頭的至少一部分和Ad5或Ad2軸的至少一部分。保留的Ad35頭和Ad5或Ad2軸的部分提供癌細胞的有效轉導。下面進一步描述在實踐本發(fā)明中有用的嵌合腺病毒纖維蛋白。
可根據(jù)本發(fā)明使用的腺病毒類群包括任何腺病毒血清型。目前可從American Type Culture Collection(ATCC，Manassas，VA)獲得腺病毒血清型1至51，并且本發(fā)明包括從任何來源獲得的腺病毒的任何其它的血清型?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的腺病毒可以是人類或非人類來源，如牛、豬、犬、猴、鳥類來源。例如，腺病毒可以是亞型A(例如，血清型12、18、31)、亞型B(例如，血清型3、7、11、14、16、21、34、35、50)、亞型C(例如，血清型1、2、5、6)、亞型D(例如，血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39、42-47、49、51)、亞型E(血清型4)、亞型F(血清型40、41)或任何其它的腺病毒血清型。通過整個說明書，對腺病毒類型5中的特異核苷酸進行對比。本領域技術人員可以確定其它血清型中的對應的核苷酸，并因此在其它的腺病毒血清型中構建類似的腺病毒載體。在一個優(yōu)選實施方式中，腺病毒核酸主鏈來源于腺病毒血清型2(Ad2)、5(Ad5)或35(Ad35)、或者包括部分腺病毒血清型2(Ad2)或者5(Ad5)與部分腺病毒血清型35(Ad35)的組合的嵌合腺病毒主鏈。人類和動物腺病毒的許多實例可從American Type Culture Collection獲得，可在網(wǎng)址例如http://www.atcc.org/SearchCatalogs/CellBiology.cfm找到。
可在GenBank中找到登錄號分別為NC 001405、AY339865、AY128640和AY271307的腺病毒血清型2、5、35(菌株Holden)和35(菌株35p)的DNA和蛋白質序列，其全部內(nèi)容引入本文作為參考。在GenBank中可以找到登錄號分別為BAD11205和BAB83691的腺病毒血清型11和14纖維的蛋白質序列，在GenBank中可以找到登錄號為X01998和M12411的腺病毒血清型3纖維的DNA序列，其全部內(nèi)容引入本文作為參考。在GenBank中可以找到登錄號分別為AB073632和AB073222的腺病毒血清型16和21的DNA序列，其全部內(nèi)容引入本文作為參考。連同該序列信息一起，GenBank條目包括有用的細節(jié)如參照、切割信號的位置、聚腺苷酸化位點、TATA信號、內(nèi)含子、每個識別基因的開始和終止密碼子、蛋白質序列、每個基因的cDNA和一系列文獻中的序列變種。
腺病毒載體基因組的大小限制腺病毒載體(Bett等，J Virol 675911-5921頁，1993)。這又限制可插入到載體中的異源DNA的數(shù)量，并且因此限制可結合到腺病毒基因組中的異源編碼序列的數(shù)量和/或長度。因此，無能力復制型病毒通常容許最大的異源DNA的插入，但仍然受到腺病毒基因組DNA的大小和除去的腺病毒DNA的量的限制。
在腺病毒載體的范圍中，術語“5′”可與“上游”互換使用并且是指左側反向未端重復(ITR)的方向。在腺病毒載體的范圍中，術語“3′”可與“下游”互換使用并且是指右側ITR的方向。
本發(fā)明的腺病毒載體包括無能力復制型和有能力復制型載體。無能力復制型載體在靶細胞中不復制，或以很低的水平復制。在一個方面中，通常通過去除或缺失，無能力復制型載體具有在E1a、E1b、E2a、E2b或E4滅活的部分或全部編碼區(qū)中的至少一個編碼區(qū)。用于增殖這些載體的方法在現(xiàn)有技術中是已知的。
在另一方面中，腺病毒載體為有能力復制型載體。有能力復制型載體能在靶細胞中復制。有能力復制型病毒包括野生型病毒和在靶細胞中經(jīng)改造以便復制的病毒。這些包括復制特異性病毒。與其它類型相比，設計復制特異性病毒以在細胞的一種類型中特異或優(yōu)選復制。
無能力復制型和有能力復制型腺病毒載體作為用于癌癥治療的治療劑正在發(fā)展。這些載體可以具有至少一個E3編碼區(qū)的缺失或有時保留一個天然的E3區(qū)。(參見，例如，WO 02/067861，WO 01/02540)。
在靶細胞中選擇性復制的腺病毒載體的情況中，已經(jīng)發(fā)展了特異的削弱有能力復制型病毒載體用于在癌細胞中選擇性復制優(yōu)選破壞那些細胞。在例如，WO 95/19434、WO 96/17053、WO 98/39464、WO98/39465、WO 98/39467、WO 98/39466、WO 99/06576、WO 99/25860、WO 00/15820、WO 00/46355、WO 02/067861、WO 02/06862，美國專利申請公開US20010053352和美國專利US5,698,443、US5,871,726、US5,998,205和US6,432,700中，描述了優(yōu)選在某些細胞類型中復制(并且因此破壞)的各種細胞特異性有能力復制型腺病毒結構。已經(jīng)設計有能力復制型腺病毒載體以便在腫瘤細胞中選擇性地復制。
靶細胞可以是某一細胞類型、組織類型或具有某一細胞狀態(tài)。在美國專利號US5,998,205、US5,846,945、US5,801,029和PCT公開WO95/19434、WO 98/39465、WO 98/39467、WO 98/39466、WO 99/06576、WO 98/39464和WO 00/15820中，進一步描述了在本發(fā)明的組合物和方法中發(fā)現(xiàn)實用性的復制特異型病毒實例。
術語“復制條件病毒”、“優(yōu)選復制病毒”、“特異復制病毒”和“選擇性復制病毒”是可互換使用的術語，并且是優(yōu)選在某些類型的細胞或組織但在較小程度或根本不在其它類型中復制的有能力復制型病毒載體和顆粒。在本發(fā)明的一個實施方式中，病毒載體和/或顆在腫瘤細胞和/或異常增殖組織如實體瘤和其它贅生物中粒選擇性復制。這樣的病毒可稱為是“溶瘤病毒”或“溶瘤載體”并且可認為是“溶細胞的”或“至細胞病變的”和影響靶細胞的“選擇性細胞溶解”。
“優(yōu)選復制”和“選擇性復制”和“特異復制”可互換使用并且是指病毒在靶細胞中的復制多于在非靶細胞中復制。在靶細胞中病毒復制的速率高于在非靶細胞中，例如至少高約3倍高、至少高約10倍、至少高約50倍、和在有些情況下至少高約100倍、400倍、500倍、1000倍或甚至1×106倍。在一個實施方式中，病毒僅在靶細胞中復制(也就是，在非靶細胞中根本不復制或以很低的水平復制)。
在本發(fā)明的另一實施方式中，腺病毒載體包括E1B 19-kDa區(qū)的部分或全部的缺失。在一個實施方式中，腺病毒載體包括除E1b 19kDa編碼序列的全部或部分缺失外的全部E1編碼序列。該缺失導致E1b 19kDa蛋白質未被表達或該蛋白質是非功能的。腺病毒E1B 19-kDa區(qū)是指編碼E1B 19kDa產(chǎn)物的腺病毒E1B基因的基因組區(qū)。根據(jù)野生型Ad5，E1B 19-kDa區(qū)是位于在核苷酸(nt)1714和nt 2244之間的一個261bp區(qū)域。已經(jīng)在例如Rao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，897742-7746頁中描述了E1B 19-kDa區(qū)。本發(fā)明包括E1B 19-kDa區(qū)的部分或全部缺失以及E1B 19-kDa區(qū)突變的實施方式，只要該缺失或突變減少或除去與E1B 19-kDa有關的細胞程序性死亡的抑制。
在本發(fā)明的一個實施方式中，嵌合纖維蛋白包括在所述的與CD46結合的腺病毒，例如Ad35頭的至少一部分中的異源氨基酸序列(例如配體)。在本發(fā)明的一些實施方式中，異源氨基酸序列位于與CD46結合的腺病毒例如Ad35頭的至少一部分的HI環(huán)中或C末端。
在本發(fā)明的一個實施方式中，腺病毒包括復制必要的腺病毒編碼序列的缺失。在一個實施方式中，復制缺陷腺病毒具有在以下區(qū)E1a、E1b、E2a、E2b和E4中的至少一個區(qū)中的至少一個缺失。在一個實施方式中，在原發(fā)腫瘤細胞中腺病毒為無能力復制型。
在本發(fā)明的一些實施方式中，腺病毒載體包括至少一個腺病毒E3編碼序列的缺失。在一個實施方式中，該至少一個腺病毒E3編碼序列選自19K、14.7K、14.5K、12.5K、11.6K、10.4K和6.7K E3蛋白質的編碼序列。在一個實施方式中，全部E3編碼序列被除去和/或突變以致相應蛋白質未被表達或為非功能性的。在一個實施方式中，腺病毒包括10.4K、14.5K和14.7K的E3編碼序列。在一個實施方式中，全部天然E3編碼序列被保留在載體中。
在本發(fā)明的實施方式中，腺病毒載體優(yōu)選在癌細胞中復制，通過比較在癌靶細胞中的復制水平(例如，細胞殺傷和/或滴度)與在非靶細胞如正常或對比細胞中的復制水平，表明其復制偏好。靶癌細胞中的腺病毒滴度和在非靶細胞類型的滴度的比較，提供了在靶細胞中總的復制偏好是增強的和/或在非靶細胞中復制是降低的關鍵指標。
在本發(fā)明的一個方面中，腺病毒載體包含基因間IRES元件，其連接兩個或多個編碼序列的翻譯。連接編碼區(qū)可以是兩個腺病毒編碼區(qū)、兩個轉基因編碼區(qū)或一個腺病毒編碼區(qū)和一個轉基因編碼區(qū)。
包含連接兩個腺病毒編碼區(qū)的IRES的腺病毒載體是穩(wěn)定的并且在一些實施方式中提供了比不含IRES的載體更好的特異性。含基因間IRES的腺病毒載體的另一優(yōu)點為使用IRES而不是第二異源轉錄調控元件(TRE)可提供用于額外基因如治療基因載體中的額外間隔。在US6,692,736中描述了含IRES的腺病毒載體的實例。在本發(fā)明的一個方面中，在本文中公開的病毒載體通常包含多順反子轉錄物內(nèi)的至少一個IRES，其中該多順反子轉錄物的產(chǎn)量通過異源的靶細胞特異TRE調節(jié)。對于在IRES控制下包含第二腺病毒編碼區(qū)的腺病毒載體，優(yōu)選將在IRES翻譯控制下的第二編碼區(qū)的內(nèi)源啟動子除去，使內(nèi)源啟動子不妨礙第二編碼區(qū)的轉錄。如果IRES包含起始密碼子，優(yōu)選第二編碼區(qū)與IRES一起在框(frame)內(nèi)。如果起始密碼子，如ATG，在IRES中，優(yōu)選將第二編碼序列的起始密碼子除去并且該IRES和第二編碼序列在框中?；蛘?，如果IRES不含起始密碼子或如果將起始密碼子從IRES中除去，使用第二編碼區(qū)的起始密碼子。在一個實施方式中，在異源TRE和引入E1A和E1B之間的IRES的轉錄控制下，腺病毒載體包含腺病毒必要的基因、E1A和E1B基因，。因此，E1A和E1B均在普通轉錄控制之下，并且由于IRES的存在可獲得E1B編碼區(qū)的翻譯。在一個實施方式中，E1A的內(nèi)源啟動子被除去。在另一實施方式中，E1A的一個內(nèi)源增強子被除去并且在還有另外實施方式中，將E1A的內(nèi)源啟動子和E1A增強子除去。在另一實施方式中，E1B的內(nèi)源啟動子被除去。在進一步的實施方式中，E1B具有E1B的19-kDa區(qū)的部分或全部的缺失。
在用于腫瘤消解腺病毒平臺的優(yōu)選實施方式中，包含自加工切割序列如2A或2A類序列的雙順反子或多順反子盒包括腺病毒早期病毒基因(E1A、E1B、E2、E3、和/和或E4)或在病毒生活周期的后期表達的基因(纖維、五鄰體和六鄰體)。
在某些情況中，由于例如癌靶細胞的相當難治的屬性或特殊的侵占性，也許增強細胞毒素活力的程度和/或速率是合乎需要的。對細胞毒性有貢獻的病毒基因的實例包括，但不局限于，腺病毒死亡蛋白(ADP)基因。在本文公開的另一實施方式中，腺病毒包括在其內(nèi)源啟動子中具有缺失或其內(nèi)源啟動子缺少的E1B基因。在本文公開的其它實施方式中，E1B的19kDa區(qū)被除去。
為了向靶細胞提供增強的細胞毒性，載體中可存在具有細胞毒素作用的一個或多個轉基因。另外，或者，任意地在異源TRE的選擇性轉錄控制下和任意地在IRES或自加工切割序列如2A或2A類序列的翻譯控制下，可將對細胞毒性和/或細胞死亡有貢獻的腺病毒基因，如腺病毒死亡蛋白(ADP)基因，被包含于載體內(nèi)。這可通過耦合靶細胞特異細胞毒素活性與異源基因或轉基因的細胞特異的表達來完成。
本發(fā)明的示例腺病毒載體包括，但不局限于，DNA、包封在腺病毒殼內(nèi)的DNA、包裝于另一個病毒或病毒狀形式(如單純皰疹和AAV)的腺病毒DNA、包封在脂質體內(nèi)的腺病毒DNA，與聚賴氨酸復合的腺病毒DNA，與合成聚陽離子分子復合的且與運鐵蛋白共軛或與化合物如PEG復合以免疫地“掩蓋”抗原性和/或增加半壽期的或與非病毒蛋白共軛的腺病毒DNA。
腺病毒載體顆粒還可包括如下所述的對纖維蛋白的進一步修飾。在一個實施方式中，本發(fā)明的腺病毒載體進一步包括包含于顆粒衣殼蛋白的靶配體。對于靶腺病毒的實例，參見實例WO 00/67576、WO 99/39734、US6,683,170、US6,555,368、US5,922,315、US5,543,328、US5,770,442和US5,846,782。
此外，本發(fā)明的腺病毒載體還可以包含對其它病毒衣殼蛋白的修飾。這些突變的實例包括，但不局限于在美國專利US5,731,190、US6,127,525、和US5,922,315中描述的那些。在美國專利US6,057,155、US5,543,328和US5,756,086中描述了其它的修飾腺病毒。
“E3區(qū)”(可與“E3”互換使用)是一個在現(xiàn)有技術中容易理解的術語并且是指編碼E3基因產(chǎn)物的腺病毒基因組區(qū)。在各種公開物，包括例如Wold等(1995)Curr.Topics Microbiol.Immunol.199237-274頁中已對E3區(qū)進行了描述。E3區(qū)的“部分”是指小于整個E3區(qū)，并且還包括多核苷酸缺失以及編碼E3區(qū)的一種或多種多肽產(chǎn)物的多核苷酸。
可以生成含E3區(qū)的腺病毒結構，其中進行含E3腺病毒質粒例如BHGE3(Microbix Biosystems Inc.，Toronto)和不含E3腺病毒質粒之間的同源重組。
或者，可將含E3區(qū)的腺病毒載體與腺病毒結構或腺病毒質粒結構一起引入細胞(例如293細胞)中，在此，它們可進行同源重組以產(chǎn)生含E3區(qū)的腺病毒。在這種情況中，含E3腺病毒載體和腺病毒結構或質粒結構包括具有足夠序列重疊以允許同源重組的腺病毒的互補區(qū)，例如，一個含左手區(qū)而另一個含右手區(qū)。
或者，本發(fā)明的含E3腺病毒載體可利用其它常規(guī)方法包括標準重組方法(例如，利用限制性核酸酶和/或PCR)、化學合成、或這些方法的任何組合來構建。進一步，可使用分子生物學的標準技術來形成E3區(qū)的部分缺失。
在一些實施方式中，在腺病毒載體中保存了E3區(qū)內(nèi)部編碼的腺病毒死亡蛋白(ADP)。在主要的晚期啟動子(MLP)的控制下，ADP基因似乎對加速宿主細胞溶解中重要的蛋白質(ADP)進行編碼。Tollefson等(1996)J.Virol.70(4)2296頁；Tollefson等(1992)J.Virol.66(6)3633頁。因此，含ADP基因的腺病毒載體可使腺病毒載體變得更有效，可以更有效地治療和/或降低劑量要求。
在一個實施方式中，有能力復制型載體包括在選擇性TRE的轉錄控制下復制必要的基因。在一個實施方式中，腺病毒載體是含E1B的有能力復制型癌特異性載體，其中E1B具有部分或全部的19-kDa區(qū)的缺失。在本發(fā)明的實施方式中，復制必要的腺病毒基因是早期基因，例如，E1A、E1B、E2a、E2b和E4中的一個或多個。在進一步的實施方式中，一個或多個附加的TRE可與一個或多個復制必要的腺病毒基因或轉基因，例如，治療基因形成有效連接。
腺病毒載體可以進一步包括附加的異源TRE，其可以或不可以與靶細胞特異TRE相同的基因有效連接。例如，TRE(如細胞型特異的或細胞狀態(tài)特異的TRE)可與靶細胞特異性TRE的第二類型并列?！安⒘小笔侵赴屑毎禺愋訲RE和第二TRE轉錄控制相同的基因。對于這些實施方式，靶細胞特異TRE和第二TRE可以是許多排列的任何一種，包括但不局限于，(a)彼此緊挨(也就是鄰接的)；(b)兩個TRE的5′朝向被轉錄控制的基因(也就是它們之間可以具有間插序列)；(c)一個TRE的5′和另一個TRE的3′朝向基因。
轉錄調控元件轉錄調控元件(TRE)，以及用于它們的鑒別、分離、表征、遺傳操作的方法和調節(jié)有效連接的編碼序列的用途，在現(xiàn)有技術中是已知的。TRE可來源于單基因的轉錄調節(jié)序列，可結合來自不同基因的序列產(chǎn)生有功能TRE，或可以合成生成TRE(例如CTP4啟動子)。
根據(jù)存在于組織或腫瘤中的細胞類型，TRE可以是組織特異性的、腫瘤特異性的、發(fā)育階段特異性的、細胞狀態(tài)特異性的等等。在本文中，這種TRE一起稱為組織特異性的或靶細胞特異性的TRE。如下更詳細的描述，靶細胞特異性TRE可包括許多結構，包括但不局限于，靶細胞特異性啟動子和靶細胞特異性增強子；異源啟動子和靶細胞特異性增強子；靶細胞特異性啟動子和異源增強子；異源啟動子和異源增強子；和上述的多聚體。靶細胞特異性TRE的啟動子和增強子組分可在所關心的編碼序列的任何方向和/或任何距離，只要獲得所需靶細胞特異性轉錄活性。
在現(xiàn)有技術中許多已知的方式可以測定轉錄激活，但是通常在靶細胞特異性TRE控制下(也就是，有效連接)通過mRNA或編碼序列的蛋白產(chǎn)品的檢測和/或定量來測定。
如本文中的進一步描述，靶細胞特異性TRE可以是變化長度，和變化序列組合。靶細胞特異性TRE優(yōu)選在限定居群(或類型)的細胞中起作用，例如，前列腺細胞、肝細胞、黑素瘤細胞等。相應地，在一些實施方式中，使用的TRE優(yōu)選在任何以下組織類型中起作用前列腺；肝臟；乳房；尿道(膀胱)；結腸；肺；卵巢胰腺；胃和子宮。
如本領域技術人員理解的那樣，TRE是多核苷酸序列，并且同樣地，可在各種序列置換上顯示功能。核苷酸替代、添加和缺失的方法在現(xiàn)有技術中是已知的，并且，容易得到的功能分析(如CAT或瑩光素酶報道者的基因分析)允許本領域技術人員測定序列變異是否顯示必要的細胞特異性轉錄調節(jié)功能。因此，本文公開的載體中可使用TRE的功能保守變異，包括核酸替代、添加、和/或缺失。相應地，變異的TRE保留了靶細胞中的功能但是不需要顯示最大功能。事實上，TRE的最大轉錄激活活性可以并不總是獲得所需結果所必需的，并且通過TRE片段提供的誘導水平對某些應用是足夠的。例如，如果用于疾病狀態(tài)的治療或減緩，少于最大的應答是足夠的，如果例如靶細胞不是特別致命和/或疾病的程度是相對限制的。
某些堿基修飾可引起增強的表達水平和/或細胞特異性。例如，如現(xiàn)有技術中所知，TRE內(nèi)部的核酸序列缺失或添加可移動轉錄調節(jié)蛋白結合部位使它們比正常構型狀態(tài)彼此離的更近或更遠，或旋轉它們使其位于DNA螺旋的對側，由此改變TRE結合轉錄因子中的空間關系，引起轉錄的減少或增加。因此，雖然不希望受理論的束縛，本公開內(nèi)容預期TRE的某些修飾會引起如TRE引導的調節(jié)表達水平，包括增強的細胞特異性的可能性。就贅生增長的更強侵入形式時，和/或當證明細胞致死的更快和/或侵入模式(例如，在無免疫應答主體中)時而論，增強表達水平的完成可能特別合乎需要。
用于本發(fā)明的載體的TRE可包括或不包括沉默子。沉默子(也就是現(xiàn)有技術中已知的負調控元件)的存在可幫助切斷非靶細胞中的轉錄(和因此的復制)。因此，通過更有效地阻止非靶細胞中的復制，沉默子的存在可以賦予增強的細胞特異性載體復制?；蛘?，沉默子的缺少可促進靶細胞中的復制，因此賦予增強的靶細胞特異性。
TRE引導的轉錄活性(包括抑制和增強)可用現(xiàn)有技術中已知的多種方法(并在下文更詳細地描述)測定，但是通常通過mRNA和/或通過TRE控制下(也就是，有效連接)的序列編碼的蛋白產(chǎn)物的檢測和/或定量來測定。
如本文中所描述，TRE可以變化長度，和變化序列組合。異源TRE的大小部分由病毒載體的容量確定，其又取決于載體的預期形式。對于TRE通常優(yōu)選最小尺寸，因為這提供潛在空間用于所需要的其它序列(如轉基因和/或附加的調控序列)的插入。在一個實施方式中，這樣的附加調控序列是自加工切割序列如2A或2A類序列。
舉例來說，腺病毒載體可以用總計高達約基因組大小的105％，或大約1.8kb，不需要病毒序列缺失的附加序列包裝。如果將非必要序列從腺病毒基因組中除去，可以允許額外4.6kb的插入(也就是，約6.4kb的總插入量)。
就有能力復制型腺病毒載體而言，為了使非特異性復制減到最小，優(yōu)選將內(nèi)源(腺病毒)TRE(也就是，天然的E1A和/或E1B啟動子)從載體中除去。除了促進靶細胞特異性復制之外，內(nèi)源TRE的除去還為載體提供更大的插入量，如果腺病毒載體是被包裝在病毒顆粒內(nèi)其具有特異的影響。甚至更重要地，內(nèi)源TRE的缺失阻止了借以除去異源TRE的重組事件的可能性并且內(nèi)源TRE承擔了其各自腺病毒編碼序列的轉錄控制(因此允許非特異性的復制)。在一個實施方式中，腺病毒載體被如此構造以使得一個或多個腺病毒基因的內(nèi)源轉錄控制序列被刪除并且由一個或多個異源TRE替代。然而，只要保持了足夠的細胞特異性復制優(yōu)選，可將內(nèi)源TRE保存在腺病毒載體中。通過在內(nèi)源TRE和復制需要的基因編碼片段之間插入異源TRE構建這些實施方式。通過比較提供異源TRE的功能的細胞中的腺病毒載體的復制與不提供異源TRE的功能的細胞中的復制的傳導分析，確定必要的細胞特異性復制偏愛。
在一些實施方式中，與在無TRE的情況下復制的堿基水平相比，在靶細胞中，TRE增加至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約400到約500倍、至少約1000倍的載體復制?？山邮艿牟町惪梢詰{經(jīng)驗測定(通過使用，例如RNA印跡分析、核糖核酸酶保護分析或現(xiàn)有技術中已知的其它分析測定mRNA的水平)并取決于載體的預期用途和/或所需結果。
可利用靶細胞中優(yōu)選起作用的TRE產(chǎn)生在特異性靶細胞引入的腺病毒載體。在本發(fā)明的一個實施方式中，靶細胞特異性或細胞狀態(tài)特異性、異源TRE為腫瘤細胞特異性的。載體可包括單個腫瘤細胞特異性TRE或腫瘤細胞特異性的并且在相同細胞中起作用的多倍異源TRE。在另一實施方式中，載體包括一個或多個腫瘤細胞特異性的異源TRE并且另外包括一個或多個組織特異性的異源TRE，憑此所有的TRE在同樣的細胞中起作用。
在一個實施方式中，對于腫瘤消解腺病毒平臺，含自加工切割序列如2A或2A類序列的雙順反子或多順反子盒包括腺病毒早期病毒基因(E1A、E1B、E2、E3、和/或E4)或在病毒生活周期的后期表達的基因(纖維、五鄰體和六鄰體)。
在某些情況中，由于例如癌靶細胞的相對難治愈的屬性或特別的侵略性，增強細胞毒素活性的程度和/或速率可合乎需要。對細胞毒性有貢獻的病毒基因的實例包括，但不局限于，腺病毒死亡蛋白質(ADP)基因。在本文公開的另一實施方式中，腺病毒包括在其內(nèi)源啟動子中具有缺失或內(nèi)源啟動子缺失的腺病毒E1B基因。在本文公開的其它實施方式中，E1B的19kDa編碼區(qū)包括部分或全部缺失，使得該19kDa蛋白質不被表達或是無功能的。
為了向靶細胞提供增強的細胞毒性，具有細胞毒素作用的一個或多個轉基因可存在于載體中。另外，或者，任意地在異源TRE的選擇性轉錄控制下和任意地在IRES或自加工切割序列如2A或2A類序列的翻譯控制下，對細胞毒性和/或細胞死亡有貢獻的腺病毒基因，如腺病毒死亡蛋白質(ADP)基因，可被包含于載體內(nèi)。這可通過耦合靶細胞特異細胞毒素的活性與異源基因或轉基因的細胞特異的表達來完成。
如下進一步所述，可將許多異源治療基因或轉基因的任何一種包含于本發(fā)明的有能力復制型病毒載體中。
通常，將如前所述的雙順反子或多順反子盒放置在轉錄反應元件的控制之下，通常細胞型或細胞狀態(tài)與在癌或腫瘤細胞中優(yōu)先表達的轉錄調控元件有關。相應地，包含于指定結構的治療基因會根據(jù)治療中的癌的類型變化。
如在現(xiàn)有技術中已知，TRE的活性是可誘導的。可誘導的TRE在無誘導物的情況下通常顯示低的活性，并且在誘導物存在的情況下為正調節(jié)。誘導物包括，例如，核酸、多肽、小分子、有機化合物和/或環(huán)境條件如溫度、壓力或低氧。當表達僅在某些時刻或在某些位置符合需要時候，或當利用誘導劑滴定表達水平合乎需要時，可優(yōu)選可誘導的TRE。例如，PSE-TRE、PB-TRE和hKLK2-TRE的轉錄活性被雄激素誘導，如本文中和PCT/US98/04080所描述，特意引入本文作為參考。相應地，在本發(fā)明的一個實施方式中，腺病毒載體包括可誘導的異源TRE。
