專利名稱：一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，特別是涉及一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是一種具有自我更新能力且在適合微環(huán)境下具有多系分化潛能的原始細(xì)胞。在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，存在各種形式的干細(xì)胞例如胚胎干細(xì)胞，能夠分化成人體各種類型的細(xì)胞，多能干細(xì)胞以及各種組織中的定向干細(xì)胞如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞等。目前，已有利用干細(xì)胞治療心肌梗塞、先天性骨發(fā)育不全、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。
成體干細(xì)胞是存在于人體組織中具有多系分化潛能的一種亞全能干細(xì)胞群，在特定環(huán)境下可誘導(dǎo)分化成多種組織細(xì)胞。脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞就是一類亞全能干細(xì)胞群。
早在20世紀(jì)60年代，Rodbell首次報(bào)道了分離脂肪細(xì)胞的方法1[1.Rodell Met al.J Biol Chem 1964；239375-80]，包括將脂肪組織剪碎，膠原酶消化，梯度離心，來(lái)得到上層懸浮的成熟脂肪細(xì)胞，而血細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及脂肪祖細(xì)胞等均位于細(xì)胞沉淀中。隨后，許多研究者對(duì)這一方法進(jìn)行了改進(jìn)，將吸脂術(shù)所得組織作為脂肪組織的來(lái)源2-6[2.Deslex S et al.Int J Obes 1986；1019-27；3.Hauner H et al.J Clin.Invest.1989；841663-1670；4.Van LR and Roncari AK.CellTiss Res 1977；181197-203；5.Lalikos JF et al.J Surg Res 1997；7095-100；6.Moore J et al.Aesthetic Plast Surg 1995；19，335-339]。吸出的脂肪用無(wú)菌的PBS平衡鹽溶液沖洗以去除血細(xì)胞和局麻藥，然后用□型膠原酶消化，37℃，30分鐘以去除細(xì)胞外基質(zhì)，然后用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco’s ModifiedEagle Medium)完全培養(yǎng)基終止膠原酶的作用，1200g離心10分鐘，去除上清，用含10％胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞沉淀，然后用0.16mol/l的NH4Cl溶解剩余的紅細(xì)胞，離心洗滌后用含10％FBS的DMEM重懸細(xì)胞，接種后置入37□，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12小時(shí)后用PBS沖洗，去除未貼壁的細(xì)胞，此后每三天半量換液，細(xì)胞達(dá)到80％融合時(shí)，用胰酶-EDTA(乙二胺四乙酸二鈉鹽)消化，傳代7-12[7.Zuk PA et al.Tissue Eng，2001，7211-228；8.Zuk PA et al.Mol BiolCell，2002，134279-4295；9.Gronthos S et al.J Cell Physiol，2001，18954-63；10.DeUgarte DA et al.Immunol Lett，2003，89267-270；11.Mizuno H et al.Plast ReconstrSurg，1999，109199-209；12.US Pat No.6,777,231]。培養(yǎng)的脂肪來(lái)源的MSCs呈纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法和由此獲得的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的新的醫(yī)藥用途。
本發(fā)明的問(wèn)世是基于這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)具有CD11a-、CD31-、CD34-、CD45-和HLA-DR-，且CD44+或Flk-1+的表型的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為造血細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
