雪蓮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及在制備抗衰老產(chǎn)品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種雪蓮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及在制備抗衰老產(chǎn)品中的應(yīng)用。具體是取天山雪蓮幼嫩葉片，對(duì)其消毒后首先利用固體培養(yǎng)基分離天山雪蓮干細(xì)胞，再利用液體培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行傳代配養(yǎng)；所述固體培養(yǎng)基含有無(wú)機(jī)鹽、維生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類和活性炭；液體培養(yǎng)基含有無(wú)機(jī)鹽、維生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類和添加物。人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物在提高了細(xì)胞內(nèi)SOD酶的活性，從而減少因紫外線輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧自由基對(duì)細(xì)胞的攻擊和損害，降低細(xì)胞的死亡率，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用，達(dá)到抗光老化的功效。
【專利說(shuō)明】雪蓮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及在制備抗衰老產(chǎn)品中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物干細(xì)胞在抗衰老產(chǎn)品的應(yīng)用，尤其涉及雪蓮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方 法及在制備抗衰老產(chǎn)品中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞是一種尚未分化發(fā)育的種子細(xì)胞，具有無(wú)限自我更新復(fù)制和分化潛能，這 是干細(xì)胞用于美容產(chǎn)品的基礎(chǔ)。干細(xì)胞美容技術(shù)及其相關(guān)產(chǎn)品近兩年受到美容界專家及業(yè) 內(nèi)人士的廣泛關(guān)注。所有的干細(xì)胞，不論它們的來(lái)源（植物、動(dòng)物或者人類）均含有特別的 表觀遺傳因子以及豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些物質(zhì)是維持干細(xì)胞的自我更新能力。
[0003] 植物干細(xì)胞技術(shù)是以植物的傷口復(fù)原機(jī)制為基礎(chǔ)，先令植物形成傷口從而誘導(dǎo)復(fù) 原組織細(xì)胞的形成，復(fù)原組織包含了未分化的細(xì)胞即干細(xì)胞，將這些復(fù)原組織細(xì)胞收集起 來(lái)并在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中蘊(yùn)含了果糖、微量元素以及植物荷爾蒙，繼而放置于生物反 應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。
[0004] 雪蓮是菊科毛鳳菊屬多肉植物，為菊科多年生草本植物。雪蓮內(nèi)含有豐富的細(xì)胞， 尤其是干細(xì)胞。此外，由于其生在在海拔5000米的山中，那里空氣稀薄同時(shí)要飽受最強(qiáng)的 紫外線和輻射的侵襲，因此其干細(xì)胞可以從根本上解決人類普遍存在的衰老問(wèn)題。
[0005] 有相關(guān)報(bào)告和專利稱，將動(dòng)植物干細(xì)胞活性成分添加到化妝品中能起到一定的抗 皺效果，然而，真正來(lái)源于動(dòng)植物干細(xì)胞的活性物由于產(chǎn)率低導(dǎo)致原料價(jià)格非常昂貴，從而 限制了它的使用。此外，現(xiàn)今市場(chǎng)上干細(xì)胞產(chǎn)品多來(lái)自于動(dòng)物性胎盤素或動(dòng)物性干細(xì)胞，它 們與人體細(xì)胞成分接近，從而可以用于抗衰老等功效。然后，動(dòng)物源性干細(xì)胞的使用在許多 國(guó)家存在爭(zhēng)議，不僅存在安全隱患，同時(shí)具有諸多人道方面的限制。