如本發(fā)明中所使用的TRE可以存在各種構型。TRE可包括多聚體。例如，TRE可包括至少兩個、至少三個、至少四個或至少五個靶細胞特異性TRE的串聯(lián)系列。這些多聚體還可包括異源啟動子和/或增強子序列。或者，TRE可包括連同一個或多個增強子區(qū)一起的一個或多個啟動子區(qū)。TRE多聚體還可以包括來自不同基因的啟動子和/或增強子序列。TRE的啟動子和增強子組分可位于與彼此有關的任何方向和在任何方向和/或在在離有關的編碼序列的任何距離，只要獲得所需靶細胞特異性轉錄活性。
在一個實施方式中，腺病毒優(yōu)先在腫瘤細胞中復制。在一個實施方式中，腺病毒包括與復制必要的至少一個腺病毒編碼序列有效連接的TRE。TRE包括，但不局限于細胞特異性TRE、細胞狀態(tài)特異性TRE和組織特異性TRE?？捎糜诒景l(fā)明的特異性TRE的實例包括，但不局限于，PSA TRE、E2F TRE、端粒酶(TERT)TRE、尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)TRE、尿激酶纖溶酶原激活物受體(uPAR)TRE、PRL-3蛋白酪氨酸磷酸酶TRE。本發(fā)明還期望利用TRE的組合。復制必要的腺病毒編碼序列可以與一個以上的異源TRE有效連接。或者，另外，一個以上的復制必要的腺病毒編碼序列可與一個或多個異源TRE有效連接。復制必要的腺病毒編碼序列的實例是位于E1a、E1b、E2a、E2b和E4區(qū)的編碼序列。復制必要的多編碼區(qū)可以與一個TRE或TRE的組合例如與IRES有效連接。在一個實施方式中，至少一個異源TRE與復制必要的第一腺病毒編碼序列有效連接，其中第一腺病毒編碼序列還與IRES有效連接并且所述IRES同樣與復制必要的第二腺病毒編碼序列連接。例如，至少一個異源TRE與E1a編碼區(qū)的編碼序列有效連接，并且這些E1a編碼序列還與下游的IRES有效連接，其中該IRES還與E1b區(qū)的編碼序列有效連接。
如在本文中所使用的，來源于特異基因的TRE相當于其來源的基因并且是調節(jié)表達該基因的宿主細胞中的有效連接的多核苷酸序列轉錄的多核苷酸序列。例如，如在本文中所使用的，“人類腺激肽釋放酶轉錄調控元件”，或“hKLK2-TRE”是多核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列，其增加在允許hKLK2-TRE起作用的宿主細胞中的有效連接的多核苷酸序列的轉錄，如表達雄激素受體的細胞(優(yōu)選哺乳動物細胞，更優(yōu)選人類細胞)，如前列腺細胞。因此，hKLK2-TRE對雄激素受體的結合應答并且包括hKLK2啟動子和/或hKLK2增強子(也就是，ARE或雄激素受體結合部位)的至少一部分。在WO99/06576中描述了人類腺激肽釋放酶增強子和包含增強子的腺病毒載體，特意引入本文中作為參考。
如在本文中所使用的，“probasin(PB)轉錄調控元件”或“PB-TRE”是多核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列，其選擇性增加在允許PB-TRE起作用的宿主細胞中有效連接的多核苷酸序列的轉錄，如表達雄激素受體的細胞(優(yōu)選哺乳動物細胞，更優(yōu)選人類細胞，甚至更優(yōu)選前列腺細胞)。因此PB-TRE對雄激素受體的結合應答并且包含PB啟動子和/或PB增強子(也就是，ARE或雄激素受體結合部位)的至少一部分。在WO98/39466中描述了對表達雄激素特異的細胞的腺病毒載體，特意引入本文中作為參考。
如在本文中所使用的，“前列腺特異性抗原(PSA)轉錄調控元件”，或“PSA-TRE”，或“PSE-TRE”是多核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列，其選擇性增加在允許PSA-TRE起作用的宿主細胞中的有效連接的多核苷酸序列的轉錄，如表達雄激素受體的細胞(優(yōu)選哺乳動物細胞，更優(yōu)選人類細胞，甚至更優(yōu)選前列腺細胞)。因此，PSA-TRE對雄激素受體的結合應答并且包含PSA啟動子和/或PSA增強子(也就是，ARE或雄激素受體結合部位)的至少一部分。在WO95/19434和WO97/01358中描述了在前列腺中有活性并在腺病毒載體中使用的組織特異性增強子，其中均特意引入本文中作為參考。
如在本文中所使用的，“癌胚抗原(CEA)轉錄調控元件”或“CEA-TRE”是多核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列，在允許CEA-TRE起作用的宿主細胞中其選擇性增加有效連接的多核苷酸序列的轉錄，如表達CEA的細胞(優(yōu)選哺乳動物細胞，甚至更優(yōu)選人類細胞)。CEA-TRE對轉錄因子和/或與產(chǎn)生CEA細胞有關的輔因子應答并且包含CEA啟動子和/或增強子的至少一部分。在WO98/39467中描述了對表達癌胚抗原特異的細胞的腺病毒載體，特意引入本文中作為參考。
如在本文中所使用的，“α-甲胎蛋白(AFP)轉錄調控元件”或“AFP-TRE”是多核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列，其選擇性增加在允許AFP-TRE起作用的宿主細胞中(有效連接的多核苷酸序列序列)的轉錄，如表達AFP的細胞(優(yōu)選哺乳動物細胞，甚至更優(yōu)選人類細胞)。AFP-TRE對轉錄因子和/或與生產(chǎn)AFP細胞有關的輔因子應答并且包含AFP啟動子和/或增強子的至少一部分。在WO98/39465中描述了表達α-甲胎蛋白特異的細胞的腺病毒載體，特意引入本文中作為參考。
如本文中所使用的，“粘蛋白基因(MUC)轉錄調控元件”或“MUCl-TRE”是多核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列，其選擇性增加在允許MUCl-TRE起作用的宿主細胞中的轉錄(有效連接的多核苷酸序列)，如表達MUCl的細胞(優(yōu)選哺乳動物細胞，甚至更優(yōu)選人類細胞)。MUCl-TRE對轉錄因子和/或與產(chǎn)MUCl細胞有關的輔因子應答并且包含MUC1啟動子和/或增強子的至少一部分。
如在本文中所使用的，“尿道上皮細胞特異性轉錄應答元件”或“尿道上皮細胞特異性TRE”是多核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列，其增加在允許尿道上皮特異性TRE起作用的宿主細胞中的有效連接的多核苷酸序列的轉錄，即靶細胞。已知的各種尿道上皮細胞特異性TRE，對與尿道上皮細胞有關細胞蛋白質(轉錄因子和/或輔因子)應答，并且包括尿道上皮特異性啟動子和/或尿道上皮特異性增強子的至少一部分。實例性的尿道上皮細胞特異性轉錄調控序列包括人類或嚙齒動物的uroplakin(UP)，例如，UPI、UPII、UPIII等。在WO 01/72994中描述了人類尿道上皮細胞特異性uroplakin轉錄調控序列和包含相同序列的腺病毒載體，特意引入本文中作為參考。
如在本文中所使用的，“黑素細胞特異性轉錄應答元件”或“黑素細胞特異性TRE”是多核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列，其增加在允許黑素特異性TRE起作用的宿主細胞中的有效連接的多核苷酸序列的轉錄，即靶細胞。已知各種黑素細胞特異性TRE，對與黑素細胞有關的細胞蛋白質(轉錄因子和/或輔因子)應答，并且包括黑素細胞特異性啟動子和/或黑素細胞特異性增強子的至少一部分。在本文中描述了用于測定黑素細胞特異性TRE活性和用于因此確定指定細胞是否允許黑素細胞特異性TRE起作用的方法。用于本發(fā)明實踐的黑素細胞特異性TRE的實例包括但不局限于來源于酪氨酸酶基因、酪氨酸酶關聯(lián)蛋白-1基因的5′旁側區(qū)的TRE，來源于酪氨酸酶關聯(lián)蛋白-2基因的5′-旁側區(qū)的TRE，來源于MART-1基因的5′旁側區(qū)的TRE或來源于黑素瘤中異常表達的基因的5′-旁側區(qū)的TRE。
在另一個方面中，本發(fā)明提供包含來源于與腺病毒復制必要的基因或轉基因有效連接的PRL-3基因的轉移性結腸癌特異性TRE的腺病毒載體。如在本文中所使用的，“來源于PRL-3基因的轉移性結腸癌特異性TRE”或“PRL-3 TRE”是多核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列，其選擇性增加在允許PRL-3 TRE起作用的宿主細胞中的有效連接的多核苷酸序列的轉錄，如細胞(優(yōu)選哺乳動物細胞，更優(yōu)選人類細胞，甚至更優(yōu)選轉移性的結腸癌細胞)。轉移性結腸癌特異性TRE可以包括一個或多個調控序列，例如增強子、啟動子、轉錄因子結合部位等，其可以來源于相同或不同的基因。在一個優(yōu)選方面中，PRL-3 TRE包含PRL-3啟動子。在WO04/009790中，描述了來源于用于PRL-3基因的翻譯起始密碼子的0.6kb序列上游的一個優(yōu)選PRL-3TRE，特意引入本文中作為參考。
在另一個方面中，本發(fā)明提供包含來源于與腺病毒復制必要的基因或轉基因有效連接的CRG-L2基因的肝癌特異性TRE的腺病毒載體。如在本文中所使用的，“來源于CRG-L2基因的肝癌特異性TRE”或“CRG-L2TRE”是多核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列，其選擇性增加在允許CRG-L2起作用的宿主細胞中的有效連接的多核苷酸序列的轉錄，如細胞(優(yōu)選哺乳動物細胞，更優(yōu)選人類細胞，甚至更優(yōu)選肝細胞癌細胞)。肝細胞癌特異性TRE可以包括一個或多個調控序列，例如增強子、啟動子、轉錄因子結合部位等，其可以來源于相同或不同的基因。在一個優(yōu)選方面中，CRG-L2 TRE可以來源于用于CRG-L2基因的翻譯起始密碼子的0.8kb序列上游，或來自包含于0.8kb序列(殘基119-803)內(nèi)的0.7kb序列；或來自來源于0.8kb序列的EcoRI到NcoI片段，如在美國臨時申請US60/511,812中的描述，特意引入本文中作為參考。
在另一個方面，本發(fā)明提供包含與腺病毒復制必要的基因或轉基因有效連接的EBV特異性轉錄調控元件(TRE)的腺病毒載體。在一個方面中，EBV特異性TRE來源于LMP1、LMP2A或LMP2B基因的翻譯起始密碼子的序列上游，如在美國臨時申請US60/423,203中的進一步描述，特意引入本文中作為參考。EBV特異性TRE可以包括一個或多個調控序列，例如增強子、啟動子、轉錄因子結合部位等，其可以來源于相同或不同的基因。
然而在另一方面中，本發(fā)明提供包含與腺病毒復制必要的基因或轉基因有效連接的低氧應答元件(“HRE”)的腺病毒載體。HRE是包含轉錄復合物HIF-I、或低氧可誘導因子-1的結合部位的轉錄調控元件，其與調節(jié)區(qū)中的幾個基因，包括血管內(nèi)皮細胞生長因子、和幾個編碼糖解酶包括烯醇酶-1的基因，相互作用。相應地，在一個實施方式中，在細胞狀態(tài)特異性TRE如HRE的轉錄控制下，腺病毒載體包含腺病毒基因，優(yōu)選復制必要的腺病毒基因，如在WO 00/15820中進一步描述，特意引入本文中作為參考。
在還有另一方面中，本發(fā)明提供包含與腺病毒復制必要的基因或轉基因有效連接的“端粒酶啟動子”或“TERT啟動子”的腺病毒載體。如在本文中使用的術語“端粒酶啟動子”或“TERT啟動子”是指天然的TERT啟動子和功能片段、突變及其衍生物。TERT啟動子不必是全長的或野生型啟動子。本領域技術人員知道如何從TERT啟動子獲得片段并且選擇性地測試它們。本發(fā)明的TERT啟動子片段具有為腫瘤細胞選擇的啟動子活性，也就是使有效連接的編碼序列的腫瘤選擇性表達。在一個實施方式中，本發(fā)明的TERT啟動子是哺乳動物的TERT啟動子。在另一實施方式中，哺乳動物的TERT啟動子是人類的TERT(hTERT)啟動子。參見，WO98/14593和WO 00/46355，例如，示例性的TERT啟動子在本發(fā)明的組合物和方法中發(fā)現(xiàn)實用性。
然而在另一方面中，本發(fā)明提供包含與腺病毒復制必要的基因或轉基因有效連接的“E2F啟動子”的腺病毒載體。如在本文中使用的術語“E2F啟動子”是指天然的E2F啟動子和功能片段、突變及其衍生物。E2F啟動子不必是全長的或野生型啟動子。本領域技術人員知道如何從E2F啟動子獲得片段并且選擇性地測試它們。本發(fā)明的E2F啟動子片段具有腫瘤細胞的啟動子活性選擇，也就是使有效選擇的編碼序列的腫瘤選擇性表達。在現(xiàn)有技術中已知許多E2F啟動子的實例。參見，例如，Parr等Nature Medicine 19973(10)1145-1149頁，WO 02/067861、US20010053352和WO 98/13508。
蛋白尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)及其細胞表面受體，尿激酶纖溶酶原激活物受體(uPAR)在許多經(jīng)常存在的贅生物中表達并且看來似乎代表癌轉移中的重要蛋白質。在乳房、結腸、前列腺、肝臟、腎、肺和卵巢癌中含有這兩種蛋白質。調節(jié)uPA和uPAR轉錄的序列成分已被廣泛研究。(Riccio等(1985)Nucleic Acids Res.132759-2771頁；Cannio等(1991)Nucleic Acids Res.192303-2308頁；同樣參見WO 98/39464)。
腺病毒載體的制備和產(chǎn)生產(chǎn)生用于插入序列表達的腺病毒載體的標準體系在現(xiàn)有技術中已知并且可從商業(yè)來源獲得，例如來自Clontech(Palo Alto，CA)(Clontechniques(2000年1月)10-12頁)的Adeno-XTM表達系統(tǒng)，來自Qbiogene(Carlsbad，CA)的AdenovatorTM腺病毒載體系統(tǒng)和AdEasyTM。
為了方便起見，提供腺病毒必要部分的質粒是可得到的。質粒pXC.l(McKinnon(1982)Gene 1933-42)包含Ad5的野生型左手末端。PBHG10(Bett等(1994)；Microbix Biosystems Inc.，Toronto)提供在一個在E3具有缺失的Ad5的右手末端。PBHG11提供更大的E3缺失，額外的0.3kb被刪除(Bett等1994)?；蛘撸琾BHGE3(Microbix Biosystems，Inc.)的使用提供具有E3全長的Ad5的右手末端。
為了處理早期基因，Ad5E1A的轉錄起始位點在病毒基因組的498處和E1A編碼片段的ATG起始位點在病毒基因組的560處。這個區(qū)可用于異源TRE的插入。
可通過使用聚合酶鏈式反應(PCR)引入限制性位點，在該處所使用的引物可局限于Ad5基因組，或可包括一部分攜帶Ad5基因組DNA的質粒。例如，在使用pBR322的情況下，引物可使用pBR322主鏈中的EcoRI位點和在Ad5的nt 1339處的XbaI位點。通過在兩個步驟進行PCR，在該區(qū)中心重疊的引物引入導致獨特的限制性位點的核苷酸序列改變，操作者可在該位點為異源TRE的插入作準備。
還可用類似的策略用于異源TRE成分的插入以便與E1B有效連接。Ad5的E1B啟動子由Sp1的單個高親合力識別位點和TATA盒組成。這個區(qū)從Ad5nt 1636延伸到1701。通過將細胞特異性異源TRE插入這個區(qū)，操作者可為E1B基因的細胞特異性轉錄作準備。通過使用由調節(jié)E1A的細胞特異性應答元件修飾的左手區(qū)，作為用于引入異源TRE以調節(jié)E1B的模板，產(chǎn)生的腺病毒載體取決于用于E1A和E1B表達的細胞特異性轉錄因子。在一些實施方式中，E1B的19kDa區(qū)的部分或全部被除去。
類似地，可將細胞特異性異源TRE插入E2基因的上游以使其表達細胞特異性。E2早期啟動子，在Ad5從約27050-27150繪圖，由一個主要的和一個次要的轉錄起始位點，后者約占該E2轉錄物的5％，兩個非規(guī)范的TATA盒、兩個E2F轉錄因子結合部位和一個ATF轉錄因子結合部位組成(對于E2啟動子結構的詳細述評參見Swaminathan等，Curr.Topicsin Micro.and Immunol.(1995)199(第三部分)177-194頁)。
E2晚期啟動子與由對鏈編碼的基因的編碼序列重疊并且因此不接受基因操作。然而，E2早期啟動子僅與對鏈上的編碼33kD蛋白的序列重疊了幾個堿基對。值得注意，SpeI限制性位點(Ad5位置27082)是上述33kD蛋白的部分終止密碼子并且方便地將主E2早期轉錄起始位點和TATA結合蛋白位點與上游轉錄因子結合部位E2F和ATF分開。因此，具有SpeI末端的異源TRE插入SpeI位點會打斷Ad5的內(nèi)源E2早期啟動子并會提供E2轉錄物的細胞特異性表達。
對于E4，必須利用腺病毒基因組的右手部分。E4轉錄起始位點主要在Ad5約nt 35605處，TATA盒在約nt 35631處和ORF I的第一AUG/CUG在約nt 35532處(Virtanen等(1984)J.Virol.51822-831)。將上述策略的任何一種用于其它基因，可將異源TRE引進轉錄起始位點的上游。對于在E4區(qū)具有異源TRE插入的全長腺病毒的構建，在這些蛋白質的合成中提供E4反式蛋白質以補充缺陷的W162細胞(Weinberg等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.805383-5386頁)中可進行共轉染和同源重組。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供腺病毒基因在第一TRE轉錄控制之下且編碼ADP的多核苷酸序列在第二TRE元件的控制下的腺病毒載體，并且其中優(yōu)選復制必要的腺病毒基因。編碼ADP的DNA序列和ADP的氨基酸序列可公開獲得。簡要地，利用現(xiàn)有技術中已知的技術，如PCR，從Ad中獲得ADP編碼序列。優(yōu)選，還可獲得Y前導序列(其是用于糾正晚期基因表達的重要序列)并將其與ADP編碼序列連接。然后，將ADP編碼序列(有或者沒有Y前導序列)引入腺病毒基因組，例如，在E3區(qū)(在該處ADP編碼序列由MLP驅動)。ADP編碼序列還可以在腺病毒基因組的其它位置插入，如E4區(qū)?；蛘撸珹DP編碼序列可與不同類型的TRE，包括但不局限于，其它病毒TRE有效連接。在一個實施方式中，本發(fā)明的載體具有與其天然TRE有效連接的ADP。
可利用現(xiàn)有技術標準的重組子技術制備本發(fā)明的病毒載體。在現(xiàn)有技術中，修飾有能力復制型或無能力復制型病毒載體的修飾方法為大家所熟知并且在本文中和本引用的公開物中描述。用于修飾腺病毒載體和克隆轉基因和期望的轉錄元件進入腺病毒的各種方法在本文中被描述并且是現(xiàn)有技術中的標準和眾所周知的。在現(xiàn)有技術中有各種含腺病毒基因組不同部分的質粒，包括含整個腺病毒基因組的質粒。在現(xiàn)有技術中(例如US20030104625)，還充分描述了這些質粒的構建。一旦選出用于修飾的位點，可用適當質粒進行該修飾。然后，通過例如同源重組或體外連接將該修飾引入全長腺病毒載體基因組。同源重組，例如，可發(fā)生在哺乳動物細胞(例如PerC6)或細菌細胞(例如E.CoIi，參見WO9617070)中。病毒載體基因組的操作可或另外包括眾所周知的分子生物學方法，包括，但不局限于，聚合酶鏈式反應(PCR)、PCR-SOEing和限制性內(nèi)切酶酶切消化。如果使用同源重組，兩個質粒會均分至少約500bp的序列重疊，盡管較小的重疊區(qū)會重組，但是通常具較低的效率。如果需要，可獨立操作每個質粒，繼之以在感受態(tài)的宿主中共轉染，提供適合腺病毒載體繁殖的互補基因。通常利用適當?shù)霓D導媒介，如陽離子脂質體或磷酸鈣，將質粒引入合適的宿主細胞(例如293、PerC.6、Hela-S3細胞)?；蛘?，還可以利用腺病毒基因組的右和左側部分的體外連接構建含腺病毒基因組所有的復制必要部分的重組腺病毒衍生物。Berkner等(1983)Nucleic Acid Research 116003-6020頁；Bridge等(1989)J.Virol.63631-638。
在現(xiàn)有技術中，用于病毒載體的“生產(chǎn)細胞”為大家所熟知(例如PCT/US98/04080)。生產(chǎn)細胞是腺病毒載體被輸送和腺病毒載體被復制并包裝入毒粒的細胞。優(yōu)選的包裝細胞是那些已經(jīng)設計成的限定可引起野生型腺病毒顆粒的同源重組的細胞。如果病毒載體有去除或失活的必需基因，則該生產(chǎn)細胞補充該失活基因?？捎脕砩a(chǎn)本發(fā)明的腺病毒顆粒的細胞包括人類胚腎細胞系293(Graham等，J Gen.Virol.3659-72頁(1977))、人類胚胎成視網(wǎng)膜細胞系PER.C6美國專利US5,994,128和US6,033,908；Fallaux等，Hum.Gene Ther.91909-1917(1998))、和人類子宮頸腫瘤源細胞系HeLa-S3(PCT申請US04/11855)?；蛘呋蛄硗?，生產(chǎn)細胞可表達在病毒載體中選擇性控制或失活的基因。本發(fā)明的一個實施方式包括含本發(fā)明的腺病毒載體的生產(chǎn)細胞。
嵌合腺病毒纖維蛋白腺病毒纖維蛋白在毒粒附著到細胞受體中起重要作用。在現(xiàn)有技術中，來自幾個不同的腺病毒血清型的纖維基因序列是已知的。將纖維蛋白分成三個結構域。保守N末端包含與五鄰體堿基聯(lián)系有關的序列以及核定位信號?？勺冮L度的桿狀“軸”包括一個15-氨基酸β結構的重復，重復的數(shù)目范圍從Ad3中的6個到Ad5中22個。包括序列TLWT的氨基酸的保守范圍標記軸中β結構的重復單位與球狀頭結構域之間界限。C末端頭結構域的大小范圍從用于Ad41的短纖維的157氨基酸殘基到Ad5纖維中的188殘基。纖維刺突是同源三體，并且每一毒粒有12個通過與五鄰體堿基復合物聯(lián)系附著的刺突。纖維蛋白必須能三聚化以便具有功能。三聚結構域可以是天然的結構域或異源的三聚結構域。
本發(fā)明中有用的嵌合腺病毒纖維包括亞型C腺病毒(例如Ad1、2、5和6血清型)軸區(qū)的至少一部分和頭區(qū)結合CD46的亞型B腺病毒(例如Ad3、7、11、14、16、21、35和50)的至少一部分。在一個實施方式中，全部軸區(qū)來自Ad2或Ad5以及全部頭區(qū)來自Ad35。在另一實施方式中，嵌合纖維包括亞型C腺病毒軸區(qū)的一部分和來自與CD46結合的腺病毒的頭區(qū)。結合CD46的纖維頭區(qū)包括，但不局限于，那些來源于Ad3的纖維頭區(qū)(Sirena等，J Virol.20045月；78(9)4454-62頁)、11、14、16、21、35、37和50。在另一實施方式中，嵌合纖維蛋白包括牛腺病毒軸結構域和來源于選自Ad3、7、11、14、16、21、35、37、50和亞型D腺病毒的腺病毒血清型的頭結構域的一部分。在另一實施方式中，嵌合纖維蛋白包括亞型C腺病毒軸區(qū)的一部分和亞型D腺病毒頭區(qū)的一部分。在以下的實例中，已經(jīng)證實具有含Ad2或Ad5軸和Ad35頭區(qū)的嵌合纖維的Ad2或Ad5衍生腺病毒載體比具有天然的Ad5或者Ad35纖維蛋白的相同的腺病毒載體更有效地轉導某些原發(fā)腫瘤細胞。本領域技術人員認識到在保留原發(fā)腫瘤細胞的增強轉導的同時，可對嵌合纖維蛋白進行進一步修飾。
GenBank AAA75331公開了Ad35纖維的序列。這是一個示范性的序列并且存在許多基因組變型(Flomenberg等，J.Infec.Dis.，155(6)1127-1134(1987))。在實施本發(fā)明中，來源于Ad35頭區(qū)的腺病毒蛋白的部分可以來自任何Ad35基因組變型。
本文給出現(xiàn)有技術中已知的Ad2、Ad5和Ad35序列信息并且提供相關指示，本領域技術人員可以將合適的Ad2或Ad5軸的部分與Ad35頭的部分結合起來以獲得腫瘤細胞尤其是原發(fā)腫瘤細胞的增強轉導。例如，本領域技術人員可以進行缺失與替代分析以確定如何結合各種序列部分。
在一個實施方式中，嵌合纖維蛋白包括完整的腺病毒血清型5(Ad5)纖維軸(SEQ ID NO2的47-399氨基酸)或完整的Ad2纖維軸(SEQ IDNO4的47-399氨基酸)。在另一實施方式中，嵌合纖維蛋白包括來自腺病毒血清型35纖維蛋白(SEQ ID NO6的46-132氨基酸)的頭區(qū)。在另一實施方式中，嵌合纖維蛋白包括完整的腺病毒血清型5(Ad5)纖維軸(SEQID NO2的47-399氨基酸)或完整的Ad2纖維軸(SEQ ID NO4的47-399氨基酸)和來自腺病毒血清型35纖維蛋白(SEQ ID NO6的46-132氨基酸)的頭區(qū)。在另一實施方式中，嵌合纖維蛋白包括來源于Ad2或Ad5纖維軸的序列部分和來源于Ad35頭區(qū)的序列部分。
