專利名稱：小金海棠Fe(Ⅱ)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)來源于蘋果屬小金海棠的Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與其在培育耐缺鐵植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鐵是植物必需的營養(yǎng)元素，它在植物體內(nèi)參與葉綠素合成、氧化還原反應(yīng)、電子傳遞以及呼吸作用等多種生理作用，影響包括氮素代謝、有機(jī)酸代謝、碳水化合物代謝及原生質(zhì)性狀等多項(xiàng)生理活動(dòng)。鐵營養(yǎng)問題現(xiàn)已成為果樹營養(yǎng)生理研究的重要內(nèi)容和研究熱點(diǎn)之一，并在近年來取得了顯著的成就。
全世界約有40％土壤上的植物會(huì)發(fā)生缺鐵失綠癥，果樹缺鐵問題更是十分嚴(yán)重，特別是在干旱半干旱的石灰性土壤上尤為嚴(yán)重。一方面是由于土壤的pH值過高，鐵多以不溶態(tài)存在，不能被果樹根系所吸收；另一方面有時(shí)盡管鐵的含量較高，但土壤的鈣化導(dǎo)致可溶性鐵的含量降低，可被植物吸收利用的可溶性鐵的含量不到10-10mol/L。缺鐵對(duì)果樹的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)均會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良影響。
鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP家族中Irt基因的發(fā)現(xiàn)，很好地解釋了鐵吸收轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中的重要問題。Irt基因是從植物中分離出來的第一個(gè)Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，該基因編碼的Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為一種質(zhì)膜蛋白，在將膜外的Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞質(zhì)中起到關(guān)鍵性的作用。
作為機(jī)制I型植物吸收鐵素的關(guān)鍵成分之一，Irt基因與植物的抗缺鐵能力有極大關(guān)系。研究表明，Irt基因在植物根部表達(dá)且受缺鐵脅迫的誘導(dǎo)，另外Irt基因也可在其它一些金屬離子如Cd2+、Co2+、Mn2+、Zn2+等的轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用。Irt1作為鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白首先在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)運(yùn)底物是二價(jià)鐵離子，隨后在擬南芥中又相繼發(fā)現(xiàn)了Irt2、Irt3兩個(gè)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；近來，IRT家族又增加了許多新成員，如人和小鼠的ZIrt1基因、西紅柿LeIrt1和LeIrt2基因、水稻OsIrt1基因。
小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)是第一個(gè)由中國人命名的蘋果屬植物品種。該品種不僅具有耐鹽、耐旱、耐熱、耐澇、抗寒等眾多抗逆境特性，還對(duì)白粉病和蘋果潛隱病毒有一定的抗性，用其作砧木嫁接不僅親合性好，而且具有矮化效應(yīng)和高度的無融合生殖特性，在蘋果的育種及繁殖中具有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，名稱為MxIrt1，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №1由364個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第1位-第30位氨基酸殘基為信號(hào)肽序列；自氨基端第184位-第192位氨基酸殘基序列為ZIP家族的功能保守區(qū)；自氨基端第54位-第76位、第91位-第113位、第129位-第151位、第209位-第231位、第276位-第292位、第307位-第329位和第339位-第361位氨基酸殘基序列為跨膜螺旋區(qū)，其中，自氨基端第184位-第192位氨基酸殘基序列為第3、4個(gè)跨膜螺旋間富含組氨酸的區(qū)域。
上述小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(MxIrt1)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由1398個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第51-第1145位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；自5’端第1-第90位堿基為信號(hào)肽的編碼序列，編碼30個(gè)氨基酸；自5’端第550-第576位堿基為ZIP家族功能保守區(qū)的編碼序列；自5’端第160-第228位、第271-第339位、第385-第453位、第625-第693位、第826-第876位、第919-第987位、第1015-第1083位堿基為跨膜螺旋區(qū)的編碼序列，其中，自5’端第550-第576位堿基為第3、4個(gè)跨膜螺旋間富含組氨酸區(qū)域的編碼序列；自5’端第1146-第1398位堿基為3’端非翻譯區(qū)。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增MxIrt1中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
