專利名稱：一種新型Kunin型多肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新型Kunin型多肽，稱之為M1型Kunin型多肽(M1 type Kunin polypeptide，M1KP)。具體地說，本發(fā)明涉及M1PK的氨基酸序列和基因序列、基因密碼子優(yōu)化、蛋白質(zhì)表達(dá)、蛋白質(zhì)純化以及功能測(cè)定。
背景技術(shù)：
Kunin蛋白家族(Kunins)是抑肽酶(aprotinin)的類似物，又稱為胰蛋白酶抑制物或Kunitz蛋白酶抑制物，常由1-3個(gè)Kunin型結(jié)構(gòu)域組成。與Kunitz型蛋白酶抑制物不同的是，Kunin型蛋白僅存在于動(dòng)物中。
每個(gè)Kunin型結(jié)構(gòu)域大約有58個(gè)左右的氨基酸殘基，比絲氨酸蛋白酶抑制物要小許多。不同Kunin型蛋白或多肽的同源性較小，最低達(dá)20％。Kunin型蛋白最顯著的特點(diǎn)是其絲氨酸殘基的組成和由此形成的二硫鍵。每個(gè)Kunin型結(jié)構(gòu)域均含有6個(gè)絲氨酸，組成3對(duì)二硫鍵，以保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。不同的Kunin蛋白或多肽由于氨基酸殘基數(shù)量和種類的差異，絲氨酸殘基和二硫鍵的部位亦有所不同，這種序列和結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致了它們功能的區(qū)別。
目前已發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)存在多種Kunin型蛋白，包括雙Kunin蛋白(bikunin)、內(nèi)α抑制物(inter-α-inhibitor)、前α抑制物(pre-α-inhibitor)、組織因子途徑抑制物-1(TFPI-1)和組織因子途徑抑制物-2(TFPI-2)等。不同的Kunin型蛋白含有數(shù)量不等的Kunin結(jié)構(gòu)域，功能也有差別，甚至差別很大。例如，TFPI-1由3個(gè)串聯(lián)的Kunin結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)Kunin結(jié)構(gòu)域含有50個(gè)氨基酸殘基，結(jié)構(gòu)域1抑制組織因子和因子VIIa，結(jié)構(gòu)域2抑制因子Xa，結(jié)構(gòu)域3與肝素及CD14結(jié)合，發(fā)揮抗凝和抗炎作用。TFPI-2的結(jié)構(gòu)與TFPI-1類似，但第二結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基數(shù)量為54個(gè)，其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系尚不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型Kunin型多肽及其制備方法。所述多肽，為M1型Kunin型多肽(M1 type Kunin polypeptide，M1KP)，M1KP具有序列5的氨基酸序列，由68個(gè)氨基酸殘基組成，其中有6個(gè)半胱氨酸殘基(C)，組成3對(duì)二硫鍵。
所述6個(gè)半胱氨酸殘基組成的3對(duì)二硫鍵，其第1個(gè)半胱氨酸殘基以前的氨基酸殘基數(shù)量和最后一個(gè)半胱氨酸殘基以后的氨基酸殘基數(shù)量可以發(fā)生任何數(shù)量上的變動(dòng)。
所述6個(gè)半胱氨酸殘基的位置分別是C1/14、C2/23、C3/39、C4/47、C5/60和C6/64，所述位置可以隨前13個(gè)氨基酸殘基數(shù)量的多寡而相應(yīng)變化。
所述6個(gè)半胱氨酸殘基組成3對(duì)二硫鍵的配對(duì)關(guān)系是C1-C6、C2-C4和C3-C5。
本發(fā)明多肽M1KP經(jīng)密碼子偏好設(shè)計(jì)后，利用PCR方法合成經(jīng)過優(yōu)化后的M1KP的基因片段，然后與表達(dá)載體重組，轉(zhuǎn)化相應(yīng)的表達(dá)細(xì)胞，篩選高表達(dá)工程菌或工程細(xì)胞。工程菌或工程細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增，收集表達(dá)相，應(yīng)用分離純化方法獲得高純度目的蛋白。
所述編碼M1KP的密碼子，其中真核細(xì)胞中編碼M1KP的密碼子具有序列1的核苷酸序列，酵母中編碼M1KP的密碼子具有序列2的核苷酸序列，其它細(xì)胞中編碼M1KP的密碼子序列是能編碼相應(yīng)氨基酸殘基的任何密碼子。
將本發(fā)明的M1KPcDNA片斷與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明所述的表達(dá)載體是原核或真核表達(dá)載體。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用真核表達(dá)載體，例如pPIC9K等。
上述重組表達(dá)載體可按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞。本發(fā)明所述的表達(dá)細(xì)胞是原核或真核表達(dá)細(xì)胞，能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用畢赤酵母菌GS115等。
本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物以具有活性的可溶性形式存在于培養(yǎng)基上清中，培養(yǎng)基上清經(jīng)超濾濃縮、分子篩、離子交換后進(jìn)行純化即獲得有活性的M1KP。