在一個實施方式中，Ad5或Ad2軸區(qū)保留了KKTK序列(SEQ IDNO2或SEQ ID NO4的91-94氨基酸)。在另一實施方式中，天然的軸序列中的KKTK(SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的91-94殘基)序列被除去或突變。在一個實施方式中，Ad5軸保留KLGTGLSFD序列(SEQ IDNO2的376-384氨基酸)(Wu等，J Virol.20037月；77(13)7225-35頁)，Ad2軸保留KLGAGLSFD序列(SEQ ID NO4的376-384氨基酸)或該軸包括共有基序KLGXGLXFD/N(SEQ ID NO7；Wu等，2003)。在一個實施方式中，Ad5軸保留包括具有彈性結構域的第三重復軸區(qū)的GNLTSQNVTTVSPPLKKTK(SEQ ID NO2的76-94氨基酸)。在另一實施方式中，Ad35軸包括該軸的第三重復(GTLQENIRATAPITKNN)，其缺少與纖維的彈性有關的序列(SEQ ID NO6的76-92氨基酸)。
嵌合纖維蛋白質可以包括進一步的修飾，包括但不局限于減少病毒載體顆粒與一個特別的細胞型或超過一個細胞型的結合、增強病毒載體顆粒與一個特定的細胞型或超過一個細胞型的結合和/或減少對獸類中的腺病毒載體的免疫應答的修飾。這些修飾的實例包括，但不局限于在美國申請US10/403,337、WO 98/07877、WO 01/92299、WO 2003/62400和美國專利US5,962,311、US6,153,435、US6,455,314和Wu等(J Virol.2003年7月1日；77(13)7225-7235頁)中描述的那些。
非天然配體可以包含于HI環(huán)中或在嵌合纖維蛋白的羧基端。
自加工切割位點和2A類序列在本發(fā)明的另一個方面中，“自加工切割位點”(例如2A類序列)用來表達兩個來自于一個mRNA的多肽。“自加工切割位點”或“自加工切割序列”是指DNA或氨基酸序列，其中翻譯時，發(fā)生包含自加工切割位點的多肽的快速分子內(nèi)(cis)的切割，從而導致離散成熟蛋白或多肽產(chǎn)物的表達。這種“自加工切割位點”，還可稱為后翻譯或同翻譯加工切割位點，在本文中通過2A位點、序列或結構域舉例說明。如在本文中所用，“自加工肽”在本文中定義為編碼自加工切割位點或序列的DNA序列的肽表達產(chǎn)物，其在翻譯時，介導蛋白或含自加工切割位點的蛋白或多肽的快速分子內(nèi)切割，以產(chǎn)生離散成熟蛋白或多肽產(chǎn)物。據(jù)報道2A位點、序列或結構域通過修飾核糖體的活性以促進酯鍵的水解顯示翻譯作用，由此以允許離散的下游翻譯產(chǎn)物的合成進行的方式釋放來自翻譯復合物的多肽(Donnelly等。J Gen Virol.2001；5月；82(Pt 5)1013-25頁)?；蛘撸€據(jù)報道，2A位點、序列或結構域通過順時切割其C-末端以產(chǎn)生初級解聚產(chǎn)物來顯示“自我蛋白酶解”或“切割”(Furler；Palmenberg，Ann.Rev.Microbiol.44603-623頁(1990))。
由于其具有的介導多蛋白的有效處理的能力，已經(jīng)研究了2A序列的變種(Donnelly等，J.Gen.Virol.821027-1041(2001))。同系物和變種2A序列包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
包括編碼自加工切割序列的序列，如開放閱讀框之間的2A或2A類序列的載體結構，可進一步包括鄰近自加工切割序列的附加蛋白水解切割位點，以除去切割后包含自加工切割序列的氨基酸。術語“附加的蛋白水解切割位點”是指插入本發(fā)明的腺病毒載體鄰近的自加工切割位點的序列，如2A或2A類序列，并且提供通過自加工切割序列除去切割后剩余的附加氨基酸的方法。在本文中描述了示范性的“附加的蛋白水解切割位點”，并且包括，但不局限于，具有共有序列RXK(R)R的弗林蛋白酶切割位點。包含編碼自加工切割序列的序列，如開放閱讀框之間的2A或2A類序列并且可以進一步包含附加的蛋白水解切割位點的載體結構，在美國專利申請US10/831,302中進一步描述，特意引入本文中作為參考。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供用于除去殘留氨基酸的方法和用于相同表達的組合物。已經(jīng)設計了許多新結構以除去來自該蛋白C末端的附加氨基酸。弗林蛋白酶切割發(fā)生在切割位點的C末端，其具有共有序列RXR(K)R，其中X是任何氨基酸。在一個方面中，本發(fā)明提供通過利用選自被稱為羧肽酶(CPs)的酶中的一種酶，其包括，但不局限于羧肽酶D、E和H(CPD、CPE、CPH)除去來自蛋白C末端的新露出的堿性氨基酸殘基R或K。因為CPs能除去蛋白C末端的堿性氨基酸殘基，可通過CP除去所有來源于弗林蛋白酶切割位點的氨基酸殘基，專門包括堿性氨基酸R或K，如RKKR(SEQ ID NO25)、RKRR(SEQ ID NO26)、RRRR(SEQ ID NO27)等。
在本發(fā)明的一個實施方式中，自加工切割序列(例如2A或2A類序列)與腺病毒蛋白編碼區(qū)和轉基因有效連接。腺病毒蛋白CDS可以在該自加工切割位點的上游，而轉基因的下游?；蛘撸D基因CDS可以在該自加工切割位點的上游，而腺病毒蛋白CDS在下游。
多CDS可與自加工切割位點連接。在一個實施方式中，Ad CDS通過自加工切割位點有效連接到第一轉基因并且所述第一轉基因通過自加工切割位點有效連接到第二轉基因。在一個實施方式中，第一和第二轉基因編碼相同或不同的蛋白質。
轉基因本發(fā)明的載體可以包括一個或多個轉基因。以這種方法可將各種遺傳性能引入靶細胞中。
“細胞因子”或語法上的等價物，包括，而不局限于，局部起作用并且不在血液中循環(huán)的那些激素，以及，當根據(jù)本發(fā)明使用時，產(chǎn)生單一免疫應答的改變。細胞因子的定義中還包括引起單一免疫應答改變的粘著或輔助分子。因此，細胞因子的實例包括，但不局限于，IL-1(a或P)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、LIF、LT、TGF-P、y-IFN、a-IFN、P-IFN、TNF-a、BCGF、CD2或ICAM。如前所述的細胞因子以及其它可應用的免疫調節(jié)劑的描述可在“Cytokines and Cytokine Receptors”A.S.Hamblin，D.Male(編著)，牛津大學出版社，紐約，NY(1993))，或“Guidebook toCytokines and Their Receptors”N.A.Nicola(編著)，牛津大學出版社，紐約，NY(1995))中找到。在期待人類治療用途的情況下，細胞因子會優(yōu)選與人類形式的蛋白顯著相似或來源于人類序列(也就是，人類來源的)。在一個優(yōu)選實施方式中，轉基因是細胞因子如GM-CSF。
另外，當其被證明顯示對免疫系統(tǒng)具有類似活性時，具有與人類形式的IL-2、GM-CSF、TNF-a等相同的基本結構的同源物和/或氨基酸順序的其它哺乳動物的細胞因子，在本發(fā)明中是有用的。類似地，發(fā)現(xiàn)與任何特別細胞因子顯著相似但具有蛋白質序列的保守改變的蛋白質，同樣在本發(fā)明中有用。因此，可以在蛋白質序列中保守置換而不妨礙蛋白質分子的功能性，并且因此可產(chǎn)生如起本發(fā)明中的細胞因子的作用卻具有與目前已知序列稍微不同的氨基酸順序的蛋白質。這種保守置換通常包括以下置換甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。
最后，本申請中的單詞“細胞因子”的單數(shù)或者復數(shù)形式的使用沒有限制并且不應限定本發(fā)明和權利要求的解釋。除了細胞因子，粘著或輔分子或其組合，可單獨使用或與細胞因子結合使用。
粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是由成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、T細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子。已顯示這種細胞因子誘導粒細胞和巨噬細胞系的造血細胞的增長。另外，它還刺激樹突狀細胞的抗原加工和呈遞功能(presenting)，其是免疫系統(tǒng)的主要抗原呈遞細胞(APC)。動物模型實驗的結果已經(jīng)充分表明產(chǎn)生GM-CSF腫瘤細胞(也就是GVAX)能誘導對親代、非轉導腫瘤細胞的免疫應答。
GM-CSF增加了能促進強抗腫瘤應答的樹突狀細胞(DC)亞類的抗原呈遞能力(Gasson，Blood 1991年3月15日；77(6)1131-45；Mach等，Cancer Res.2000年6月15日；60(12)3239-46；Mach和Dranoff的綜述，Curr Opin Immunol.2000年10月；12(5)571-5)。參見，例如，Boon和Old，Curr Opin Immunol.1997年十月1；9(5)681-3)。期望腫瘤抗原標位對引流淋巴結中的T細胞的呈遞引起對腫瘤轉移的系統(tǒng)免疫應答。同樣，表達GM-CSF的輻射腫瘤細胞已表明起抗腫瘤激發(fā)的有效疫苗的作用(如在以下部分進一步描述的命名為“GVAX”)。由基因修飾細胞輸送的某些細胞因子的局部高濃度，已發(fā)現(xiàn)可引起腫瘤退化。(Abe等，J.Cane.Res.Clin.Oncol.121587-592頁(1995)；Gansbacher等，Cancer Res.507820-7825頁(1990)；Fomi等，Cancer and Met.Reviews 7289-309頁(1988))。PCT公開WO200072686描述了表達各種細胞因子的腫瘤細胞。
在本發(fā)明的一個實施方式中，腺病毒包含與用于原發(fā)腫瘤細胞中的表達的調控元件有效連接的GM-CSF編碼序列。在一個實施方式中，GM-CSF編碼序列編碼人類GM-CSF。或者，GM-CSF編碼序列可編碼鼠科動物GM-CSF。在一些實施方式中，GM-CSF編碼序列是一個cDNA序列(例如SEQ ID NO16)。換句話說，GM-CSF編碼序列不包括翻譯前在外拼接的內(nèi)含子序列。在另一實施方式中，GM-CSF編碼碼序列是基因組編碼序列(例如SEQ ID NO15)。換句話說，該編碼序列包括翻譯前在外拼接的至少一個天然GM-CSF內(nèi)含子。在一個實施方式中，GM-CSF編碼序列編碼SEQ ID NO14。在Genbank登記入冊號AF373868、AC034228、AC034216、M10663和NM000758中可找到GM-CSF編碼序列的其它實例。
在一個實施方式中，轉基因編碼一個標記。在另一個實施方式中，轉基因編碼一個細胞毒素蛋白質?？捎镁幋a細胞毒素蛋白的載體通過提高細胞毒素活性的速率可用來增強治療效能的程度。這可通過耦合調節(jié)的病毒復制及相應的選擇性細胞毒性和一個或多個代謝酶的表達來實現(xiàn)，這些酶例如HSV-tk、硝基還原酶、細胞色素P450或能使5-氟胞嘧啶(5-FC)代謝為化學治療劑5-氟尿嘧啶(5-FU)的胞嘧啶脫氨酶(CD)、羧酸酯酶(CA)、脫氧胞苷激酶(dCK)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、羧肽酶G2(CPG2；Niculescu-Duvaz等J Med Chem.2004年5月6日；47(10)2651-2658)、胸腺苷磷酸化酶(TP)、胸苷激酶(TK)或黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(XGPRT)。還可利用這類轉基因賦予旁觀者效應。
可包含于本發(fā)明的腺病毒載體中的轉基因的其他實例包括能啟動細胞程序性死亡的因子、反義或核糖酶，其連同其他性能可引導mRNAs編碼對細胞或病原體的增殖必要的蛋白質，如結構蛋白、轉錄因子、聚合酶等，病毒或其它致病蛋白，其中病原體細胞內(nèi)增生、細胞毒素蛋白，例如，白喉系列、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白等，編碼核酸酶(例如核糖核酸酶A)或蛋白酶(例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、羧肽酶等)的基因工程胞質變型的基因，趨化因子，如MCP3α或MIP-1、來源于病毒、細菌或哺乳動物細胞的成孔蛋白，融合基因、化療致敏基因和放射致敏基因。其它相關的基因包括細胞因子、抗原、跨膜蛋白等，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或flt3、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IFN-α、-β、-γ，TNF-α、-β，TGF-α、-β，NGF、MDA-7(黑素瘤分化相關基因-7，mda-7/白細胞介素-24)等。進一步的實例包括，促細胞凋亡基因如Fas、Bax、Caspase、TRAIL、Fas配體、氧化氮合酶(NOS)等；可引起細胞融合或促進細胞融合的熔合基因如V22、VSV等；腫瘤抑制基因如p53、RB、p16、p17、W9等；與細胞周期有關的基因和編碼抗血管生成蛋白的基因如內(nèi)抑制素、制管張素等。
盡管在本發(fā)明的實踐中可使用任何相關的基因或編碼序列，某些基因或其片段尤其合適。例如，編碼免疫原多肽、毒素、免疫毒素和細胞因子的編碼區(qū)在本發(fā)明的實踐中是有用的。這些編碼區(qū)包括上文中的那些編碼區(qū)和其他編碼區(qū)包括那些編碼以下的物質的編碼區(qū)促進與免疫細胞相互作用的蛋白質，如B7、CD28、MHC類I、MHC類II、TAPs，腫瘤相關抗原如來自MART-1、gp100(pmel-17)的免疫原序列，酪氨酸酶、酪氨酸酶關聯(lián)蛋白1、酪氨酸酶關聯(lián)蛋白2、促黑素細胞激素受體，MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE12、BAGE、GAGE、NY-ESO-1、β-連環(huán)蛋白、MUM-1、CDK-4、半胱氨酸天冬氨酸酶8、KIA 0205、HLA-A2R1701、α-甲胎蛋白、端粒酶催化的蛋白質、G-250、MUC-1、癌胚蛋白、p53、Her2/neu、磷酸丙糖異構酶、CDC-27、LDLR-FUT、端粒酶反轉錄酶、PSMA、阻斷抑制信號(CTLA4阻斷)的抗體的cDNA、趨化因子(MIP1α、MIP3α、CCR7配體和鈣網(wǎng)蛋白)，抗血管生成基因包括，但不局限于，編碼METH-1、METH-2、TrpRS片段、增殖蛋白關聯(lián)蛋白、催乳激素片段、PEDF、血管抑制素、胞外基質蛋白質和生長因子/細胞因子抑制劑的各種片段的基因；胞外基質蛋白質的各種片段包括，但不局限于，制管張素、內(nèi)抑制素、激肽原抑制素、纖維蛋白原-E片段、血小板反應蛋白、塔牡斯達丁(tumstatin)、卡斯達丁(canstatin)、靜息蛋白(restin)，生長因子/細胞因子抑制劑包括，但不局限于，VEGF/VEGFR對抗劑、sFlt-1、sF1k、sNRP1、血管生成素/tie對抗劑、sTie-2、趨化因子(IP-10、PF-4、Gro-β、IFN-γ(Mig)、IFNα、FGF/FGFR對抗劑(sFGFR)、Ephrin/Eph對抗劑(sEphB4和sephrinB2)、PDGF、TGFβ和IGF-1。適于本發(fā)明的實踐利用的基因可編碼酶(如例如，尿素酶、血管緊張肽原酶、凝血酶、金屬蛋白酶、氧化氮合酶、過氧化物歧化酶、過氧化氫酶及本領域技術人員所知的其他酶)，酶抑制劑(例如α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、細胞或病毒蛋白酶抑制劑、纖溶酶原激活物抑制劑-1、金屬蛋白酶的組織抑制劑等)，囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)(CFTR)蛋白、胰島素、營養(yǎng)不良蛋白、或類I或II的主要組織相容性復合體(MHC)抗原。同樣有用的是編碼可調整/調節(jié)相應基因表達的多肽、能抑制細菌、寄生物或病毒感染或其發(fā)育的多肽(例如，抗原多肽、抗原表位和通過競爭抑制天然蛋白質作用的反式顯性(transdominant)蛋白變型)、細胞程序性死亡誘導劑或抑制劑(例如，Bax、Bcl2、BclX及本領域技術人員所知其他物質)、細胞生長抑制劑(例如，p21、p16、Rb等)、脫脂蛋白(例如，ApoAI、ApoAIV、ApoE等)、氧自由基清除劑、具有抗腫瘤效果的多肽、抗體、毒素、免疫毒素、標記(例如，β-半乳糖苷酶、熒光素酶等)或現(xiàn)有技術中被認可的對臨床狀態(tài)的治療或預防有用的有價值的任何其它基因。進一步的轉基因包括那些編碼抑制細胞分裂或信號轉導的多肽，腫瘤抑制蛋白(例如，p53、Rb、p73)，激活宿主免疫系統(tǒng)的多肽，腫瘤關聯(lián)抗原(例如，MUC-1、BRCA-1、HPV早期或晚期抗原如E6、E7、L1、L2等)的基因，任選與細胞因子結合。
本發(fā)明進一步包括含有兩個或多個轉基因組合的腺病毒載體。在一些情況中，兩個或多個轉基因具有協(xié)同的、互補的和/或不重疊的毒性和作用的方式。
在設計本發(fā)明的腺病毒載體時，考慮到轉基因的生物活性，例如，在有些情況中，有利的是在載體中插入轉基因使轉基因僅在腺病毒感染的早期或晚期表達或主要表達。對于一些轉基因，優(yōu)選在病毒生活周期的早期表達轉基因。在此情況下，可將該轉基因插在任何早期區(qū)(例如，E3)或插入上游L1區(qū)。
GVAX本發(fā)明還涉及通過提供含Ad5或Ad2軸的至少一部分和至少一部分Ad35頭的嵌合纖維蛋白的腺病毒載體轉導的腫瘤細胞，來改變對靶抗原或抗原的單一免疫應答的方法。通常腫瘤細胞為原發(fā)腫瘤細胞。示例性的腫瘤細胞包括來自相同個體(自體的)或來自不同個體(異源的)的腫瘤細胞。在另一實施方式中，腫瘤細胞是來自與正治療的腫瘤或癌相同類型的腫瘤細胞系。
本發(fā)明進一步包括通過引入哺乳動物來提高對腫瘤細胞的免疫應答的方法，腫瘤細胞用具有含Ad5或Ad2軸的至少一部分和Ad35頭的至少一部分的嵌合纖維蛋白的腺病毒載體轉導，其中對腫瘤細胞的哺乳動物免疫應答提高。在一個實施方式中，提高的免疫應答是體液免疫應答。在另一實施方式中，提高的免疫應答是細胞免疫應答。在又一個實施方式中，提高的免疫應答是細胞和體液免疫應答。
在有關實施方式中，該方法進一步包括滅活轉導的腫瘤細胞和轉導腫瘤細胞給予哺乳動物。給予的腫瘤細胞可以是自體的轉導腫瘤細胞、異源的或旁觀者細胞(下面進一步解釋)。通常，在引入前，使轉導的腫瘤細胞變得增殖缺陷。在一個實施方式中，該哺乳動物是具有與轉導腫瘤細胞相同類型的腫瘤細胞的人類。在優(yōu)選實施方式中，繼轉導腫瘤細胞引入后，該哺乳動物的腫瘤細胞顯示生長抑制或細胞死亡。
在另一方面中，本發(fā)明通過引入治療有效量的用含編碼至少一種人類細胞因子的核酸的嵌合重組腺病毒轉導的基因修飾的增殖缺陷腫瘤細胞，提供用于促進對哺乳動物中腫瘤，或其抗原的系統(tǒng)免疫應答的方法，其中該轉導腫瘤細胞和該腫瘤類型相同并且表達至少一種共同抗原。
在某些實施方式中，對腫瘤的系統(tǒng)免疫應答導致腫瘤退化或抑制腫瘤的生長。
在一個實施方式中，腫瘤細胞來源于具有腫瘤的哺乳動物，如人類。在一些實施方式中，在引入前，腫瘤細胞是冷藏的。在某些實施方式中，正在治療的腫瘤細胞類型選自前列腺腫瘤、黑素瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌、表皮癌、膀胱癌、前列腺癌、頭和頸癌、腫瘤前病變、癌性息肉、卵巢癌、子宮頸癌、血癌和腎癌。當正在治療的腫瘤細胞類是前列腺癌時，前列腺腫瘤細胞系可選自DU1 45、PC-3和LnCaP。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，利用本發(fā)明的腺病毒載體將人類GM-CSF轉基因離體輸入原發(fā)人類腫瘤細胞。在轉導后，輻射該細胞使它們變得無能力增殖。然后，將增殖缺陷的表達GM-CSF細胞重新引入病人(例如，通過皮內(nèi)或皮下途徑)并且由此起癌疫苗的作用。
腫瘤細胞選自自體的腫瘤細胞、異源的腫瘤細胞和腫瘤細胞系?？赏ㄟ^體外、離體或體內(nèi)轉導腫瘤細胞。在美國專利US5,637,483、US5,904,920和US6,350,445中，描述了已被基因修飾以表達細胞因子，例如，GM-CSF，隨后重新引入病人體內(nèi)用于癌的治療的自體的和異源的癌細胞，特意引入本文中作為參考。在美國專利US6,033,674和US5,985,290中，描述了用于胰腺癌治療的表達GM-CSF基因修飾腫瘤細胞或“表達細胞因子細胞疫苗”(“GVAX”)的形式，特意引入本文中作為參考。在美國專利US6,464,973中，描述了一個通用的免疫調節(jié)基因修飾的旁觀者細胞系，特意引入本文中作為參考。
使用表達GM-CSF細胞疫苗(GVAX)的臨床試驗已開始用于前列腺癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、腎癌和多發(fā)性骨髓瘤的治療。已經(jīng)描述了利用GVAX細胞疫苗的許多臨床試驗，值得注意的是在黑素瘤，和前列腺、腎和胰腺癌(Simons JW等Cancer Res.1999；595160-5168；SimonsJW等Cancer Res.1997；571537-1546；Soiffer R等Proc.Natl.Acad.SciUSA 1998；9513141-13146；Jaffee，等J Clin Oncol 2001；19145-156；Salgia等J Clin Oncol 200321624-30；Soiffer等J Clin Oncol 2003213343-50；Nemunaitis等J Natl Cancer Inst.2004年2月18日96(4)326-31)。
本發(fā)明提供促進對哺乳動物受試者，優(yōu)選人類病人的癌的提高免疫應答的方法。所需要的是，該方法影響對癌的系統(tǒng)免疫應答，即，T細胞應答和/或B細胞應答。這種改善包括向病人引入病人具有的腫瘤細胞所表達的至少一種抗原的基因修飾腫瘤細胞，并且利用具有嵌合纖維蛋白的腺病毒載體完成該基因修飾，其中嵌合纖維蛋白包含亞型C腺病毒(例如Ad1、2、5和6血清型)軸區(qū)的至少一部分和頭區(qū)結合CD46的亞型B腺病毒(例如Ad3、7、11、14、16、21、35和50)頭區(qū)的至少一部分，例如，Ad5或Ad2軸和Ad35頭的至少一部分。這種腺病毒載體的使用促進轉導和轉基因的表達。盡管可使用任何已知的或后來發(fā)現(xiàn)的使細胞增殖缺陷的方法，但通常通過輻射，使基因修飾腫瘤細胞變得無能力增殖。在將基因修飾腫瘤細胞引入受試者時，激發(fā)了對癌抗原的免疫應答。
在一種方法中，基因修飾腫瘤細胞包括經(jīng)修飾以表達細胞因子的單一居群的細胞并且作為部分治療方法給予受試者。在另一方法中，逐一修飾兩個或多個基因修飾腫瘤細胞居群以表達不同的轉基因并且給予受試者。治療方式可以包括一種或多種其他的癌治療劑或療法。
通常，在本發(fā)明的實踐中使用的基因修飾腫瘤細胞包括一個或多個自體的腫瘤細胞、異源的腫瘤細胞和腫瘤細胞系(也就是，旁觀者細胞)。舉例來說，在一種方法中，基因修飾腫瘤細胞(也就是，GVAX)作為異源的或旁觀者細胞系提供并且一個或多個其他的癌治療劑由自體細胞表達。在另一方法中，當通過自體細胞表達細胞因子(也就是，GM-CSF)時，一個或多個其他的轉基因通過異源的或旁觀者細胞系表達。直接比較由各種細胞因子轉導的鼠腫瘤細胞證明，分泌GM-CSF腫瘤細胞誘導了最全面的抗腫瘤保護。在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的基因修飾腫瘤細胞表達的細胞因子是GM-CSF(“GVAX”)。利用改良腺病毒載體將GM-CSF編碼序列引入該載體，該載體具有包含亞型C腺病毒軸區(qū)的至少一部分和其頭區(qū)結合CD46的亞型B腺病毒頭區(qū)的至少一部分，例如Ad5或Ad2軸和Ad35頭的至少一部分的嵌合纖維蛋白。GM-CSF的優(yōu)選編碼序列是在Huebner K.等Science 230(4731)1282-5，1985中描述的基因組序列，然而，有時在本發(fā)明的實踐中發(fā)現(xiàn)cDNA形式的GM-CSF的實用性(Cantrell等，Proc.Natl.Acad.Sci.，82，6250-6254，1985)。
在一些實施方式中，在引入前基因修飾的腫瘤細胞是冷藏的。在優(yōu)選實施方式中，基因修飾腫瘤細胞被引入來自其起源的相同個體。在另一優(yōu)選實施方式中，基因修飾腫瘤細胞和腫瘤來源于不同個體。在某些優(yōu)選實施方式中，正在治療的腫瘤類型選自膀胱、乳房、結腸、腎、肝臟、肺、卵巢、子宮頸、胰腺、直腸、前列腺、胃、表皮的癌；淋巴或骨髓譜系的造血腫瘤；間質來源的腫瘤如纖維肉瘤或橫紋肌肉瘤；其它的腫瘤類型如黑素瘤、畸胎癌、神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)膠質瘤、腺癌和非小肺細胞癌。
在引入病人之前，基因修飾腫瘤細胞優(yōu)選在從約50-200rads/min，更優(yōu)選從約120-140rads/分的劑量下照射。細胞優(yōu)選用足以顯著抑制100％細胞進一步增殖的總劑量照射。因此，期望用從約10,000-20,000rads，最佳用約15,000rads的總劑量照射該細胞。
