專利名稱：一種植物細胞抗衰老劑(pg)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物組織和細胞培養(yǎng)技術領域具體涉及植物細胞和組織培養(yǎng)用的培養(yǎng)基及DNA提取液的制備。其國際專利分類號為C12N5/00。
衰老(Senescence)是生物的一個自然過程，但有些情況下的衰老是由環(huán)境條件惡化而引起的，當環(huán)境得到改善時，衰老即可延緩。衰老的生理過程與體內(nèi)的激素變化密切相關。其中最引人注目的是乙烯的變化。Yang等提出乙烯在植物體中的合成途徑是蛋氨酸(Met)→S-腺苷蛋氨酸(SAM)→1-氨基環(huán)丙烷基羧酸(ACC)→乙烯[14]。(見Yang，S.F.1985，Hortsci.，1459-60)，許多抗衰老劑和保鮮劑均依照Yang的理論在配方中加入乙烯拮抗劑和抑制劑。例如Ag(S2O3)2，AVG(氨基乙氧基乙烯基甘氨酸)、AOA(氨基氧乙酸)(Wang，C.Y.et al.，1977，J.Am.Soci.Hort.Sci.，10517-520.)等。但AVG生產(chǎn)成本較高而不能用于商業(yè)，AOA也未能大量應用于實際中。Baker發(fā)現(xiàn)乙烯的合成和自由基的存在有關(見Baker，J.E.et al.，1978，Plant Physicl.，61886-888)，所以又有些研究者用一些自由基清除劑來抗衰老，如苯甲酸(見1978，Plant Physicl，61886-888)和醅酸正丙酯(見Wang，C.Y.et al.，1977，J.Am.Soei.Hort.Sci.，10517-520)。懸浮培養(yǎng)的細胞的衰老-則是由于細胞間相互營養(yǎng)競爭引起，更重要的是細胞生長條件的惡化。如環(huán)境中由于代謝而產(chǎn)生的有害物質(zhì)，特別是氧化物質(zhì)，所以研究者常把抗氧化劑如抗壞血酸、硫代硫酸鈉等添加到培養(yǎng)基中。硫代硫酸鈉的抗氧化效果不好，抗壞血酸雖有較好的抗氧化效果，但其本身的化學性質(zhì)極不穩(wěn)定。通常人們認為懸浮系的褐化是有害物質(zhì)累積的結果，故采用一些吸附物質(zhì)，如活性炭，來改善細胞的褐化。但其易吸附培養(yǎng)基中的有效成份而改變培養(yǎng)基的性質(zhì)。本發(fā)明者認為，pH值的變化會對細胞的生長產(chǎn)生廣泛而深遠的影響，優(yōu)化培養(yǎng)液的pH值是抗衰老最有效而簡便的途徑。懸浮培養(yǎng)中，細胞選擇性地吸收NH4+、K+等陽離子，會使培養(yǎng)液酸化，蔗糖的分解也是一個因素，再加之細胞本身向外分泌一些酸性物質(zhì)，從而加快了酸化速度。由于酸化可能影響到一些營養(yǎng)的吸收及體內(nèi)的代謝活動，進而影響生長。當NO3-被吸收時，培養(yǎng)液的pH值會升高，當pH值升高到一定程度(＞6.2)時，會影響細胞對鐵的吸收，由于缺鐵，生長即告停止。生物體內(nèi)的許多生化反應是要求在一定的pH值下進行的，所以pH值的變化會影響到代謝。在原生質(zhì)體培養(yǎng)中Davey(1983)觀察到pH值除了直接影響原生質(zhì)體及再生細胞的生理活動外，還能影響外源激素對培養(yǎng)物的毒害性。pH值在5.6或6.0時，2，4-D濃度超過1mg/L時就能對低濃度培養(yǎng)物產(chǎn)生毒害。pH值的變化還可影響到氧化還原電位。(見In Protoplast 1983，LectureProceeding Birkhuser Venlage，Basel.pp.19-29)。植物本身對pH值的緩沖能力是非常有限的，所以人們?yōu)榱朔€(wěn)定pH值，在培養(yǎng)液中添加Ca(H2PO4)2、CaCO3、MES等(見中科院上海植生所，1978，植物組織和細胞培養(yǎng)，上?？茖W技術出版社p195)。但鈣鹽穩(wěn)定pH值的效果不是很好，MES雖有較好的pH值穩(wěn)定效果，但其價格昂貴且依賴進口，大規(guī)模使用是不現(xiàn)實的，所以尋求較為理想的pH值緩沖物質(zhì)是非常有意義的。d′Utra-Vaz(1992)在原生質(zhì)體培養(yǎng)時對培養(yǎng)物加以無菌的分子氧流從而促進了原生質(zhì)體的植板和克隆的形成，懸浮培養(yǎng)時，環(huán)境的供氧狀態(tài)對細胞生長至關重要。(見1992，Plant Cell Report，11(8)416-418)。一般培養(yǎng)條件下的供氧是不足的。如果人為過于增加環(huán)境的氧分壓并降低CO2的濃度就可能刺激乙烯的產(chǎn)生，因為CO2是乙烯的抑制物質(zhì)。(見Uota，M.，1969，J.Amer.Soc.Hort.Sci.，94598-601)。所以除氫保氧是良好的解決途徑。棉花、花生等含酚類物質(zhì)的作物依一般方法提取的DNA有發(fā)紅現(xiàn)象，這影響到以后的酶切。Andrew曾用DIECA來解決這一問題(1993.PlantMdecular Bidogy Reporter，11(2)122-127)。DIECA價格昂貴，國內(nèi)應用依賴進口。
