專利名稱：：一種真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細(xì)胞工程和組織工程領(lǐng)域中一種細(xì)胞生長促進(jìn)劑，特別涉及一種真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑。
背景技術(shù)：
：近年來隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物材料以及移植免疫學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，各種領(lǐng)域取得的成果和技術(shù)不斷交叉、融合和相互滲透，逐漸形成了一門新的學(xué)科——組織工程學(xué)(FishmanJ.Howtobuildabodypart.Time，1999，153(8)54-55；CowleyG，UnderwoodA.Replacementparts.Newsweek，1997，129(4)66-69；StixG.Growinganewfield.ScientificAmerican，1997，277(4)15-16)。組織工程(TissueEngineering)一詞最早是由美國國家科學(xué)基金委員會正式提出和確定的。其基本原理和方法是將體外培養(yǎng)擴增的正常組織細(xì)胞吸附于一種具有優(yōu)良細(xì)胞相容性并可以被機體降解吸收的生物材料上面形成復(fù)合物，然后將細(xì)胞，生物材料復(fù)合物植入人體組織、器官的病損部位，在作為細(xì)胞生長支架的生物材料逐漸被機體降解吸收的同時，細(xì)胞不斷增殖、分化，形成新的并且其形態(tài)、功能方面與相應(yīng)組織、器官一致的組織，從而達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的(LangerR，VacantiJP.Artificialorgans.ScientificAmerican，1995，273(3)130-133；KeithT，CimaLG，Yaremchuk，etal.Injectablecartilage.PlastReconstrSurg，1995，96(6)1390-1398；SchultzO，KeuszerG，ZacherJ，etal.ArithritisRheum，1997；40(8)1420-1433.)。聚羥基脂肪酸酯(PHA)是很多細(xì)菌在特定條件下合成的一種細(xì)菌胞內(nèi)高分子聚酯(ChenGQ，WuQ，ZhaoK，YuHP&ChanA.ChineseJofPolymerScience18(2000)389-396)，是新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌的生物能量來源之一，具有非常優(yōu)良的性質(zhì)，其生物可降解性、生物可相容性等特性已引起了學(xué)術(shù)界，特別是生物醫(yī)學(xué)界的濃厚興趣(DengY，ZhaoK，ZhangXF，HuP，ChenGQ.Biomaterials23(20)(2002)4049-4056；ZhengZ，DengY，LinXS，ZhangLX，ChenGQ.JBiomaterSci.PolymerEdn14(2003)615-624)。其在藥物緩釋材料、可植入人體生物材料等高附加值方面的應(yīng)用開發(fā)正在全球范圍內(nèi)展開，在人工器官，整形外科，創(chuàng)傷.愈合上的應(yīng)用前景尤其廣闊(DengY，LinXS，ZhengZ，DengJG，ChenJC，MaH，ChenGQ.Biomaterials24(2003)4273-4281；WangYW，ChenGQ，WuQ.Biomaterials24(2003)4621-4629)。PHA在其生物降解過程中釋放出寡聚PHA(OHA)和3-羥基脂肪酸(HA)單體，如，3-羥基丁酸(HB)及其寡聚物(OHB)、3-羥基戊酸(HV)及其寡聚物(OHV)，3-羥基己酸(HHx)及其寡聚物(OHHx)，3-羥基癸酸(HD)及其寡聚物(OHD)。研究表明，高等動物的細(xì)胞器和胞漿里面也存在著OHA(寡聚PHA)，與鈣離子通道和DNA轉(zhuǎn)運等有關(guān)。實驗結(jié)果表明OHB在人工模擬的平面脂雙層中形成非選擇性離子通道，可以運輸鈣離子通過囊泡的雙層膜。在初步研究中，PHA、OHA與蛋白等的復(fù)合物被認(rèn)為與人類的兩種主要疾病動脈硬化和糖尿病有關(guān)(ReuschRN，SadoffHL.ProcNatlAcadSciUSA1988；85(12)4176-80)。發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑。本發(fā)明所提供的真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑，它的活性成分為寡聚3-羥基脂肪酸和/或其單體3-羥基脂肪酸，所述寡聚3-羥基脂肪酸及其單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下其中，R為由一至十個碳組成的直鏈或側(cè)鏈的烷基，n為1-1000的自然數(shù)。在實際應(yīng)用中，R優(yōu)選為甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基或庚基；n優(yōu)選為1-200的自然數(shù)。上述真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的活性成分也可以是寡聚3-羥基脂肪酸和/或其單體3-羥基脂肪酸的鹽類。當(dāng)R＝甲基時，寡聚3-羥基脂肪酸單體為3-羥基丁酸(3-hydroxybutyrate或HB)；R＝乙基時，寡聚3-羥基脂肪酸單體為3-羥基戊酸(3-hydroxyvalerate或HV)；R＝丙基時，寡聚3-羥基脂肪酸單體為3-羥基己酸(3-hydroxyhexanoate或HHx)；R＝丁基時，寡聚3-羥基脂肪酸單體為3-羥基庚酸(3-hydroxyheptanoate或HHp)；R＝戊基時，寡聚3-羥基脂肪酸單體為3-羥基辛酸(3-hydroxyoctanoate或HO)；R＝己基時，寡聚3-羥基脂肪酸單體為3-羥基壬酸(3-hydroxynonanoate或HN)；R＝庚基時，寡聚3-羥基脂肪酸單體為3-羥基癸酸(3-hydroxydecanoate或HD)。