自體的自體基因修飾的轉基因表達腫瘤細胞的使用具有優(yōu)點，因為每個病人的腫瘤表達獨特的一組腫瘤抗原，其不同于來自其它病人的組織類似的MHC-匹配腫瘤細胞。參見，例如，Kawakami等，J.Immunol.，148，638-643(1992)；Darrow等，J.Immunol.，142，3329-3335(1989)；和Hom等，J.Immunother.，10，153-164(1991)。相反，MHC-匹配腫瘤細胞具有優(yōu)點病人不需要手術就可獲得用于基因修飾腫瘤細胞產(chǎn)生的其腫瘤樣本。
在一個優(yōu)選方面中，本發(fā)明包括通過進行以下步驟的治療癌的方法(a)從具有腫瘤的哺乳動物受試者獲得腫瘤細胞；(b)利用具有含亞型C腺病毒軸區(qū)的至少一部分和頭區(qū)結合CD46的亞型B腺病毒頭區(qū)的至少一部分，例如Ad5或Ad2軸和Ad35頭的至少一部分的嵌合纖維蛋白的腺病毒載體，修飾該腫瘤細胞，使它們能產(chǎn)生一個或多個與未修飾腫瘤細胞有關的轉基因的增長水平；(c)使修飾腫瘤細胞變得無能力增殖；和(d)向獲得腫瘤細胞的哺乳動物受試者或具有與獲得腫瘤細胞的哺乳動物相同MHC類型的哺乳動物重新引入該修飾腫瘤細胞。引入的腫瘤細胞是自體的并且對宿主是MHC-匹配的。優(yōu)選將該組合物皮下、皮內(nèi)或腫瘤內(nèi)引入到哺乳動物受試者。
單個自體腫瘤細胞可表達不止一種轉基因或每個轉基因可以通過不同的自體的腫瘤細胞表達。在本發(fā)明的一個方面，通過引入含如本文所描述的嵌合纖維蛋白的腺病毒載體和編碼轉基因的核酸序列，例如，細胞因子，如GM-CSF，修飾異源腫瘤細胞，其與啟動子及其表達必要的表達/控制序列有效連接。在另一方面中，通過含編碼至少一個與啟動子及其表達必要的表達/控制序列有效連接的其他轉基因的核酸序列的載體的引入，修飾相同的自體腫瘤細胞或第二自體腫瘤細胞。利用相同或不同載體，將編碼一個或多個轉基因的核酸序列引入相同或不同的自體腫瘤細胞。編碼轉基因的核酸序列可以或不可以進一步包括與啟動子有效連接的選擇性標記序列。
異體的如Jaffee等，Seminars in Oncology，22，81-91(1995)所述，研究人員已尋求自體和MHC-匹配細胞的代用品作為腫瘤疫苗。早期的腫瘤疫苗對策是根據(jù)預防接種腫瘤細胞起著抗原呈遞細胞(APCs)作用的理解，抗原呈遞細胞使腫瘤抗原呈現(xiàn)其MHC類I和II分子狀態(tài)，并且直接活化免疫系統(tǒng)的T細胞臂。Huang等(Science，264，961-965，1994)的結果，表明通過分泌細胞因子如GM-CSF使宿主的專門APCs而不是預防接種腫瘤細胞填裝免疫系統(tǒng)的T細胞臂，以便將骨髓源APCs補充到腫瘤區(qū)。骨髓源APCs占據(jù)用于加工的腫瘤的全部細胞蛋白質，然后在其MHC類I和II分子上呈遞抗原肽，由此填充免疫系統(tǒng)的CD4+和CD8+T細胞臂，引起系統(tǒng)的腫瘤特異性抗腫瘤免疫應答。這些結果暗示，為了引起抗癌免疫應答使用自體或MHC匹配腫瘤細胞不是必要或最佳的，并且異源的MHC基因(來自相同物種的不同遺傳個體)的轉移可增強腫瘤免疫原性。更具體地說，在某些情況下，腫瘤表達異源的MHC類I分子的排斥引起對后續(xù)競爭未修飾親代腫瘤的激發(fā)增強系統(tǒng)免疫應答，如上述Jaffee等和上述Huang等所描述。
如在本文中所描述，“腫瘤細胞系”包括最初來源于腫瘤的細胞。這樣的細胞通常是轉化細胞(也就是，在培養(yǎng)中顯示無限生長)。在一優(yōu)選方面中，本發(fā)明提供通過進行以下步驟治療癌的方法(a)獲得腫瘤細胞系；(b)利用含嵌合纖維蛋白的腺病毒載體修飾腫瘤細胞系，以使這些細胞能產(chǎn)生與未修飾腫瘤細胞相關的一個或多個轉基因的增長水平，其中該蛋白包括亞型C腺病毒軸區(qū)的至少一部分和頭區(qū)結合CD46的亞型B腺病毒的頭區(qū)的至少一部分，例如Ad5或Ad2軸和Ad35頭的至少一部分；(c)使該修飾腫瘤細胞系無能力增殖，和(d)將該腫瘤細胞系引入具有與所獲得的腫瘤細胞系相同類型的腫瘤的至少一種腫瘤哺乳動物受試者(宿主)。該引入腫瘤細胞系對宿主是異源的和非MHC匹配的。這樣的異源細胞系具有優(yōu)點它們可預先制備、表征、在含已知表達轉基因細胞的小管中等分和存儲(被冷凍)以利于將表征好的細胞引入病人。在WO 00/72686A1中舉例描述了用于生產(chǎn)基因修飾的異源細胞的方法，特意引入本文中作為參考。
在一個制備基因修飾表達轉基因異源細胞的方法中，將一個或多個編碼治療劑核酸序列(轉基因)引入一個異源腫瘤細胞系的細胞系中(也就是，來源于一個除了正在治療的個體以外的個體)。在另一方法中，將一個或多個轉基因引入分離的異源腫瘤細胞系。通常，細胞或細胞居群是來自與正在治療的腫瘤或癌相同類型的腫瘤細胞系。腫瘤和/或腫瘤細胞系可以是任何形式的癌，包括但不局限于，膀胱、乳房、結腸、腎、肝臟、肺、卵巢、子宮頸、胰腺、直腸、前列腺、胃、表皮的癌；淋巴或骨髓譜系的造血腫瘤；間質來源的腫瘤如纖維肉瘤或橫紋肌肉瘤；或其它腫瘤，包括黑素瘤、畸胎癌、神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)膠質瘤、腺癌和非小肺細胞癌。
在本發(fā)明的一個方面中，通過引入具有嵌合纖維蛋白的腺病毒載體修飾異源的腫瘤細胞，其中該嵌合纖維蛋白包含亞型C腺病毒軸區(qū)的至少一部分和頭區(qū)結合CD46的亞型B腺病毒頭區(qū)的至少一部分，例如Ad5或Ad2軸和Ad35頭的至少一部分，其包括編碼與啟動子及其表達必要的表達控制序列有效連接的轉基因的核酸序列，例如細胞因子如GM-CSF。在另一方面中，通過引入具有如上所述的含與啟動子及其表達所必要的表達控制序列的有效連接的至少一個其它轉基因的嵌合纖維蛋白的另一腺病毒載體，修飾相同的異源腫瘤細胞或第二異源腫瘤細胞。利用相同或不同載體，可將編碼轉基因的核酸序列引入相同或不同的異源腫瘤細胞中。編碼轉基因的核酸序列可以或不可以進一步包括與啟動子有效連接的選擇性標記序列。令人期望地，異源細胞系表達高水平的細胞因子，例如GM-CSF。
在本發(fā)明的實踐中，將一個或多個異源細胞系與自體癌抗原，例如自體腫瘤細胞(其共同包括異源細胞系組合物)一起培養(yǎng)，然后將該異源細胞系組合物給予病人。癌抗原通常是由將要治療的癌細胞，即，自體癌細胞提供。在此情況下，通常通過照射使該組合物變得無能力增殖，其中，如上所述，將該異源細胞和癌細胞在組織培養(yǎng)板上平板培養(yǎng)，并且利用銫源在室溫下照射。在指定的引入中，異源細胞與自體癌細胞的比率根據(jù)其組合而變化。
可使用任何適當?shù)奶幚硗緩綄愒醇毎到M合物引入病人，該組合物優(yōu)選皮下、皮內(nèi)或腫瘤內(nèi)引入。
在本發(fā)明的實踐中，異源細胞系的使用具有治療優(yōu)點通過將基因修飾的表達轉基因細胞系引入患癌病人，與自體癌抗原一起，治療轉基因如細胞因子的旁分泌產(chǎn)生引起對腫瘤的有效免疫應答。這避免了培養(yǎng)并且將自體腫瘤細胞轉導入每個病人的需要。
旁觀者在一個進一步的方面中，本發(fā)明提供表達至少一個轉基因的通用的免疫調節(jié)基因修飾轉基因表達旁觀者細胞。相同的通用旁觀者細胞系可表達超過一個轉基因，或個體轉基因可通過不同的通用旁觀者細胞系表達。通用的旁觀者細胞系包括天生缺少主要組織親和性類I(MHC-I)抗原和主要組織相容性類II(MHC-II)抗原或者已被修飾以便它們?nèi)鄙費HC-I抗原和MHC-II抗原的細胞。在本發(fā)明的一個方面中，通過引入具有嵌合纖維蛋白的載體腺病毒載體修飾通用的旁觀者細胞系，其中該嵌合纖維蛋白包含亞型C腺病毒軸區(qū)的至少一部分和頭區(qū)結合CD46的載體亞型B腺病毒頭區(qū)的至少一部分，例如Ad5或Ad2軸和Ad35頭的至少一部分其中該載體包括編碼與啟動子及其表達所必需的表達控制序列有效連接的轉基因例如細胞因子如GM-CSF的核酸序列。在另一方面中，通過引入包含編碼至少一個與啟動子及其表達必要的表達控制序列有效連接其它轉基因的核酸序列的載體的引入，修飾相同的通用旁觀者細胞系或第二通用旁觀者細胞系。利用相同或不同載體，將編碼轉基因的核酸序列引入相同或不同的通用旁觀者細胞系。編碼轉基因的核酸序列可以或不可以進一步包括與啟動子有效連接的選擇性標記序列。激發(fā)抗腫瘤免疫應答的任何轉基因組合可以在本發(fā)明的實踐中發(fā)現(xiàn)實用性。通用旁觀者細胞系優(yōu)選在規(guī)定的即無血清介質，優(yōu)選懸浮液中生長。
優(yōu)選通用旁觀者細胞系的實例是K562(ATCC CCL-243；Lozzio等，Blood 45(3)321-334(1975)；Klein等，Int.J.Cancer 18421-431(1976))。在美國專利US6,464,973中實例描述了人類旁觀者細胞系世代的詳細說明，特意引入本文中作為參考。
令人期望地，通用旁觀者細胞系表達高水平的細胞因子，例如，GM-CSF。
在本發(fā)明的實踐中，將一個或多個通用旁觀者細胞系與自體癌抗原，例如，自體腫瘤細胞(其共同包括通用的旁觀者細胞系組合物)一起培養(yǎng)，然后將該通用旁觀者細胞系組合物給予病人。可使用任何適當?shù)奶幚硗緩綄⑼ㄓ门杂^者細胞系組合物引入病人。優(yōu)選將該組合物皮下、皮內(nèi)或腫瘤內(nèi)引入。
癌抗原通常是由要治療的癌細胞即自體癌細胞提供。在此情況下，通過照射使該組合物變得無能力增殖，其中，如上所述將該異源細胞和癌細胞在組織培養(yǎng)板上平板培養(yǎng)，并且利用銫源在室溫下照射。
在給定的處理中，旁觀者細胞與自體癌細胞的比率根據(jù)組合物而變化。對于產(chǎn)生GM-CSF的旁觀者細胞，在給定的引入中，旁觀者細胞與自體癌細胞的比率應該使在治療上產(chǎn)生有效水平的GM-CSF。除了GM-CSF閾值以外，旁觀者細胞與自體癌細胞的比率不應該大于1∶1。利用現(xiàn)有技術中已知的常用方法，可確定旁觀者細胞與腫瘤細胞或腫瘤抗原的適當比率。
在本發(fā)明的實踐中，旁觀者細胞系的使用具有治療優(yōu)點通過將表達細胞因子旁觀者細胞系和至少一種其他的癌治療劑(通過相同或不同的細胞表達)與自體癌抗原一起，引入具有癌的病人，免疫調節(jié)細胞因子的旁分泌產(chǎn)生，引起對腫瘤的有效免疫應答。這避免了培養(yǎng)和將自體腫瘤細胞轉導入每個病人的需要。
通常約3500Rads的最小劑量足以滅活細胞并且使其變得增殖缺陷，盡管約30,000Rads的劑量是可接受的。在一些實施方式中，在引入哺乳動物之前，優(yōu)選在從約50-200rads/min，或從約120-140rads/min的劑量下照射該細胞。通常，當使用照射時，需要的照射水平是2,500rads、5,000rads、10,000rads、15,000rads或20,000rads。在一個實施方式中，使用約10,000Rads的劑量滅活細胞并且使其變得增殖缺陷。應該理解照射只是使細胞變得增殖缺陷的一個方法，并且在本發(fā)明中包括引起細胞不能多次分裂的滅活卻保持表達轉基因(例如細胞因子)能力的其它方法(例如，用絲裂霉素C、放線菌酮，和原理上類似試劑，或細胞中自殺基因的結合的處理)。
用于實踐本發(fā)明的組合物和方法本發(fā)明提供包含本發(fā)明的重組腺病毒載體和/或顆粒和/或利用本發(fā)明的重組腺病毒載體和/或顆粒已被基因修飾的腫瘤細胞和藥物可接受的載體的藥物組合物，以及使用該組合物的方法。
在一個方面中，本發(fā)明提供包含藥物可接受的載體中的本發(fā)明的治療有效量的腺病毒載體的組合物，適合以單位劑量形式局部或系統(tǒng)引入個體，無菌腸道外的溶液或懸浮液，無菌非腸道外溶液或口服溶液或懸浮液，水包油或油包水乳化液等。用于腸胃外和非腸胃外的施藥配方在現(xiàn)有技術中已知的。組合物還包括腺病毒載體的凍干和/或重組形式和本發(fā)明的顆粒?？山邮艿乃幬镙d體是，例如鹽溶液、硫酸精蛋白(Elkins Sinn，Inc.，Cherry Hill，N.J.)、水、含水緩沖液，如磷酸鹽緩沖液和Tris緩沖液、聚凝胺(polybrene)(Sigma Chemical，St.Louis MO)和磷酸緩沖鹽溶液和蔗糖。從本文中所包含的教導，合適的藥物載體的選擇對本領域技術人員而言是顯而易見的。這些溶液是無菌的并且通常除了所需的腺病毒毒粒以外是無顆粒物的。該組合物可以包括藥物可接受的輔助物質如所需要的近似生理條件如pH校準和緩沖劑、毒性校準劑等，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等?？梢园ㄔ鰪娤俨《靖腥炯毎馁x形劑。
在一個實施方式中，以有效抑制、防止、或破壞腫瘤細胞的生長的量(也就是，治療有效量)將本發(fā)明的腺病毒載體引入宿主。這可以例如通過腫瘤細胞中病毒載體的復制和/或腫瘤細胞轉導后的轉基因的表達來完成。這樣的引入可以以存在有效輸送腺病毒載體到腫瘤靶細胞的任何量進行，如將載體系統(tǒng)引入或直接注入腫瘤中。在一個方法中，以至少為5×109病毒顆粒/公斤體重的量，將載體系統(tǒng)引入，并且總的來說，這樣的量不超過1×1013病毒顆粒/公斤體重。在另一方法中，以至少2×1010個病毒顆粒的量，將載體引入腫瘤內(nèi)，并且通常這個量不超過1×1013病毒顆粒/公斤體重。在又一個方法中，將載體滴注入受試者的膀胱。在此情況下，可以用如US20040131590中所描述的膀胱增強子預處理膀胱。所引入的確切劑量取決于包括年齡、體重、和病人性別以及正在治療的腫瘤的大小和嚴重度的各種因素?？梢砸胼d體一次或多次。組合物的單次或多次引入可通過治療醫(yī)生所選擇的劑量水平和模式進行。如有必要，通過使用各種免疫抑制劑、或除去先前存在的抗體可減小免疫應答，使得通過減少對病毒的免疫應答允許重復引入和/或增強復制。本發(fā)明的腺病毒載體的引入可與其它抗腫瘤流程結合，其中的許多實例在現(xiàn)有技術中是已知的。這樣的抗腫瘤流程根據(jù)治療的癌的類型而變化?？鼓[瘤流程的示例組成如下進一步描述。
可用多種方法，使用脂質體、直接注射、全身注射、導管、局部施用、吸入等完成輸送。
接著，本發(fā)明提供治療具有贅生狀態(tài)(通常具有癌的病人)受試者的方法，包括向受試者引入本發(fā)明的治療有效量的本發(fā)明的腺病毒載體。腺病毒載體可以是有能力復制型或無能力復制型。本發(fā)明的一個方面涉及變得無能力增殖(也就是，通過照射)并且給予受試者的基因修飾的表達轉基因的腫瘤細胞的用途。將治療有效量的基因修飾的，增殖缺陷型腫瘤細胞引入受試者，通常為人類癌病人。
通過用如上所述的本發(fā)明的腺病毒載體的轉導修飾腫瘤細胞。在一個實施方式中，本發(fā)明用編碼一個或多個轉基因的一種重組腺病毒載體進行腫瘤細胞居群的單一轉導。在其它實施方式中，本發(fā)明依賴具有相同重組腺病毒載體的腫瘤細胞群的多轉導(感染)。在其它的實施方式中，本發(fā)明通過編碼不同轉基因的重組腺病毒進行多或單一轉導。
轉導細胞引入到哺乳動物以刺激方式引起，個體系統(tǒng)免疫應答的調節(jié)。在其它方面，本發(fā)明涉及原始腫瘤的逆轉或抑制的表達一個或多個轉基因的修飾腫瘤細胞(如原發(fā)腫瘤細胞)的用途。還可轉導腫瘤細胞以表達多耐藥性蛋白質(MDR)?？梢栽谙嗤俨《据d體、不同腺病毒載體或者甚至非腺病毒載體上編碼MDR。其它載體可與本發(fā)明的腺病毒載體組合使用以轉導腫瘤細胞。不同載體可在對預期效果合適的基本上同時或在其他時候運輸?shù)侥[瘤細胞。
在另一個方面，本發(fā)明提供增強對腫瘤抗原免疫應答的方法。在這個方法中，用本發(fā)明的腺病毒載體修飾原發(fā)腫瘤細胞以表達轉基因并且引入受試者，如人類癌病人。以治療的有效量和以獲得對抗原的提高的哺乳動物免疫應答的方式(例如皮內(nèi)或皮下)，將該修飾腫瘤細胞引入。
在相關實施方式中，將基因修飾腫瘤細胞和本發(fā)明的腺病毒載體都引入受試者。這樣的基因修飾腫瘤細胞可以是自體的、異源的或旁觀者細胞并且引入可以同時發(fā)生或可以依次發(fā)生。
表達轉基因的轉導細胞和哺乳動物所具有的腫瘤細胞不必是相同的腫瘤類型。例如，旁觀者細胞可以在體內(nèi)表達轉基因并且是與哺乳動物所具有的腫瘤不相同的細胞或腫瘤。在另一實例中，轉導以表達GM-CSF的細胞不是相同的腫瘤類型，但可以與哺乳動物的腫瘤細胞一起表達腫瘤抗原。因此，提高了對哺乳動物腫瘤的免疫應答。
腫瘤和轉導腫瘤細胞(即原發(fā)腫瘤細胞)通常是相同類型的癌并且具有共同抗原。該癌可以是任何類型的癌，包括但不局限于，膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、腦和脊髓癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內(nèi)膜和其它子宮癌、食道癌、膽囊和膽管癌、胃(胃)癌、頭和頸癌、腎癌、血癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、血液病、視網(wǎng)膜母細胞瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、維耳姆斯瘤、原始腫瘤病變、癌性息肉等。
在一個實施方式中，該方法包括引入未轉導的增殖缺陷腫瘤細胞和助劑例如本發(fā)明的腺病毒載體，被引入的助劑與細胞因子表達腫瘤細胞同時或依次引入。在一個方法中，本發(fā)明的腺病毒載體包括轉基因例如，細胞因子如GM-CSF的編碼序列，并且與增殖缺陷腫瘤細胞一起引入，其中該腫瘤細胞是自體或異源的。
受試者通常是人類病人。對于人類病人，如果異源編碼序列包含于載體中，該異源編碼序列可以是人類起源，盡管可以使用在人類中表現(xiàn)出高同源性和生物學上相同的或等價功能的緊密相關物種的基因，如果在容器中異源編碼序列的產(chǎn)物沒有產(chǎn)生/引起逆向免疫反應。在一個實施方式中，異源編碼序列編碼治療的蛋白質或治療的RNA。核酸序列或治療基因的治療活性量是在劑量和一段時間達到所需結果必要的有效量。這個量可以根據(jù)包括但不局限于受試者的性別、年齡、體重等的各種因素變化。
普通技術人員應該理解從醫(yī)生或病人的角度看，實際上任何減輕或防止不希望癥狀(例如，與疾病有關的癥狀、對環(huán)境因素的敏感度、自然老化等)是希望的。
給本發(fā)明的藥物組合物的給予可以在個體中產(chǎn)生免疫應答或治療癌有關的其它治療以后、以前、代替、或結合。例如，通過化療、放射療法、以及免疫療法的其它形式和過繼轉移可先于或同時治療哺乳動物。例如，本發(fā)明的組合物可能與化療劑如順式鉑氨、復合順式鉑氨/cyclophaphamide、紅豆杉醇或順式鉑氨/環(huán)磷酰胺/阿霉素一起使用。在使用這樣的療法的情況，可以一種方式或在不妨礙本發(fā)明的組合物的免疫原性時使用它們。哺乳動物也可以引入別的疫苗或其它的組合物以便激發(fā)免疫應答。這樣的替代組合物可以包括腫瘤抗原疫苗、編碼腫瘤抗原的核酸疫苗、抗獨特型疫苗、和包括細胞因子表達腫瘤細胞系的其它類型的細胞疫苗。
在一個實施方式中，加工轉導細胞以除去制備細胞中使用的大部分其他組分。尤其是，除去胎牛血清、牛血清組分或培養(yǎng)基中的其它的生物添加物。在一個實施方式中，如通過重復的溫柔離心，洗滌細胞成合適的藥理學親和性的賦形劑。親和性的賦形劑包括等滲(isotonic)鹽水，有或者沒有生理學親和性的緩沖液類似磷酸鹽或Hepes和養(yǎng)分如葡萄糖、生理學親和性的離子、或氨基酸，和各種培養(yǎng)基，尤其那些缺少其它免疫原組分的培養(yǎng)基?？赏瑯邮褂脭y帶試劑，如清蛋白和血漿餾分和非活性濃縮劑。在一個實施方式中，非活性生物組分，在它們存在于藥理學制備中的程度上，來源于人類，并且甚至可從要治療的受試者預先獲得。
然而本發(fā)明的其它方面涉及用于調節(jié)對腫瘤抗原的哺乳動物的免疫應答的試劑盒。這些試劑盒包括具有嵌合纖維蛋白的本發(fā)明的重組腺病毒并且可以或不可以進一步包括編碼轉基因例如細胞因子如GM-CSF的核酸，其中該嵌合纖維蛋白包含亞型C腺病毒軸區(qū)的至少一部分和頭區(qū)結合CD46的亞型B腺病毒頭區(qū)的至少一部分，例如Ad5或Ad2軸和Ad35頭的Ad35的至少一部分。該試劑盒進一步包括有用的存儲器例如，用于放置和存儲腫瘤細胞或腫瘤片段，并且在其內(nèi)用重組病毒轉導腫瘤細胞。在一些實施方式中，試劑盒進一步包括將腫瘤組織轉化為單一細胞懸液的消化酶。在一些實施方式中，該酶是膠原酶。在一些實施方式中，試劑盒進一步包括包含未被含編碼細胞因子的遺傳物質的重組病毒轉導的增殖缺陷型腫瘤細胞的助劑。
實施例通過引用以下實例描述本發(fā)明，其通過解釋的方式提供并且不想以任何方式限定本發(fā)明。利用在現(xiàn)有技術中已知的標準技術或如下具體所述的技術。僅使用常規(guī)試驗，本領域技術人員認為，或能清楚在本文中具體描述了的許多本發(fā)明具體實施方式
的的等價方案。這樣的方案是指包含在以下權利要求書范圍中。
實施例1人類腫瘤細胞系和細胞培養(yǎng)在本文中描述的實施例中使用的人類頭和頸癌系和人類黑素瘤細胞系列于表1。
表1.腫瘤細胞系


在含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)列于表1中的人類頭和頸癌系和人類黑素瘤細胞系。在含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)人類前列腺癌細胞系，PC3M-2AC6。在含10％FBS、L-谷氨酰胺(2mM)、非必需氨基酸(0.1mM)、碳酸鈉(0.075％)和丙酮酸鈉(1mM)的RPMI中培養(yǎng)人類前列腺癌細胞系，LNCaP(ATCC，CRL-10995)。在補充有10％FBS和L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI中培養(yǎng)人類前列腺癌細胞系，PC-3(ATCC，CRL-1435)。
實施例2E1缺陷、表達GFP纖維嵌合Ad5載體的構建如下所述，為了產(chǎn)生基于纖維嵌合體的Ad5載體，首先構建穿梭質粒，pAd5LtRt-SmaI。首先，用兩個引物通過PCR擴增Ad5DNA的左手末端(bp 1-1009bp)；
引物1(5′-GAATTCTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCTT-3′；SEQ ID NO17)和引物2(5′-CCCGGGGTGCTCCACATAAATCT-3′；SEQ ID NO18)。使用稱為引物3(5′-AAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCTT-3′；SEQ ID NO19)和引物4(5′-CCCGGGGGAATACATACCCGCAGG-3′；SEQ ID NO20)的第二套引物擴增Ad5DNA的右未端580bp序列。將I-SceI的識別序列被并入引物1和3。用EcoRI和Smal消化第一PCR產(chǎn)物以及用HindIII和SmaI消化第二PCR產(chǎn)物。對所生成的片段凝膠純化并且通過三向連接將所生成的片段克隆進pBlueScript(Stratagene，La Jolla，CA)的EcoRI和HindIII位點以產(chǎn)生pAd5LtRt-SmaI。通過結合Smal-線性化的pAd5LtRt SmaI和E.coli中Ad5.CMV5-GFP(Qbiogene，Carlsbad，CA)的基因組DNA，產(chǎn)生包含以I-SceI位點為界的Ad5GFP載體基因組的質粒pFLAd5.CMV5-GFP。
以幾個步驟產(chǎn)生纖維嵌合載體。首先用SmaI消化質粒，pFLAd5.CMV5-GFP，并且凝膠純化和自我連接含Ad5.CMV5-GFP的左側和右側未端片段(分別為nt.1至3047和32652至33231)的片段，以產(chǎn)生pAd5Lt & RtSmaI-CMV5-GFP。通過分別結合SmaI-線性化的pAd5Lt &RtSmaI-CMV5-GFP和AvlnBg5T35H、AvlnBg35F AvlnBg-5T3H(Smith等，2003)的基因組DNA，和CRAdhUPII-E1a-IRES-E1b/Fb5/3LL-RGD，產(chǎn)生含用GFP編碼區(qū)取代E1編碼區(qū)的并且含嵌合纖維編碼區(qū)的全長Ad5DNA的質粒pFLAd5.CMV5-GFP5T35H、pFLAd5.CMV5-GFP-35F、pFLAd5.CMV5-GFP-5T3H和pFLAd5.CMV5-GFP-5T3H-RGD。編碼條件有能力復制型腺病毒中的纖維蛋白質的軸部分的基因，CRAdhUPII-E1a-IRES-E1b/Fb5/3 LL-RGD來源于Ad5，而編碼區(qū)的結從Ad3中獲得。通過在蛋白質的羧基末端結合RGD配體，進一步修飾此病毒的嵌合纖維蛋白。用I-SceI消化全長質粒并且轉染進PER.C6細胞中，以產(chǎn)生纖維嵌合載體。