本發(fā)明的技術(shù)方案為一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，它包括取人體脂肪組織，用膠原酶消化，經(jīng)梯度離心、過(guò)濾，隨后在體外培養(yǎng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。所述體外培養(yǎng)體系含有DMEM/F12、EFG和FCS；較佳地，所述體外培養(yǎng)體系含有90％-99％DMEM/F12、10-30ng/mlEFG和1-10％FCS；優(yōu)選含有95％DMEM/F12、5％FCS、20ng/mlEGF的培養(yǎng)體系。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有CD11a-、CD31-、CD34-、CD45-和HLA-DR-，且CD44+或Flk-1+的表型。所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可由上述方法獲得。更佳地，所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞還具有CD29+、CD105+和/或CD166+的表型。
另一方面，本發(fā)明還提供了上述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在制備可誘導(dǎo)分化為造血細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞的藥物中的用途。
此外，本發(fā)明還提供了上述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在制備可用于人體其它組織工程、組織再生、修復(fù)的藥物中的用途。
本發(fā)明提供了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，操作簡(jiǎn)單可行；本發(fā)明還公開了人脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞新的醫(yī)藥用途。此類細(xì)胞經(jīng)移植體內(nèi)可分化為多種組織特異的細(xì)胞，參與機(jī)體多種組織的損傷修復(fù)，其優(yōu)勢(shì)在于脂肪取材方便，給患者帶來(lái)的痛苦較小，而且不容易受到惡性腫瘤的侵犯，更容易進(jìn)行體外凈化，對(duì)惡性血液病和實(shí)體腫瘤的患者可以預(yù)先儲(chǔ)備脂肪來(lái)源的干細(xì)胞亞群，在大劑量放療和化療后可以用于重建造血。這就為組織工程、再生醫(yī)學(xué)中的種子細(xì)胞來(lái)源以及為成體干細(xì)胞群的應(yīng)用提供了新的選擇。


圖1脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和瑞士染色圖2脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖3脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型流式細(xì)胞議結(jié)果圖4脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化示鈣化小結(jié)(a)實(shí)驗(yàn)組第四天 (b)實(shí)驗(yàn)組第八天 (c)對(duì)照組圖5脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化油紅-O染色(a)實(shí)驗(yàn)組為紅色呈陽(yáng)性 (b)對(duì)照組陰性圖6脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化(a)誘導(dǎo)4小時(shí)后細(xì)胞形態(tài) (b)NF陽(yáng)性 (c)NSE陽(yáng)性 (d)GFAP陰性圖7脂肪干細(xì)胞亞群向內(nèi)皮細(xì)胞分化(a)誘導(dǎo)14天后細(xì)胞形態(tài) (b)實(shí)驗(yàn)組CD31陽(yáng)性 (c)對(duì)照組CD31陰性(d)實(shí)驗(yàn)組vWF陽(yáng)性 (e)對(duì)照組vWF陰性(f)Western blot證實(shí)vWF (g)免疫電鏡證實(shí)vWF圖8脂肪干細(xì)胞亞群向肝上皮樣細(xì)胞分化
(a)誘導(dǎo)前細(xì)胞形態(tài) (b)實(shí)驗(yàn)組ALB單抗綠色熒光 (c)ALB對(duì)照組(d)實(shí)驗(yàn)組CK18單抗紅色熒光 (e)CK18對(duì)照組(f)b和d結(jié)合的ALB+CK18+ (g)RT-PCR驗(yàn)證ALB和CK18圖9干細(xì)胞亞群參與受體小鼠血管的新生熒光顯示鼠vWF藍(lán)色，人vWF綠色，人CD45紅色(A)小腸 (B)肝臟 (C)肺 (D)修復(fù)的創(chuàng)傷圖10干細(xì)胞亞群參與受體小鼠呼吸道上皮細(xì)胞損傷的修復(fù)(A)支氣管中人特異抗體pan-CK染色(B)小鼠支氣管局部顯示人pan-CK藍(lán)色，人CD45紅色，人Y-染色體DNA探針綠色(箭頭指示)(C)RT-PCR證實(shí)支氣管中有供體來(lái)源的上皮細(xì)胞(D)肺中人特異抗體SP-B染色(E)小鼠肺局部顯示人SP-B藍(lán)色，人CD45紅色，人Y-染色體DNA探針綠色(箭頭指示)(F)RT-PCR證實(shí)肺中有供體來(lái)源的上皮細(xì)胞(G)Western