而植物干細(xì)胞蘇日安大 都具有全能性，具備干細(xì)胞的特點(diǎn)，然而其與人體的同源性較多，因此植物干細(xì)胞提取物具 備的功能目前還不是十分清楚，阻礙了相應(yīng)的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 目前蘋果干細(xì)胞已被首次應(yīng)用到化妝品中，而對(duì)于雪蓮干細(xì)胞的研宄目前并未報(bào) 道，所以本發(fā)明首次從雪蓮復(fù)原組織中提取分離較高生理活性的植物干細(xì)胞，并進(jìn)行大規(guī) 模生產(chǎn)；將其制成凍干粉，以一定的比例添加至抗衰老美容產(chǎn)品中。
[0007] 本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0008] 一種雪蓮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，取天山雪蓮幼嫩葉片，對(duì)其消毒后 首先利用固體培養(yǎng)基分離天山雪蓮干細(xì)胞，再利用液體培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行傳代配養(yǎng)；所述固 體培養(yǎng)基含有無(wú)機(jī)鹽、維生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類和活性炭；液體培養(yǎng)基含有無(wú)機(jī)鹽、維 生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類和添加物。
[0009] 優(yōu)選包括以下步驟：
[0010] ⑴取雪蓮幼嫩葉片，清洗、消毒；
[0011] (2)將消毒后的雪蓮葉片接種至固體培養(yǎng)基上；所述固體培養(yǎng)基含有無(wú)機(jī)鹽、維 生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類、活性炭和瓊脂；培養(yǎng)溫度為25-29°C，pH值為6. 0-6. 5,培養(yǎng)時(shí) 間為20-25天，得到來(lái)源于形成層的雪蓮干細(xì)胞；
[0012] (3)將來(lái)源于形成層的雪蓮干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述液體培養(yǎng)基含 有無(wú)機(jī)鹽、維生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類和添加物。
[0013] 在步驟（2)所述接種之前，先將消毒后雪蓮幼嫩葉片切成約0. 5cm*0. 5cm大小，接 種時(shí)，使葉背面與培養(yǎng)基接觸，每瓶1片；
[0014] 步驟（2)所述無(wú)機(jī)鹽為硝酸鉀、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、氯化鈣、碘化鉀、 氯化鈷、磷酸二氫鈉或硼酸中的一種以上；各物質(zhì)的含量為：硝酸鉀2450-2500mg/L，硫酸 鎂 122-124mg/L，硫酸錳 ll-13mg/L，硫酸鋅 2. 0-3. Omg/L，硫酸銅(λ 03-0. 05mg/L，氯化鈣 112-114mg/L，碘化鉀 0· 7-0. 75mg/L，氯化鈷 0· 024-0. 026mg/L，磷酸二氫鈉 132-135mg/L， 硼酸 2. 8-3. Omg/L ;
[0015] 維生素為肌醇、硫胺類、煙酸、L-抗壞血酸或檸檬酸中的一種以上；各物質(zhì)的含量 為：肌醇 210-230mg/L，硫胺類 19-21mg/L，煙酸 L 6-2. 2mg/L，L-抗壞血酸 52-55mg/L，檸檬 酸 75_85mg/L ;
[0016] 氨基酸為L(zhǎng)-天冬氨酸、L精氨酸、甘氨酸或脯氨酸中的一種以上；各物質(zhì)的 含量為：L-天冬氨酸135-145mg/L，L精氨酸160-180mg/L，甘氨酸78-85mg/L，脯氨酸 118-126mg/L ；
[0017] 生長(zhǎng)素為α -萘乙酸，含量為L(zhǎng) 8-3. Omg/L ;
[0018] 糖類為蔗糖或果糖，含量為10. 0-12. Omg/L ;
[0019] 活性炭的含量為450-550mg/L ;
[0020] 瓊脂的含量為3. 6-3. 8mg/L ;
[0021] 步驟（3)所述無(wú)機(jī)鹽為硝酸鉀、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、氯化鈣、碘化鉀、 氯化鈷、磷酸二氫鈉或硼酸中的一種以上；