利用植物表達(dá)載體，將本發(fā)明的小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MxIrt1的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對(duì)缺鐵脅迫耐受力增強(qiáng)的的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。
所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它的可效應(yīng)mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。本發(fā)明的MxIrt1基因的3’端非翻譯區(qū)域亦可被用于在植物中表達(dá)。
使用MxIrt1構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、根部特異表達(dá)啟動(dòng)子等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有本發(fā)明MxIrt1的植物表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥、玉米等單子葉植物，也可以是擬南芥、番茄、煙草、草坪草、蘋果等雙子葉植物。
本發(fā)明的小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物抗缺鐵機(jī)制中起主要作用，MxIrt1對(duì)培育耐缺鐵植物品種將具有重要意義。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1為Southern雜交分析MxIrt1在小金海棠基因組中組成的情況圖2A為MxIrt1在缺鐵誘導(dǎo)條件下表達(dá)狀態(tài)的Northern檢測(cè)結(jié)果圖2B為提取的四種樣品RNA的瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果圖3為PCR法檢測(cè)MxIrt1轉(zhuǎn)基因煙草植株的結(jié)果圖4為MxIrt1轉(zhuǎn)基因煙草植株在缺鐵條件下存活的植株具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物均由上海生物工程公司合成。
實(shí)施例1、MxIrt1基因的克隆植物材料將蘋果砧木小金海棠植株用完全營養(yǎng)液(每升營養(yǎng)液中各營養(yǎng)元素含量為N 73mg，P 31mg，K 78.2mg，Ca 70.47mg，Mg 20.8mg，S 16.7mg，B 0.11mg，Mn 0.5mg，Mo 0.5mg，Zn 0.3mg，Cu 0.25mg，Na 0.54mg，Cl 0.5mg，F(xiàn)e 1.311mg，pH 6.0)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，保證定時(shí)通氣，光照時(shí)間為16h/8h(光/暗)，光強(qiáng)4001x，室溫保持24-28℃，相對(duì)濕度85％。待幼苗長出12-14片真葉時(shí)對(duì)其進(jìn)行缺鐵脅迫處理，方法為將幼苗置于不含鐵元素的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，營養(yǎng)液中其它成分與完全營養(yǎng)液相同。
一、缺鐵脅迫下蘋果砧木小金海棠根系cDNA文庫的構(gòu)建將用上述方法培養(yǎng)的小金海棠植株白色新生根的根尖部分于液氮中速凍、研磨，用SDS-苯酚法提取總RNA，再經(jīng)mRNA純化試劑盒(Clontech公司)處理得到mRNA；以此mRNA為模板，在引物P15’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’和引物P25’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3’的引導(dǎo)下，使用SMARTTMcDNA合成試劑盒(Clontech公司)并參照試劑盒說明書合成其雙鏈cDNA；將得到的雙鏈cDNA與載體λTripIEx2(Promega公司)16℃連接過夜，得到含有雙鏈cDNA的重組載體；最后用λ噬菌體包裝蛋白(Promega公司)對(duì)重組載體進(jìn)行體外包裝，得到經(jīng)缺鐵脅迫處理的蘋果砧木小金海棠根系的cDNA文庫。經(jīng)檢測(cè)該cDNA文庫的滴度為1.298×106，大小為1.122×106，插入片斷大小平均為1kb，重組率大于99％，文庫擴(kuò)增后滴度為1.652×1010。
二、小金海棠根系cDNA文庫中編碼Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因片段的篩選根據(jù)Genbank中公布的Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族的功能保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)常規(guī)PCR引物，引物序列如下引物P35’-CAGCTTCTCCGTTATCGTGT-3’引物P45’-AACTTCAAGCCCATTTAGCC-3’以小金海棠缺鐵脅迫處理的根系cDNA文庫的λDNA為模板，在引物P3和引物P4的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，表明擴(kuò)增出了約490bp的特異性條帶，對(duì)該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，表明該cDNA片段與番茄和豌豆的Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因分別具有86％和84％的氨基酸序列同源性，從而證明該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物是Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因片段。