blot證實(shí)供體來(lái)源的上皮細(xì)胞圖11干細(xì)胞亞群參與受體小鼠消化道上皮細(xì)胞損傷的修復(fù)(A)小腸中人特異抗體pan-CK染色(B)小鼠小腸局部顯示人pan-CK藍(lán)色，人CD45紅色，人Y-染色體DNA探針綠色(箭頭指示)(C)胃中人特異抗體pan-CK染色(D)小鼠胃局部顯示人pan-CK藍(lán)色，人CD45紅色，人Y-染色體DNA探針綠色(箭頭指示)(E)和(F)RT-PCR證實(shí)受體鼠內(nèi)臟中有供體來(lái)源的上皮細(xì)胞圖12干細(xì)胞亞群參與受體小鼠肝上皮細(xì)胞損傷的修復(fù)(A)人特異抗體ALB染色(B)小鼠肝臟局部顯示人ALB藍(lán)色，人CD45紅色，人Y-染色體DNA探針綠色(箭頭指示)(C)RT-PCR證實(shí)受體鼠肝臟中有供體來(lái)源的ALB+上皮細(xì)胞(D)Western blot證實(shí)有功能的供體來(lái)源肝上皮細(xì)胞具體實(shí)施方式
本發(fā)明涉及一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及其分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)的方法及由該方法獲得的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明還涉及所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在制備可誘導(dǎo)分化為造血細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞的藥物中的用途。
具體地說(shuō)，本發(fā)明的方法可包括如下步驟取人脂肪組織，用膠原酶消化，經(jīng)梯度離心、過(guò)濾，隨后在體外培養(yǎng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，其中所述體外培養(yǎng)體系含有DMEM/F12、EFG和FCS；較佳地，所述體外培養(yǎng)體系含有90％-99％DMEM/F12、10-30ng/ml EFG和1-10％FCS；優(yōu)選含有95％DMEM/F12、5％FCS20ng/ml EGF的培養(yǎng)體系。此外，在所述培養(yǎng)體系中還可以加入100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素等，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)知如何選擇合適的成分、配比以使所述培養(yǎng)體系達(dá)到最佳效果。
細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和生長(zhǎng)特點(diǎn)取上述1、3、6代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞亞群，置于有小玻片的3.5cm直徑平皿中，37℃，飽和濕度，5％CO2培養(yǎng)12天后取出空氣風(fēng)干，瑞士染色，油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。倒置顯微鏡下，培養(yǎng)細(xì)胞大部分于24小時(shí)內(nèi)即貼壁，細(xì)胞成圓形，有小的胞漿突起。72小時(shí)后，大多數(shù)細(xì)胞有胞漿突起。一周后以梭形細(xì)胞為主，胞漿豐富，核大，核染色質(zhì)細(xì)，核仁明顯。瑞士染色后，于光鏡下可見(jiàn)成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞成平行排列生長(zhǎng)或漩渦狀生長(zhǎng)(圖1)。種入96孔板的單個(gè)細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)。
細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定取各代細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，接種于24孔板內(nèi)(5×103細(xì)胞/孔)，37□，飽和濕度，5％CO2培養(yǎng)，每天取兩孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值，繪制生長(zhǎng)曲線(圖2)。在細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，脂肪干細(xì)胞亞群倍增時(shí)間為25小時(shí)。
流式細(xì)胞儀鑒定脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的表型、細(xì)胞周期以及免疫組化分析細(xì)胞表型測(cè)定用間接免疫熒光法檢測(cè)。一抗為小鼠抗人的單克隆抗體CD105、CD11a、CD29、CD34、CD31、CD44、CD166、CD45。為檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原Flk1，細(xì)胞與一抗孵育之前，用2％多聚甲醛4℃固定15min，并在室溫下用0.1％的皂角素透膜1h。細(xì)胞用洗液PBS洗過(guò)后，加入FITC標(biāo)記的二抗4℃孵育30min。細(xì)胞洗兩次，并懸浮在500ul的PBS中，置于冰上待流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果表明細(xì)胞表面CD11a、CD31、CD34、CD45、HLA-DR為陰性，流式結(jié)果基本在1％以下；CD29、CD44、CD105、CD166、Flk-1為陽(yáng)性，流式結(jié)果在98％以上(圖3)。