[0022] 各物質(zhì)的含量為：硝酸鉀992-996mg/L，硫酸鎂180-184mg/L，硫酸錳22-26mg/L， 硫酸鋅l〇_12mg/L，硫酸銅(λ 3-0. 5mg/L，氯化鈣72-76mg/L，碘化鉀(λ 3-0. 6mg/L，氯化鈷 0· 03-0. 036mg/L，磷酸二氫鈉 126-131mg/L，硼酸 2· 0-2. 5mg/L ;
[0023] 維生素為肌醇、硫胺類、煙酸、L-抗壞血酸或檸檬酸中的一種以上；各物質(zhì)含量 為：肌醇194-220mg/L，硫胺類20-23mg/L，煙酸3-5mg/L，L-抗壞血酸57-62mg/L，檸檬酸 75-83mg/L ；
[0024] 氨基酸為L(zhǎng)-天冬氨酸、L精氨酸、甘氨酸或脯氨酸中的一種以上；各物質(zhì)的含 量為：L-天冬氨酸136-142mg/L，L精氨酸172-180mg/L，甘氨酸75. 0-85. Omg/L，脯氨酸 HO. 0-115. 0mg/L ；
[0025] 生長(zhǎng)素為α -萘乙酸，含量為3. 0-5. 0mg/L ;
[0026] 糖類為蔗糖或果糖，含量為32. 0-34. 0mg/L ;
[0027] 添加物為麥飯石顆粒和硒礦石顆粒，麥飯石顆粒60. 0-80. 0mg/L，硒礦石顆粒 60.0-80. 0mg/L〇
[0028] 本發(fā)明還提供了一種利用所述的分離培養(yǎng)方法制備雪蓮干細(xì)胞提取物的方法，包 括以下步驟：
[0029] (1)將上述的分離培養(yǎng)方法獲得的雪蓮干細(xì)胞放大培養(yǎng)；
[0030] (2)過(guò)濾培養(yǎng)液，將截留的細(xì)胞系培養(yǎng)物取出，冷凍、破碎后，過(guò)濾，將濾液濃縮即 得雪蓮干細(xì)胞提取物。
[0031] 所述放大培養(yǎng)是將在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干細(xì)胞移入生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)液 使用液態(tài)培養(yǎng)基（成分同分離培養(yǎng)方法步驟（3)中的液體培養(yǎng)基），在25°C不間斷攪拌，在 培養(yǎng)至第IOd時(shí)，向生物反應(yīng)器內(nèi)注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和無(wú)菌磁化水的混合液；
[0032] 步驟（2)所述冷凍是放入-80°C超低溫冷凍2h，取出解凍30min ;再放入-80°C超 低溫冷凍，依次3-5次；最后一次解凍后利用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，過(guò)濾器過(guò)濾，收集濾 液，旋轉(zhuǎn)式真空蒸發(fā)器內(nèi)濃縮，即為雪蓮干細(xì)胞提取物。
[0033] 還包括將雪蓮干細(xì)胞提取物與甘露醇和水混合后，除菌、凍干制得雪蓮干細(xì)胞提 取物凍干粉的步驟。所述水為50?60°C的超純水，采用BCA法對(duì)所述雪蓮干細(xì)胞提取物進(jìn) 行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，根據(jù)該蛋白濃度，加入水調(diào)節(jié)至蛋白終濃度為50. 0±0. 5 μ g/ml ;所述 甘露醇的質(zhì)量占雪蓮干細(xì)胞提取物總質(zhì)量的5% ;所述凍干的溫度為-20?-35°C，真空度 為50?200Pa，凍干時(shí)間為48小時(shí)。
[0034] 本發(fā)明提供了 一種雪蓮干細(xì)胞提取物凍干粉包括雪蓮干細(xì)胞提取物和甘露醇，其 中甘露醇的質(zhì)量占雪蓮干細(xì)胞提取物總質(zhì)量的5%。
[0035] 本發(fā)明還提供了所述的雪蓮干細(xì)胞提取物的制備方法制得雪蓮干細(xì)胞提取物或 雪蓮干細(xì)胞提取物凍干粉在抗衰老產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0036] 優(yōu)選，所述的方法制得雪蓮干細(xì)胞提取物或雪蓮干細(xì)胞提取物凍干粉制得的一種 眼霜，包含雪蓮干細(xì)胞凍干粉〇. l_20ng、緊膚劑2. 0-3. 5g、去皺劑0. 5-2. 5g、丙烯酸聚合物 0. 5-2. 5g、乳化劑I. 0-3. 5g、棕櫚酸異丙酯3. 5-5. 5g和合成角鯊?fù)?. 5-3. 5g。
[0037] 本發(fā)明眼霜的制備工藝包括如下步驟：