三、利用RACE法克隆小金海棠根系中Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cDNA全長序列以步驟二篩選出的長度為490bp的cDNA片斷為模板，分別進(jìn)行3’和5’RACE反應(yīng)，引物序列如下引物P5(3’RACE引物)5’-CAGCTTCTCCGTTATCGTGT-3’引物P6(5’RACE引物)5’-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC-3’結(jié)果3’RACE擴(kuò)增出了一條長度為758bp的特異性條帶，測(cè)序結(jié)果表明該基因片段含有終止密碼子、AATAAA加尾信號(hào)和poly(A)尾巴，證明是完整的3’末端序列，同源性比較結(jié)果表明該擴(kuò)增產(chǎn)物是Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因片段。5’RACE擴(kuò)增出了一條長度為1135bp的特異性條帶。根據(jù)3’和5’RACE測(cè)序結(jié)果拼讀出一條完整的cDNA序列，該序列具有序列表中SEQ ID №2的多核苷酸序列，由1398個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第51-第1145位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；自5’端第1-第90位堿基為信號(hào)肽的編碼序列，編碼30個(gè)氨基酸；自5’端第550-第576位堿基為ZIP家族功能保守區(qū)的編碼序列；自5’端第160-第228位、第271-第339位、第385-第453位、第625-第693位、第826-第876位、第919-第987位、第1015-第1083位堿基為跨膜螺旋區(qū)的編碼序列，其中，自5’端第550-第576位堿基為第3、4個(gè)跨膜螺旋間富含組氨酸區(qū)域的編碼序列；自5’端第1146-第1398位堿基為3’端非翻譯區(qū)。證明克隆到了小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，將其命名為MxIrt1。
實(shí)施例2、MxIrt1在小金海棠基因組中的分析提取小金海棠基因組總DNA，分別用EcoRI、HindIII和XhoI三種限制性內(nèi)切酶對(duì)其進(jìn)行消化。然后將用不同酶消化的DNA分別轉(zhuǎn)到Hybond-N+尼龍膜(GIBCO公司)上，再以MxIrt1部分序列作探針，該探針序列為序列表中的SEQ ID №3，用a-P32-dCTP標(biāo)記后進(jìn)行Southern雜交分析。在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下洗膜(65℃，0.1×SSC，0.1％SDS)，結(jié)果均只得到一條雜交條帶，如圖1所示，圖中E代表EcoRI酶切產(chǎn)物、H代表HindIII酶切產(chǎn)物、X代表XhoI酶切產(chǎn)物，表明MxIrt1在小金海棠基因組中以低拷貝形式存在。
實(shí)施例3、小金海棠根系MxIrt1在缺鐵脅迫下的表達(dá)特征對(duì)在完全營養(yǎng)液中生長4-6周的小金海棠，在缺鐵條件下分別處理1、3、6天，分別剪取經(jīng)不同時(shí)間缺鐵處理的白色初生根經(jīng)液氮速凍，提取RNA作Northern分析。Northern雜交反應(yīng)中以正常供鐵條件下的小金海棠白色初生根RNA為對(duì)照。結(jié)果如圖2A所示，CK表示未經(jīng)缺鐵處理的對(duì)照，1、2、3分別表示經(jīng)缺鐵脅迫1、3、6天的樣品；圖2B為提取的上述四種樣品RNA的瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果。表明MxIrt1的轉(zhuǎn)錄受到缺鐵脅迫的誘導(dǎo)。
實(shí)施例4、MxIrt1基因的煙草轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的生理分析實(shí)驗(yàn)一、MxIrt1基因的煙草轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)
1、植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化把MxIrt1基因用Xba I和Sac I限制性內(nèi)切酶酶切后與用相同酶酶切的載體pBI121連接得到植物表達(dá)載體，命名為pBMxIrt1；將pBMxIrt1用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，挑出陽性克隆測(cè)序，表明獲得了整合有植物表達(dá)載體pBMxIrt1的重組子，將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中。
2、煙草轉(zhuǎn)化1)煙草的培養(yǎng)將煙草種子均勻播在營養(yǎng)土與蛭石混合比例為1∶1的土壤中，約30d后，待植物長出約10-15片真葉，高約40cm，可用于下述轉(zhuǎn)化。
2)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)挑取轉(zhuǎn)化有pBMxIrtl的農(nóng)桿菌單菌落接種于3mL YEB(Kan 50mg/L，利福平50mg/L)液體培養(yǎng)基中，28℃250rpm培養(yǎng)30小時(shí)；按1∶400轉(zhuǎn)接入200mL新鮮的YEB(Kan50mg/L，利福平50mg/L)液體培養(yǎng)基中，28℃250rpm培養(yǎng)約14小時(shí)，測(cè)OD600≈1.5；在4℃7500rpm下離心10min收集菌體；重懸菌體于二倍體積(400mL)的滲透液(1/2 MS鹽+5％蔗糖，pH5.7，121℃滅菌15min；用之前加入終濃度為0.044u M6-BA，VB61mg/L，VB110mg/L，SILWET 0.02％)。