細(xì)胞周期分析用流式細(xì)胞儀(FACSVantage型)檢測(cè)，ModFIT軟件分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)超過(guò)80％的細(xì)胞都處于G0/G1期。
免疫組化分析采用SA法檢測(cè)I型膠原的表達(dá)為陽(yáng)性、vWF因子的表達(dá)為陰性。
體外向三個(gè)胚層多系誘導(dǎo)分化取上述所得的單克隆來(lái)源擴(kuò)增細(xì)胞，以5×103/cm2接種于25cm2培養(yǎng)瓶和6cm直徑的培養(yǎng)皿。
1.成骨分化體系含10-7M地塞米松、10mMβ-磷酸甘油、0.05mM維生素C和10％FCS的IMDM；在第4天、第8天、第12天和第16天分別von Kossa染色法檢測(cè)鈣化小結(jié)及骨鈣蛋白基因的表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果顯示成骨培養(yǎng)中細(xì)胞形態(tài)由原來(lái)的梭形變成了立方形，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)密度的增長(zhǎng)形成多層的結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)，而對(duì)照中細(xì)胞仍是梭形且呈單層生長(zhǎng)；von Kossa染色發(fā)現(xiàn)第四天細(xì)胞分泌的鈣化基質(zhì)，在第八天有明顯的鈣化基質(zhì)沉積，而對(duì)照中未見(jiàn)到此現(xiàn)象(圖4)；RT-PCR分析表明干細(xì)胞亞群經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后表達(dá)骨鈣蛋白基因。說(shuō)明干細(xì)胞亞群可在體外誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。
2.脂肪分化體系含10-6M地塞米松、0.5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)、0.1mM維生素C和10％FCS的IMDM。在第4天、第8天、第12天和第16天分別油紅-O染色及脂蛋白脂酶基因的表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果顯示培養(yǎng)8天可見(jiàn)到折光度增加的液泡充滿整個(gè)細(xì)胞；油紅-O染色發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)中約90％細(xì)胞富含脂肪滴，而對(duì)照體系中的細(xì)胞脂肪滴很少(圖5)；RT-PCR分析表明經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后表達(dá)脂蛋白脂酶基因，而對(duì)照體系不表達(dá)或只有微量表達(dá)。說(shuō)明干細(xì)胞亞群可在體外誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞。
3.成軟骨分化體系含DMEM-HG、MCDB、2％FCS、地塞米松10-7M、TGF-β10ng/ml的IMDM。在第4天、第8天、第12天和第16天分別阿爾新藍(lán)染色，免疫組化法檢測(cè)II型膠原，RT-PCR法檢測(cè)II型膠原基因表達(dá)。結(jié)果顯示培養(yǎng)四天即可通過(guò)免疫組化檢測(cè)到II型膠原的表達(dá)，而對(duì)照組中陽(yáng)性細(xì)胞較少；RT-PCR分析表明細(xì)胞經(jīng)軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后表達(dá)II型膠原基因，而對(duì)照體系不表達(dá)或只有微量表達(dá)；培養(yǎng)八天后，通過(guò)阿爾新藍(lán)染色可檢測(cè)到蛋白多糖，對(duì)照組只有微量表達(dá)。從而鑒定干細(xì)胞亞群成軟骨分化潛能。
4.成神經(jīng)誘導(dǎo)分化體系用含有1mM巰基乙醇和20％FCS的DMEM培養(yǎng)液預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)，再用含有10mM巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)5小時(shí)。免疫組化法檢測(cè)NSE(神經(jīng)特異烯醇化酶)，NF(神經(jīng)絲蛋白)，GFAP(神經(jīng)膠質(zhì)蛋白)。結(jié)果顯示預(yù)誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，誘導(dǎo)4小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)明顯改變。一部分細(xì)胞呈神經(jīng)樣，所有的誘導(dǎo)后細(xì)胞NF，NSE陽(yáng)性，GFAP陰性(圖6)。
