專利名稱：：一種抗病毒的多肽及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體涉及一種高效抗病毒功能的多肽。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種東亞鉗蝎抗病毒多肽在抗麻疹病毒(MeV)和人免疫缺陷病毒(HIV)中的用途。
背景技術(shù)：
：病毒感染是一個(gè)嚴(yán)重危害人類健康的疾病，這個(gè)問(wèn)題困擾了人類多年。早在公元前412年的古希臘時(shí)期，希波克拉底就已經(jīng)記述了類似流感的疾?。?742年至1743年由流感病毒引起的流行性感冒曾殃及90%的東歐人；1889年至1894年席巻西歐的"俄羅斯流感"，發(fā)病范圍廣泛，死亡率很高；1918年，一場(chǎng)致命的流感席巻全球，造成了2000萬(wàn)至5000萬(wàn)人死亡；1957年"亞洲流感"及1968年"香港流感"的爆發(fā)，就美國(guó)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)看，分別有7萬(wàn)人和3.4萬(wàn)人因此喪命；流感病毒平均每年在美國(guó)也導(dǎo)致11萬(wàn)多人住院，3.4萬(wàn)人死亡。1981年6月，美國(guó)疾病控制中心首先報(bào)道了5例獲得性人類免疫缺陷癥，隨后，在美國(guó)和其他國(guó)家都陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了類似癥狀的病人，后在全世界大規(guī)模傳播開(kāi)來(lái)；至2003年艾滋病毒感染新例達(dá)到近550萬(wàn)例，使全世界艾滋病毒(HIV)攜帶者和病人(AIDS)數(shù)量達(dá)到3430萬(wàn)人。報(bào)告指出，除非出現(xiàn)奇跡，大部分病人將在今后10年內(nèi)死亡。自人類發(fā)現(xiàn)艾滋病后，已有1880萬(wàn)人死于該絕癥；由..SARS病毒引起的"非典"在2003年爆發(fā)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)字，2003年全球累計(jì)非典病例共8422例，全球因非典死亡人數(shù)919人，病死率近11%。從這些統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以看出，病毒感染已經(jīng)對(duì)人類的健康造成極大的危害，并且還正在繼續(xù)危害人類的健康。病毒分布廣泛，能引起各種人類疾病，難以治療，危害人類健康。比如HIV病毒引起的獲得性人類免疫缺陷癥(AIDS)，該病患者的免疫功能部分或完全喪失，CD4+細(xì)胞數(shù)目減少，繼而發(fā)生機(jī)會(huì)性感染、腫瘤等，臨床表現(xiàn)多種多樣。該病傳播速度快、病死率高，且目前無(wú)法治愈；流感目前沒(méi)有藥物可以治愈，市面上的流感藥物只能夠減輕流感癥狀，通過(guò)人體自身的免疫能力對(duì)抗病毒?，F(xiàn)在比較有效的方法是注射流感疫苗預(yù)防，有效率為70%至90%。由于流感病毒極其容易發(fā)生變異，每年流行的流感病毒類型不一樣，因此必須每年注射疫苗才能發(fā)揮作用；乙肝沒(méi)有辦法治愈，但是可以其控制不發(fā)作，一旦感染，終生攜帶。病毒很難殺滅，是由于病毒使用了寄主的活動(dòng)機(jī)制。現(xiàn)有的抗病毒藥物一般為病毒遺傳物質(zhì)復(fù)制的抑制劑，這些抑制劑也會(huì)抑制人體的遺傳物質(zhì)復(fù)制，所以對(duì)人體也是具有毒性的，所以現(xiàn)在最積極的預(yù)防病毒的方法仍然還是接種疫苗。但是有些病毒如流感、HIV，其自身遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定，容易發(fā)生突變，從而使得在此之前的疫苗對(duì)這種新的突變病毒的預(yù)防作用降低或者完全失效。