實施例3E1缺陷和人類表達GM-CSF纖維嵌合Ad5載體的構建為了產(chǎn)生這些載體，首先，如下所述構建穿梭質粒，pAd5LtRtSma-CAGhGM。用引物PSR3(5-CTTCGAGGAATTCAGGATGTGGCTGCAGAGCCTGCTG-3；SEQ ID NO21)和PSR4(5-CTTCGAGAAGCTTACTCCTGGACTGGCTCCCAG-3；SEQ ID NO22)從pDR20hGMF進行PCR擴增編碼hGMCSF的基因。將限制性內(nèi)切酶識別序列并入引物PSR3(EcoRI)和PSR 4(HindIII)以促進克隆。用EcoRI和HindIII消化PCR產(chǎn)物(435bp)并且凝膠純化所產(chǎn)生的片段。用引物PSR6(5-CTTCGAGAAGCTTCAGACATGATAAGATACATTG-3；SEQ ID NO23)和PSR7(5-CTTCGAGGGATCCTACCACATTTGTAGAGGTTTAC-3；SEQID NO24)從pCAT-基進行PCR擴增SV40晚期聚(A)信號。將限制性內(nèi)切酶識別序列改造進引物PSR6(HindIII)和PSR7(BamHI)中。用HindIII和BamHI消化PCR產(chǎn)物(222bp)并且凝膠純化所產(chǎn)生的片段。將兩個凝膠純化片段克隆入pGEM-7Z(Promega Corp，Madison，WI)的EcoRI和BamHI位點以產(chǎn)生pGMCSF-SV40pA-7Z。
用BamHI消化所產(chǎn)生的質粒并且利用克列諾片段用dNTP混合物填充末端。隨后進行酚-氯仿萃取和乙醇沉淀，用EcoRI消化所產(chǎn)生的DNA并且凝膠純化670bp片段。其次，用BgIII消化pAd5Lt& RtSmaI-CMV5-GFP，利用克列諾片段用dNTP混合物填充所產(chǎn)生的末端。凝膠純化含Ad5DNA的左側末端(357bp)和右側末端(583bp)和質粒主鏈的4.3KB片段。通過HindIII和BamHI消化和凝膠純化從pRRLsinhCAG.gammapptpre(Shoji等，1997.J.Gen Virol.782657-2664；Miyazaki等1989 Gene79269-277.urce)中獲得含CAG啟動子(CMV增強子，小雞β肌動蛋白啟動子和內(nèi)含子和兔球蛋白內(nèi)含子)的1.6KB片段。將所有三個凝膠純化片段連接以產(chǎn)生穿梭質粒、pAd5LtRtSma-CAGhGM。在E.coli中，將SmaI線性化pAd5LtRtSma-CAGhGM與Ad5-CMV5-GFP的基因組DNA(參見SEQ ID NO1)結合產(chǎn)生全長質粒，pFLAd5-CAG-hGM-5F。為了產(chǎn)生含來源于Ad35和Ad3的結編碼區(qū)的類似全長克隆，通過用StuI消化繼之以含左側和右側未端片段的限制性內(nèi)切酶片段的凝膠純化以及自連接作用，從pFLAd5-CAG-hGM-5F構建新的穿梭質粒，pAd5Lt &RtStu-CAG-hGM。用StuI線性化所產(chǎn)生的質粒，結合來源于E.coli中的Ad5-CMV5-GFP-5T35H和Ad5-CMV5-GFP-5T3H-RGD的基因組DNA，分別產(chǎn)生pFLAd5.CAG-hGM-5T35和pFLAd5.CAG-hGM-5T3H-RGD。用I-SceI消化全長質粒并且轉染入PER.C6細胞中以產(chǎn)生Ad5.CAG-hGM、Ad5.CAG-hGM-5T35H和Ad5.CAG-hGM-5T3H-RGD。
實施例4用于制備原發(fā)腫瘤細胞的方法。
將外科獲得的腫瘤組織(例如肺)呈送病理評估以確定其作為腫瘤組織(為非小細胞肺癌)的同一性。在轉運培養(yǎng)基(Td培養(yǎng)基；含1％人血清白蛋白的α-MEM)中，在40℃下將剩余的腫瘤運送/轉運到實驗室。大多數(shù)情況下，在小于24小時以內(nèi)轉運該腫瘤。到達以后立即吸出轉運培養(yǎng)基并且用50ml的Td培養(yǎng)基洗滌腫瘤并且利用Stomacher實驗室攪拌器(Brinkmann Westbury NY)通過機械消化30分鐘加工成單一細胞懸液。通過過濾和Ficol密度梯度離心(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)除去細胞碎片和團。將細胞平板培養(yǎng)在6-well組織培養(yǎng)皿中。
實施例5利用實施例3中的步驟分離的細胞系或原發(fā)腫瘤細胞的感染和轉導百分數(shù)的測定在含2％胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中，在37℃下，將平板培養(yǎng)的原發(fā)腫瘤細胞或細胞系暴露給一個或不同的感染復數(shù)(MOIs)的Ad5基GFP載體(例如用嵌合纖維)2hr。將血清濃度增加到4-10％并且將該細胞進一步培養(yǎng)24hr以為GFP表達作準備。用PBS洗滌細胞并且利用流式細胞計測定轉導百分數(shù)。
為了測定并且比較Ad5纖維嵌合體和攜帶野生型纖維Ad5的轉導效率，在含2％FBS的總量為0.5ml的培養(yǎng)基中在37℃下，用50個顆粒/細胞(ppc)的載體將選擇的人類細胞系轉導兩個小時。用2ml含4％FBS的合適的培養(yǎng)基替換感染培養(yǎng)基。將細胞培養(yǎng)24小時以便為轉基因(β-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋質，GFP)表達作準備。為了監(jiān)測β-半乳糖苷酶表達，將細胞單層固定并且用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷(X-GaI)染色24h。用光學顯微鏡在高倍視野下通過統(tǒng)計每全體細胞中轉導的藍色細胞數(shù)測定轉導的百分比；每井統(tǒng)計三視野并且確定轉導平均百分數(shù)。為了監(jiān)測GFP表達，用胰蛋白酶處理分離細胞單層，然后用PBS洗滌細胞。通過流式細胞計測定轉導的百分比。在三重井中進行每個載體轉導實驗并且測定轉導的平均百分數(shù)。
實施例6體外Ad5和嵌合纖維載體介導的人類細胞的轉導。
如實施例5所描述，以50個顆粒/細胞轉導細胞。在感染后24小時，監(jiān)測受感染細胞的β-半乳糖苷酶表達。結果如表2所示并且反映了轉導細胞的百分比。
表2.體外Ad5和Ad5纖維嵌合載體介導的人類細胞的轉導。


實施例7體外Ad5和嵌合纖維載體介導的原發(fā)人類非小細胞肺癌細胞的轉導。
用纖維嵌合載體轉導細胞并且用如實施例5中所描述的FACS在感染后24hr通過監(jiān)測GFP表達測定細胞轉導百分數(shù)。結果如表3所示。
表3.體外Ad5和Ad5纖維嵌合載體介導的原發(fā)人類非小細胞肺癌細胞的轉導。

實施例8在人類腫瘤細胞系中選擇細胞表面受體的密度。
如上所述，與纖維嵌合腺病毒載體相比，黑素瘤以及頭和頸癌(HNC)細胞系對Ad5感染的敏感相對小。為了研究這些細胞系對Ad5而不是纖維嵌合載體的平板相對抗性的生物學基礎，測定腺病毒載體所用的受體的細胞水平。用PBS洗滌培養(yǎng)的腫瘤細胞并且用0.025％胰蛋白酶，將其與平板分離，用PBS(pH7.4)洗滌一次并且在PBS中懸浮(pH 7.4)。用鼠抗體引導的抗柯薩奇-腺病毒受體(CAR，Rmcb，Upstate biotechnology，Lake placid，NY)、CD46(Clone E4.3，BD Biosciences，Pharmingen，SanDiego，CA)αvβ3(Chemicon International，Temecula，CA)或αvβ5(ChemiconInternational，Temecula CA)，在4℃下將細胞培養(yǎng)30min。隨后，用PBS洗滌細胞三次并且用FITC-共軛的次級抗鼠IgG(BD Biosciences，Pharmingen，San Diego，CA)在4℃下培養(yǎng)30min。用PBS洗滌后，將細胞懸浮在PBS中并且用流式細胞計分析以測定陽性細胞百分比。表4和5分別提供了人類頭和頸癌細胞系以及黑素瘤細胞系的數(shù)據(jù)。
表4.人類頭和頸癌細胞系中選擇的細胞表面受體表達(％陽性細胞)

表5.人類黑素瘤細胞系中選擇的細胞表面受體表達(％陽性細胞)

這些研究證明黑素瘤和HNC細胞系表達低水平的CAR。相反，尤其對于頭和頸癌細胞系，測定的CD46的水平相當高。另外，所有五個測試的頭和頸癌細胞系具有很低水平的αvβ3和αvβ5整聯(lián)蛋白并且因此不能被流式細胞計檢測；然而，在大多數(shù)黑素瘤細胞中αvβ3整聯(lián)蛋白的表達水平是高的。因此，通過高表達水平的CD46、Ad3和Ad35的原發(fā)受體，和低水平的CAR表達、在黑素瘤上的Ad5的原發(fā)受體和HNC細胞，說明纖維嵌合載體的相對敏感性和對Ad5的抗性。
實施例9含E1和人類表達GM-CSF纖維嵌合Ad5載體的構建含嵌合纖維的含E1溶瘤載體通過幾個步驟產(chǎn)生。首先，通過結合E.coli中的Smal-線性化pAd5LtRtSmaI和Ad5的基因組DNA，構建全長質粒，pFLAd5。產(chǎn)生的穿梭質粒pFLAd5包括以I-SceI位點為界的Ad5基因組。其次，用XhoI消化pFLAd5并且凝膠純化和自連接含Ad5的左側以及右側未端片段的片段以產(chǎn)生pAd5-LtRtXhoI。利用PCR將整個纖維編碼區(qū)刪除并且插入SwaI的識別序列以產(chǎn)生pAd5-LtRtXhodelfiber。結合XhoI-線性化pAd5LtRtXhodelfiber和CG0070(如WO2005030261中的實施例所描述)的基因組DNA產(chǎn)生含全長CG0070DNA小纖維編碼區(qū)的質粒pFLAr20pAE2fhGmdelfiber。用XbaI和EcoRV消化從Genetic TherapyInc.，(GTI)獲得的并且含編碼Ad5纖維軸與Ad35纖維結的基因的重組質粒，pFBSE5T35H，并且利用標準技術凝膠純化含嵌合纖維編碼區(qū)的片段。通過結合SwaI線性化pFLAr20pAE2fhGmdelfiber和E.coli中的凝膠純化片段，產(chǎn)生其中Ad5軸和Ad35結取代Ad5纖維編碼區(qū)的質粒，pFLAr20pAE2fGm-5T35H。通過用I-SceI消化pFLAr20pAE2fGm-5T35H并且轉染入PER.C6細胞產(chǎn)生纖維嵌合腫瘤消解腺病毒載體，OV1191。
為產(chǎn)生含E1溶瘤載體OV1192，從CRAdhUPII-Ela-IRES-Eib/Fb5/3LL-RGD的基因組DNA中獲得含編碼嵌合纖維蛋白(Ad5軸和Ad3結)基因的3.6kb EcoRI和KpnI限制性內(nèi)切酶片段，并且克隆入pBlueScript以產(chǎn)生pBlue-5T3H-RGD。其次，通過用EagI和KpnI消化pBlue-5T3H-RGD獲得跨纖維編碼區(qū)的3.16kb限制性內(nèi)切酶片段。在E.coli中，凝膠純化片段和SwaI-線性化pFLAr20pAE2fhGmdelfiber結合以產(chǎn)生pFLAr20pAE2fhGM-5T3H-RGD。用I-SceI消化所產(chǎn)生的質粒并且轉染進PER.C6細胞中以產(chǎn)生OV1192。
通過幾個步驟，產(chǎn)生了三個其它的與其位于固有E1A ATG上游的額外ATG被刪除的CG0070、OV 1191和1192相似的含E1溶瘤載體。首先，將從pFLAr21pAe2fF中獲得的左側和右側未端KpnI限制性內(nèi)切酶片段自連接以產(chǎn)生pAr21Lt & RtKpn-E2f。從全長質粒，pAr21pAE2fe(GTI)中獲得1.3-kb NheI-KpnI片段。在這個全長質粒中，已刪除E1A ATG的額外ATG上游。用限制性內(nèi)切酶片段取代來自pAr21LtRt Kpn-E2f的相應片段以產(chǎn)生pAr21LtRtKpn-E2fe。結合KpnI線性化pAr21LtRtKpn-E2fe和CG0070、OV1191和OV1192的基因組DNA，分別產(chǎn)生三個全長質粒，pFLAr20pAE2fe-5fiber，pFLAr20pAE2fe-5T35H和pFLAr20pAE2fe-5T3H-RGD。將I-SceI消化的線性化以及將pFLAr20pAE2fe-5fiber、pFLAr20pAE2fe-5T35H和pFLAr20pAE2fe-5T3H-RGD轉染進PER.C6細胞，分別產(chǎn)生OV1193、OV1194和OV1195。
此外，產(chǎn)生了中其在hTERT啟動子支配下放置E1A表達的腫瘤消解腺病毒載體。首先，為了用hTERT啟動子代替E2F-1啟動子，pAr21LtRtKpn-E2f的NheI-KpnI限制性內(nèi)切酶片段被的來源于pAr6pATrtexE3F的1293bp Nhe-KpnI片段替代。用Kpnl線性化產(chǎn)生的質粒，pAr21LtRtKpn-Trtex，并且結合來源于CG0070、OV1191、OV1192的基因組DNA以產(chǎn)生pFLAr20pATrtex-5fiber、pFLAr20pATrtex-5T35H和pFLAr20pATrtex-5T3H-RGD。將I-SceI酶消化的線性化以及將pFLAr20pATrtex-5fiber、pFLAr20pATrtex-5T35H和pFLAr20pATrtex-5T3H-RGD轉染進PER.C6細胞，分別產(chǎn)生OV1196、OV1197和OV1198。
在本文中使用的其它的腺病毒包括CV802，其是含全部野生型DNA序列的野生型Ad5并且用于正控制。Addl312是在E1a基因中具有一個缺失的無能力復制型載體，并且被用作負控制載體。
利用兩輪氯化銫密度梯度離心純化全部含E1載體。如以前所描述，利用分光光度法測定病毒顆粒滴度(例如，參見Mittereder，等1996)。
實施例10體外Ad5和嵌合纖維載體介導的人類細胞的轉導和細胞毒性。
通過將腫瘤和正常細胞系列暴露向病毒的系列稀釋物七天，測定本發(fā)明的Ad5和Ad5嵌合纖維載體的體外細胞毒性。根據(jù)廠家的說明(CellTiter 96AQueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay，Promega，Madison，WI)利用MTS細胞毒性分析測定細胞活力。未感吸收值可解釋為未感染控制的百分數(shù)并且其與載體劑量的比作圖。S形的劑量-反應曲線適于該數(shù)據(jù)并且利用GraphPad Prism軟件版本3.0計算每一復制的EC50值。EC50值是每細胞(PPC)顆粒中的載體量，其減少暴露細胞培養(yǎng)的最大光吸收的50％。
在四個典型頭和頸癌以及黑素瘤細胞系中，測試了嵌合纖維腫瘤消解腺病毒載體的體外溶細胞潛能。這些數(shù)據(jù)匯于表6和7。
表6典型的頭和頸癌細胞系的EC50值

表7典型的黑素瘤細胞系的EC50值

這些數(shù)據(jù)證明用纖維嵌合載體OV1194、OV1195、OV1197和OV1198感染的低EC50值，并且可通過高表達水平的CD46，Ad3和Ad35的原發(fā)受體，和低水平的CAR表達、黑素瘤上Ad5原發(fā)受體和HNC細胞，解釋對Ad5的相應抗性。
實施例11通過嵌合纖維Ad載體表達的人類GM-CSF水平的測定。
為評估人類GM-CSF表達，將培養(yǎng)的腫瘤細胞在50病毒顆粒/細胞下感染，在感染后24和72小時收集上清液并且經(jīng)過市售的ELISA分析(R&D Systems，Minneapolis，MN)以測定總GM-CSF表達。在分析緩沖液中，將培養(yǎng)細胞上清液稀釋10倍-1000倍。在分光光度計490nm處獲得數(shù)據(jù)并且利用SoftMax軟件包分析該數(shù)據(jù)。人類GM-CSF標準曲線通常具有＞0.995的R2值并且分析的靈敏度通常是7.8pg/mL。頭和頸癌細胞系的典型嵌合纖維載體的人類GM-CSF表達量如表8A(24小時)和表8B(72小時)所示，以及黑素瘤細胞系的如表9A(24小時)和表9B(72小時)所示。
表8A.感染后24小時典型的頭和頸癌細胞系中的人類GM-CSF表達(ng/106細胞/天)。

表8B.感染后72小時典型的頭和頸癌細胞系中的人類GM-CSF表達(ng/106細胞/天)。

表9A.感染后24小時典型的黑素瘤細胞系中的人類GM-CSF表達(ng/106細胞/天)。

表9B.感染后72小時典型黑素瘤細胞系中的人類GM-CSF表達(ng/106細胞/天)。

結果表明當用纖維嵌合載體OV1194和OV1195感染典型頭和頸癌以及黑素瘤細胞系時，在感染后24以及72小時獲得人類GM-CSF的高水平的表達。
實施例12異種移植腫瘤模型中的嵌合纖維Ad載體的體內(nèi)效能。
在含F(xiàn)aDu(頭和頸癌)或A375-luc(黑素瘤)異種移植的裸鼠中評估含E1嵌合纖維Ad載體的效能。將FaDu(100μl的Hanks緩沖鹽(HBSS)中5×106細胞)或A375-luc(在100μl HBSS中2×106)注入裸鼠(HsdAthymic Nude-nu；Simonsen laboratories，Gilroy CA)右側腹中。當腫瘤達到50-150mm3時，將小鼠分組(n＝10)并且用1×1010個顆粒的病毒劑或50μl體積劑量的PBS腫瘤內(nèi)處理四次。在二維空間內(nèi)每周兩次測定腫瘤的尺寸，并且計算腫瘤體積為W×(L)2×II/6.每處理組的平均腫瘤體積±SE平均與載體注射后的天數(shù)作圖。
實施例13一種分離、用本發(fā)明的腺病毒轉導和重引入哺乳動物的原發(fā)腫瘤細胞的方法。
從皮膚和皮下的病變，淋巴結，和肺、肝臟以及軟組織轉移病變切除腫瘤細胞。切除后，將標本無菌轉移到無菌容器并且轉運到實驗室。
所有后續(xù)程序優(yōu)選在無菌條件下進行?；蛘咄ㄟ^膠原酶處理或通過機械離解將腫瘤組織解聚，并且隨后培養(yǎng)中生長和/或用50％FCS(膠原酶處理)或者人白蛋白(機械離解)在DMSO中冷凍。培養(yǎng)的初生和次生自體腫瘤細胞的數(shù)目可擴大，隨后利用編碼hGM-CSF的本發(fā)明的重組腺病毒轉導部分或者全部細胞以產(chǎn)生hGM-CSF。
優(yōu)選在證實轉導細胞是無菌的、有活力的和并能產(chǎn)生細胞因子之后，照射轉導腫瘤細胞，懸浮在生理鹽水中，并且注射(以0.25-1.0ml)的體積在達五個不同部位皮內(nèi)和皮下注射)回原供體中。每次注射的細胞量通常在5×105-5×108之間并且在一個實施方式中在4×106-5×107細胞之間。可給于多注射。在一個實施方式中，在不同時期(例如在7天、14天、21天、1月間隔或其組合)進行多注射。在一個實施方式中，進行高達三次的注射。其中，注射計劃可取決于轉導細胞產(chǎn)量。
實施例14用于分離、用本發(fā)明的腺病毒轉導和重引入哺乳動物的原發(fā)腫瘤細胞的其它方法。
利用手術操作獲得用于疫苗制備的腫瘤組織(例如自體的)。疫苗細胞的制備涉及48小時的制造過程。疫苗由包括淋巴結、肺、胸膜積液、腎上腺、甲狀腺皮下結節(jié)和異常棘腫塊部位獲得的轉移性腫瘤制成。
簡要地，將腫瘤樣品從個體中除去，用HBSS緩沖液洗滌并且切成優(yōu)選重量為3克或以下的部分。將每一部分投入一個單獨的添加了5ml膠原酶/克組織的陪氏培養(yǎng)皿中。將腫瘤組織切碎成1-3mm3的切片并且放入細菌分離器袋中。
該體積優(yōu)選小于20ml。將袋密封并且放置在機械勻質機或者Stomacher實驗室攪拌器中并且勻化直至完全消化(通常30到40分鐘，即，直至袋的含量為具有少數(shù)未消化的組織碎片(如果存在未消化的組織碎片)的濃乳狀懸浮液)。然后用20ml生長培養(yǎng)基稀釋勻漿物，定容至最終容積為40ml，并且在4℃下2,000RPM離心10分鐘。除去上清液并且細胞小球在冰上懸浮在10ml生長培養(yǎng)基中。重復這些步驟直至將全部樣品消化并且可洗滌基本上無酶(例如膠原酶)并且懸浮在生長培養(yǎng)基中。然后可用Trypan測定細胞懸液中細胞的數(shù)目和生活力。
然后通過在4℃在2,000rpm下離心10min，將細胞懸液濃縮到用于轉導的合適濃度。然后將小球再懸浮到用于轉導的最終細胞密度(例如107細胞/ml)。將一些細胞留出用于遲發(fā)型超敏反應(Delayed TypeHypersensitivity)(DTH)測試，確立細胞系和低溫貯藏。用例如編碼人類GM-CSF的重組腺病毒轉導剩余細胞。
通過增加的細胞總數(shù)(死的+有活力的，在腫瘤消化之后計算)測定需要進行轉導的噬菌斑形成單位(pfu)或者病毒顆粒的數(shù)目。例如，如果要求10感染復數(shù)，細胞的總數(shù)乘以10。然后在培養(yǎng)基中將病毒稀釋到最終濃度的10倍。然后，將每毫升腫瘤懸浮液0.1毫升的腺病毒GM-CSF懸浮液加入細胞懸液。重組腺病毒可以是，例如，具有引入E1刪除區(qū)的人類GM-CSF cDNA的標準第一代基因刪除的E1和E3復制缺陷病毒。當然，可將細胞因子cDNA引入病毒基因組的其它區(qū)。
每10分鐘一次的溫柔混合，在室溫下(即大約23-25℃)將細胞培養(yǎng)1小時。通過將適當體積的生長培養(yǎng)基加入腫瘤細胞懸浮液，然后腫瘤細胞懸浮液的體積加倍。將細胞懸液轉移到合適的組織培養(yǎng)容器中并且在37℃下培養(yǎng)細胞。
在37℃下，用重組腺病毒整夜轉導腫瘤細胞。在整夜轉導之后，用HBSS仔細洗滌細胞，并且然后用γ輻射源10,000Rads下照射24小時?？赡軐⑿〔糠值募毎?達總數(shù)的10％)放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。
如果GM-CSF是轉基因，來自轉導細胞的GM-CSF分泌物可利用ELISA(例如利用市售的試劑盒，例如來自R&D實驗室，Minneapolis，MN)測定以證明GM-CSF產(chǎn)量的適合目標等級。在本發(fā)明的一些實施方式中，目標等級為至少20ng GM-CSF/106細胞/24小時，為至少40ngGM-CSF/106細胞/24小時，至少100ng GM-CSF/106細胞/24小時或者超過1000ng GM-CSF/106細胞/24小時。
此外，可進行用于細菌和真菌的常規(guī)培養(yǎng)以確保操作細胞的無菌狀態(tài)。然后，用于接種疫苗和免疫學評估的細胞在10％DMSO/90％胎牛血清中冷凍并且貯藏于液氮中。
接種疫苗操作的實例如下。用HBSS溶液將細胞解凍并且洗滌兩次。對于引入，將在引入之前解凍不超過1小時的細胞再懸浮于具有無菌鹽的總體積至多1ml的緩沖液中。優(yōu)選給予總共不超過1ml的體積，接種疫苗組成單一注射，用23或25計量針皮內(nèi)注入交替堿基的上臂或者股節(jié)。每一注射的總體積取決于引入的劑量水平。
序列表中序列的描述因此，與同時公開有關的序列表和同時公開的內(nèi)容結合引入作為參考。以下是包含于序列表中的序列的描述SEQ ID NO1是編碼Ad5纖維蛋白(Ad5-CMV5-GFP；Bp位置28338-30083)的核苷酸序列SEQ ID NO2是Ad5纖維氨基酸序列，長度為581氨基酸。
SEQ ID NO3是編碼Ad2纖維蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO4是Ad2纖維氨基酸序列SEQ ID NO5是編碼Ad35纖維蛋白(Ad5-CMV5-GFP-35F；Bp位置28337-29308)的核苷酸序列SEQ ID NO6是Ad35纖維氨基酸序列，長度為323氨基酸。
SEQ ID NO7是腺病毒纖維共有基序，KLGXGLXFD/NSEQ ID NO8是編碼5T35H纖維蛋白(Ad5-CMV5-GFP-5T35H；Bp位置28338-30110)的基因(ORF)的核苷酸序列SEQ ID NO9是5T35H纖維的氨基酸順序(尾部和軸來源于Ad5，結區(qū)獲得自Ad35)長度為590氨基酸。
SEQ ID NO10是編碼5T3H纖維蛋白(Ad5-CMV5-GFP-5T3H；Bp位置28338-30097)的基因(ORF)的核苷酸序列
SEQ ID NO11是5T3H纖維的氨基酸序列(尾部和軸來源于Ad5，結區(qū)獲得自Ad3)長度為587氨基酸SEQ ID NO12是編碼5T3H-RGD纖維蛋白(Ad5-CMV5-GFP-5T3H；Bp位置30217-32052)的基因(ORF)的核苷酸序列SEQ ID NO13是5T3H-RGD纖維的氨基酸序列(尾部和軸來源于Ad5，結區(qū)獲得自Ad3)長度為611氨基酸。RGD序列位于纖維蛋白的羧基末端。
SEQ ID NO14是hGM-CSF的氨基酸序列SEQ ID NO15是編碼hGM-CSF的核苷酸序列SEQ ID NO16是編碼hGM-CSF的cDNA的核苷酸序列SEQ ID NO17是腺病毒5PCR引物1SEQ ID NO18是腺病毒5PCR引物2SEQ ID NO19是腺病毒5PCR引物3SEQ ID NO20是腺病毒5PCR引物4SEQ ID NO21是人類GM-CSF PCR引物PSR3SEQ ID NO22是人類GM-CSF PCR引物PSR4SEQ ID NO23是SV40晚期聚(A)信號PCR引物PSR6SEQ ID NO24是SV40晚期聚(A)信號PCR引物PSR7SEQ ID NO25是來源于弗林蛋白酶切割位點的氨基酸殘基RKKR，其可通過羧肽酶除去。