5.內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系含30ng/mL VEGF，10nng/mL bFGF的內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基。向內(nèi)皮誘導(dǎo)的分化情況用免疫熒光、免疫電鏡及免疫印跡鑒定。定向誘導(dǎo)14天后，未加內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基的對(duì)照組細(xì)胞倒置顯微鏡下未見(jiàn)有形態(tài)上的變化，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞則見(jiàn)形成典型的鵝卵石樣的細(xì)胞區(qū)(見(jiàn)圖7a)，免疫組化顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表達(dá)CD31(見(jiàn)圖7b、c)及vWF(見(jiàn)圖7d、e)，免疫電鏡及免疫印跡結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果(圖7f、g)。
6.上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系擴(kuò)增培養(yǎng)基中不含EGF，培養(yǎng)12小時(shí)后，將培養(yǎng)基改為含30ng/mL HGF，20ng/mL bFGF的上皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基。向上皮樣細(xì)胞誘導(dǎo)的結(jié)果用免疫熒光、免疫印跡及RT-PCR鑒定。向肝上皮樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)14天后，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ALB及CK18陽(yáng)性，RT-PCR進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果(圖8)。
體內(nèi)多向分化研究，治療機(jī)體多組織損傷1.干細(xì)胞亞群體內(nèi)移植以接受亞致死量照射的非肥胖型糖尿病及嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠為損傷模型，將受體雌性NOD/SCID小鼠(6-8周鼠齡)預(yù)先經(jīng)銫源全身照射300cGy后在4小時(shí)內(nèi)從尾靜脈輸入脂肪來(lái)源干細(xì)胞亞群細(xì)胞，對(duì)照組小鼠則注射等體積RPMI 1640。
2.血管新生模型建立雌性NOD/SCID小鼠(6-8周鼠齡)，移植細(xì)胞4小時(shí)前，剪去背部毛發(fā)(直徑約6cm)，碘酒消毒，使用微型打孔機(jī)在此區(qū)域造成一創(chuàng)傷，使該皮膚創(chuàng)傷的傷口深達(dá)真皮層。移植細(xì)胞(106/只)后7天，在麻醉狀態(tài)下活檢創(chuàng)傷部位，三色免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞參與受體小鼠皮膚受損部位血管新生的情況。
3.細(xì)胞體內(nèi)植入及分化檢測(cè)結(jié)果于移植后2月，取受體小鼠的骨髓及脾細(xì)胞，應(yīng)用人特異性抗體，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化和RT-PCR的方法，檢測(cè)受體小鼠中人造血細(xì)胞表面標(biāo)志(CD34，CD45，CD2，CD7，CD10，CD13，CD14，CD19，CD33，CD38等)的表達(dá)情況；取受體小鼠的各種組織(受損皮膚愈合部位，氣管，肺，肝，小腸，胃等)制備切片，利用抗人角蛋白(pan-cytokeratin，pan-CK)、白蛋白(ALB)或表面活性物質(zhì)B(surfactant B，SP-B)的特異性抗體，通過(guò)組化、免疫熒光以及Y染色體熒光原位雜交(Y-FISH)、RT-PCR和Western Blot等方法檢測(cè)受體小鼠不同組織中人源細(xì)胞的植入及分化情況。取受體小鼠血清，用抗人ALB特異性抗體行Western Blot檢測(cè)；為了解供體來(lái)源細(xì)胞在受體鼠體內(nèi)是否也能夠向血管內(nèi)皮分化并避免與人源造血細(xì)胞相混淆，我們利用不同顏色熒光標(biāo)記的抗鼠vWF多克隆抗體(Cy5)、抗人vWF單抗(FITC)和抗人CD45單抗(PE)對(duì)組織切片進(jìn)行了三色免疫熒光組化。