而陽(yáng)離子防御肽的發(fā)現(xiàn)使人們看到了治療病毒疾病的新方法。陽(yáng)離子防御肽是一類由宿主生成，并且在天然免疫中特異性發(fā)揮防御性作用的一類小肽。這一類小分子多肽通常由10—50個(gè)氨基酸構(gòu)成，靜電荷從+2到+9不等，在生物體抵御微生物的入侵中發(fā)揮重要的作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)的差別，陽(yáng)離子防御肽可以分為如下幾類含有2—4個(gè)P片層的兩親性分子、兩親性a螺旋、巻曲結(jié)構(gòu)、以及含有高級(jí)結(jié)構(gòu)的分子。陽(yáng)離子防御肽在體內(nèi)對(duì)細(xì)菌、真菌、寄生蟲、以及病毒的侵染均有有效的抵御作用。研究表明，蜂毒溶血肽Melitiin和天蠶素Cecropins在亞毒性濃度下通過(guò)阻遏基因表達(dá)來(lái)抑制人免疫缺陷病毒HIV-1的增殖，爪蟾抗病毒肽Magainin-2對(duì)皰疹病毒HSV-1和HSV-2有一定的抑制效果，這些多肽都是a螺旋類陽(yáng)離子防御肽。目前的研究表明，a螺旋類陽(yáng)離子防御肽特異性作用于有包膜的RNA病毒及DNA病毒，其作用方式通常是作用于病毒進(jìn)入的過(guò)程，或者是直接作用于病毒的包膜。例如，Dermaseptin就是通過(guò)作用于HIV的包膜而引起HIV的失活，從而達(dá)到抗病毒的作用。所以，陽(yáng)離子防御肽不再是傳統(tǒng)的疫苗防治，而是通過(guò)直接抑制病毒達(dá)到抗病毒的目的。蝎子中陽(yáng)離子防御肽的研究也已經(jīng)有多年的歷史。其中除了從淋巴系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的防御肽外，更多的是從蝎毒腺中分離到的防御肽，例如hadrurin，Scorpine，opistoporin,parabutoporin，ISCT，pandinin。這些肽的功能都己經(jīng)得到有效的鑒定。本室長(zhǎng)期從事蝎毒素的研究，目前從文庫(kù)中篩選并鑒別的系列陽(yáng)離子多肽。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種抗病毒的多肽，抗病毒活性高，該抗病毒肽含有17個(gè)氨基酸，生產(chǎn)成本低，水溶性好。本發(fā)明涉及一種抗病毒多肽在制備治療或預(yù)防麻疹病毒(MeV)和人免疫缺陷病毒(HIV)感染的藥物中的應(yīng)用，具有抑制病毒感染的功能，抑制效果好，無(wú)副作用。多肽AVP-W2在制備MeV和HIV引起疾病的治療或預(yù)防藥物中的應(yīng)用，其在預(yù)防和治療由MeV和HIV所引起的感染效果顯著。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，采用化學(xué)合成的方法，獲得了蝎毒抗病毒多肽AVP-W2，抗病毒試驗(yàn)結(jié)果表明，抗病毒多肽AVP-W2對(duì)MeV和HIV有明顯的抑制作用。當(dāng)AVP-W2的濃度達(dá)到10|jg/mL時(shí)，AVP-W2對(duì)MeV和HIV的抑制率就可以達(dá)到100%抑制。ABP-W2是一種具有抗病毒能力陽(yáng)離子防御肽，目前的研究結(jié)果顯示ABP-W2抗病毒能力強(qiáng)，毒性低；加上ABP-W2只有17個(gè)氨基酸，工業(yè)生產(chǎn)成本低，所以將陽(yáng)離子抗病毒肽ABP-W2應(yīng)用于抗病毒藥物具有廣闊的前景。本發(fā)明提供的一種蝎毒抗病毒多肽。首先構(gòu)建高質(zhì)量東亞鉗蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)，具體包括蝎毒腺總RNA的分離和mRNA純化，cDNA的第一鏈和第二鏈合成，雙鏈cDNA與pSPORT1載體(購(gòu)自美國(guó)lnvitragen)的連接和轉(zhuǎn)化，獲得蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)。