SEQ ID NO26是來源于弗林蛋白酶切割位點的氨基酸殘基RKRR，其可通過羧肽酶除去。
SEQ ID NO27是來源于弗林蛋白酶切割位點的氨基酸殘基RRRR，其可通過羧肽酶除去。
序列表<110>細胞基因系統(tǒng)有限公司<120>用于腫瘤細胞的增強轉導的纖維修飾腺病毒載體<130>3802-105-11 PCT<140>
<141>
<150>60/604,009<151>2004-08-25<160>27<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1746<212>DNA<213>腺病毒型5<400>1atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata tgacacggaa 60accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg tatcccccaa tgggtttcaa120gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc ctatccgaac ctctagttac ctccaatggc180atgcttgcgc tcaaaatggg caacggcctc tctctggacg aggccggcaa ccttacctcc240caaaatgtaa ccactgtgag cccacctctc aaaaaaacca agtcaaacat aaacctggaa300atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg tggctgccgc cgcacctcta360atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggccc cgctaaccgt gcacgactcc420aaacttagca ttgccaccca aggacccctc acagtgtcag aaggaaagct agccctgcaa480acatcaggcc ccctcaccac caccgatagc agtaccctta ctatcactgc ctcaccccct540ctaactactg ccactggtag cttgggcatt gacttgaaag agcccattta tacacaaaat600ggaaaactag gactaaagta cggggctcct ttgcatgtaa cagacgacct aaacactttg660accgtagcaa ctggtccagg tgtgactatt aataatactt ccttgcaaac taaagttact720ggagccttgg gttttgattc acaaggcaat atgcaactta atgtagcagg aggactaagg780attgattctc aaaacagacg ccttatactt gatgttagtt atccgtttga tgctcaaaac840caactaaatc taagactagg acagggccct ctttttataa actcagccca caacttggat900attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa acaattccaa aaagcttgag960gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgcta cagccatagc cattaatgca 1020
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Ala Ile Asn Ala Gly Asp Gly Leu Glu Phe Gly Ser Pro Asn Ala Pro340 345 350Asn Thr Asn Pro Leu Lys Thr Lys Ile Gly His Gly Leu Glu Phe Asp355 360 365Ser Asn Lys Ala Met Val Pro Lys Leu Gly Thr Gly Leu Ser Phe Asp370 375 380Ser Thr Gly Ala Ile Thr Val Gly Asn Lys Asn Asn Asp Lys Leu Thr385 390 395 400Leu Trp Thr Thr Pro Ala Pro Ser Pro Asn Cys Arg Leu Asn Ala Glu405 410 415Lys Asp Ala Lys Leu Thr Leu Val Leu Thr Lys Cys Gly Ser Gln Ile420 425 430Leu Ala Thr Val Ser Val Leu Ala Val Lys Gly Ser Leu Ala Pro Ile435 440 445Ser Gly Thr Val Gln Ser Ala His Leu Ile Ile Arg Phe Asp Glu Asn450 455 460Gly Val Leu Leu Asn Asn Ser Phe Leu Asp Pro Glu Tyr Trp Asn Phe465 470 475 480Arg Asn Gly Asp Leu Thr Glu Gly Thr Ala Tyr Thr Asn Ala Val Gly485 490 495Phe Met Pro Asn Leu Ser Ala Tyr Pro Lys Ser His Gly Lys Thr Ala500 505 510Lys Ser Asn Ile Val Ser Gln Val Tyr Leu Asn Gly Asp Lys Thr Lys515 520 525Pro Val Thr Leu Thr Ile Thr Leu Asn Gly Thr Gln Glu Thr Gly Asp530 535 540Thr Thr Pro Ser Ala Tyr Ser Met Ser Phe Ser Trp Asp Trp Ser Gly545 550 555 560
His Asn Tyr Ile Asn Glu Ile Phe Ala Thr Ser Ser Tyr Thr Phe Ser565 570 575Tyr Ile Ala Gln Glu580<210>3<211>1749<212>DNA<213>腺病毒型2<400>3atgaaacgcg ccagaccgtc tgaagacacc ttcaaccccg tgtatccata tgacacagaa 60accgggcctc caactgtgcc ctttcttacc cctccatttg tttcacccaa tggtttccaa120gaaagtcccc ctggagttct ctctctacgc gtctccgaac ctttggacac ctcccacggc180atgcttgcgc ttaaaatggg cagcggtctt accctagaca aggccggaaa cctcacctcc240caaaatgtaa ccactgttac tcagccactt aaaaaaacaa agtcaaacat aagtttggac300acctccgcac cacttacaat tacctcaggc gccctaacag tggcaaccac cgctcctctg360atagttacta gcggcgctct tagcgtacag tcacaagccc cactgaccgt gcaagactcc420aaactaagca ttgctactaa agggcccatt acagtgtcag atggaaagct agccctgcaa480acatcagccc ccctctctgg cagtgacagc gacaccctta ctgtaactgc atcacccccg540ctaactactg ccacgggtag cttgggcatt aacatggaag atcctattta tgtaaataat600ggaaaaatag gaattaaaat aagcggtcct ttgcaagtag cacaaaactc cgatacacta660acagtagtta ctggaccagg tgtcaccgtt gaacaaaact cccttagaac caaagttgca720ggagctattg gttatgattc atcaaacaac atggaaatta aaacgggcgg tggcatgcgt780ataaataaca acttgttaat tctagatgtg gattacccat ttgatgctca aacaaaacta840cgtcttaaac tggggcaggg acccctgtat attaatgcat ctcataactt ggacataaac900tataacagag gcctatacct ttttaatgca tcaaacaata ctaaaaaact ggaagttagc960ataaaaaaat ccagtggact aaactttgat aatactgcca tagctataaa tgcaggaaag 1020ggtctggagt ttgatacaaa cacatctgag tctccagata tcaacccaat aaaaactaaa 1080attggctctg gcattgatta caatgaaaac ggtgccatga ttactaaact tggagcgggt 1140ttaagctttg acaactcagg ggccattaca ataggaaaca aaaatgatga caaacttacc 1200ctgtggacaa ccccagaccc atctcctaac tgcagaattc attcagataa tgactgcaaa 1260tttactttgg ttcttacaaa atgtgggagt caagtactag ctactgtagc tgctttggct 1320
gtatctggag atctttcatc catgacaggc accgttgcaa gtgttagtat attccttaga 1380tttgaccaaa acggtgttct aatggagaac tcctcactta aaaaacatta ctggaacttt 1440agaaatggga actcaactaa tgcaaatcca tacacaaatg cagttggatt tatgcctaac 1500cttctagcct atccaaaaac ccaaagtcaa actgctaaaa ataacattgt cagtcaagtt 1560tacttgcatg gtgataaaac taaacctatg atacttacca ttacacttaa tggcactagt 1620gaatccacag aaactagcga ggtaagcact tactctatgt cttttacatg gtcctgggaa 1680agtggaaaat acaccactga aacttttgct accaactctt acaccttctc ctacattgcc 1740caggaataa 1749<210>4<211>582<212>PRT<213>腺病毒型2<400>4Met Lys Arg Ala Arg Pro Ser Glu Asp Thr Phe Asn Pro Val Tyr Pro1 5 10 15Tyr Asp Thr Glu Thr Gly Pro Pro Thr Val Pro Phe Leu Thr Pro Pro20 25 30Phe Val Ser Pro Asn Gly Phe Gln Glu Ser Pro Pro Gly Val Leu Ser35 40 45Leu Arg Val Ser Glu Pro Leu Asp Thr Ser His Gly Met Leu Ala Leu50 55 60Lys Met Gly Ser Gly Leu Thr Leu Asp Lys Ala Gly Asn Leu Thr Ser65 70 75 80Gln Asn Val Thr Thr Val Thr Gln Pro Leu Lys Lys Thr Lys Ser Asn85 90 95Ile Ser Leu Asp Thr Ser Ala Pro Leu Thr Ile Thr Ser Gly Ala Leu100 105 110Thr Val Ala Thr Thr Ala Pro Leu Ile Val Thr Ser Gly Ala Leu Ser115 120 125Val Gln Ser Gln Ala Pro Leu Thr Val Gln Asp Ser Lys Leu Ser Ile130 135 140
Ala Thr Lys Gly Pro Ile Thr Val Ser Asp Gly Lys Leu Ala Leu Gln145 150 155 160Thr Ser Ala Pro Leu Ser Gly Ser Asp Ser Asp Thr Leu Thr Val Thr165 170 175Ala Ser Pro Pro Leu Thr Thr Ala Thr Gly Ser Leu Gly Ile Asn Met180 185 190Glu Asp Pro Ile Tyr Val Asn Asn Gly Lys Ile Gly Ile Lys Ile Ser195 200 205Gly Pro Leu Gln Val Ala Gln Asn Ser Asp Thr Leu Thr Val Val Thr210 215 220Gly Pro Gly Val Thr Val Glu Gln Asn Ser Leu Arg Thr Lys Val Ala225 230 235 240Gly Ala Ile Gly Tyr Asp Ser Ser Asn Asn Met Glu Ile Lys Thr Gly245 250 255Gly Gly Met Arg Ile Asn Asn Asn Leu Leu Ile Leu Asp Val Asp Tyr260 265 270Pro Phe Asp Ala Gln Thr Lys Leu Arg Leu Lys Leu Gly Gln Gly Pro275 280 285Leu Tyr Ile Asn Ala Ser His Asn Leu Asp Ile Asn Tyr Asn Arg Gly290 295 300Leu Tyr Leu Phe Asn Ala Ser Asn Asn Thr Lys Lys Leu Glu Val Ser305 310 315 320Ile Lys Lys Ser Ser Gly Leu Asn Phe Asp Asn Thr Ala Ile Ala Ile325 330 335Asn Ala Gly Lys Gly Leu Glu Phe Asp Thr Asn Thr Ser Glu Ser Pro340 345 350Asp Ile Asn Pro Ile Lys Thr Lys Ile Gly Ser Gly Ile Asp Tyr Asn355 360 365
Glu Asn Gly Ala Met Ile Thr Lys Leu Gly Ala Gly Leu Ser Phe Asp370 375 380Asn Ser Gly Ala Ile Thr Ile Gly Asn Lys Asn Asp Asp Lys Leu Thr385 390 395 400Leu Trp Thr Thr Pro Asp Pro Ser Pro Asn Cys Arg Ile His Ser Asp405 410 415Asn Asp Cys Lys Phe Thr Leu Val Leu Thr Lys Cys Gly Ser Gln Val420 425 430Leu Ala Thr Val Ala Ala Leu Ala Val Ser Gly Asp Leu Ser Ser Met435 440 445Thr Gly Thr Val Ala Ser Val Ser Ile Phe Leu Arg Phe Asp Gln Asn450 455 460Gly Val Leu Met Glu Asn Ser Ser Leu Lys Lys His Tyr Trp Asn Phe465 470 475 480Arg Asn Gly Asn Ser Thr Asn Ala Asn Pro Tyr Thr Asn Ala Val Gly485 490 495Phe Met Pro Asn Leu Leu Ala Tyr Pro Lys Thr Gln Ser Gln Thr Ala500 505 510Lys Asn Asn Ile Val Ser Gln Val Tyr Leu His Gly Asp Lys Thr Lys515 520 525Pro Met Ile Leu Thr Ile Thr Leu Asn Gly Thr Ser Glu Ser Thr Glu530 535 540Thr Ser Glu Val Ser Thr Tyr Ser Met Ser Phe Thr Trp Ser Trp Glu545 550 555 560Ser Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Thr Phe Ala Thr Asn Ser Tyr Thr Phe565 570 575Ser Tyr Ile Ala Gln Glu580
<210>5<211>972<212>DNA<213>腺病毒型35<400>5atgaccaaga gagtccggct cagtgactcc ttcaaccctg tctaccccta tgaagatgaa 60agcacctccc aacacccctt tataaaccca gggtttattt ccccaaatgg cttcacacaa120agcccagacg gagttcttac tttaaaatgt ttaaccccac taacaaccac aggcggatct180ctacagctaa aagtgggagg gggacttaca gtggatgaca ctgatggtac cttacaagaa240aacatacgtg ctacagcacc cattactaaa aataatcact ctgtagaact atccattgga300aatggattag aaactcaaaa caataaacta tgtgccaaat tgggaaatgg gttaaaattt360aacaacggtg acatttgtat aaaggatagt attaacacct tatggactgg aataaaccct420ccacctaact gtcaaattgt ggaaaacact aatacaaatg atggcaaact tactttagta480ttagtaaaaa atggagggct tgttaatggc tacgtgtctc tagttggtgt atcagacact540gtgaaccaaa tgttcacaca aaagacagca aacatccaat taagattata ttttgactct600tctggaaatc tattaactga ggaatcagac ttaaaaattc cacttaaaaa taaatcttct660acagcgacca gtgaaactgt agccagcagc aaagccttta tgccaagtac tacagcttat720cccttcaaca ccactactag ggatagtgaa aactacattc atggaatatg ttactacetg780actagttatg atagaagtct atttcccttg aacatttcta taatgctaaa cagccgtatg840atttcttcca atgttgccta tgccatacaa tttgaatgga atctaaatgc aagtgaatct900ccagaaagca acatagctac gctgaccaca tccccctttt tcttttctta cattacagaa960gacgacgaat aa972<210>6<211>323<212>PRT<213>腺病毒型35<400>6Met Thr Lys Arg Val Arg Leu Ser Asp Ser Phe Asn Pro Val Tyr Pro1 5 10 15Tyr Glu Asp Glu Ser Thr Ser Gln His Pro Phe Ile Asn Pro Gly Phe20 25 30Ile Ser Pro Asn Gly Phe Thr Gln Ser Pro Asp Gly Val Leu Thr Leu35 40 45
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Ser Ile Met Leu Asn Ser Arg Met Ile Ser Ser Asn Val Ala Tyr Ala275 280 285Ile Gln Phe Glu Trp Asn Leu Asn Ala Ser Glu Ser Pro Glu Ser Asn290 295 300Ile Ala Thr Leu Thr Thr Ser Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ile Thr Glu305 310 315 320Asp Asp Glu<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成腺病毒2纖維共有基序<220>
<221>MOD_RES<222>(4)<223>可變氨基酸<220>
<221>MOD_RES<222>(7)<223>可變氨基酸<220>
<221>MOD_RES<222>(9)<223>Asn或Asp<400>7Lys Leu Gly Xaa Gly Leu Xaa Phe Xaa1 5<210>8<211>1773<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述編碼5T35H纖維蛋白(Ad5-CMV5-GFP-5T35H；Bp位置28338-30110)的基因地合成核苷酸序列<400>8atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata tgacacggaa 60
accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg tatcccccaa tgggtttcaa120gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc ctatccgaac ctctagttac ctccaatggc180atgcttgcgc tcaaaatggg caacggcctc tctctggacg aggccggcaa ccttacctcc240caaaatgtaa ccactgtgag cccacctctc aaaaaaacca agtcaaacat aaacctggaa300atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg tggctgccgc cgcacctcta360atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggccc cgctaaccgt gcacgactcc420aaacttagca ttgccaccca aggacccctc acagtgtcag aaggaaagct agccctgcaa480acatcaggcc ccctcaccac caccgatagc agtaccctta ctatcactgc ctcaccccct540ctaactactg ccactggtag cttgggcatt gacttgaaag agcccattta tacacaaaat600ggaaaactag gactaaagta cggggctcct ttgcatgtaa cagacgacct aaacactttg660accgtagcaa ctggtccagg tgtgactatt aataatactt ccttgcaaac taaagttact720ggagccttgg gttttgattc acaaggcaat atgcaactta atgtagcagg aggactaagg780attgattctc aaaacagacg ccttatactt gatgttagtt atccgtttga tgctcaaaac840caactaaatc taagactagg acagggccct ctttttataa actcagccca caacttggat900attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa acaattccaa aaagcttgag960gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgcta cagccatagc cattaatgca 1020ggagatgggc ttgaatttgg ttcacctaat gcaccaaaca caaatcccct caaaacaaaa 1080attggccatg gcctagaatt tgattcaaac aaggctatgg ttcctaaact aggaactggc 1140cttagttttg acagcacagg tgccattaca gtaggaaaca aaaataatga taagctaact 1200ttgtggaccg gaataaaccc tccacctaac tgtcaaattg tggaaaacac taatacaaat 1260gatggcaaac ttactttagt attagtaaaa aatggagggc ttgttaatgg ctacgtgtct 1320ctagttggtg tatcagacac tgtgaaccaa atgttcacac aaaagacagc aaacatccaa 1380ttaagattat attttgactc ttctggaaat ctattaactg aggaatcaga cttaaaaatt 1440ccacttaaaa ataaatcttc tacagcgacc agtgaaactg tagccagcag caaagccttt 1500atgccaagta ctacagctta tcccttcaac accactacta gggatagtga aaactacatt 1560catggaatat gttactacat gactagttat gatagaagtc tatttccctt gaacatttct 1620ataatgctaa acagccgtat gatttcttcc aatgttgcct atgccataca atttgaatgg 1680aatctaaatg caagtgaatc tccagaaagc aacatagcta cgctgaccac atcccccttt 1740ttcttttctt acattacaga agacgacgaa taa1773