3)轉(zhuǎn)化煙草剪取面積為20-25cm2，較靠近植株頂部，葉面較平整，肥厚，絨毛較少的煙草葉片3-5片，將其置于一個(gè)直徑為10cm的平皿中，倒入次氯酸鈉溶液(有效氯濃度為2.0％)，不斷用鑷子輕輕將葉片壓入次氯酸鈉溶液，浸泡20分鐘；然后將葉片用鑷子夾入盛放無菌水的平皿中漂洗約4-6次。用無菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，轉(zhuǎn)入上鋪一層濾紙的MS基本培養(yǎng)基，在28℃下暗培養(yǎng)；三天后，將材料轉(zhuǎn)到含有抗生素的分化培養(yǎng)基(配方為MS+3mg/L+6-BA+0.2mg/L+NAA+Kan 100μg/mL+cef250mg/L)中進(jìn)行培養(yǎng)；待抗性芽生長至2-3cm高時(shí)，切下小芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(配方為MS基本培養(yǎng)基+Kan 100mg/L+cef 250mg/L)中誘導(dǎo)生根。
3、PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA的提取，包括以下步驟1)取0.1-0.2g轉(zhuǎn)基因煙草植物葉片，在液氮中研磨，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中。
2)加入0.7mL CTAB(含Tris 100mM，NaCl 1.4M，20mM EDTA，CTAB 2％，巰基乙醇0.1％)，60℃水浴30分鐘，每隔10分鐘，顛倒一次。
3)加0.7mL酚氯仿(1∶1)，顛倒幾次，10000rpm離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一新的離心管，加等體積的氯仿異戊醇(24∶1)，混勻，10000rpm離心5分鐘。轉(zhuǎn)移上清至一新的離心管。
4)加等體積的異丙醇，顛倒混勻，10000rpm離心10分鐘，除去上清，用70％乙醇洗一次，抽干，將DNA沉淀溶于50μL無菌水中，用于PCR檢測(cè)。
根據(jù)pBI121中35S啟動(dòng)子序列和MxIrt1的基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下引物75’-GGAAGGTGGCTCCTACAAATGC-3’引物85’-GACATGGCATATGAATCAGGC-3’以轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA為模板，在引物7和引物8的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為(20μL)轉(zhuǎn)基因植株DNA 1μL(20ng-50ng)，10×PCR緩沖液2μL，MgCl2(2.5mM)2μL，Taq酶0.2μL，dNTP(2.5mM)2μL，引物7和引物8各10μM，加無菌水至20μL。PCR反應(yīng)條件為先94℃5分鐘；再94℃45秒，60℃45秒，72℃60秒，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，泳道1為DNA ladder，泳道2為陰性對(duì)照煙草PCR結(jié)果，泳道3為轉(zhuǎn)基因煙草PCR結(jié)果，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化有MxIrt1基因的陽性植株可擴(kuò)增出610bp大小的目的條帶(圖中箭頭所指)。
二、MxIrt1轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗缺鐵實(shí)驗(yàn)把MxIrt1轉(zhuǎn)基因植株與未轉(zhuǎn)基因植株置于MS培養(yǎng)基中生長2-3周，在低鐵MS(正常供鐵量的1/10)培養(yǎng)基中處理14天，結(jié)果MxIrt1轉(zhuǎn)基因植株的存活率為90％，葉片多數(shù)仍能保持綠色；未轉(zhuǎn)基因的植株存活率為20％，存活植株葉片枯黃(圖4)，表明MxIrt1基因能夠明顯提高植株的抗缺鐵能力。
序列表<160>3<210>1<211>364<212>PRT<213>蘋果屬小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)<400>1Met Ala Ala Thr Lys Ser His Leu Lys Leu Ile Pro Ile Ile Phe Phe1 5 10 15Ile Leu Ile Ile Ser Ile Leu Thr Pro Lys Ala Tyr Ser Gln Ser Glu20 25 30Glu Asp Glu Cys Ser Thr Glu Asn Thr Ser Ser Cys Asn Asp Lys Ser35 40 45Gly Ala Val Pro Leu Lys Ile Ile Ala Leu Val Ser Ile Leu Val Thr50 55 60Ser Met Ile Gly Val Ser Phe Pro Leu Val Thr Arg Ser Ile Pro Ala65 70 75 80Phe His Pro Asp Arg Asn Leu Phe Val Ile Val Lys Cys Phe Ala Gly85 90 95Gly Ile Ile Leu Ala Thr Gly Phe Met His Val Leu Pro Asp Ser Tyr100 105 110Ala Met Leu Gln Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Pro Trp His Lys Phe115 120 125Pro Phe Ser Gly Phe Val Ala Met Leu Ser Ala Ile Leu Thr Leu Met130 135 140Val Asp Ser Met Ala Thr Ser Ile Tyr Ser Arg Arg Cys Arg Thr Gly145 150 155 160Val Ile Pro Asp Lys Gly Glu Thr Pro Ala Leu Glu Val Asp Gln Glu165 170 175