[0038] 將丙烯酸聚合物用去離子水加熱溶解、攪拌均勻，A組分于70?80°C溶解，A組分 倒入丙烯酸聚合物中，攪拌均勻，降溫至37?50°C后加入C組分和D組分，攪拌均勻，則制 備得到本實(shí)施例的雪蓮干細(xì)胞凍干粉眼霜。A組分包括乳化劑、棕櫚酸異丙酯和合成角鯊 烷。C組分包括緊膚劑和去皺劑，D組分為用穩(wěn)定劑溶解后的雪蓮干細(xì)胞凍干粉。
[0039] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0040] 人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物在提高了細(xì)胞內(nèi)SOD酶的活性，從而減少因紫外線輻 射誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧自由基對(duì)細(xì)胞的攻擊和損害，降低細(xì)胞的死亡率，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作 用，達(dá)到抗光老化的功效。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1為雪蓮干細(xì)胞凍干粉對(duì)SOD酶活性的影響；
[0042] 圖2為雪蓮干細(xì)胞凍干粉對(duì)小鼠血漿中SOD酶活性影響；
[0043] 圖3為雪蓮干細(xì)胞凍干粉對(duì)小鼠血漿中GPx活性影響；
[0044] 圖4為雪蓮干細(xì)胞凍干粉對(duì)小鼠血漿中MDA活性影響。

【具體實(shí)施方式】
[0045] 實(shí)施例1
[0046] (1)天山雪蓮材料的準(zhǔn)備
[0047] 本發(fā)明取天山雪蓮幼嫩葉片，葉片用自來(lái)水流水沖洗2h ;用濃度70%酒精表面消 毒10s，無(wú)菌水沖洗3次；用濃度0. 1 %升貢溶液分別消毒4、6、8、IOmin后，用無(wú)菌水沖洗3 次，洗去植物表面的升貢殘液，以構(gòu)成不同的消毒處理；將消毒材料放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用 無(wú)菌濾紙吸干水分備用。
[0048] (2)從材料中分離天山雪蓮干細(xì)胞
[0049] 無(wú)菌條件下，將消毒后雪蓮幼嫩葉片切成約0. 5cm*0. 5cm大小，接種在固體培養(yǎng) 基上。接種時(shí)，使葉背面與培養(yǎng)基接觸，每瓶1塊。培養(yǎng)溫度為25°C，培養(yǎng)pH值6. 0,培養(yǎng) 時(shí)間為20天。
[0050] 固體培養(yǎng)基成分為硝酸鉀2450mg/L ;肌醇210mg/L ;L-天冬氨酸135mg/L ; α -萘 乙酸 I. 8mg/L、鹿糖 10. Omg/L、活性炭 450mg/L，瓊脂 3. 6mg/L，用 0· 1% NaOH 或 HCl 調(diào) pH 值 至5. 8,在溫度121°C、壓力98kPa的條件下，高壓蒸汽滅菌20min后置無(wú)菌室保存?zhèn)溆谩?br> [0051] ⑶傳代培養(yǎng)
[0052] 待培養(yǎng)至20天時(shí)，將形成層細(xì)胞轉(zhuǎn)移至優(yōu)選的包含液態(tài)培養(yǎng)基的燒瓶中培養(yǎng)，并 時(shí)刻在顯微鏡下觀察細(xì)胞的聚集狀態(tài)和程度。
[0053] 液體培養(yǎng)基為：硝酸鉀992mg/L、煙酸3. Omg/L、甘氨酸75mg/L、α -萘乙酸3. Omg/ L、蔗糖32. Omg/L、麥飯石顆粒60. Omg/L和硒礦石顆粒60. Og/L，其余為水。用0· 1 % NaOH 或HCl調(diào)pH值至5. 8,在溫度121°C、壓力98kPa的條件下，高壓蒸汽滅菌20min后置無(wú)菌 室保存?zhèn)溆谩?br> [0054] (4)生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)
[0055] 將在燒瓶中培養(yǎng)的干細(xì)胞移入20L的生物反應(yīng)器內(nèi)放大培養(yǎng)，培養(yǎng)液使用（3)中 優(yōu)選的液態(tài)培養(yǎng)基，在25°C不間斷攪拌。在培養(yǎng)至第IOd時(shí)，向生物反應(yīng)器內(nèi)注入蔗糖、甲 基茉莉酮酸酯和無(wú)菌磁化水的混合液，以補(bǔ)充后期營(yíng)養(yǎng)加速干細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0056] (5)細(xì)胞收集及破碎