在構(gòu)建文庫(kù)的基礎(chǔ)上，隨機(jī)挑選50克隆子進(jìn)行測(cè)序，序列分析發(fā)現(xiàn)W2克隆子為一個(gè)新的東亞鉗蝎抗病毒肽基因，命名為AVP-W2。一種分離的多肽基因，其序列為SEQIDNO:1所示的核苷酸序列tcatgcattggtcggacttctcccttcggtgatcggagggctggtatcagcattcaagggccgaaggaagttattcgcaaata/tgcctgattactgatctcaattactctttcagtttcatcgcttagcataagttttacttaatcataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。AVP-W2的前體組織形式編碼74個(gè)氮基酸殘基，由三個(gè)部分組成，即信號(hào)肽(22個(gè)殘基)、成熟肽(17個(gè)殘基)和前體肽(35個(gè)殘基)?；谛舅厍绑wC末端殘基的加工規(guī)則，AVP-W2末端最后的殘基Phe被特異性羧肽酶(Carboxyp印tidase)切除，且被酰氨化(圖1)。因此，本發(fā)明提供一個(gè)東亞鉗蝎蝎毒抗病毒肽LVGLLPSVIGGLVSAFK-NH2(SEQIDNO:2)。本發(fā)明提供的一種高效抗麻疹病毒的多肽(SEQIDNO:2)。通過(guò)固相化學(xué)合成的辦法，得到了純度達(dá)95c/o以上的合成多肽AVP-W2(圖2和圖3)?？共《窘Y(jié)果表明合成多肽AVP-W2對(duì)MeV和HIV增殖的高效抑制作用，在10pg/mL時(shí)，AVP-W2對(duì)MeV和HIV的抑制率就可以達(dá)到100%抑制。本發(fā)明涉及的AVP-W2抗病毒多肽，只含有17個(gè)氨基酸，生產(chǎn)成本低，水溶性好。對(duì)于MeV和HIV有良好的抑制作用，而且沒(méi)有副作用。與現(xiàn)有的抗病毒藥物相比，這個(gè)藥物具有更加直接而且有效的作用。圖1東亞鉗蝎蝎毒抗病毒肽AVP-W2基因及其氨基酸。cDNA序列下方為推斷的對(duì)應(yīng)氨基序列；信號(hào)肽氨基酸以單下劃線標(biāo)記；成熟肽氨基酸以黑體標(biāo)記；方框部分氨基酸為羧肽酶識(shí)別位點(diǎn)；陰影部分氨基酸為c端前體肽。圖2東亞鉗蝎抗病毒多肽AVP-W2的HPLC純度圖。圖3東亞鉗蝎抗病毒多肽AVP-W2質(zhì)譜鑒定分子量圖。圖4不同濃度AVP-W2對(duì)MeV滴度的影響。橫坐標(biāo)為AVP-W2的濃度(ijg/mL)，縱坐標(biāo)為相應(yīng)濃度的多肽處理后病毒的滴度(titer/mL)。圖5不同濃度AVP-W2對(duì)MeV的抑制率。橫坐標(biāo)為AVP-W2的濃度(叩/mL)，縱坐標(biāo)為相應(yīng)濃度的多肽對(duì)病毒的抑制率(％)。圖6不同濃度AVP-W2對(duì)HIV滴度的影響。橫坐標(biāo)為AVP-W2的濃度(pg/mL)，縱坐標(biāo)為相應(yīng)濃度的多肽處理后病毒的滴度(titer/mL)。圖7不同濃度AVP-W2對(duì)HIV的抑制率。橫坐標(biāo)為AVP-W2的濃度(|jg/mL)，縱坐標(biāo)為相應(yīng)濃度的多肽對(duì)病毒的抑制率(％)。具體實(shí)施方式下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1:一種蝎毒抗病毒多肽的制備。步驟如下A:蝎毒腺總RNA的提取(TrizolLS—步法TrizolLS購(gòu)自美lnvitrogen)①取500mg的蝎尾腺在液氮中研成細(xì)粉末，加入IOmlTrizolLS混勻，室溫(20-25。