<210>9<211>590<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5T35H纖維的合成氨基酸序列(來源于Ad5的尾和軸和從Ad35獲得的結區(qū))<400>9Met Lys Arg Ala Arg Pro Ser Glu Asp Thr Phe Asn Pro Val Tyr Pro1 5 10 15Tyr Asp Thr Glu Thr Gly Pro Pro Thr Val Pro Phe Leu Thr Pro Pro20 25 30Phe Val Ser Pro Asn Gly Phe Gln Glu Ser Pro Pro Gly Val Leu Ser35 40 45Leu Arg Leu Ser Glu Pro Leu Val Thr Ser Asn Gly Met Leu Ala Leu50 55 60Lys Met Gly Asn Gly Leu Ser Leu Asp Glu Ala Gly Asn Leu Thr Ser65 70 75 80Gln Asn Val Thr Thr Val Ser Pro Pro Leu Lys Lys Thr Lys Ser Asn85 90 95Ile Asn Leu Glu Ile Ser Ala Pro Leu Thr Val Thr Ser Glu Ala Leu100 105 110Thr Val Ala Ala Ala Ala Pro Leu Met Val Ala Gly Asn Thr Leu Thr115 120 125Met Gln Ser Gln Ala Pro Leu Thr Val His Asp Ser Lys Leu Ser Ile130 135 140Ala Thr Gln Gly Pro Leu Thr Val Ser Glu Gly Lys Leu Ala Leu Gln145 150 155 160Thr Ser Gly Pro Leu Thr Thr Thr Asp Ser Ser Thr Leu Thr Ile Thr165 170 175
Ala Ser Pro Pro Leu Thr Thr Ala Thr Gly Ser Leu Gly Ile Asp Leu180 185 190Lys Glu Pro Ile Tyr Thr Gln Asn Gly Lys Leu Gly Leu Lys Tyr Gly195 200 205Ala Pro Leu His Val Thr Asp Asp Leu Asn Thr Leu Thr Val Ala Thr210 215 220Gly Pro Gly Val Thr Ile Asn Asn Thr Ser Leu Gln Thr Lys Val Thr225 230 235 240Gly Ala Leu Gly Phe Asp Ser Gln Gly Asn Met Gln Leu Asn Val Ala245 250 255Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ser Gln Asn Arg Arg Leu Ile Leu Asp Val260 265 270Ser Tyr Pro Phe Asp Ala Gln Asn Gln Leu Asn Leu Arg Leu Gly Gln275 280 285Gly Pro Leu Phe Ile Asn Ser Ala His Asn Leu Asp Ile Asn Tyr Asn290 295 300Lys Gly Leu Tyr Leu Phe Thr Ala Ser Asn Asn Ser Lys Lys Leu Glu305 310 315 320Val Asn Leu Ser Thr Ala Lys Gly Leu Met Phe Asp Ala Thr Ala Ile325 330 335Ala Ile Asn Ala Gly Asp Gly Leu Glu Phe Gly Ser Pro Asn Ala Pro340 345 350Asn Thr Asn Pro Leu Lys Thr Lys Ile Gly His Gly Leu Glu Phe Asp355 360 365Ser Asn Lys Ala Met Val Pro Lys Leu Gly Thr Gly Leu Ser Phe Asp370 375 380Ser Thr Gly Ala Ile Thr Val Gly Asn Lys Asn Asn Asp Lys Leu Thr385 390 395 400Leu Trp Thr Gly Ile Asn Pro Pro Pro Asn Cys Gln Ile Val Glu Asn405 410 415
Thr Asn Thr Asn Asp Gly Lys Leu Thr Leu Val Leu Val Lys Asn Gly420 425 430Gly Leu Val Asn Gly Tyr Val Ser Leu Val Gly Val Ser Asp Thr Val435 440 445Asn Gln Met Phe Thr Gln Lys Thr Ala Asn Ile Gln Leu Arg Leu Tyr450 455 460Phe Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Thr Glu Glu Ser Asp Leu Lys Ile465 470 475 480Pro Leu Lys Asn Lys Ser Ser Thr Ala Thr Ser Glu Thr Val Ala Ser485 490 495Ser Lys Ala Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Thr Thr500 505 510Thr Arg Asp Ser Glu Asn Tyr Ile His Gly Ile Cys Tyr Tyr Met Thr515 520 525Ser Tyr Asp Arg Ser Leu Phe Pro Leu Asn Ile Ser Ile Met Leu Asn530 535 540Ser Arg Met Ile Ser Ser Asn Val Ala Tyr Ala Ile Gln Phe Glu Trp545 550 555 560Asn Leu Asn Ala Ser Glu Ser Pro Glu Ser Asn Ile Ala Thr Leu Thr565 570 575Thr Ser Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ile Thr Glu Asp Asp Glu580 585 590<210>10<211>1764<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5T3H纖維蛋白質(Ad5-CMV5-GFP-5T3H；Bp位置28338-30097)的基因的合成核苷酸序列
<400>10atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata tgacacggaa 60accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg tatcccccaa tgggtttcaa120gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc ctatccgaac ccctagttac ctccaatggc180atgcttgcgc tcaaaatggg caacggcctc tctctggacg aggccggcaa ccttacctcc240caaaatgtaa ccactgtgag cccacctctc aaaaaaacca agtcaaacat aaacctggaa300atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg tggctgccgc cgcacctcta360atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggccc cgctaaccgt gcacgactcc420aaacttagca ttgccaccca aggacccctc acagtgtcag aaggaaagct agccctgcaa480acatcaggcc ccctcaccac caccgatagc agtaccctta ctatcactgc ctcaccccct540ctaactactg ccactggtag cttgggcatt gacttgaaag agcccattta tacacaaaat600ggaaaactag gactaaagta cggggctcct ttgcatgtaa cagacgacct aaacactttg660accgtagcaa ctggtccagg tgtgactatt aataatactt ccttgcaaac taaagttact720ggagccttgg gttttgattc acaaggcaat atgcaactta atgtagcagg aggactaagg780attgattctc aaaacagacg ccttatactt gatgttagtt atccgtttga tgctcaaaac840caactaaatc taagactagg acagggccct ctttttataa actcagccca caacttggat900attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa acaattccaa aaagcttgag960gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgcta cagccatagc cattaatgca 1020ggagatgggc ttgaatttgg ttcacctaat gcaccaaaca caaatcccct caaaacaaaa 1080attggccatg gcctagaatt tgattcaaac aaggctatgg ttcctaaact aggaactggc 1140cttagttttg acagcacagg tgccattaca gtaggaaaca aaaataatga taagctaact 1200ttgtggaccg gtccaaaacc agaagccaac tgcataattg aatacgggaa acaaaaccca 1260gatagcaaac taactttaat ccttgtaaaa aatggaggaa ttgttaatgg atatgtaacg 1320ctaatgggag cctcagacta cgttaacacc ttatttaaaa acaaaaatgt ctccattaat 1380gtagaactat actttgatgc cactggtcat atattaccag actcatcttc tcttaaaaca 1440gatctagaac taaaatacaa gcaaaccgct gactttagtg caagaggttt tatgccaagt 1500actacagcgt atccatttgt ccttcctaat gcgggaacac ataatgaaaa ttatattttt 1560ggtcaatgct actacaaagc aagcgatggt gccctttttc cgttggaagt tactgttatg 1620cttaataaac gcctgccaga tagtcgcaca tcctatgtta tgactttttt atggtccttg 1680aatgctggtc tagctccaga aactactcag gcaaccctca taacctcccc atttaccttt 1740
tcctatatta gagaagatga ataa 1764<210>11<211>587<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5T3H纖維的合成氨基酸序列(來源于Ad5的尾和軸和從Ad3獲得的結區(qū))<400>11Met Lys Arg Ala Arg Pro Ser Glu Asp Thr Phe Asn Pro Val Tyr Pro1 5 10 15Tyr Asp Thr Glu Thr Gly Pro Pro Thr Val Pro Phe Leu Thr Pro Pro20 25 30Phe Val Ser Pro Asn Gly Phe Gln Glu Ser Pro Pro Gly Val Leu Ser35 40 45Leu Arg Leu Ser Glu Pro Leu Val Thr Ser Asn Gly Met Leu Ala Leu50 55 60Lys Met Gly Asn Gly Leu Ser Leu Asp Glu Ala Gly Asn Leu Thr Ser65 70 75 80Gln Asn Val Thr Thr Val Ser Pro Pro Leu Lys Lys Thr Lys Ser Asn85 90 95Ile Asn Leu Glu Ile Ser Ala Pro Leu Thr Val Thr Ser Glu Ala Leu100 105 110Thr Val Ala Ala Ala Ala Pro Leu Met Val Ala Gly Asn Thr Leu Thr115 120 125Met Gln Ser Gln Ala Pro Leu Thr Val His Asp Ser Lys Leu Ser Ile130 135 140Ala Thr Gln Gly Pro Leu Thr Val Ser Glu Gly Lys Leu Ala Leu Gln145 150 155 160Thr Ser G1y Pro Leu Thr Thr Thr Asp Ser Ser Thr Leu Thr Ile Thr165 170 175
Ala Ser Pro Pro Leu Thr Thr Ala Thr Gly Ser Leu Gly Ile Asp Leu180 185 190Lys Glu Pro Ile Tyr Thr Gln Asn Gly Lys Leu Gly Leu Lys Tyr Gly195 200 205Ala Pro Leu His Val Thr Asp Asp Leu Asn Thr Leu Thr Val Ala Thr210 215 220Gly Pro Gly Val Thr Ile Asn Asn Thr Ser Leu Gln Thr Lys Val Thr225 230 235 240Gly Ala Leu Gly Phe Asp Ser Gln Gly Asn Met Gln Leu Asn Val Ala245 250 255Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ser Gln Asn Arg Arg Leu Ile Leu Asp Val260 265 270Ser Tyr Pro Phe Asp Ala Gln Asn Gln Leu Asn Leu Arg Leu Gly Gln275 280 285Gly Pro Leu Phe Ile Asn Ser Ala His Asn Leu Asp Ile Asn Tyr Asn290 295 300Lys Gly Leu Tyr Leu Phe Thr Ala Ser Asn Asn Ser Lys Lys Leu Glu305 310 315 320Val Asn Leu Ser Thr Ala Lys G1y Len Met Phe Asp Ala Thr Ala Ile325 330 335Ala Ile Asn Ala Gly Asp Gly Leu Glu Phe Gly Ser Pro Asn Ala Pro340 345 350Asn Thr Asn Pro Leu Lys Thr Lys Ile Gly His Gly Leu Glu Phe Asp355 360 365Ser Asn Lys Ala Met Val Pro Lys Leu Gly Thr Gly Leu Ser Phe Asp370 375 380Ser Thr Gly Ala Ile Thr Val Gly Asn Lys Asn Asn Asp Lys Leu Thr385 390 395 400
Leu Trp Thr Gly Pro Lys Pro Glu Ala Asn Cys Ile Ile Glu Tyr Gly405 410 415Lys Gln Asn Pro Asp Ser Lys Leu Thr Leu Ile Leu Val Lys Asn Gly420 425 430Gly Ile Val Asn Gly Tyr Val Thr Leu Met Gly Ala Ser Asp Tyr Val435 440 445Asn Thr Leu Phe Lys Asn Lys Asn Val Ser Ile Asn Val Glu Leu Tyr450 455 460Phe Asp Ala Thr Gly His Ile Leu Pro Asp Ser Ser Ser Leu Lys Thr465 470 475 480Asp Leu Glu Leu Lys Tyr Lys Gln Thr Ala Asp Phe Ser Ala Arg Gly485 490 495Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Val Leu Pro Asn Ala Gly500 505 510Thr His Asn Glu Asn Tyr Ile Phe Gly Gln Cys Tyr Tyr Lys Ala Ser515 520 525Asp Gly Ala Leu Phe Pro Leu Glu Val Thr Val Met Leu Asn Lys Arg530 535 540Leu Pro Asp Ser Arg Thr Ser Tyr Val Met Thr Phe Leu Trp Ser Leu545 550 555 560Asn Ala Gly Leu Ala Pro Glu Thr Thr Gln Ala Thr Leu Ile Thr Ser565 570 575Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp Glu580 585<210>12<211>1836<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5T3H-RGD纖維蛋白質(Ad5-CMV5-GFP-5T3H-RGD；Bp位置30217-32052)的基因的合成核苷酸序列
<400>12atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata tgacacggaa 60accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg tatcccccaa tgggtttcaa120gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc ctatccgaac ctctagttac ctccaatggc180atgcttgcgc tcaaaatggg caacggcctc tctctggacg aggccggcaa ccttacctcc240caaaatgtaa ccactgtgag cccacctctc aaaaaaacca agtcaaacat aaacctggaa300atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg tggctgccgc cgcacctcta360atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggccc cgctaaccgt gcacgactcc420aaacttagca ttgccaccca aggacccctc acagtgtcag aaggaaagct agccctgcaa480acatcaggcc ccctcaccac caccgatagc agtaccctta ctatcactgc ctcaccccct540ctaactactg ccactggtag cttgggcatt gacttgaaag agcccattta tacacaaaat600ggaaaactag gactaaagta cggggctcct ttgcatgtaa cagacgacct aaacactttg660accgtagcaa ctggtccagg tgtgactatt aataatactt ccttgcaaac taaagttact720ggagccttgg gttttgattc acaaggcaat atgcaactta atgtagcagg aggactaagg780attgattctc aaaacagacg ccttatactt gatgttagtt atccgtttga tgctcaaaac840caactaaatc taagactagg acagggccct ctttttataa actcagccca caacttggat900attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa acaattccaa aaagcttgag960gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgcta cagccatagc cattaatgca 1020ggagatgggc ttgaatttgg ttcacctaat gcaccaaaca caaatcccct caaaacaaaa 1080attggccatg gcctagaatt tgattcaaac aaggctatgg ttcctaaact aggaactggc 1140cttagttttg acagcacagg tgccattaca gtaggaaaca aaaataatga taagctaacc 1200ctatggacag gtccaaaacc agaagccaac tgcataattg aatacgggaa acaaaaccca 1260gatagcaaac taactttaat ccttgtaaaa aatggaggaa ttgttaatgg atatgtaacg 1320ctaatgggag cctcagacta cgttaacacc ttatttaaaa acaaaaatgt ctccattaat 1380gtagaactat actttgatgc cactggtcat atattaccag actcatcttc tcttaaaaca 1440gatctagaac taaaatacaa gcaaaccgct gactttagtg caagaggttt tatgccaagt 1500actacagcgt atccatttgt ccttcctaat gcgggaacac ataatgaaaa ttatattttt 1560ggtcaatgct actacaaagc aagcgatggt gccctttttc cgttggaagt tactgttatg 1620cttaataaac gcctgccaga tagtcgcaca tcctatgtta tgactttttt atggtccttg 1680