[0057] 將培養(yǎng)液用Ium過(guò)濾器過(guò)濾，去掉培養(yǎng)液，將截留的細(xì)胞系培養(yǎng)物取出，放 入-80°C超低溫速凍2h，取出解凍30min ;再放入-80°C超低溫速凍，依次3次；最后一次解 凍后利用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，過(guò)濾器過(guò)濾，收集濾液，旋轉(zhuǎn)式真空蒸發(fā)器內(nèi)濃縮，即為 雪蓮干細(xì)胞提取物溶液。
[0058] (6)凍干粉制備
[0059] 采用BCA法對(duì)雪蓮干細(xì)胞提取物溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，根據(jù)該蛋白濃度， 加入賦形劑甘露醇（甘露醇占雪蓮干細(xì)胞提取物溶液總重量的5% )和50°C的超純水 混勻，并調(diào)節(jié)至蛋白終濃度為50. 0+0. 5 μ g/ml，過(guò)濾除菌，然后進(jìn)行凍干處理，凍干溫度 為-20°C，真空度為50Pa，凍干時(shí)間為48小時(shí)，則制備得到所需的雪蓮干細(xì)胞提取物凍干 粉；凍干粉按照Iml量/支分裝。
[0060] 實(shí)施例2
[0061] (1)天山雪蓮材料的準(zhǔn)備
[0062] 本發(fā)明取天山雪蓮幼嫩葉片，葉片用自來(lái)水流水沖洗4h ;用濃度75%酒精表面消 毒15s，無(wú)菌水沖洗5次；用濃度0. 1 %升貢溶液分別消毒4、6、8、IOmin后，用無(wú)菌水沖洗5 次，洗去植物表面的升貢殘液，以構(gòu)成不同的消毒處理；將消毒材料放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用 無(wú)菌濾紙吸干水分備用。
[0063] (2)從材料中分離天山雪蓮干細(xì)胞
[0064] 無(wú)菌條件下，將消毒后雪蓮幼嫩葉片切成約0. 5cm*0. 5cm大小，接種在固體培養(yǎng) 基上。接種時(shí)，使葉背面與培養(yǎng)基接觸，每瓶1塊。培養(yǎng)溫度為29°C，培養(yǎng)pH在6. 5,培養(yǎng) 時(shí)間為30天左右。
[0065] 固體培養(yǎng)基為：氯化鈷0. 〇25mg/l、L-抗壞血酸54mg/l ;脯氨酸120mg/l ;生長(zhǎng)素 為α -萘乙酸2. 5mg/l、糖類為蔗糖11. Omg/1、添加物為活性炭500mg/L，瓊脂3. 7mg/l。用 0· 1 % NaOH或HCl調(diào)pH值至5. 8,在溫度121 °C、壓力108kPa的條件下，高壓蒸汽滅菌25min 后置無(wú)菌室保存?zhèn)溆谩?br> [0066] (3)傳代培養(yǎng)
[0067] 待培養(yǎng)至30天時(shí)，將形成層細(xì)胞轉(zhuǎn)移至優(yōu)選的包含液態(tài)培養(yǎng)基的燒瓶中培養(yǎng)，并 時(shí)刻在顯微鏡下觀察細(xì)胞的聚集狀態(tài)和程度。
[0068] 液體培養(yǎng)基的成分為：磷酸二氫鈉130mg/l ;檸檬酸80mg/l ;脯氨酸114. Omg/1 ; 生長(zhǎng)素為α -萘乙酸4. Omg/1、糖類為蔗糖33. Omg/1、添加物為麥飯石顆粒70. Omg/1和硒 礦石顆粒70. Omg/1，其余為水。用0· 1% NaOH或HCl調(diào)pH值至5. 8,在溫度121 °C、壓力 108kPa的條件下，高壓蒸汽滅菌25min后置無(wú)菌室保存?zhèn)溆谩?br> [0069] (4)生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)
[0070] 將在燒瓶中培養(yǎng)的干細(xì)胞移入20L的生物反應(yīng)器內(nèi)放大培養(yǎng)，培養(yǎng)液使用（3)中 優(yōu)選的液態(tài)培養(yǎng)基，在25°C不間斷攪拌。在培養(yǎng)至第IOd時(shí)，向生物反應(yīng)器內(nèi)注入蔗糖、甲 基茉莉酮酸酯和無(wú)菌磁化水的混合液，以補(bǔ)充后期營(yíng)養(yǎng)加速干細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0071] (5)細(xì)胞收集及破碎
[0072] 將培養(yǎng)液用Ium過(guò)濾器過(guò)濾，去掉培養(yǎng)液，將截留的細(xì)胞系培養(yǎng)物取出，放 入-80°C超低溫速凍2h，取出解凍30min ;再放入-80°C超低溫速凍，依次5次；最后一次解 凍后利用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，過(guò)濾器過(guò)濾，收集濾液，旋轉(zhuǎn)式真空蒸發(fā)器內(nèi)濃縮，即為 雪蓮干細(xì)胞提取物溶液。