研究結(jié)果表明□脂肪來(lái)源干細(xì)胞亞群參與受體小鼠的造血重建。接受移植后2月，在受體NOD/SCID小鼠體內(nèi)即可檢測(cè)到高水平的、表達(dá)人造血細(xì)胞表面標(biāo)志的細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)顯示受體骨髓中人CD45+細(xì)胞比例可高達(dá)40％，其中既有淋巴細(xì)胞，也含有髓系細(xì)胞。RT-PCR證實(shí)受體鼠骨髓中有人特異性基因的表達(dá)(人GADPH及CD45、CD34、CD19、CD33)。另外，免疫熒光顯示受體鼠脾中存在人CD45+和CD19+細(xì)胞，而未接受細(xì)胞移植的對(duì)照鼠脾細(xì)胞，染色則為陰性。因此，正是植入的人脂肪來(lái)源干細(xì)胞亞群參與了受體小鼠的造血重建；□向血管內(nèi)皮分化。通過(guò)三色免疫熒光組化發(fā)現(xiàn)，如圖9所示，在大多數(shù)(高達(dá)80％)受體鼠體內(nèi)(小腸、肝、肺及皮膚損傷模型等組織)，都能檢測(cè)到表達(dá)人內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志vWF的細(xì)胞，它們參與受體照射后微血管損傷的修復(fù)；在血管新生模型中，也可檢測(cè)到人源內(nèi)皮細(xì)胞參與血管新生。通過(guò)對(duì)人CD45染色，證實(shí)這些人vWF+細(xì)胞并不表達(dá)CD45，從而排除了是造血細(xì)胞的可能；□皮膚組織再生。在受體鼠皮膚受損部位明顯可見(jiàn)創(chuàng)傷愈合，生成正常皮膚組織和毛發(fā)，免疫組化檢測(cè)到供體來(lái)源的皮膚細(xì)胞(pan-CK+CD45-Y-chromosome+)，RT-PCR和Western Blot均證實(shí)再生的皮膚組織來(lái)源于人脂肪來(lái)源的干細(xì)胞亞群，從而證明了該干細(xì)胞亞群在體內(nèi)可分化為有功能的正常皮膚組織。
□供體來(lái)源的上皮細(xì)胞。在受體鼠的氣管、肺、消化道和肝中，檢測(cè)到供體來(lái)源的上皮細(xì)胞(pan-CK+CD45-Y-chromosome+或SP-B+CD45-Y-chromosome+)或肝細(xì)胞(ALB+CD45-Y-chromosome+)，而未接受細(xì)胞移植的對(duì)照鼠則為陰性。這一結(jié)果亦得到RT-PCR的證實(shí)。Westem Blot示受體小鼠血清中含有人ALB，RT-PCR證實(shí)其肝臟中有人ALB mRNA表達(dá)。這些都說(shuō)明，移植的細(xì)胞能夠在受體體內(nèi)分化為消化道上皮細(xì)胞及有功能的肝細(xì)胞(圖10，11，12)。
□二次移植。取已移植成功(RT-PCR、FACS及免疫熒光證實(shí))的首次移植小鼠(3只)的骨髓細(xì)胞，以2×107/只尾靜脈輸注給另三只預(yù)先經(jīng)銫源全身照射300cGy的雌性NOD/SCID小鼠(6-8周鼠齡)，二次移植3個(gè)月后，在受體小鼠的骨髓、脾、氣管、肺、肝和消化道中，同樣也檢測(cè)到人源細(xì)胞，分布與第一次移植相似，分別表達(dá)造血、內(nèi)皮、上皮以及肝細(xì)胞的特征性表型(表1)。更進(jìn)一步提示人脂肪來(lái)源干細(xì)胞亞群屬于一類亞全能干細(xì)胞群體，很可能成為一種理想的種子細(xì)胞，可作為造血干細(xì)胞移植中CD34+造血干細(xì)胞的替代品及用于治療一些遺傳及退行性疾病。
表1脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在受體鼠內(nèi)分化為造血細(xì)胞

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。但并不意味著本發(fā)明僅限于此。
實(shí)施例1人脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)取人脂肪組織，用D-Hank’s液沖洗，剪碎，0.2％II型膠原酶37℃消化2小時(shí)，用D-Hank’s液洗滌中止II型膠原酶的作用，離心1000r/m，10min后，用200目的濾網(wǎng)過(guò)濾，并用移液管反復(fù)吹打，使之成為單細(xì)胞懸液，在體外培養(yǎng)體系(含95％DMEM/F12、5％FCS20ng/ml EGF、100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素)。中置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1天后換液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每三天半量換液。第一代細(xì)胞以0.6細(xì)胞/孔的密度種入96孔板，24小時(shí)后顯微鏡下挑選并記錄只有一個(gè)細(xì)胞的孔，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80-90％融合時(shí)，0.25％胰酶常規(guī)消化傳代，做單克隆細(xì)胞培養(yǎng)。