C,以下相同)放置5分鐘；②然后加入2ml氯仿混合15秒，室溫放置2-3分鐘，4'C下12000g離心15分鐘；③取水相加1倍體積異丙醇，室溫放置10分鐘，4'C下12000g離心10分鐘得RNA沉淀；沉淀用5m175X乙醇洗滌，7500g離心5分鐘；RNA沉淀干燥后溶于DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理的滅菌水，55-60'C保溫10分鐘以徹底溶解RNA。整個(gè)過(guò)程參照TRIZOL(TotalRNAlsolation)ReagentKit推薦方法進(jìn)行。制備的蝎毒腺總RNA采用甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。得到了高質(zhì)量的蝎毒腺總RNA。B:mRNA的分離純化采用PolyATractmRNA分離系統(tǒng)(Promega，USA)分離和純化mRNA，其工作原理是基于寡聚核苷酸Oligo(dT)與mRNA3'端poly(A)尾的互補(bǔ)配對(duì)特性，用生物素標(biāo)記Oligo(dT)，通過(guò)它與mRNA3'端poly(A)的退火形成雜交體，然后用標(biāo)有親合素的磁珠和磁性分離架捕獲并洗滌生物素Oligo(dT)/mRNA雜交體，最后用無(wú)RNA酶的ddH20將之洗脫下來(lái)，達(dá)到從總RNA中分離mRNA的目的。①樣品的制備將RNA加入到含有32Ml卜巰基乙醇的800pl的GTC中。②探針的退火取250pM濃度Oligo(dT)5pl，加蒸餾水至50卩1;加入1.6ml預(yù)熱的稀釋緩沖液(dilutionbuffer已加入32plP—巰基乙醇)，與RNA混勻，70'C溫育5分鐘。③磁珠的活化取1.2ml的磁珠SA-PMPS(購(gòu)自美Promega)于1.5ml的離心管中；用0.5XSSC(氯化鈉和檸檬酸三鈉溶液)重懸SA-PMPS，以磁架吸附磁珠，原體積0.5XSSC洗滌SA-PMPS3次。④mRNA的獲取將70'C溫育的RNA與SA-PMPS混合，室溫放置5分鐘放磁架上吸附磁珠，棄上清液；2ml的0.5XSSC懸浮磁珠，洗滌重復(fù)2次，最后一次盡量去除SSC;加入無(wú)RNA酶的ddH20至磁珠中，輕輕混勻，然后離心(12000gX3分鐘)或磁架吸附磁珠；取上清，獲得mRNA。通過(guò)電泳和紫外測(cè)定mRNA的濃度和純度。mRNA的沉淀將④獲得的mRNA中加入糖原和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀過(guò)夜，mRNA將用于cDNA的合成。關(guān)于mRNA分離的所有操作步驟見(jiàn)PolyATractmRNA分離系統(tǒng)的說(shuō)明書(Prom印a，USA)。C:第一鏈cDNA合成①在1.5mlEp管中加入2iJlA/ofIPrimer-adapter和6ylmRNA(含3ijgmRNA)，7CTC溫育10min，迅速放于冰上，離心后，加入下列成分4pl5Xfirststrandbuffer;2|jI0.1MDTT;1|jM0mMdNTPs;1|jlH20。輕輕混勻后離心，37。C放至2min;②加入5|jl逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻后取2|jl，加1|jl[a-32PdCTP(4|jCi)(示蹤管)。與上述反應(yīng)組分(樣品管)同時(shí)37'C溫育1h,然后放入冰上終止反應(yīng)；③對(duì)于示蹤管，依次加入43ijI20mMEDTA(乙二胺四乙酸)和5|jl酵母tRNA，混勻后，分別取兩份10iJl點(diǎn)于兩張濾膜上，l份用10。/oTCA洗3次，每次5min，95%乙醇洗1次，空氣干燥后，放入1.5ml閃爍液中(為1#樣品)；另l份空氣干燥后，放入1.5ml閃爍液(為2#樣品)。另3(HJI示蹤液，力卩1.5pl7.5M醋酸氨(NH4Oac)和90ijI無(wú)水乙醇(-20。C)，混勻后立即14,000rpm離心20min,棄上清，加入0.5ml70%無(wú)水乙醇(-20。C),14,000rpm離心2min，棄上清，37。