[0073] (6)凍干粉制備
[0074] 采用BCA法對(duì)雪蓮干細(xì)胞提取物溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，根據(jù)該蛋白濃度，加 入賦形劑甘露醇（甘露醇占雪蓮干細(xì)胞提取物溶液總重量的5% )和60°C的超純水混勻， 并調(diào)節(jié)至蛋白終濃度為49. 5 μ g/ml，過(guò)濾除菌，然后進(jìn)行凍干處理，凍干溫度為-35°C，真 空度為200Pa，凍干時(shí)間為48小時(shí)，則制備得到所需的雪蓮干細(xì)胞提取物凍干粉；凍干粉按 照Iml量/支分裝。
[0075] 實(shí)施例3
[0076] (1)天山雪蓮材料的準(zhǔn)備
[0077] 本發(fā)明取天山雪蓮幼嫩葉片，葉片用自來(lái)水流水沖洗3h;用濃度75%酒精表面消 毒15s，無(wú)菌水沖洗4次；用濃度0. 1 %升貢溶液分別消毒4、6、8、IOmin后，用無(wú)菌水沖洗4 次，洗去植物表面的升貢殘液，以構(gòu)成不同的消毒處理；將消毒材料放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用 無(wú)菌濾紙吸干水分備用。
[0078] (2)從材料中分離天山雪蓮干細(xì)胞
[0079] 無(wú)菌條件下，將消毒后雪蓮幼嫩葉片切成約0. 5cm*0. 5cm大小，接種在固體培養(yǎng) 基上。接種時(shí)，使葉背面與培養(yǎng)基接觸，每瓶1塊。培養(yǎng)溫度為27°C，培養(yǎng)pH值在6. 0,培 養(yǎng)時(shí)間為15天。
[0080] 固體培養(yǎng)基成分為：碘化鉀0. 75mg/l、氯化鈷0. 026mg/l ;煙酸2. 2mg/l、甘氨酸 85mg/l ;生長(zhǎng)素為α -萘乙酸3. Omg/1、糖類為果糖12. Omg/ml、添加物為活性炭500. Omg/ 1，瓊脂3.811^/1;用0.1%恥0!1或!1(：1調(diào)？!1值至5.8，在溫度121°0、壓力100迚 &的條件 下，高壓蒸汽滅菌15min后置無(wú)菌室保存?zhèn)溆谩?br> [0081] ⑶傳代培養(yǎng)
[0082] 待培養(yǎng)至15天時(shí)，將形成層細(xì)胞轉(zhuǎn)移至優(yōu)選的包含液態(tài)培養(yǎng)基的燒瓶中培養(yǎng)，并 時(shí)刻在顯微鏡下觀察細(xì)胞的聚集狀態(tài)和程度。
[0083] 液體培養(yǎng)基的成分為：磷酸二氫鈉131mg/l、硼酸2. 5mg/l ;L-抗壞血酸62. Omg/ 1、檸檬酸83.0mg/l ;L-天冬氨酸142.0mg/l、L精氨酸180mg/l ;生長(zhǎng)素為α-萘乙酸 5. Omg/1、糖類為鹿糖34. Omg/1、添加物為麥飯石顆粒80mg/l和硒礦石顆粒80mg/l，其余為 水。用0. 1 % NaOH或HCl調(diào)pH值至5. 8,在溫度121°C、壓力IOOkPa的條件下，高壓蒸汽滅 菌15min后置無(wú)菌室保存?zhèn)溆谩?br> [0084] (4)生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)
[0085] 將在燒瓶中培養(yǎng)的干細(xì)胞移入20L的生物反應(yīng)器內(nèi)放大培養(yǎng)，培養(yǎng)液使用（3)中 優(yōu)選的液態(tài)培養(yǎng)基，在25°C不間斷攪拌。在培養(yǎng)至第IOd時(shí)，向生物反應(yīng)器內(nèi)注入蔗糖、甲 基茉莉酮酸酯和無(wú)菌磁化水的混合液，以補(bǔ)充后期營(yíng)養(yǎng)加速干細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0086] (5)細(xì)胞收集及破碎
[0087] 將培養(yǎng)液用Ium過(guò)濾器過(guò)濾，去掉培養(yǎng)液，將截留的細(xì)胞系培養(yǎng)物取出，放 入-80°C超低溫速凍2h，取出解凍30min ;再放入-80°C超低溫速凍，依次4次；最后一次解 凍后利用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，過(guò)濾器過(guò)濾，收集濾液，旋轉(zhuǎn)式真空蒸發(fā)器內(nèi)濃縮，即為 雪蓮干細(xì)胞提取物溶液。
[0088] (6)凍干粉制備