實(shí)施例2人脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)重建造血1.干細(xì)胞亞群體內(nèi)移植NOD/SCID鼠8-10周，預(yù)先經(jīng)Cs137全身照射300rad隨機(jī)分為2組，每組4只，照射后4小時(shí)內(nèi)從尾靜脈輸入細(xì)胞?！鯇?duì)照組輸入0.4ml/只生理鹽水；□輸入2×106/0.4ml/只人脂肪來(lái)源的干細(xì)胞亞群(實(shí)施例1制備)。輸入的干細(xì)胞亞群預(yù)先經(jīng)PKH26染色，染色步驟按照Sigma的說(shuō)明書進(jìn)行。移植24小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組NOD/SCID鼠皮下注射G-CSF2400ng/只。對(duì)照組小鼠在經(jīng)Cs137全身照射后在7-14天死亡，實(shí)驗(yàn)組小鼠全部存活1個(gè)月以上。
2.受體小鼠骨髓和脾臟的細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析NOD/SCID小鼠移植一個(gè)月和兩個(gè)月后，分別斷頸處死，收集骨髓和脾臟細(xì)胞，用0.016M的NH4CL溶解紅細(xì)胞，D-Hanks液洗滌中止，用含0.5％的牛血清白蛋白的PBS沖洗，加入一抗4℃孵育30min，一抗為人特異性的FITC標(biāo)記的CD3，CD14，CD19，CD33，CD34，CD45。細(xì)胞洗兩次，并懸浮在500ul的PBS中，置于冰上待流式細(xì)胞儀檢測(cè)。移植后的小鼠在一個(gè)月的時(shí)候，流式細(xì)胞儀分析小鼠骨髓PKH26陽(yáng)性的細(xì)胞為22.6％，脾臟PKH26陽(yáng)性的細(xì)胞為21.5％。移植后的小鼠在兩個(gè)月的時(shí)候，流式細(xì)胞儀分析小鼠骨髓和脾臟人血液細(xì)胞特異性抗體陽(yáng)性的細(xì)胞，骨髓CD344.14％，CD1444.36％，CD1941.32％，CD3351.08％，CD3444.66％，CD4541.84％；脾臟CD314.84％，CD1428.99％，CD1914.82％，CD3320.23％，CD3417.30％，CD4513.31％。
3.受體小鼠骨髓和脾臟細(xì)胞RT-PCR分析NOD/SCID小鼠移植兩個(gè)月后，斷頸處死，收集骨髓和脾臟細(xì)胞，檢測(cè)人源干細(xì)胞亞群分化為CD19，CD33，CD34，CD45陽(yáng)性的細(xì)胞。小鼠骨髓和脾臟細(xì)胞用Dynabeads mRNA direct kit(Dynal，Oslo，Norway)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列為CD19(594bp)，5′-CGA GTT CTA TGA GAA CGA CTC-3′and 5′-ACTGGA AGT GTC ACT GGC ATG-3′；CD34(647bp)，5′-GTC TTG ACA ACA ACGGTA CTG C-3′and 5′-CAA GAC CAG CAG TAG ACA CTG A-3′；CD45(418bp)，5′-CAG GCA TGG TTT CCA CAT TC-3′and 5′-CTA CAA ATA TTG GTT CGCTGC-3′；CD33(640bp)，5′-AAC CTT ACC TGC TCT GTG TCC TGG GC-3′and 5′-GCC TGA TGC TCT TGA GGG TTC CTC AC-3′；PCR的反應(yīng)條件是96℃變性5min后，94℃變性1min，58℃退火50sec，72℃延伸1min共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。RT-PCR分析結(jié)果為CD19，CD33，CD34，CD45人特異性片段的表達(dá)均為陽(yáng)性，而對(duì)照組則均為陰性。
4.受體小鼠和對(duì)照組小鼠CFU-CM培養(yǎng)的比較分析取實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組NOD/SCID小鼠骨髓組織制成單細(xì)胞懸液，用白細(xì)胞稀釋液計(jì)數(shù)有核細(xì)胞數(shù)量。正常成人的骨髓5ml，用Ficoll(1.077g/cm3)分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，1200r/m離心20min，取白環(huán)以上的細(xì)胞1000r/m離心10min，計(jì)數(shù)。在含30％胎牛血清，40ng/mlGM-CSF(分別為人和小鼠的)和0.3％瓊脂的IMDM培養(yǎng)基的六空板中接種5×104個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)皿置于37℃，5％CO2的飽和濕箱中培養(yǎng)10天，在倒置光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)含有多于50個(gè)細(xì)胞的集落的數(shù)目。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)組小鼠有CFU-GM，CFU-G，CFU-M的生長(zhǎng)，而未移植的小鼠則沒(méi)有集落生長(zhǎng)，從而證實(shí)人脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有重建造血的能力，并可以分化為成熟的粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。