本發(fā)明的目的在于克服已有技術之不足，制造一種適合離體培養(yǎng)(in vitro)條件下植物細胞抗衰老劑，用于改善植物細胞和組織培養(yǎng)中愈傷組織及細胞懸浮培養(yǎng)中的抗衰老以及DNA的提取中的抗氧化方面。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一種用于離體培養(yǎng)條件下的植物細胞抗衰老劑組合物(以重量計)，含有10.000-500.000g/L的肌醇六磷酸酯(PA)0.200-20.000g/L的二氧化鍺(GeO2)，和/或MES(Morpholinoethanesulfonic acid)0.500-25.000g/L發(fā)明人認為該細胞抗衰老劑也可以按下列比例配制(以重量計)，其中PA為30.000～350.000g/L；GeO2為1.00010.000g/LMES為1.000～20.000g/L。其最佳添加量為PA為80.000～110.0008/L；GeO2為1.500～5.000g/L；MES為3.000～10.000g/L。
使用時是先將上述PA、GeO2和/或MES按一定重量比例配成母液(本發(fā)明稱此抗衰老劑為PG，下同)，再按植物組織和細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)基的制備規(guī)程添加到各自的培養(yǎng)基中去。
本發(fā)明的構思依據(jù)是，本發(fā)明的細胞抗衰老劑PG含有下列三種化合物或天然產(chǎn)物，即PA(肌醇六磷酸酯)，二氧化鍺(GeO2)和MES(Marpholinoethane Sulfonic acid)，PA為天然產(chǎn)物，系直接從谷物中提取。PA分子結構中具有眾多的羥基，所以具有很強的抗氧化和穩(wěn)定pH值的作用，PA在廣泛的pH值范圍內(nèi)對金屬離子起絡合作用，對多酚氧化酶的中心金屬元素銅起到強的絡合作用。PA與鍺能形成具有多種生物活性的絡合物-有機鍺。鍺和氫的作用能力很強，能優(yōu)先和細胞代謝過程中出現(xiàn)的氫結合從而起到保氧作用。鍺還能清除自由基起到抗衰老作用。由于PA對鍺的結合，使其可能的毒害性不會對細胞產(chǎn)生不利的影響。配方中一定量的MES用于加強PA對pH值的穩(wěn)定作用。
本發(fā)明的植物細胞抗衰老劑(PG)在植物組織與細胞培養(yǎng)和DNA提取中有著廣泛的應用前景。其突出效果是1.促進愈傷組織的生長組織培養(yǎng)中有些基因型愈傷組織生長緩慢，細胞團過于致密，添加PG可促進細胞快速分裂，促進愈傷的生長。
2.改良愈傷的狀態(tài)劣變的愈傷組織常表現(xiàn)為褐化或水漬化，加入PG后可抑制褐化，消除水漬化，達到松脆的目的。
3.建立和保持良好的細胞懸浮系添加PG于培養(yǎng)基中可促進細胞的分裂松散，防止褐化和發(fā)粘，長期繼代可保持其分化能力。
4.解決某些物種DNA提取中DNA發(fā)紅問題，并提高DNA的產(chǎn)率。
實施例1.(按重量計，下同)PG配方1PA 400.000g/lGeO28.000g/lMES 25.000g/lPG配方2PA 30.000g/lGeO20.200g/lMES 5.000g/lPG配方3PA 100.000g/lGeO22.000g/lMES 15.000g/lPG配方4PA 150.000g/lGeO23.000g/l
以上配方的各組分的用量是按100倍母液的量配制的，應用時可根據(jù)不同作物及對象稀釋后再添加到各培養(yǎng)基(液)中去。
實施例2將PG的濃度設置為0.01％，0.01％，0.1％，0.15％，0.5％，1％基礎培養(yǎng)基為NB。試驗材料為粳稻毫梅品種的懸浮細胞(3月齡)，以不添加PG的NB培養(yǎng)基作對照。培養(yǎng)液量50ml，接種量2ml懸浮細胞，接種后連續(xù)培養(yǎng)15天，不繼代，每隔2天測定培養(yǎng)基的pH值和mV值(在雷磁PHS-3C型精密PH計上測定)。培養(yǎng)結束時稱量培養(yǎng)物鮮重。培養(yǎng)物的鮮重及外觀評價如表1。
表1.幾種PG添加濃度對培養(yǎng)物的鮮重及外觀的影響
*+號多者表明鮮艷度高。外觀評價由本室?guī)孜谎芯空吖餐鞒雠袛唷?br> 由表1可見PG的添加一般可以提高培養(yǎng)物的生物量，外觀也得到改善。效果最好的是0.1％的PG添加濃度。
實施例3.