[0089] 采用BCA法對(duì)雪蓮干細(xì)胞提取物溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，根據(jù)該蛋白濃度，加 入賦形劑甘露醇（甘露醇占雪蓮干細(xì)胞提取物溶液總重量的5% )和55°C的超純水混勻， 并調(diào)節(jié)至蛋白終濃度為50. 0 μ g/ml，過(guò)濾除菌，然后進(jìn)行凍干處理，凍干溫度為-30°C，真 空度為l〇〇Pa，凍干時(shí)間為48小時(shí)，則制備得到所需的雪蓮干細(xì)胞提取物凍干粉；凍干粉按 照Iml量/支分裝。
[0090] 雪蓮干細(xì)胞凍干粉眼霜
[0091] 本實(shí)施例將眼霜成分進(jìn)行分組，如表1所示，制備得到3種配方的含有制備的雪蓮 干細(xì)胞凍干粉的眼霜。
[0092] 表 1
[0093]

【權(quán)利要求】
1. 一種雪蓮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，取天山雪蓮幼嫩葉片，對(duì)其消毒后首 先利用固體培養(yǎng)基分離天山雪蓮干細(xì)胞，再利用液體培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行傳代配養(yǎng)；所述固體 培養(yǎng)基含有無(wú)機(jī)鹽、維生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類和活性炭；液體培養(yǎng)基含有無(wú)機(jī)鹽、維生 素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類和添加物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 取雪蓮幼嫩葉片，清洗、消毒； (2) 將消毒后的雪蓮葉片接種至固體培養(yǎng)基上；所述固體培養(yǎng)基含有無(wú)機(jī)鹽、維生素、 氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類、活性炭和瓊脂；培養(yǎng)溫度為25-29°C，pH值為6. 0-6. 5,培養(yǎng)時(shí)間為 20-25天，得到來(lái)源于形成層的雪蓮干細(xì)胞； (3) 將來(lái)源于形成層的雪蓮干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述液體培養(yǎng)基含有無(wú) 機(jī)鹽、維生素、氨基酸、生長(zhǎng)素、糖類和添加物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，在步驟（2)所述接種之前，先 將消毒后雪蓮幼嫩葉片切成約〇. 5cm*0. 5cm大小，接種時(shí)，使葉背面與培養(yǎng)基接觸，每瓶1 片； 步驟（2)所述無(wú)機(jī)鹽為硝酸鉀、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、氯化鈣、碘化鉀、氯 化鈷、磷酸二氫鈉或硼酸中的一種以上；各物質(zhì)的含量為：硝酸鉀2450-2500mg/L，硫酸 鎂 122-124mg/L，硫酸錳 ll-13mg/L，硫酸鋅 2. 0-3. Omg/L，硫酸銅 0? 03-0. 05mg/L，氯化鈣 112-114mg/L，碘化鉀 0? 7-0. 75mg/L，氯化鈷 0? 024-0. 026mg/L，磷酸二氫鈉 132-135mg/L， 硼酸 2. 8-3. Omg/L ; 維生素為肌醇、硫胺類、煙酸、L-抗壞血酸或檸檬酸中的一種以上；各物質(zhì)的含量為： 肌醇 210-230mg/L，硫胺類 19-21mg/L，煙酸 1. 6-2. 2mg/L，L-抗壞血酸 52-55mg/L，檸檬酸 75_85mg/L ; 氨基酸為L(zhǎng)-天冬氨酸、L精氨酸、甘氨酸或脯氨酸中的一種以上；各物質(zhì)的含量為： L-天冬氨酸 135-145mg/L，L 精氨酸 160-180mg/L，甘氨酸 78-85mg/L，脯氨酸 118-126mg/L ; 生長(zhǎng)素為a-萘乙酸，含量為1.8-3. Omg/L; 糖類為蔗糖或果糖，含量為10. 0-12. Omg/L ; 活性炭的含量為450-550mg/L ; 瓊脂的含量為3. 6-3. 8mg/L ; 步驟（3)所述無(wú)機(jī)鹽為硝酸鉀、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、氯化鈣、碘化鉀、氯化 鈷、磷酸二氫鈉或硼酸中的一種以上； 各物質(zhì)的含量為：硝酸鉀992-996mg/L，硫酸鎂180-184mg/L，硫酸錳22-26mg/L，硫 酸鋅 10-12mg/L，硫酸銅 0? 3-0. 5mg/L，氯化鈣 72-76mg/L，碘化鉀 0? 3-0. 6mg/L，氯化鈷 0? 