所述寡聚3-羥基脂肪酸的單體及3-羥基脂肪酸可以是單一立體結(jié)構(gòu)的化合物，如R型，或S型，甚至可以是R和S型的混合物，也可為外消旋結(jié)構(gòu)的化合物。寡聚3-羥基脂肪酸包括寡聚的3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸的單純寡聚物或共聚寡聚物，也包括這些寡聚物的混合物。所述3-羥基脂肪酸可為3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸，也可為這些酸的混合物。所述真核細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、腎細(xì)胞等。上述真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑可促進(jìn)體外培養(yǎng)的組織器官，如成纖維組織、腺體、肺、卵巢、神經(jīng)、骨組織、腦組織、血管、肝、腎的生長。上述寡聚3-羥基脂肪酸及其單體3-羥基脂肪酸可以通過水解或酶解以及基因工程微生物發(fā)酵方法來獲得(席建忠.微生物方法合成手性羥基脂肪酸.清華大學(xué)碩士論文(2000)；GaoHJ，WuQ，ChenGQ.FEMSMicrobiolLett213(2002)59-65；ZhaoK，TianG，ZhengZ，ChenJC，ChenGQ.FEMSMicrobiolLett218(2003)59-64；ZhengZ，ZhangMJ，ZhangGandChenGQ.AntonievanLeeuwenhoek(2004)inpress)?？赏ㄟ^液相色譜檢測寡聚3-羥基脂肪酸的純度。本發(fā)明的真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的使用濃度為0.001-0.1g/L培養(yǎng)基。實驗證明，本發(fā)明的真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑在一定范圍內(nèi)隨著濃度的升高，細(xì)胞的生長量也在提高，但過高的濃度并不能使細(xì)胞的生長量持續(xù)增加，并且對細(xì)胞系和原代細(xì)胞表現(xiàn)出了同樣的促生長作用效果，而且具有成本低的優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞工程和組織工程以及真核細(xì)胞和組織器官的體外培養(yǎng)。圖1a為不同濃度3-羥基丁酸真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑對成纖維細(xì)胞L929生長的影響柱狀圖。圖1b為不同濃度R型3-(R)-羥基丁酸作為真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑對成纖維細(xì)胞L929生長的影響柱狀圖。圖2a為不同濃度3-羥基丁酸真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑對乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的影響柱狀圖。圖2b為不同濃度3-(R)-羥基丁酸作為真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑對乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長的影響柱狀圖。圖3a為不同濃度3-羥基丁酸真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑對人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響柱狀圖。圖3b為不同濃度3-(R)-羥基丁酸真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑對人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響柱狀圖。具體實施例方式下述實施例中的R表示旋光性，不是取代基。實施例1、外消旋3-羥基丁酸(HB)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑和光活性的3-(R)-羥基丁酸(3-(R)-HB)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑對成纖維細(xì)胞L929增殖的影響細(xì)胞系成纖維細(xì)胞L929(購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所)。培養(yǎng)基DMEM(Dulbecco’sModifiedEagleMedium)(GIBCO)，216mg/LL-谷氨酰胺，36mg/LL-天冬酰胺酸，4.766g/LHepes(二羥乙基呱嗪乙烷磺酸)，2g/LNaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，10％胎牛血清(三利)。無血清培養(yǎng)基DMEM(GIBCO)，216mg/LL-谷氨酰胺，36mg/LL-天冬酰胺酸，4.766g/LHepes，2g/LNaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素。消化液DMEM(GIBCO)，216mg/LL-谷氨酰胺，36mg/LL-天冬酰胺酸，4.766g/LHepes，2g/LNaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，0.2％胰蛋白酶。