C干燥10min讓乙醇揮發(fā)，溶于10|jlTEN溶液，加入10iJl2X加樣緩沖液，取1(HJI用于堿性凝膠電泳。用[a-"P]dCTP標(biāo)記入DNAAV/nof川片段作分子量標(biāo)記；④混勻后室溫下放置15min，加入2pl0.2MEDTA終止反應(yīng)。取6pl反應(yīng)液和6ml2X堿性電泳緩沖液混勻，電泳5h后，用7%TCA浸泡20min，直至溴酚蘭變黃。然后用衛(wèi)生紙吸干(8h左右)，進(jìn)行放射自顯影；⑤對(duì)于樣品管，用于第二鏈的合成。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>AddddH20tofinalvolumeof20plD:第二鏈cDNA合成(D冰上在樣品管中依次加入下列成分;②輕輕混勻后，16'C溫育2h;③加入2pl(10units)T4DNA聚合酶，繼續(xù)16。C反應(yīng)5min;④轉(zhuǎn)入冰上，加入10|jl0.5MEDTA;⑤加入等體積(150pl)酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)，徹底渦旋后，室溫下14,000rpm離心5min。將水相(140pl)轉(zhuǎn)入另一1.5mlEp管；加入70pl的7.5M醋酸氨和0.5ML無(wú)水乙醇(-20'C),渦旋后，室溫下14,000rpm離心20min;⑦棄上清，加入0.5ml70%乙醇(-20。C)，同上離心2min。棄上清，37。C干燥10min。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>E:雙鏈cDNA與Sa/l銜接頭的連接①用25Ml滅菌水溶解步驟D的cDNA樣品，然后按下表依次加入；②輕輕混勻，16。C反應(yīng)過(guò)夜(約20h)。③用酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)抽提和醋酸氨/乙醇沉淀后，37'C干燥10min。5XT4DNAligasebuffer10plSalIadapters10|jlT4DNAligase5|jlFinalVolume50|jlF:Wofl消化雙鏈cDNA①將步驟E的樣品溶于41pl，然后按下表依次加入；②混勻后，37'C溫育2h;③用酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)抽提一次，然后用7.5MNH40ac/乙醇沉淀，37。C干燥10min。④溶于70plTEN，取1pl用于定量，其余-2CTC保存?zhèn)溆?。REACT3buffer5|jlNotI4|jIFinalVolume50|jlG:去除雙鏈cDNA分子中的過(guò)量Sa/l銜接頭和酶切小片段用nucleonextractionandpurificationkit(Amersham,USA)去除過(guò)量Sa/1銜接頭和酶切小片段。①室溫下懸浮樹脂，然后取600yl加于離心柱中，2000rpm離心10s，去掉液體。在樹脂中央加入40pl上述cDNA溶液。同上離心；②收集洗脫液用于連接反應(yīng)。H:雙鏈cDNA與pSPORT1載體的連接和轉(zhuǎn)化①在1.5mlEp管中依次加入下列成分；②室溫下反應(yīng)16h;③在②反應(yīng)液中依次加入下列成分5.0jjIyeasttRNA，12.5|jl7.5M醋酸氨，70pl無(wú)水乙醇(-20。C)。渦旋混勻后立即14000離心20min;④沉淀用70%乙醇(-20'C)洗滌，37'C干燥后溶于4nl;⑤取2iJl電擊轉(zhuǎn)化5(Hjl大腸桿菌(￡.00//乂12!/101061)。用PCR方法鑒定文庫(kù)的質(zhì)量，正向弓l物5TCGACCCACGCGTCCG3'(按Sail銜接頭序列設(shè)計(jì))；反向引物5'GAGCGGCCGCCCT153'(按Notl引物-銜接頭的序列設(shè)計(jì))。