03-0. 036mg/L，磷酸二氫鈉 126-131mg/L，硼酸 2. 0-2. 5mg/L ; 維生素為肌醇、硫胺類、煙酸、L-抗壞血酸或檸檬酸中的一種以上；各物質(zhì)含量為： 肌醇194-220mg/L，硫胺類20-23mg/L，煙酸3-5mg/L，L-抗壞血酸57-62mg/L，檸檬酸 75-83mg/L ； 氨基酸為L(zhǎng)-天冬氨酸、L精氨酸、甘氨酸或脯氨酸中的一種以上；各物質(zhì)的含量 為：L-天冬氨酸136-142mg/L，L精氨酸172-180mg/L，甘氨酸75. 0-85. Omg/L，脯氨酸 110. 0-115. 0mg/L ； 生長(zhǎng)素為a -萘乙酸，含量為3. 0-5. Omg/L ; 糖類為蔗糖或果糖，含量為32. 0-34. Omg/L ; 添加物為麥飯石顆粒和硒礦石顆粒，麥飯石顆粒60. 0-80. Omg/L，硒礦石顆粒 60.0-80. Omg/L〇
4. 利用權(quán)利要求1或2的分離培養(yǎng)方法制備雪蓮干細(xì)胞提取物的方法，其特征在于，包 括以下步驟： (1) 將權(quán)利要求1或2所述的分離培養(yǎng)方法獲得的雪蓮干細(xì)胞放大培養(yǎng)； (2) 過(guò)濾培養(yǎng)液，將截留的細(xì)胞系培養(yǎng)物取出，冷凍、破碎后，過(guò)濾，將濾液濃縮即得雪 蓮干細(xì)胞提取物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述放大培養(yǎng)是將在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 的干細(xì)胞移入生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)液使用液態(tài)培養(yǎng)基，在25°C不間斷攪拌，在培養(yǎng)至第 10d時(shí)，向生物反應(yīng)器內(nèi)注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和無(wú)菌磁化水的混合液； 步驟（2)所述冷凍是放入_80°C超低溫冷凍2h，取出解凍30min ;再放入-80°C超低溫 冷凍，依次3-5次；最后一次解凍后利用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，過(guò)濾器過(guò)濾，收集濾液，旋 轉(zhuǎn)式真空蒸發(fā)器內(nèi)濃縮，即為雪蓮干細(xì)胞提取物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，還包括將雪蓮干細(xì)胞提取物與甘露醇和 水混合后，除菌、凍干制得雪蓮干細(xì)胞提取物凍干粉的步驟。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述水為50?60°C的超純水，采用BCA 法對(duì)所述雪蓮干細(xì)胞提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，根據(jù)該蛋白濃度，加入水調(diào)節(jié)至蛋白終 濃度為50. 0±0. 5 y g/ml ;所述甘露醇的質(zhì)量占雪蓮干細(xì)胞提取物總質(zhì)量的5% ;所述凍干 的溫度為-20?_35°C，真空度為50?200Pa，凍干時(shí)間為48小時(shí)。
8. -種雪蓮干細(xì)胞提取物凍干粉，其特征在于，包括雪蓮干細(xì)胞提取物和甘露醇，其中 甘露醇的質(zhì)量占雪蓮干細(xì)胞提取物總質(zhì)量的5%。
9. 權(quán)利要求4-7之一所述的方法制得雪蓮干細(xì)胞提取物或雪蓮干細(xì)胞提取物凍干粉 在抗衰老產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求4-7之一所述的方法制得雪蓮干細(xì)胞提取物或雪蓮干細(xì)胞提取物凍干粉 制得的一種眼霜，其特征在于，包含雪蓮干細(xì)胞凍干粉〇. l_20ng、緊膚劑2. 0-3. 5g、去皺劑 0. 5-2. 5g、丙烯酸聚合物0. 5-2. 5g、乳化劑1. 0-3. 5g、棕櫚酸異丙酯3. 5-5. 5g和合成角鯊 烷 0? 5-3. 5g。
【文檔編號(hào)】C12N5/04GK104498425SQ201410715007
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 馬巖巖, 王小燕, 羅二梅, 舒輝萍 申請(qǐng)人:廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司