沖洗液PBS緩沖液(8.0g/L氯化鈉、0.20g/L氯化鉀、1.44g/L磷酸氫二鈉、0.24g/L磷酸二氫鉀)，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素。MTT(Thiazolylblue)染液5mg/ml(5mgMTT溶于1mlPBS)。裂解液DMSO(二甲基亞砜)外消旋3-羥基丁酸HB真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由外消旋3-羥基丁酸鈉(購自Sigma公司)單一成分組成。3-(R)-羥基丁酸((R)HB)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由3-(R)-HB或3-(R)-羥基丁酸鈉(購自Sigma公司)單一成分組成。上述兩種真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的添加濃度均分別為0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。培養(yǎng)條件37℃，5％CO2恒溫培養(yǎng)箱，接種量為104個/孔(24孔板)用MTT法測定細(xì)胞的生長量1)染色細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)一定時間后，取出樣品，吸去培養(yǎng)液，每孔加入0.5ml無菌的PBS(PH＝7.4)蕩洗3次。再加入0.1mlMTT染液和1ml不含血清的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中保存4小時。2)吸去上清，加入1mlDMSO，室溫下放置30分鐘，使顏色顆粒充分溶解。3)取0.2ml待測液加入到96孔酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀550nm下測定吸光度值。結(jié)果如圖1a和圖1b所示，表明在添加了內(nèi)消旋3-羥基丁酸(HB)3-羥基丁酸真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑、或者3-(R)-羥基丁酸真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的作用組中，均產(chǎn)生一定的細(xì)胞生長促進(jìn)作用，二者的最佳添加濃度分別為0.05g/L，0.01g/L，對細(xì)胞的生長增加量分別達(dá)到了98.5±1.5％和50.3±2.6％。實施例2、3-羥基丁酸(HB)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑和3-(R)-羥基丁酸(3-(R)-HB)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑對乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖的影響傳代細(xì)胞乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(GIBCO)，216mg/LL-谷氨酰胺，36mg/LL-天冬酰氨酸，4.766g/LHepes，2g/LNaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，10％胎牛血清(三利)無血清培養(yǎng)基DMEM(GIBCO)，216mg/LL-谷氨酰胺，36mg/LL-a天冬酰氨酸，4.766g/LHepes，2g/LNaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素消化液DMEM(GIBCO)，0.125％胰蛋白酶，0.02％EDTA，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素沖洗液PBS，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素MTT染液5mg/ml(5mgMTT溶于1mlPBS)裂解液DMSO3-羥基丁酸(HB)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由3-羥基丁酸鈉(購自Sigma公司)單一成分組成。3-(R)-羥基丁酸真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由3-(R)-HB或3-(R)-羥基丁酸鈉(購自Sigma公司)單一成分組成。上述兩種真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的添加濃度均分別為0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。培養(yǎng)條件與MTT法同實施例1。結(jié)果如圖2a和圖2b所示，表明在添加了3-羥基丁酸真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑、或者3-(R)-羥基丁酸真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的作用組中，均產(chǎn)生一定的細(xì)胞生長促進(jìn)作用，二者的最佳添加濃度分別為0.05g/L，0.005g/L，對細(xì)胞的生長增加量分別達(dá)到了66.5±1.4％和28.4±1.6％。實施例3、3-羥基丁酸(HB)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑和3-(R)-羥基丁酸(3-(R)-HB)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響傳代細(xì)胞人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)基M199(GIBCO)，2.3g/LNaHCO3，15mmol/LHEPES，2mg/LECGF，5mg/L肝素，2mmol/LL-Gln，1mmol/L丙酮酸鈉，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，20％胎牛血清(三利)。