表2受體小鼠和對(duì)照組小鼠CFU-CM培養(yǎng)的比較分析
實(shí)施例3人脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)先損傷NOD/SCID小鼠的皮膚，然后再經(jīng)尾靜脈注射PKH26染色的細(xì)胞，7-9天后在肉芽腫最明顯的時(shí)候手術(shù)切除肉芽腫組織，熒光顯微鏡下觀察PKH26陽(yáng)性的細(xì)胞的分布，并用人特異性血管內(nèi)皮抗體免疫熒光染色。NOD/SCID小鼠在損傷后第8天左右，肉芽腫最明顯，切下的肉芽腫組織經(jīng)冰凍切片，免疫熒光染色，熒光顯微鏡下可以見(jiàn)到(圖9)(1)冰凍切片可見(jiàn)到PKH26的紅色熒光，證明存在人源性的細(xì)胞存在；(2)CD31，vWF的冰凍切片中可見(jiàn)到FITC的綠色熒光，證明為人來(lái)源的血管內(nèi)皮細(xì)胞；(3)比較紅色熒光和綠色熒光的照片，可以見(jiàn)到有些細(xì)胞同時(shí)有紅色熒光，和綠色熒光，證明其為人脂肪來(lái)源的MSC在NOD/SCID小鼠的損傷部位分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。
本發(fā)明所涉及的多個(gè)方面已做如上闡述。然而，應(yīng)理解的是，在不偏離本發(fā)明精神之前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)其進(jìn)行等同變換和修飾。它們的范圍也包括在所附的權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，它包括取人體脂肪組織，用膠原酶消化，經(jīng)梯度離心、過(guò)濾，隨后在體外培養(yǎng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；其特征在于，由該方法分離、培養(yǎng)獲得的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有CD11a-、CD31-、CD34-、CD45-和HLA-DR-，且CD44+或Flk-1+的表型；所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)制備可分化為造血細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述體外培養(yǎng)體系含有90％-99％DMEM/F12、10-30ng/mlEFG和1-10％FCS；所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞還具有CD29+、CD105+和/或CD166+的表型。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)制備可分化為造血細(xì)胞的藥物的用途。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)制備可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物中的用途。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)制備可分化為成骨細(xì)胞的藥物中的用途。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)制備可分化為成軟骨細(xì)胞的藥物中的用途。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)制備可分化為神經(jīng)細(xì)胞的藥物中的用途。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)制備可分化為上皮細(xì)胞的藥物中的用途。
9.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞經(jīng)制備可為人體其它組織工程、組織再生、修復(fù)的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，具體涉及一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。它包括取人體脂肪組織，用膠原酶消化，經(jīng)梯度離心、過(guò)濾，隨后在體外培養(yǎng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，其中所述體外培養(yǎng)體系含有DMEM/F12、EFG和FCS。本發(fā)明的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有CD11a
文檔編號(hào)C12N5/08GK1778905SQ20041008440
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月22日
發(fā)明者趙春華 申請(qǐng)人:趙春華