以0.1％的PG添加于固體培養(yǎng)基MSD中，以未添加PG的MSD作為對照，接種水稻材料31301s、毫梅、米泉黑芒、普通野生稻和IR1545-339，每材料接種5-10管，培養(yǎng)20天后調(diào)查平均鮮重和比重。結果如表2。
表2.PG添加于MSD對愈傷生長的效應
經(jīng)t測驗結果表明在平均鮮重上，處理和對照間差異非常顯著(t＝4.875**)。在平均比重上差異未達顯著水平(t＝2.186)。這說明，在固體誘導培養(yǎng)基上PG能促進愈傷的生長，愈傷的比重并不下降且略有升高。處理后的愈傷組織外觀鮮艷度高，基本無玻璃化愈傷出現(xiàn)。
實施例4，小麥愈傷組織材料為35816。PG配方為0.1％PA+0.05％MES+20ppm GeO2，基礎培養(yǎng)基為MSD。培養(yǎng)20天后檢驗鮮重。試驗結果如表3。t測驗(t＝4.636**)認為處理效應達到極顯著水平，這說明PG可以推廣應用到小麥的組織培養(yǎng)中。表3.PG對小麥愈傷組織生長的效應(鮮重g)
實施例5取58棉花幼葉于-20℃條件下冰凍，于研缽中直接磨樣。DNA提取方法是在Andrew，H(1993)(Plant Molecular BiologyReporter.11(2)122-127)的方法基礎上進行修改的。提取過程中沒有進行核裂解，并在棉花DNA提取緩沖液中以0.1％PG取代0.1％DIECA(diethyldthiocarbamic acid)，以不添加PG的棉花DNA提取液作對照。DNA的數(shù)量以玻棒勾起的情況作定性判斷，試驗結果如表4。表4.PG對棉花DNA提取的效果*
*+多者表示用玻棒勾起量多。
所以，PG在棉花DNA提取中能起到提高DNA質(zhì)量和產(chǎn)率的作用，能取代進口產(chǎn)品DIECA。
權利要求
1.一種植物細胞抗衰老劑，主要用于植物組織與細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基和DNA提取液的制備，其特征在于含有(按重量計，下同)肌醇六磷酸酯(PA)10.000-500.000g/L，二氧化鍺(GeO2)0.200～20.000g/L和/或MES(Morpholinoethane sulfonic acid)0.500～25.000g/L。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于，PA為30.000～350.000g/L，GeO21.000～10.000g/L和/或MES1.000～20.000g/L。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的組合物，其特征在于，PA的最佳添加量為80.000～110.000g/L，GeO2的最佳添加量為1.500-5.000g/L，和/或MES3.000～10.000g/L。
全文摘要
一種植物細胞抗衰老劑，主要用于植物組織和細胞離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基和DNA提取液的制備，屬于植物組織與細胞培養(yǎng)技術領域。其特點是，該抗衰老劑(PG)含有肌醇六磷酸酯(PA)10.000-500.000g/L，二氧化鍺(GeO
文檔編號C12N5/04GK1147014SQ95109548
公開日1997年4月9日 申請日期1995年10月4日 優(yōu)先權日1995年10月4日
發(fā)明者陳葆棠, 謝岳峰, 張端品, 余毓君 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學