本發(fā)明從人cDNA文庫(kù)中或人胎盤組織中獲取M1KP基因。為了實(shí)現(xiàn)M1KP的高效表達(dá)，本發(fā)明對(duì)其cDNA序列進(jìn)行優(yōu)化，從而實(shí)現(xiàn)了M1KP在不同表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá)。純化后的M1KP顯示出良好的抗纖溶酶、抗胰蛋白酶、抗基質(zhì)金屬蛋白酶和抗惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等作用。本發(fā)明新型kunin型多肽還可用于防止動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂。
以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學(xué)操作均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。


圖1是M1KP的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中，共68個(gè)氨基酸殘基，方向如箭頭所指，半胱氨酸殘基的順序按C1-C6排列。
圖2是胎盤總RNA甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖3是M1KP對(duì)纖溶酶和胰蛋白酶活性的影響，M1KP明顯抑制胰蛋白酶和纖溶酶活性。
圖4顯示M1KP能夠明顯抑制MMP2和MMP9的活性。
圖5顯示M1KP明顯抑制HT-1080纖維肉瘤轉(zhuǎn)移。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 M1KP基因的獲取(1)胎盤總RNA的提取利用invitrogen公司組織RNA提取試劑提取人胎盤組織總RNA，經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳證明所提總RNA符合逆轉(zhuǎn)錄要求，結(jié)果見圖2。
(2)RT-PCR總RNA用寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷做引物經(jīng)MMLV逆轉(zhuǎn)錄后，PCR方法擴(kuò)增M1KP的目的基因。PCR所用引物為sense primer5’-GCC GAA TTC GAT GCT GCT CAG GAG CCA ACA-3’antisense primer5’-AGG TGC GGC CGC TTA TTC TAT CCT CCA GCA AGC-3’反應(yīng)條件為94℃4min，94℃30sec、46℃30sec、72℃30sec 8cycles，94℃30sec、55℃30sec、72℃30sec 22cycles，72℃7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析，并測(cè)序驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的序列，人體內(nèi)M1KP的基因序列見序列表。
MMLV、oligodT購(gòu)自TAKARA公司。
實(shí)施例2 M1KP基因的優(yōu)化和制備(1)M1KP基因的優(yōu)化及真核表達(dá)質(zhì)粒rpPIC9K/M1KP的構(gòu)建M1KP基因的優(yōu)化方法為按照畢赤酵母密碼子使用的偏好性將M1KP的cDNA進(jìn)行優(yōu)化改造。采用PCR方法，利用兩條長(zhǎng)引物以野生性M1KP的cDNA為模板擴(kuò)增出優(yōu)化后的M1KP編碼序列。優(yōu)化后的基因與真核表達(dá)載體pPIC9K重組，核苷酸序列分析證實(shí)基因序列與預(yù)期相符。
M1KP基因優(yōu)化方法如下采用長(zhǎng)引物擴(kuò)增法，根據(jù)酵母密碼子使用的偏好性，合成下列兩條長(zhǎng)引物Forward5’……GCTAGAA TTCGAT GCT GCT CAA GAA CCA ACT GGT AAT AACGCT GAG ATC TGT TTG TTG CCA TTG GAT TAC GGT CCT TGT AGA GCT CTT TTG TTGAGA TAC TAC TAC GAC AGA TA……3’；Rewards5’……ATTGCG GCC GCT TAT TCA ATT CTC CAA CAA GCA TCG TCACAA GCT TCC CAA GTG TAG AAG TTG TTA GCG TTA CCC TCA CAA CCA CCG TAC AAGAAC TGT CTG CAA GAC TGA GTG……3’上面兩條引物中劃?rùn)M線的序列為限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI的識(shí)別位點(diǎn)。以野生性M1KP的cDNA序列為模板，上游引物與下游引物配對(duì)，進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物即為經(jīng)過優(yōu)化的M1KP的編碼基因。優(yōu)化后的編碼基因經(jīng)EcoRI和NotI酶切后與pPIC9K重組。
限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司，大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pPIC9K、酵母菌GS115為Invitrogen公司產(chǎn)品。
(2)篩選高拷貝高效表達(dá)細(xì)胞株將質(zhì)粒rpPIC9KM1KP電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，使其與酵母菌染色體發(fā)生重組，G418篩選高效表達(dá)細(xì)胞株。