aatgctggtc tagctccaga aactactcag gcaaccctca taacctcccc atttaccttt 1740tcctatatta gagaagatga cggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 1800ggatcctgtg actgccgcgg agactgtttc tgctaa 1836<210>13<211>611<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5T3H-RGD纖維的合成氨基酸序列(來源于Ad5的尾和軸和從Ad3獲得的結區(qū))<400>13Met Lys Arg Ala Arg Pro Ser Glu Asp Thr Phe Asn Pro Val Tyr Pro1 5 10 15Tyr Asp Thr Glu Thr Gly Pro Pro Thr Val Pro Phe Leu Thr Pro Pro20 25 30Phe Val Ser Pro Asn Gly Phe Gln Glu Ser Pro Pro Gly Val Leu Ser35 40 45Leu Arg Leu Ser Glu Pro Leu Val Thr Ser Asn Gly Met Leu Ala Leu50 55 60Lys Met Gly Asn Gly Leu Ser Leu Asp Glu Ala Gly Asn Leu Thr Ser65 70 75 80Gln Asn Val Thr Thr Val Ser Pro Pro Leu Lys Lys Thr Lys Ser Asn85 90 95Ile Asn Leu Glu Ile Ser Ala Pro Leu Thr Val Thr Ser Glu Ala Leu100 105 110Thr Val Ala Ala Ala Ala Pro Leu Met Val Ala Gly Asn Thr Leu Thr115 120 125Met Gln Ser Gln Ala Pro Leu Thr Val His Asp Ser Lys Leu Ser Ile130 135 140Ala Thr Gln Gly Pro Leu Thr Val Ser Glu Gly Lys Leu Ala Leu Gln145 150 155 160
Thr Ser Gly Pro Leu Thr Thr Thr Asp Ser Ser Thr Leu Thr Ile Thr165 170 175Ala Ser Pro Pro Leu Thr Thr Ala Thr Gly Ser Leu Gly Ile Asp Leu180 185 190Lys Glu Pro Ile Tyr Thr Gln Asn Gly Lys Leu Gly Leu Lys Tyr Gly195 200 205Ala Pro Leu His Val Thr Asp Asp Leu Asn Thr Leu Thr Val Ala Thr210 215 220Gly Pro Gly Val Thr Ile Asn Aan Thr Ser Leu Gln Thr Lys Val Thr225 230 235 240Gly Ala Leu Gly Phe Asp Ser Gln Gly Asn Met Gln Leu Asn Val Ala245 250 255Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ser Gln Asn Arg Arg Leu Ile Leu Asp Val260 265 270Ser Tyr Pro Phe Asp Ala Gln Asn Gln Leu Asn Leu Arg Leu Gly Gln275 280 285Gly Pro Leu Phe Ile Asn Ser Ala His Asn Leu Asp Ile Asn Tyr Asn290 295 300Lys Gly Leu Tyr Leu Phe Thr Ala Ser Asn Asn Ser Lys Lys Leu Glu305 310 315 320Val Asn Leu Ser Thr Ala Lys Gly Leu Met Phe Asp Ala Thr Ala Ile325 330 335Ala Ile Asn Ala Gly Asp Gly Leu Glu Phe Gly Ser Pro Asn Ala Pro340 345 350Asn Thr Asn Pro Leu Lys Thr Lys Ile Gly His Gly Leu Glu Phe Asp355 360 365Ser Asn Lys Ala Met Val Pro Lys Leu Gly Thr Gly Leu Ser Phe Asp370 375 380
Ser Thr Gly Ala Ile Thr Val Gly Asn Lys Asn Asn Asp Lys Leu Thr385 390 395 400Leu Trp Thr Gly Pro Lys Pro Glu Ala Asn Cys Ile Ile Glu Tyr Gly405 410 415Lys Gln Asn Pro Asp Ser Lys Leu Thr Leu Ile Leu Val Lys Asn Gly420 425 430Gly Ile Val Asn Gly Tyr Val Thr Leu Met Gly Ala Ser Asp Tyr Val435 440 445Asn Thr Leu Phe Lys Asn Lys Asn Val Ser Ile Asn Val Glu Leu Tyr450 455 460Phe Asp Ala Thr Gly His Ile Leu Pro Asp Ser Ser Ser Leu Lys Thr465 470 475 480Asp Leu Glu Leu Lys Tyr Lys Gln Thr Ala Asp Phe Ser Ala Arg Gly485 490 495Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Val Leu Pro Asn Ala Gly500 505 510Thr His Asn Glu Asn Tyr Ile Phe Gly Gln Cys Tyr Tyr Lys Ala Ser515 520 525Asp Gly Ala Leu Phe Pro Leu Glu Val Thr Val Met Leu Asn Lys Arg530 535 540Leu Pro Asp Ser Arg Thr Ser Tyr Val Met Thr Phe Leu Trp Ser Leu545 550 555 560Asn Ala Gly Leu Ala Pro Glu Thr Thr Gln Ala Thr Leu Ile Thr Ser565 570 575Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Ile Arg Glu Asp Asp Gly Gly Gly Gly Ser580 585 590Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asp Cys Arg Gly Asp595 600 605Cys Phe Cys610
<210>14<211>144<212>PRT<213>人類<400>14Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile1 5 10 15Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His20 25 30Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp35 40 45Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe50 55 60Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys65 70 75 80Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met85 90 95Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser100 105 110Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys115 120 125Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu130 135 140<210>15<211>2027<212>DNA<213>人類<400>15tgtggctgca gagcctgctg ctcttgggca ctgtggcctg cagcatctct gcacccgccc 60gctcgcccag ccccagcacg cagccctggg agcatgtgaa tgccatccag gaggcccggc120gtctcctgaa cctgagtaga gacactgctg ctgagatggt aagtgagaga atgtgggcct180gtgcctaggc cacccagctg gcccctgact ggccacgcct gtcagcttga taacatgaca240
ttttcctttt ctacagaatg aaacagtaga agtcatctca gaaatgtttg acctccaggt300aagatgcttc tctctgacat agctttccag aagcccctgc cctggggtgg aggtggggac360tccattttag atggcaccac acagggttgt ccactttctc tccagtcagc tggctgcagg420aggagggggt agcaactggg tgctcaagag gctgctggcc gtgcccctat ggcagtcaca480tgagctcctt tatcagctga gcggccatgg gcagacctag cattcaatgg ccaggagtca540ccaggggaca ggtggtaaag tgggggtcac ttcatgagac aggagctgtg ggtttggggc600gctcactgtg ccccgagacc aagtcctgtt gagacagtgc tgactacaga gaggcacaga660ggggtttcag gaacaaccct tgcccaccca gcaggtccag gtgaggcccc acccccctct720ccctgaatga tggggtgaga gtcacctcct tccctaaggc tgggctcctc tccaggtgcc780gctgagggtg gcctgggcgg ggcagtgaga agggcaggtt cgtgcctgcc atggacaggg840cagggtctat gactggaccc agcctgtgcc cctcccaagc cctactcctg ggggctgggg900gcagcagcaa aaaggagtgg tggagagttc ttgtaccact gtgggcactt ggccactgct960caccgacgaa cgacattttc cacaggagcc gacctgccta cagacccgcc tggagctgta 1020caagcagggc ctgcggggca gcctcaccaa gctcaagggc cccttgacca tgatggccag 1080ccactacaag cagcactgcc ctccaacccc ggtgagtgcc tacggcaggg cctccagcag 1140gaatgtctta atctaggggg tggggtcgac atggggagag atctatggct gtggctgttc 1200aggaccccag ggggtttctg tgccaacagt tatgtaatga ttagccctcc agagaggagg 1260cagacagccc atttcatccc aaggagtcag agccacagag cgctgaagcc cacagtgctc 1320cccagcagga gctgctccta tcctggtcat tattgtcatt atggttaatg aggtcagagg 1380tgagggcaaa cccaaggaaa cttggggcct gcccaaggcc cagaggaagt gcccaggccc 1440aagtgccacc ttctggcagg actttcctct ggccccacat ggggtgcttg aattgcagag 1500gatcaaggaa ggggggctac ttggaatgga caaggacctc aggcactcct tcctgcggga 1560agggagcaaa gtttgtggcc ttgactccac tccttctggg tgcccagaga cgacctcagc 1620ccagctgccc tgctctgccc tgggaccaaa aaggcaggcg tttgactgcc cagaaggcca 1680acctcaggct ggcacttaag tcaggccctt gactctggct gccactggca gagctatgca 1740ctccttgggg aacacgtggg tggcagcagc gtcacctgac ccaggtcagt gggtgtgtcc 1800tggagtgggc ctcctggcct ctgagttcta agaggcagta gagaaacatg ctggtgcttc 1860cttcccccac gttacccact tgcctggact caagtgtttt ttatttttct ttttttaaag 1920gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc tttgaaagtt tcaaagagaa cctgaaggac 1980
tttctgcttg tcatcccctt tgactgctgg gagccagtcc aggagtg 2027<210>16<211>435<212>DNA<213>人類<400>16atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc 60cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg120cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc180tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag240cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac300tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagac tatcaccttt360gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag420ccagtccagg agtaa 435<210>17<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的腺病毒5PCR引物1<400>17gaattctagg gataacaggg taatcatcat caataatata cctt 44<210>18<211>23<212>DNA<213>
人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的腺病毒5PCR引物2<400>18cccggggtgc tccacataaa tct 23<210>19<211>44<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的腺病毒5PCR引物3<400>19aagctttagg gataacaggg taatcatcat caataatata cctt 44<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的腺病毒5PCR引物4<400>20cccgggggaa tacatacccg cagg24<210>21<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的人類GM-CSF PCR引物PSR3<400>21cttcgaggaa ttcaggatgt ggctgcagag cctgctg 37<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的人類GM-CSF PCR引物PSR4<400>22cttcgagaag cttactcctg gactggctcc cag 33<210>23<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的SV40晚期聚腺苷酸信號PCR引物PSR6<400>23cttcgagaag cttcagacat gataagatac attg 34
<210>24<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的SV40晚期聚腺苷酸信號PCR引物PSR7<400>24cttcgaggga tcctaccaca tttgtagagg tttac35<210>25<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>25Arg Lys Lys Arg1<210>26<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>26Arg Lys Arg Arg1<210>27<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>27Arg Arg Arg Arg權利要求
1.一種在原發(fā)腫瘤細胞中表達異源核酸的方法，包括用含嵌合纖維蛋白的腺病毒載體轉導所述原發(fā)腫瘤細胞，其中所述嵌合纖維蛋白包括亞型C腺病毒的軸區(qū)的至少一部分和的亞型B腺病毒的頭區(qū)的至少一部分，其中頭區(qū)結合有CD46。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述嵌合纖維蛋白包括Ad5或Ad2軸的至少一部分和Ad35頭的至少一部分。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中細胞被體外轉導。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中細胞被體內(nèi)轉導。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中嵌合纖維蛋白包括SEQ ID NO6中46-136的氨基酸。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中嵌合纖維蛋白包括SEQ ID NO2中47-399的氨基酸或者SEQ ID NO4中47-399的氨基酸。
7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中嵌合纖維蛋白包括SEQ ID NO2中47-399的氨基酸或者SEQ ID NO4中47-399的氨基酸。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述原發(fā)腫瘤細胞選自肺腫瘤細胞、前列腺腫瘤細胞、頭和頸腫瘤細胞、膀胱腫瘤細胞和腎腫瘤細胞。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述原發(fā)腫瘤細胞是非小細胞肺腫瘤細胞。
10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述腺病毒在所述原發(fā)腫瘤細胞中優(yōu)先復制。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述腺病毒包括與復制必要的至少一個腺病毒編碼序列有效連接的異源轉錄調控元件(TRE)。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述TRE選自細胞特異性TRE、細胞狀態(tài)特異性TRE和組織特異性TRE。
13.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述TRE選自PSA TRE、E2FTRE、端粒酶(TERT)TRE、尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)TRE、probasinTRE、酪氨酸酶關聯(lián)蛋白-2 TRE、MART-1 TRE、CRGL2 TRE和PRL-3蛋白酪氨酸磷酸酶TRE。
14.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述腺病毒編碼序列在選自E1a、E1b、E2a、E2b和E4中的腺病毒編碼區(qū)中。
15.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述腺病毒包括E1B 19-kDa區(qū)的部分或者全部缺失。
16.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述腺病毒包括復制必要的腺病毒編碼序列的缺失。
17.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中所述腺病毒使原發(fā)腫瘤細胞中的腺病毒為無能力復制型腺病毒。
18.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中所述復制必要的腺病毒編碼序列選自E1a、E1b、E2a、E2b和E4。
19.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述腺病毒包括至少一個腺病毒E3編碼序列的缺失。
20.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中所述腺病毒E3編碼序列選自用于19K、14.7K、14.5K、12.5K、11.6K、10.4K和6.7K E3蛋白的編碼序列。
21.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中全部E3編碼序列缺失。
22.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中所述腺病毒包括10.4K、14.5K和14.7K E3編碼序列。
23.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述腺病毒包括所有天然的E3編碼序列。
24.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述腺病毒包括與其中GM-CSF在所述原發(fā)腫瘤細胞中表達的調控元件有效連接的GM-CSF編碼序列。
25.根據(jù)權利要求24所述的方法，其中所述GM-CSF編碼序列是人類序列。
26.根據(jù)權利要求24所述的方法，進一步包括滅活轉導的腫瘤細胞和將轉導的腫瘤細胞引入哺乳動物中。
27.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中所述腫瘤細胞對所述哺乳動物來說是自體的。
28.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中所述腫瘤細胞對所述哺乳動物來說是異源的。
29.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中所述哺乳動物包括與轉導的腫瘤細胞相同類型的腫瘤細胞。
30.根據(jù)權利要求29所述的方法，其中所述哺乳動物是人類。
全文摘要
提供一種有效轉導原發(fā)腫瘤細胞的腺病毒載體。該腺病毒載體包括嵌合腺病毒纖維蛋白質，其包括亞型C腺病毒纖維軸的至少一部分和其中頭區(qū)結合CD46的亞型B腺病毒或者血清型37腺病毒頭的至少一部分。
文檔編號C12N15/00GK101068933SQ200580036596
公開日2007年11月7日 申請日期2005年8月25日 優(yōu)先權日2004年8月25日
發(fā)明者塞斯達·雷迪·鮑里斯, 珊?！じ仕? 于得超 申請人:細胞基因系統(tǒng)有限公司