繼代培養(yǎng)基M199(GIBCO)，2.3g/LNaHCO3，15mmol/LHEPES，2mg/LECGF，5mg/L肝素，2mmol/LL-Gln，1mmol/L丙酮酸鈉，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，15％胎牛血清(三利)。無血清培養(yǎng)基M199(GIBCO)，2.3g/LNaHCO3，15mmol/LHEPES，2mg/LECGF，5mg/L肝素，2mmol/LL-Gln，1mmol/L丙酮酸鈉，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素。沖洗液PBS，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素消化液PBS，0.125％胰蛋白酶，0.02％EDTA，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素終止液PBS，5％胎牛血清(三利)MTT染液5mg/ml(5mgMTT溶于lmlPBS)裂解液DMSO3-羥基丁酸(HB)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由3-羥基丁酸鈉(購自Sigma公司)單一成分組成。3-(R)-羥基丁酸((R)HB)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由3-(R)-HB或3-(R)-羥基丁酸鈉(購自Sigma公司)單一成分組成。上述兩種真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的添加濃度均分別為0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。培養(yǎng)條件與MTT法同實施例1。結(jié)果如圖3a和圖3b所示，表明在添加了3-羥基丁酸真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑、或者3-(R)-羥基丁酸真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的作用組中，均產(chǎn)生一定的細(xì)胞生長促進(jìn)作用，二者的最佳添加濃度分別為0.05g/L，0.01g/L，對細(xì)胞的生長增加量分別達(dá)到了57±1.6％和31.6±1.8％。實施例4、3-羥基戊酸(HV)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑、3-(R)-羥基戊酸((R)HV)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑及寡聚物OHV真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響傳代細(xì)胞人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞3-羥基戊酸(HV)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由3-羥基戊酸(HV)單一成分組成。3-(R)-羥基戊酸((R)HV)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由3-(R)-羥基戊酸((R)HV)單一成分組成。寡聚物OHV真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由寡聚物OHV單一成分組成。其中，3-羥基戊酸(HV)、或者3-(R)-羥基戊酸((R)HV)、或者其寡聚物OHV由嗜水假單胞菌Aeromonashydrophila在十一酸中合成聚3-羥基戊酸PHV，在酸性或堿性水解PHV得到。具體方法參照文獻(xiàn)DSeebach，MGFritz.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules25(1999)217-236。其中，嗜水假單胞菌Aeromonashydrophila購自中國科學(xué)院微生物菌種保藏中心。上述三種真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的添加濃度均分別為0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。培養(yǎng)方法、條件與MTT法同實施例1。實驗結(jié)果表明在添加了3-羥基戊酸(HV)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑、3-(R)-羥基戊酸(R)HV真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑、寡聚物OHV真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的作用組中，均產(chǎn)生一定的細(xì)胞生長促進(jìn)作用，三者的最佳添加濃度分別為0.05g/L，0.01g/L，0.04g/L，對細(xì)胞的生長增加量分別達(dá)到了48±1.5％、24±2.5％、45±2.1％。實施例5、3-羥基己酸(HHx)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑、3-(R)-羥基己酸((R)HHx)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑及寡聚物(OHHx)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑對成纖維細(xì)胞L929增殖的影響細(xì)胞系成纖維細(xì)胞L929(購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所)培養(yǎng)方法同實施例1。