篩選方法按照invitrogen說明書進(jìn)行。
挑取上述陽(yáng)性克隆接種于10ml低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基BMGY〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，1％甘油，1％酵母提取物，2％蛋白胨〗中，30℃快速振遙(250 RPM)，培養(yǎng)過夜。次日測(cè)定光密度OD600，離心棄BMGY培液，用無菌水洗滌后用BMMY培液〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，0.5％甲醇，1％酵母提取物，2％蛋白胨〗稀釋至OD600＝1。每天補(bǔ)加體積百分?jǐn)?shù)為1％的甲醇兩次，誘導(dǎo)培養(yǎng)3天，離心棄沉淀，上清于-20℃保存。直接取培液上清與2x上樣緩沖液等體積混合后取20ul上樣，作還原性SDS-PAGE電泳。考馬斯亮藍(lán)R-250染色后，PharmaciaImagenaster VDS掃描定純度、分子量?？梢娬T導(dǎo)后上清液在分子量約8kd處有一濃集的條帶，經(jīng)掃描，目的蛋白約占上清總蛋白的60％；上述還原性SDS-PAGE按Laemmli方法進(jìn)行。
(3)發(fā)酵表達(dá)工程細(xì)胞株按上述篩選高表達(dá)細(xì)胞株作為工程細(xì)胞株，然后以30L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵。從-70℃深低溫冰箱中取出種子菌，室溫下解凍，在種子菌培養(yǎng)室100級(jí)潔凈度條件下劃YPD平板，30℃溫箱培養(yǎng)2-3天。從平板上挑取單菌落，同樣在100級(jí)潔凈度條件下接種于10ml BMGY培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)過夜，此為一級(jí)種子液。再將一級(jí)種子液加入1000ml培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)6-8小時(shí)，直至OD600＝6，此為二級(jí)種子液。種子菌接入后，自然擴(kuò)增，待基礎(chǔ)培養(yǎng)基中預(yù)加的甘油被耗盡以后，開始補(bǔ)充甘油，補(bǔ)充速度16ml/L/h，待OD600達(dá)到120左右，停止補(bǔ)加甘油。待培養(yǎng)液中甘油全部耗盡后，開始甲醇誘導(dǎo)。甲醇補(bǔ)料速度從1ml/L/h逐漸升高至12ml/L/h，以后一直維持此速度。本發(fā)明的發(fā)酵技術(shù)是用低鹽培養(yǎng)基擴(kuò)增工程菌，誘導(dǎo)前用含微量元素的甘油溶液進(jìn)行補(bǔ)料，到達(dá)一定菌體濃度后用含微量元素的甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
甲醇誘導(dǎo)40h以后，停止發(fā)酵，從發(fā)酵罐中立即放出菌液進(jìn)行離心，分離沉淀菌體，收集上清進(jìn)行純化。發(fā)酵參數(shù)為溫度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，攪拌速度與DO連動(dòng)。
(4)超濾濃縮脫鹽將離心所獲上清經(jīng)Millipore超濾裝置(NMWL3000，Millipore公司)超濾濃縮至0.4L。
(5)凝膠過濾Sephadex G-50(Pharmacia公司)柱用20mmol/L PB(pH6.0)平衡后，將超濾濃縮液上樣，加樣時(shí)注意勿攪動(dòng)Sephadex G-50膠面。然后用PB洗脫，流速10ml/min，收集蛋白峰。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱層析以10倍體積的20mmol/L PB(pH6.0)平衡Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，凝膠過濾后收集的目的蛋白峰以50ml/min的速率將其吸附到Q-Sepharose F.F.柱上。用PB洗柱直至OD280達(dá)0.00，然后用0-1mol/L NaCl(20mmol/L PB pH6.0)線性梯度洗脫，收集蛋白峰，分裝，冷凍干燥，-40℃保存。
(7)純度鑒定及分子量測(cè)定樣品進(jìn)行15％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R-250染色后，PharmaciaInagemasterVDS掃描測(cè)定純度、分子量。同時(shí)HPLC進(jìn)一步鑒定純度。所得產(chǎn)品純度96％以上，分子量約8kD。
實(shí)施例3 M1KP的性質(zhì)測(cè)定(1)抗胰蛋白酶與纖溶酶活性測(cè)定使用發(fā)色底物法測(cè)定，方法如下。
50nM的胰蛋白酶或30nM纖溶酶在15mM Tris-HCl(pH7.4)，100mM NaCl，5mM CaCl2，0.01％Tween 80中和不同濃度的M1KP 37℃孵育15分鐘，加入終濃度為10mM的發(fā)色底物S-2251，37℃保溫，測(cè)定405nm的吸光度。根據(jù)OD405判斷剩余胰蛋白酶或纖溶酶的活性。結(jié)果見圖3，可見M1KP具有明顯的抑制胰蛋白酶和纖溶酶的活性(2)抗MMP-2和MMP-9活性的測(cè)定使用明膠酶譜法，方法如下。
配制含2mg/ml明膠的丙烯酰胺(15％)膠，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435的培養(yǎng)基上清與2×的上樣緩沖液等體積混合后在上述丙烯酰胺膠中電泳。電泳完畢用2.5％的TritonX-100/50mM Tris-HCl，pH7.5漂洗凝膠兩次，每次30min。之后凝膠放在含不同濃度M1KP的0.15M NaCl，10mM CaCl2，50mM Tris-HCl，pH7.5，0.05％NaN3中37℃孵育16小時(shí)。取出凝膠后用SDS-PAGE染色液和脫色液分別進(jìn)行染色和脫色。根據(jù)凝膠中產(chǎn)生的透明帶的亮度判斷培養(yǎng)基中剩余MMP-2和MMP-9的活性。結(jié)果見圖4，可見M1KP具有明顯的抑制MMP-2和MMP-9的作用。