Met Ala Val Val Gly Ala Gly His Gly His Phe His Ala His Asn His180 185 190Val Val Asp Lys Gly Glu Asn Gly Asp Ser Gln Gln Leu Ser Arg Tyr195 200 205Arg Val Val Ala Met Val Leu Glu Leu Gly Ile Ile Val His Ser Val210 215 220Val Ile Gly Leu Ser Leu Gly Ala Ser Asn Asn Thr Cys Thr Ile Lys225 230 235 240Gly Leu Val Ala Ala Leu Cys Phe His Gln Met Phe Glu Gly Met Gly245 250 255Leu Gly Gly Cys Ile Leu Gln Ala Glu Tyr Lys Phe Met Lys Lys Ala260 265 270Ile Met Val Phe Phe Phe Ser Thr Thr Thr Pro Phe Gly Ile Ala Ile275 280 285Gly Met Ala Met Thr Lys Ser Tyr Lys Glu Asn Ser Pro Lys Ser Leu290 295 300Ile Ala Val Gly Leu Leu Asn Ala Ser Ser Ala Gly Leu Leu Ile Tyr305 310 315 320Met Ala Leu Val Asp Leu Leu Ala Ala Asp Phe Met Gly Pro Lys Leu325 330 335Gln Arg Ser Ile Lys Leu Gln Ile Lys Ser Tyr Ile Ala Val Leu Leu340 345 350Gly Ala Gly Gly Met Ser Val Leu Ala Lys Trp Ala355 360<210>2<211>1398<212>DNA<213>蘋果屬小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)<400>2cacggccggg ggatagtacc aataatagct tgagctaaaa atcagggtca atggctgcca60
ccaagtcaca tttgaagctc atcccaatta ttttcttcat cctaattatc tccatcctca 120cccccaaagc ttattcacag tctgaggagg acgagtgcag cactgaaaac acctcctcct 180gcaatgacaa gtcaggtgct gtgcccctca aaatcatagc ccttgtatca attctagtca 240caagcatgat tggagtgagc ttccctcttg tcactcgttc cataccagcc ttccaccccg 300atcgaaacct cttcgtgatc gtcaagtgct ttgcaggtgg catcattctt gccactggtt 360tcatgcacgt tttgcctgat tcatatgcca tgttacaatc tagttgttta aaagaaaatc 420catggcacaa gttccctttt tctggctttg tggctatgtt gtctgcaatt ctgactttaa 480tggtggactc tatggccact agcatataca gtaggagatg tagaactgga gttatcccag 540ataaaggtga aactccagcc ctggaggtag accaagagat ggctgtggtg ggtgctgggc 600atggccattt tcatgcacac aaccatgttg ttgacaaggg agaaaacgga gactcgcaac 660agctgtcccg ttatcgtgtt gttgccatgg tattagaact gggtatcatt gtccattcag 720ttgttatagg gctttctctt ggagcttcaa acaacacctg cacaattaaa ggtcttgtag 780ctgcgctttg ctttcatcaa atgtttgaag gcatgggtct tggcggttgc attctacagg 840ccgagtacaa gttcatgaag aaggccataa tggtgttctt cttctcaaca acgaccccat 900ttggaattgc aattggaatg gctatgacaa aatcgtacaa agaaaatagt ccaaagtcac 960taatcgcagt aggactgctt aatgcatcat cggctggcct tcttatctac atggctttgg1020ttgatcttct tgctgccgac ttcatgggtc caaagttgca acgcagcatt aagctccaga1080tcaaatctta cattgcagtt cttttgggtg caggtggcat gtctgtattg gcaaagtggg1140cttaacaaga ctattcatgc catgccatga tcatctgaaa attaagcaaa tactattgtt1200ttttatttta tgtgttttgg tgtcaagccg gtcgtgttaa tttcctcaat