3-羥基己酸(HHx)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由3-羥基己酸(HHx)(購自Sigma公司)單一成分組成。3-(R)-羥基己酸((R)HHx)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由3-(R)-羥基己酸((R)HHx)(購自Sigma公司)單一成分組成。寡聚3-(R)-羥基己酸(OHHx)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由寡聚3-(R)-羥基己酸(OHHx)單一成分組成。其中，寡聚3-(R)-羥基己酸(OHHx)由嗜水假單胞菌Aeromonashydrophila在月桂酸中生長合成3-(R)-羥基丁酸HB和3-(R)-羥基己酸共聚物PHBHHx，在酸性或堿性水解PHBHHx得到，具體方法參照文獻(xiàn)DSeebach，MGFritz.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules25(1999)217-236。其中，嗜水假單胞菌Aeromonashydrophila購自中國科學(xué)院微生物菌種保藏中心。上述三種真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的添加濃度均分別為0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。培養(yǎng)條件與MTT法同實施例1。實驗結(jié)果表明在添加了3-羥基己酸(HHx)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑、3-(R)-羥基己酸((R)HHx)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑及寡聚物(OHHx)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的作用組中，均產(chǎn)生一定的細(xì)胞生長促進(jìn)作用，最佳添加濃度分別為0.05g/L，0.01g/L，0.03g/L，對細(xì)胞的生長增加量分別達(dá)到了32±2.4％、29±2.6％、68±1.9％。實施例6、3-羥基癸酸(HD)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑、或者3-(R)-羥基癸酸((R)HD)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑及寡聚物OHD真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑對乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖的影響傳代細(xì)胞乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞3-羥基癸酸(HD)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由3-羥基癸酸(HD)(購自Sigma公司)單一成分組成。3-(R)-羥基癸酸((R)HD)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由3-(R)-羥基癸酸((R)HD)(購自Sigma公司)單一成分組成。寡聚物OHD真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由寡聚物OHD單一成分組成。其中，寡聚物OHD由假單胞菌Pseudomonasstutzeri1317在葡萄糖中生長合成3-(R)-羥基辛酸HO和3-(R)-羥基癸酸共聚物PHOD，在酸性或堿性水解PHOD得到。具體方法參照文獻(xiàn)DSeebach，MGFritz.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules25(1999)217-236。其中，假單胞菌Pseudomonasstutzeri1317購自中國科學(xué)院微生物菌種保藏中心。上述三種真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的添加濃度均分別為0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。培養(yǎng)方法同實施例2，培養(yǎng)條件與MTT法同實施例1。實驗結(jié)果表明在添加了3-羥基癸酸(HD)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑、或者3-(R)-羥基癸酸((R)HD)真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑及寡聚物OHD真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的作用組中，均產(chǎn)生一定的細(xì)胞生長促進(jìn)作用，最佳添加濃度分別為0.02g/L，0.005g/L，0.02g/L，對細(xì)胞的生長增加量分別達(dá)到了58±1.3％，26±1.7％，57±2.2％。實施例7、3-(R)-羥基丁酸((R)HB)和3-(R)-羥基己酸((R)HHx)混合物真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑及共聚寡聚物OHBHHx真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑對成纖維細(xì)胞L929增殖的影響細(xì)胞系成纖維細(xì)胞L929(購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所)培養(yǎng)方法同實施例1。