(3)抗HT-1080纖維肉瘤侵襲活性的測(cè)定使用人工基底膜法測(cè)定，方法如下。200mg/filter的metrigel鋪在Transwell小孔的上層，37℃保溫使其凝固。不同濃度的M1KP溶于DMEM中，取100μL加入transwell的上層。纖維肉瘤細(xì)胞HT-1080用EDTA消化，取100μL(6×105細(xì)胞/ml)加入Transwell上層小孔中。下層加入600μL的無血清的HT-1080細(xì)胞培養(yǎng)液作為趨化劑。37℃培養(yǎng)20小時(shí)，取下小孔中的膜，用HE法染色。顯微鏡下觀察穿到膜下層的細(xì)胞數(shù)。記數(shù)18個(gè)視野中的細(xì)胞總數(shù)，取平均數(shù)比較。結(jié)果見圖5，表明M1KP具有良好的抑制纖維肉瘤侵襲的作用。
無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
從以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可很容易地明了本發(fā)明的本質(zhì)特征，而且在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變更和改進(jìn)。
SEQUENCE LISTING<110>復(fù)旦大學(xué)<120>一種新型Kunin型多肽及其制備方法<130>Fudan-20041116<160>5<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>207<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(207)<400>1gat gct gct cag gag cca aca gga aat aac gcg gag atc tgt ctc ctg 48Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu1 5 10 15ccc cta gac tac gga ccc tgc cgg gcc cta ctt ctc cgt tac tac tac 96Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr20 25 30gac agg tac acg cag agc tgc cgc cag ttc ctg tac ggg ggc tgc gag 144Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu35 40 45ggc aac gcc aac aat ttc tac acc tgg gag gct tgc gac gat gct tgc 192Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys50 55 60tgg agg ata gaa taa 207Trp Arg Ile Glu65
<210>2<211>68<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu1 5 10 15Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr20 25 30Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu35 40 45Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys50 55 60Trp Arg Ile Glu65<210>3<211>207<212>DNA<213>畢赤酵母(Pichia pastoris)<220>
<221>CDS<222>(1)..(207)<400>3gat gct gct caa gaa cca act ggt aat aac gct gag atc tgt ttg ttg 48Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu1 5 10 15cca ttg gat tac ggt cct tgt aga gct ctt ttg ttg aga tac tac tac 96Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr
20 25 30gac aga tac act cag tct tgc aga cag ttc ttg tac ggt ggt tgt gag 144Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu35 40 45ggt aac gct aac aac ttc tac act tgg gaa gct tgt gac gat gct tgt 192Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys50 55 60tgg aga att gaa taa 207Trp Arg Ile Glu65<210>4<211>68<212>PRT<213>畢赤酵母(Pichia pastoris)<400>4Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu1 5 10 15Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr20 25 30Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu35 40 45Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys50 55 60Trp Arg Ile Glu65<210>5<211>68