gtttgtgaaa1260atttgatgtt cgttatatgt ttccacaaat cgatatagat ctttttatgt tagttgtcat1320tgttgtattg tggttacctc aaggtggaat aaatagccca gcttcctaaa aaaaaaaaaa1380aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1398<210>3<211>798<212>DNA<213>蘋果屬小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)<400>3atggccattt tcatgcacac aaccatgttg ttgacaaggg agaaaacgga gactcgcaac 60agctgtcccg ttatcgtgtt gttgccatgg tattagaact gggtatcatt gtccattcag 120
ttgttatagg gctttctctt ggagcttcaa acaacacctg cacaattaaa ggtcttgtag 180ctgcgctttg ctttcatcaa atgtttgaag gcatgggtct tggcggttgc attctacagg 240ccgagtacaa gttcatgaag aaggccataa tggtgttctt cttctcaaca acgaccccat 300ttggaattgc aattggaatg gctatgacaa aatcgtacaa agaaaatagt ccaaagtcac 360taatcgcagt aggactgctt aatgcatcat cggctggcct tcttatctac atggctttgg 420ttgatcttct tgctgccgac ttcatgggtc caaagttgca acgcagcatt aagctccaga 480tcaaatctta cattgcagtt cttttgggtg caggtggcat gtctgtattg gcaaagtggg 540cttaacaaga ctattcatgc catgccatga tcatctgaaa attaagcaaa tactattgtt 600ttttatttta tgtgttttgg tgtcaagccg gtcgtgttaa tttcctcaat gtttgtgaaa 660atttgatgtt cgttatatgt ttccacaaat cgatatagat ctttttatgt tagttgtcat 720tgttgtattg tggttacctc aaggtggaat aaatagccca gcttcctaaa aaaaaaaaaa 780aaaaaaaaaa aaaaaaaa 798
權(quán)利要求
1.一個(gè)小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)作用的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述序列表中SEQ ID №1的自氨基端第184位-192位氨基酸殘基序列為ZIP家族的功能保守區(qū)。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于它具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.含有權(quán)利要求3或4所述小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的植物表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求3或4所述小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.含有權(quán)利要求3或4所述小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的宿主菌。
8.擴(kuò)增權(quán)利要求3或4所述基因中任一片段的引物。
9.權(quán)利要求1或2所述的小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在培育耐缺鐵植物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求3或4所述的小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在培育耐缺鐵植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。其目的是提供一個(gè)來源于蘋果屬小金海棠的Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與其在培育耐缺鐵植物中的應(yīng)用。該小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白， 是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)作用的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的小金海棠Fe(II)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物抗缺鐵機(jī)制中起主要作用，MxIrt1對(duì)培育耐缺鐵植物品種將具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1680437SQ200510005039
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2005年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月31日
發(fā)明者韓振海, 許雪峰, 戚金亮, 曹冬梅, 王憶 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)