3-(R)-羥基丁酸((R)HB)和3-(R)-羥基己酸((R)HHx)混合物真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由3-(R)-羥基丁酸((R)HB)和3-(R)-羥基己酸((R)HHx)(均購自Sigma公司)混合而成(混合的質(zhì)量比為50∶50)。3-(R)-羥基丁酸((R)HB)和3-(R)-羥基己酸((R)HHx)共聚寡聚物OHBHHx真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑由3-(R)-羥基丁酸(R)HB和3-(R)-羥基己酸(R)HHx共聚寡聚物OHBHHx單一成分組成。其中，3-(R)-羥基丁酸((R)HB)和3-(R)-羥基己酸((R)HHx)共聚寡聚物OHBHHx由嗜水假單胞菌Aeromonashydrophila在月桂酸中生長合成3-(R)-羥基丁酸HB和3-(R)-羥基己酸共聚物PHBHHx，在酸性或堿性水解PHBHHx得到。具體方法參照文獻(xiàn)DSeebach，MGFritz.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules25(1999)217-236。其中，嗜水假單胞菌Aeromonashydrophila購自中國科學(xué)院微生物菌種保藏中心。上述兩種真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的添加濃度均分別為0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。培養(yǎng)條件與MTT法同實施例1。實驗結(jié)果表明在添加了3-(R)-羥基丁酸((R)HB)和3-(R)-羥基己酸((R)HHx)混合物真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑及寡聚物OHBHHx真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的作用組中，均產(chǎn)生一定的細(xì)胞生長促進(jìn)作用，最佳添加濃度分別為0.001g/L，0.01g/L，對細(xì)胞的生長增加量分別達(dá)到了30±2.2％、22±2.0％。權(quán)利要求1.一種真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑，它的活性成分為寡聚3-羥基脂肪酸和/或其單體3-羥基脂肪酸，所述寡聚3-羥基脂肪酸及其單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下其中，R為由一至十個碳組成的直鏈或側(cè)鏈的烷基，n為1-1000的自然數(shù)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑，其特征在于所述R為甲基，乙基，丙基，丁基、戊基、己基或庚基；n為1-200的自然數(shù)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑，其特征在于所述寡聚3-羥基脂肪酸的單體及3-羥基脂肪酸為單一立體結(jié)構(gòu)的化合物、R和S型的混合物或外消旋結(jié)構(gòu)的化合物。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑，其特征在于所述組成真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑的寡聚3-羥基脂肪酸的單體及3-羥基脂肪酸選自3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、3-羥基己酸和3-羥基癸酸中的一種或幾種。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述寡聚3-羥基脂肪酸為3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、3-羥基己酸、3-羥基癸酸的單純寡聚物或共聚寡聚物或所述單純寡聚物和共聚寡聚物的混合物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述真核細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞或腎細(xì)胞。7.權(quán)利要求1-6任一項權(quán)利要求所述的真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑在體外培養(yǎng)組織器官中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述組織器官包括成纖維組織、腺體、肺、卵巢、神經(jīng)、骨組織、腦組織、血管、肝、腎。全文摘要本發(fā)明公開了一種真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑。本發(fā)明所提供的真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑，它的活性成分為寡聚3－羥基脂肪酸和/或其單體3－羥基脂肪酸，所述寡聚3－羥基脂肪酸及其單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如上，其中，R為由一至十個碳組成的直鏈或側(cè)鏈的烷基，n為1－1000的自然數(shù)。其中，R優(yōu)選為甲基，乙基，丙基，丁基、戊基、己基或庚基；n優(yōu)選為1－200的自然數(shù)。本發(fā)明的真核細(xì)胞生長促進(jìn)劑可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞工程和組織工程以及真核細(xì)胞和組織器官的體外培養(yǎng)。文檔編號C12N5/00GK1560233SQ20041000616公開日2005年1月5日申請日期2004年3月4日優(yōu)先權(quán)日2004年3月4日發(fā)明者陳國強,楊飛申請人:清華大學(xué)