<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu1 5 10 15Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr20 25 30Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu35 40 45Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys50 55 60Trp Arg Ile Glu6權(quán)利要求
1.一種新型kunin型多肽，命名為M1型kunin多肽，M1KP，其特征在于所述M1KP具有序列5的氨基酸序列，由68個(gè)氨基酸殘基組成，其中有6個(gè)半胱氨酸殘基(C)，組成3對(duì)二硫鍵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型kunin型多肽，其特征在于所述6個(gè)半胱氨酸殘基組成的3對(duì)二硫鍵，其第1個(gè)半胱氨酸殘基以前的氨基酸殘基數(shù)量和最后一個(gè)半胱氨酸殘基以后的氨基酸殘基數(shù)量可以發(fā)生任何數(shù)量上的變動(dòng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型kunin型多肽，其特征在于所述6個(gè)半胱氨酸殘基的位置分別是C1/14、C2/23、C3/39、C4/47、C5/60和C6/64，所述位置可以隨前13個(gè)氨基酸殘基數(shù)量的多寡而相應(yīng)變化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型kunin型多肽，其特征在于所述6個(gè)半胱氨酸殘基組成3對(duì)二硫鍵的配對(duì)關(guān)系是C1-C6、C2-C4和C3-C5。
5.權(quán)利要求1所述的新型kunin型多肽的制備方法，其特征是包括下述步驟，M1KP經(jīng)密碼子偏好設(shè)計(jì)后，利用PCR方法合成經(jīng)過優(yōu)化后的M1KP的基因片段，然后與表達(dá)載體重組，轉(zhuǎn)化相應(yīng)的表達(dá)細(xì)胞，篩選高表達(dá)工程菌或工程細(xì)胞，工程菌或工程細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增，收集表達(dá)相，用分離純化方法獲得高純度目的蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的新型kunin型多肽的制備方法，其特征在于所述編碼M1KP的密碼子，其中真核細(xì)胞中編碼M1KP的密碼子具有序列1的核苷酸序列，酵母中編碼M1KP的密碼子具有序列2的核苷酸序列，其它細(xì)胞中編碼M1KP的密碼子序列是能編碼相應(yīng)氨基酸殘基的任何密碼子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的制備方法，其中所述的表達(dá)載體是原核或真核表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的制備方法，其中所述的表達(dá)載體是pPIC9K。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的制備方法，其中所述的表達(dá)細(xì)胞是原核或真核表達(dá)細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的制備方法，其中所述的表達(dá)細(xì)胞是畢赤酵母GS115。
11.根據(jù)權(quán)利要求5的制備方法，其中所述的分離純化方式是超濾后，進(jìn)行分子篩和離子交換層析。
12.權(quán)利要求1的新型kunin型多肽在制備抑制纖溶酶或胰蛋白酶或基質(zhì)金屬蛋白酶或組織因子藥物中的用途。
13.權(quán)利要求1的新型kunin型多肽在制備抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的用途。
14.權(quán)利要求1的新型kunin型多肽在制備防止動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型kunin型多肽，命名為M1型kunin多肽，M1KP，本發(fā)明M1KP由68個(gè)氨基酸殘基組成，其中有6個(gè)半胱氨酸殘基(C)，組成3對(duì)二硫鍵。M1KP經(jīng)密碼子偏好設(shè)計(jì)后，利用PCR方法合成經(jīng)過優(yōu)化后的M1KP的基因片段，然后與表達(dá)載體重組，轉(zhuǎn)化相應(yīng)的表達(dá)細(xì)胞，篩選高表達(dá)工程菌或工程細(xì)胞。工程菌或工程細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增，收集表達(dá)相，應(yīng)用分離純化方法獲得高純度目的蛋白。獲得的M1KP具有良好的抗纖溶酶、抗胰蛋白酶、抗基質(zhì)金屬蛋白酶和抗惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等作用。
文檔編號(hào)C12N15/81GK1634986SQ200410084289
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月18日
發(fā)明者馬端, 孔德升, 宋后燕 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)