5XT4DNAligasebuffer4plpSPORT1，Notl-Sall-Cut(50ng/|jl)1picDNA(3ng/pl)4plT4DNAligase1ylAddddH20tofinalvolume20|jlh隨機(jī)測(cè)序策略篩選cDNA文庫(kù)隨機(jī)從構(gòu)建好的東亞鉗蝎毒腺cDNA文庫(kù)中挑選50克隆子，送上海三博公司測(cè)序。序列錄入軟件為BioEditV4.5.8(TomHall,1999),同源性比較和信號(hào)肽切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件分別為CLUSTALX1.8(Thompsonetal.，1997)和PC/GENE(lntelligeneticsInc.,Switzerland)。序列分析表明克隆子W2為一個(gè)全新的抗病毒肽基因，命名為AVP-W2。其序列為SEQIDNO:1所示的核苷酸序列acttaatcataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(圖1)。AVP-W2的前體組織形式編碼74個(gè)氨基酸殘基，由三個(gè)部分組成，即信號(hào)肽(22個(gè)殘基)、成熟肽(17個(gè)殘基)和前體肽(35個(gè)殘基)?；谛舅厍绑wC末端殘基的加工規(guī)則，AVP-W2末端最后的殘基Phe被特異性羧肽酶(Carboxyp印tidase)切除，且被酰氨化。AVP-W2抗病毒多肽氨基酸序列，一種分離的東亞鉗蝎抗病毒多肽序列，其序列為L(zhǎng)VGLLPSVIGGLVSAFK-NH2所示的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。實(shí)施例2:化學(xué)合成蝎毒抗病毒多肽AVP-W2從東亞鉗蝎毒腺中分離了一個(gè)由17氨基酸組成的多肽AVP-W2，且被酰氨化。釆用固相化學(xué)合成的辦法獲得高純度的AVP-W2多肽LVGLLPSVIGGLVSAFK-NH2。實(shí)施例3:抗病毒多肽AVP-W2藥物對(duì)麻疹病毒的抑制材料A:VeroE6細(xì)胞的培養(yǎng)非洲綠猴腎上皮細(xì)胞系(VeroE6)，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。培養(yǎng)基10%(傳代培養(yǎng)基)或2%(維持培養(yǎng)基)小牛血清(FCS,G舊CO-BRL)，56'C，30分鐘加熱滅菌；2raM/mL左旋谷氮酸鹽；100U/nvL青霉素和100jjg/mL鏈霉素。培養(yǎng)條件為37'C,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。B:病毒株本研究使用的Edmoriston麻疹病毒來(lái)源于中科院武漢病毒所(購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)。具體操作方法單層VeroE6細(xì)胞接于96孔板，每孔104細(xì)胞，加入抗性培養(yǎng)基，使得細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁。病毒加入到含單層VeroE6細(xì)胞的維持培養(yǎng)基中，48小時(shí)后通過(guò)噬斑法測(cè)病毒的滴度，通過(guò)滴度確定麻疹病毒對(duì)于VeroE6細(xì)胞的病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染量TCIDsQ為2X105titer/mL。為測(cè)定AVP-W2對(duì)病毒的作用，貼壁細(xì)胞將進(jìn)行以下三步處理A:病毒的處理50pL的多肽AVP-W2以2.5、5.0、10、20pg/mL的系列濃度，分別與50yL的2X105TCID5o/mL麻疹病毒混合，二者均用維持培養(yǎng)基作溶劑；陰性對(duì)照為50iJL維持培養(yǎng)基與50iJL病毒混合?；旌虾笥?7'C孵育1小時(shí)。孵育后的病毒10倍等比稀釋。B:細(xì)胞感染第一步中處理的病毒加入單層貼壁的VeroE6細(xì)胞，每孔50[jL。每個(gè)濃度的AVP-W2設(shè)置3個(gè)重復(fù)孑L。病毒在37'C吸附細(xì)胞2小時(shí)。然后1000g離心10分鐘，去除上清液。重新加入100ijL新鮮的維持培養(yǎng)基，在37t:，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。C:觀察結(jié)果48小時(shí)后，觀察96孔板中病毒的滴度。加入兔抗麻疹病毒多抗，37'C孵育1小時(shí)；然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，37'C孵育1小時(shí)；最后加入DAB顯色，挑選合適的病毒稀釋度在顯微鏡下進(jìn)行噬斑計(jì)數(shù)。根據(jù)噬斑數(shù)求得麻疹病毒滴度。病毒樣品滴度=噬斑數(shù)X稀釋倍數(shù)抑制率=(陰性對(duì)照滴度-待測(cè)樣品滴度)/陰性對(duì)照滴度X100X抗病毒結(jié)果表明合成多肽AVP-W2對(duì)麻疹病毒的增殖具有高效抑制作用當(dāng)AVP-W2的濃度為10|jg/mL時(shí)，對(duì)麻疹病毒增殖的抑制率可以達(dá)到97.6%;當(dāng)AVP-W2的濃度為20|jg/mL時(shí)，對(duì)麻疹病毒增殖的抑制率可以達(dá)到100%。(見(jiàn)表1)實(shí)施例4:抗病毒多肽AVP-W2藥物對(duì)HIV的抑制材料A:VeroE6細(xì)胞的培養(yǎng)非洲綠猴腎上皮細(xì)胞系(VeroE6)M)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，人宮頸癌細(xì)胞系HeLa(CD4-LTR/e-Gal)來(lái)自中科院武漢病毒所。培養(yǎng)基10%(傳代培養(yǎng)基)或2%(維持培養(yǎng)基)小牛血清(FCS,G舊CO-BRL)，56°C,30分鐘加熱滅菌；2mM/mL左旋谷氨酸鹽；100U/mL青霉素和10(Hjg/mL鏈霉素。培養(yǎng)條件為37'C，5%002培養(yǎng)箱培養(yǎng)。B:病毒株本研究使用的人免疫缺陷病毒株HIV1的基因組DNA(pKS242)來(lái)源于中科院武漢病毒所。具體操作方法單層VeroE6細(xì)胞接于96孔板，每孔104細(xì)胞，加入抗性培養(yǎng)基，使得細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁。為測(cè)定AVP-W2對(duì)病毒的作用，貼壁細(xì)胞將進(jìn)行以下四步處理A:HIV顆粒的收獲將2ijg編碼HIV1的DNA(pKS242)加入單層VeroE6細(xì)胞，37。C孵育2小時(shí)。然后，除去舊的培養(yǎng)基，加入新的維持培養(yǎng)基，37'C孵育30小時(shí)。30小時(shí)后取培養(yǎng)上清，即HIV顆粒。B:病毒的處理50pL的多肽AVP-W2以2.5、5.0、10、20iJg/mL的系列濃度，分別與50ijL上一步收集的病毒混合，二者均用維持培養(yǎng)基作溶劑；陰性對(duì)照為50pL維持培養(yǎng)基與50pL病毒混合?；旌虾笥?7'C孵育1小時(shí)。孵育后的病毒10倍等比稀釋。C:細(xì)胞感染第二步中處理的病毒加入單層貼壁的HeLa(CD4-LTR/e-Gal)細(xì)胞，每孔50yL。每個(gè)濃度的AVP-W2設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。病毒在37'C吸附細(xì)胞2小時(shí)。然后1000g離心10分鐘，去除上清液。重新加入100pL新鮮的維持培養(yǎng)基，在37。C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。D:觀察結(jié)果48小時(shí)后，觀察96孔板中病毒的滴度。受到HIV病毒感染的HeLa(CD4-LTR/P-Gal)細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色，可根據(jù)藍(lán)色細(xì)胞的數(shù)目計(jì)算病毒的滴度與抑制率。病毒樣品滴度=藍(lán)色細(xì)胞數(shù)目x稀釋倍數(shù)抑制率=(陰性對(duì)照滴度-待測(cè)樣品滴度)順性對(duì)照滴度乂100%抗病毒結(jié)果表明合成多肽AVP-W2對(duì)HIV的增殖具有高效抑制作用當(dāng)AVP-W2的濃度為10pg/mL時(shí)，對(duì)HIV病毒增殖的抑制率可以達(dá)到93.4%;當(dāng)AVP-W2的濃度為20叩/mL時(shí)，對(duì)HIV病毒增殖的抑制率可以達(dá)到100%。(見(jiàn)表2)表1不同濃度AVP-W2對(duì)麻疹病毒的作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2為不同濃度AVP-W2對(duì)HIV病毒的抑制作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>SEQUENCELISTING〈110〉武漢大學(xué)<120>—種抗病毒的多肽及用途<130〉一種抗病毒的多肽及用途<160〉2〈170>Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉376〈212〉腿〈213>Mesobuthusmartensiikarsch〈400〉1aattccttctcgctgtcttcttgatcgttttggttgttac60tgatcattgtcatgcattggtcggacttctcccttcggtgatcggagggctggtatcagc120attc犯gggccgaaggaaacgccagatggaagctcgattxgaaccccgi犯atagg犯tta180caggaaacgcgagctcgaccttgaaaagttattcgcaaatatgcctgattactgatctca240attactctttcagtttcatcgcttagcataagtttttcaagttactgccgctactattgc300atcatgatgtgaattggttaactatacttaEitcEitaaaaa360376<210>2<211>17〈212〉PRT<213〉Mesobuthusmartensiikarsch〈400〉2LeuValGlyLeuLeuProSerVallieGlyGlyLeuValSerAlaPheLys15101權(quán)利要求1.一種分離的東亞鉗蝎抗病毒的多肽，其序列為SEQIDNO1所示的核苷酸序列。2、一種分離的東亞鉗蝎抗病毒的多肽，其序列為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。3、多肽AVP-W2在制備治療或預(yù)防麻疹病毒的藥物中的應(yīng)用。4、多肽AVP-W2在制備治療或預(yù)防人免疫缺陷病毒的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種蝎毒素抗病毒的多肽及用途，通過(guò)分子生物學(xué)和化學(xué)合成的方法，獲得蝎毒素抗病毒多肽(AVP-W2)，然后采用抗體中和法測(cè)定了該蝎毒抗病毒多肽對(duì)麻疹病毒(MeV)和人免疫缺陷病毒(HIV)的抗病毒活性，在低濃度可以有效抑制病毒感染。多肽AVP-W2在制備治療或預(yù)防由病毒引起的疾病中的應(yīng)用藥物，有很好的前景。本發(fā)明的抗病毒肽對(duì)MeV和HIV活性高，方法簡(jiǎn)便，可作為抗病毒藥物開(kāi)發(fā)。文檔編號(hào)A61K38/10GK101284869SQ20081004791公開(kāi)日2008年10月15日申請(qǐng)日期2008年6月3日優(yōu)先權(quán)日2008年6月3日發(fā)明者潮戴,曹志賤,李文鑫,趙震環(huán),鄢慧民,馬一保申請(qǐng)人:武漢大學(xué)